ALDH18A1

摘要：病毒样颗粒（VLPs）是不含病毒遗传物质的病毒结构蛋白，因此是非感染性的。它们是安全有效的免疫刺激剂，在疫苗开发中发挥重要作用，因为它们具有固有的免疫原性，能够诱导细胞和体液免疫反应。在抗病毒疫苗设计中，基于VLPs的疫苗是具有吸引力的多功能候选物，具有自组装纳米结构、重复表面表位、易于遗传和化学修饰、作为抗原呈递平台的多功能性、固有免疫原性以及与减毒活疫苗和灭活疫苗相比更高的安全性等优势。在本综述中，我们讨论了VLPs疫苗诱导细胞和体液免疫反应的机制。我们概述了在构建有效的基于VLPs的疫苗时，大小、形状、表面电荷、抗原呈递、遗传和化学修饰以及表达系统的影响。总结了抗病毒VLPs疫苗的最新应用及其临床试验。 1.引言 病毒样颗粒（VLPs）是多聚体自组装病毒衣壳蛋白，不含病毒遗传物质，结构上类似于其亲本病毒。大多数VLPs的直径范围为10至200纳米，具有重复的病毒表面表位，自组装成二十面体或杆状结构。VLPs分为两类：非包膜VLPs和包膜VLPs。非包膜VLPs是通常表达为单层或多层蛋白颗粒的病毒衣壳蛋白，没有外层脂质包膜。包膜VLPs代表在病毒复制过程中被脂质层包裹的病毒衣壳蛋白。包膜层本身，称为“病毒体”，由宿主细胞膜衍生的磷脂双层膜和膜稳定糖蛋白组成。目前，已有100多种源自人类、动物、植物和噬菌体病毒的VLPs，分为35个家族，用于药物输送、医学成像、生物催化和疫苗的应用。 由于从其亲本病毒继承的固有属性，VLPs被认为是疫苗开发中理想的模板。VLPs与先天和适应性免疫细胞相互作用，诱导强烈的体液免疫反应，通常也观察到细胞免疫反应。与减毒活疫苗和灭活疫苗相比，由于缺乏病毒基因组，VLPs具有更高的安全性，是非感染性的。VLPs不仅可以引起对同一来源病毒的免疫反应，VLPs也是展示外来抗原的理想疫苗平台，诱导免疫反应以预防和治疗不同病原体。VLPs通过在其外部呈现多个抗原副本来增强许多可溶性抗原的免疫原性，从而通过控制抗原价态来调节免疫反应。这些优势使VLPs成为抗病毒疫苗开发中具有吸引力的候选物，研究人员高度重视它们在对抗新出现的病毒感染中的战斗。已有几种VLPs疫苗获得食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗病毒感染，包括乙型肝炎病毒（HBV）、戊型肝炎病毒（HEV）、人乳头瘤病毒（HPV）和流感病毒，越来越多的VLPs疫苗已进入临床试验。 2.机制  从其亲本病毒遗传而来，无论是包膜还是非包膜VLPs仍然具有靶向和进入抗原呈递细胞（APCs）和其他靶细胞的能力，而无需病毒基因组。VLPs进入宿主细胞的细胞吞噬作用使用不同的机制，包括吞噬作用、微囊泡吞噬作用、受体介导的内吞作用、依赖或不依赖于洞穴的吞噬作用。VLPs的高度重复表面表位是强大的病原体相关分子模式（PAMPs），与先天和适应性免疫细胞的模式识别受体（PRRs）如Toll样受体（TLRs）、NOD样受体和RIG1样受体相互作用，激发体内免疫原性。 PAMPs与PRRs之间的相互作用激活APCs，如树突状细胞（DCs），并随后在APCs内吞噬VLPs，随后的溶酶体消化导致VLPs衍生的抗原肽装载到MHC II分子上（图1A）。通过MHC II分子呈递的VLPs衍生抗原介导CD4+ T细胞的激活。CD4+ 辅助T细胞的T细胞受体（TCRs）然后识别MHC II表面特异性抗原表位，诱导细胞因子和共刺激受体信号，激活CD4+ 辅助T细胞。CD4+ T细胞通过释放包括白细胞介素和干扰素在内的细胞因子介导巨噬细胞、CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和T细胞依赖B细胞的激活。巨噬细胞的激活为放大T细胞激活效应提供了正反馈，由于其作为APCs的功能增强。CD8+ T细胞和T细胞依赖B细胞的激活引发下游细胞和体液免疫。重复的VLPs表面表位可以通过交联B细胞受体（BCRs）诱导T细胞独立B细胞激活，刺激抗体产生。 PAMPs与表达在先天免疫细胞表面如吞噬细胞、NK细胞、DCs、B-1细胞、肥大细胞和粒细胞的PRRs相互作用，激活先天免疫反应，如吞噬作用、靶细胞溶解和炎症反应。与其亲本病毒类似，许多VLPs可以在先天免疫细胞如DCs的MHC I表面诱导抗原交叉呈递，通过与CD8+ T细胞的TCR相互作用介导CTL免疫反应。激活CD8+ T细胞也需要来自CD4+ T细胞的共刺激受体和细胞因子信号。激活的CD8+ T细胞通过释放穿孔素、颗粒酶和启动Fas/FasL途径诱导靶细胞溶解和凋亡。尽管通常观察到CD8+ T细胞反应，但与其他疫苗方式相比，VLPs似乎很少在诱导细胞毒性T细胞方面表现出色。 值得注意的是，VLPs在进入靶细胞膜后可能会遇到细胞内宿主防御，如TRIM（三部分基序）蛋白，导致VLPs的蛋白酶体降解或通过泛素化过程改变它们与其他蛋白的相互作用能力。K48连接的泛素化引发蛋白酶体降解，而K63连接的多泛素化通常调节VLPs与其他蛋白的相互作用。这些机制可能会影响VLPs疫苗的抗原呈递和下游免疫反应。有报道称，TRIM与HIV-1病毒衣壳的干预与增强CD8+ T细胞激活有关，但需要进一步研究以验证这种效应的机制。 由于高度有序和重复的表面表位，VLPs具有高价态以交联BCRs，超过B细胞的激活阈值，诱导强烈的体液反应（图1B）。有时甚至在没有T细胞帮助的情况下也可以发生这一过程。大多数VLPs包含结构相同的表面表位，这比亚单位疫苗在保护性抗体诱导方面提供了刺激优势，因为高价态促进了结合亲和力并增强了对反应性不强或BCRs亲和力低的B细胞的激活。CD4+ 辅助T细胞识别MHC II表面衍生自VLPs的抗原，诱导细胞因子和共刺激受体信号，启动B细胞向抗体产生浆细胞和记忆B细胞的转变。或者，一些VLPs诱导T细胞独立B细胞激活和抗体产生，从而快速免疫反应。保护性抗体的生物活性包括中和病原体、激活补体、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和病原体的吞噬作用。总的来说，VLPs可以刺激细胞和体液免疫反应，因此是疫苗设计的最佳候选物，因为它们在诱导保护性免疫和作为抗原展示平台方面具有优势。 图1. 病毒样颗粒（VLPs）诱导体液和细胞免疫应答的假设机制。(A) 抗原呈递细胞（APCs）的模式识别受体（PRRs）识别VLPs的病原体相关分子模式（PAMPs）表位，导致APCs成熟和VLPs的细胞内摄取。VLPs在APCs的内体内被处理，其抗原表位被呈递在MHC分子表面。呈递在MHC II表面的抗原肽诱导共刺激受体信号传导和细胞因子释放，介导CD4+ T细胞的激活。CD4+ T细胞诱导T细胞依赖的B细胞激活和巨噬细胞激活。通过交叉呈递途径在MHC I表面呈递的抗原表位导致CD8+ T细胞的激活，这些细胞通过释放穿孔素、颗粒酶和启动Fas/FasL途径诱导靶细胞溶解和凋亡。(B) 重复的VLPs表面表位交联B细胞受体（BCRs），诱导T细胞独立的B细胞激活。T细胞依赖和独立的激活都诱导B细胞向记忆B细胞和抗体产生浆细胞的转变。保护性抗体的下游生物活性包括中和病原体、激活补体、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和病原体的吞噬作用。TLRs：Toll样受体，DC：树突状细胞。 3.VLPs疫苗设计考虑因素  为了开发高效性和安全性的基于VLPs的疫苗，需要考虑与提高内化作用和与免疫细胞相互作用相关的多个因素。我们下面讨论一些我们认为会影响设计有效基于VLPs的疫苗的方面，无论是使用VLPs作为针对其亲本病毒的疫苗还是作为抗原（或免疫佐剂）展示平台。 3.1.大小和形状 淋巴管壁是多孔的，允许小于200纳米的颗粒自由扩散。由于大多数VLPs的大小在10-200纳米之间，允许VLPs进入淋巴系统与免疫细胞相互作用。VLPs可以通过多孔的淋巴管壁扩散，然后通过被动运输在淋巴结的皮质下窦中积累。VLPs与其亲本病毒的大小相似，有利于与免疫细胞的直接相互作用，实现通过MHC分子的抗原呈递、抗体产生和CTL反应。在利用VLPs作为抗原展示平台的情况下，也可能产生类似的效果。免疫系统识别VLPs的高度重复和有序结构作为PAMPs，以引发细胞和体液免疫反应。VLPs的有序结构模式方便交联BCRs，作为体液免疫反应的强烈激活信号。大多数病毒衣壳蛋白相隔5-10纳米，这种间距可能适用于在VLPs表面展示外来抗原以实现最佳的BCR交联。由于其独特的结构模式，一些VLPs可以诱导T细胞独立B细胞激活，从而快速释放针对病原体的IgM。 大小还决定了VLPs是否可以被APCs有效摄取。VLPs具有病原体大小、带电或疏水表面区域、受体结合方式，这些都有助于更好地诱导APCs，与一些小型和可溶性蛋白抗原相比。诱导适应性免疫反应需要激活APCs以产生细胞因子和上调共刺激分子。几何构型和大小是诱导DCs成熟的重要因素，正如我们所注意到的，一些VLPs（而不是未组装的VLPs单体）可以触发这一过程。例如，应该在诱导CTL反应之前激活DCs，因为单独的交叉呈递途径是不足够的。DCs的TLRs识别许多VLPs的形状和重复表面表位作为PAMPs，导致DCs的功能成熟，释放细胞因子和过度表达共刺激分子，这将调节随后的适应性免疫反应。 3.2.表面电荷 表面电荷可能会影响VLPs颗粒进入免疫细胞的内化作用，并可能改变免疫反应。带正电荷的纳米颗粒往往比带负电荷或中性电荷的纳米颗粒诱导更高的细胞内化，这可能归因于纳米颗粒与阴离子细胞膜脂双层之间的静电相互作用。带正电荷的VLPs可以屏蔽其带负电荷的货物，如核酸，并且可以被细胞轻易摄取。然而，急性炎症和非特异性免疫刺激与带正电荷的纳米颗粒有关，因为它们可能会激活模式识别受体。笼状纳米颗粒带有高正电荷或负电荷表现出更高的非特异性细胞传递到小鼠巨噬细胞，导致在临床前研究中肝脏积累。这可能归因于肝脏内Kuffer细胞的积极吞噬作用。当纳米颗粒的净电荷为弱负电荷时，可以减少在正常组织包括肝脏中的非特异性积累。在临床前和临床条件下，蛋白质冠层的形成会改变VLPs的表面特性，可能影响细胞摄取和下游细胞信号传导。在使用基于铁氧化物的纳米颗粒的研究中，带正电荷和中性纳米颗粒与带负电荷的纳米颗粒相比，显示出更高的血清吸收。总体而言，通过改变VLPs的表面电荷来预测免疫反应的结果仍然需要未来的重大努力，以获得指导VLPs疫苗设计的明确结论。 3.3.抗原呈递 VLPs不仅是疫苗设计的验证候选物，它们也适合作为多聚体抗原呈递平台，以诱导最佳免疫反应。由于VLPs本身具有免疫原性，因此它们不仅作为三维抗原展示的多价支架，而且作为免疫佐剂以增强免疫反应。将许多可溶性抗原与VLPs等多价平台结合可以解决它们无法引起足够免疫反应的问题。看来APCs已经进化到更有效地处理病原体大小（20-100纳米）的抗原，因此将可溶性抗原的大小增加到这个范围可能会促进APCs的抗原摄取和呈递，最终增强细胞和体液免疫。可溶性抗原在VLPs上呈递后，进入DCs的MHC I交叉呈递途径的效率通常比单独呈递高3-4个数量级，这增强了CTL反应。对于呈递T细胞表位的VLPs，抗原不必暴露在外部表面，因为VLPs会在APCs的溶酶体-内质体系统中降解，产生的表位肽随后会呈递给目标TCRs。在这种情况下，抗原也可以插入到VLPs中通常不暴露于环境中的部位。必须根据结构分析和预测确定最佳插入位点，因为某些抗原插入位点可能会危及VLPs的结构完整性或改变免疫原性。当插入到VLPs中时，特别是插入到免疫优势区域时，抗原的大小通常限制在20-30个氨基酸，超过该序列的长度通常无法折叠成完整的VLPs结构。与T细胞表位不同，BCR与B细胞表位之间的直接相互作用对于诱导BCR交联和抗体产生是必要的。这要求B细胞表位在VLPs表面的暴露部位展示，最好是在免疫优势区域。在VLPs的表面环中插入通常是首选，因为这是许多病毒与BCRs相互作用的部位。此外，外部N或C末端是插入的另一个选择。在这些VLPs的暴露部位，大小容忍度可以达到十倍更高（200-300个氨基酸）。很难预测一个抗原表位是否会成功地整合到定义的插入位点而不会影响VLPs的结构稳定性，以及插入后的一般免疫原性。例如，原始序列中插入位点的微小变化（如2-3个氨基酸）可能导致三维空间中结构阻碍的大变化。长序列、强正电荷、高疏水性和β-链指数的抗原可能会对VLPs的结构完整性造成问题。有报道称，插入位点的轻微变化也可能导致VLPs和插入抗原的免疫原性发生剧烈变化。蛋白质-蛋白质对接是预测蛋白质结构的成熟技术。LZerD对接服务器（https://lzerd.kiharalab.org/）基于蛋白质序列进行全原子建模，不需要提交预先确定的结构信息[37]。在蛋白质结构预测领域，深度学习已成为分析和建模蛋白质折叠过程的主导技术，因此在疫苗开发中具有重要影响。从头结构预测工具Rosetta套件（https://www.rosettacommons.org/）从蛋白质结构数据库中组装蛋白质片段，并使用Rosetta算法形成最终预测。最近发布的Alpha Fold 2算法（https://github.com/deepmind/alphafold/）在插入抗原到VLPs时可能会提供更好的预测结果，因为它在三维结构预测中实现了非常高的保真度（全局距离测试得分92.4），但是需要进一步在更大的采样规模上使用Alpha Fold进行验证。 3.4.内表面 VLPs的内表面用于储存遗传物质，包括编码酶和对病毒复制和结构稳定性至关重要的结构蛋白的DNA和RNA。VLPs的内表面通常带正电荷，因此可以包装带负电荷的核酸或其他免疫佐剂，诱导强大的免疫反应以协同VLPs的免疫原性。VLPs在其空心腔内保护其货物免受酶降解（DNases、RNases和蛋白酶），增强目标细胞内有效载荷的细胞摄取，释放免疫佐剂以增强VLPs在内质体-溶酶体室中的免疫原性，在那里交付载体被降解。可以封装在VLPs内表面的免疫佐剂，包括激活APCs的dsRNA、ssRNA和CpGs，以刺激相应的TLRs受体，释放细胞因子如干扰素，以诱导APCs激活和促炎反应。可以采用两种简单的方法将佐剂包装在VLPs内，名为纳米反应器或重组路线。佐剂可以直接通过VLPs壳层的孔隙扩散并积累在内表面，通过纳米反应器路线，或者VLPs蛋白壳可以被解组装以与佐剂混合，然后在佐剂存在下通过重组路线重新组装VLPs笼。 3.5.VLPs平台的遗传和化学修饰 当向VLPs平台引入外来抗原时，通常使用遗传修饰。抗原基因可以插入VLPs DNA序列的特定部位，导致每个VLPs支架亚单位上显示嵌合抗原。抗原和VLPs嵌合基因通常根据真核或原核表达系统的偏好进行密码子优化，然后人工合成融合基因，并将其置于选定的蛋白质表达系统中以产生重组嵌合蛋白。然而，这项技术的缺陷如前所述，抗原的大小、插入位点会影响最终产品的结构完整性和整体免疫原性。通过预先形成的VLPs平台的化学修饰可以规避这样的问题。VLPs和抗原可以分别合成，并通过共价或非共价键化学连接。抗原与VLPs的共价连接依赖于VLPs表面存在的功能基团，这些基团是自然呈现的或人为引入到VLPs支架上的。常用的VLPs表面功能基团是氨基、羧基、巯基和羟基。可以通过赖氨酸的氨基酰化、半胱氨酸的巯基烷基化和活化羧酸残基的胺偶联来实现抗原与VLPs的共价连接。VLPs平台的共价和非共价化学修饰列于表1。EDC-NHS-氨基偶联广泛用于将药物（包括叶酸和阿霉素）连接到VLPs（如豇豆花叶病毒CPMV）的外部氨基上，用于癌症治疗应用。VLPs的半胱氨酸残基提供了一个有用的把手，可以进行马来酰亚胺-硫醇偶联，但它们通常形成二硫键而不是作为游离半胱氨酸存在。最近开发的二硫键桥接马来酰亚胺衍生物（如二溴马来酰亚胺）可以在不影响共价二硫键的情况下将功能基团连接到半胱氨酸。荧光二溴马来酰亚胺连接到噬菌体Qbeta VLPs表面的180个半胱氨酸残基，用于细胞内成像应用。可以人为地将非天然氨基酸引入VLPs，这使得可以在VLPs的特定部位进行化学修饰，如“点击化学”连接抗原。非天然氨基酸的炔基被引入到Qbeta VLPs的表面，这使得铜催化的叠氮-炔烃环加成反应可以共价连接叠氮功能化的Tn抗原（GalNAc-α-O-Ser/Thr）。此外，可以使用链霉亲和素和生物素之间的非共价相互作用来用抗原功能化VLPs。HPV16 L1 VLPs与生物素受体Avitag遗传融合，单价链霉亲和素（mSA）融合的疟疾抗原（VAR2CSA）可以连接到生物素化的Avitag-VLPs上，形成基于VLPs的抗疟疾疫苗。与遗传修饰相比，化学修饰提供了相当大的好处，但它并非没有自己的缺点。尽管它避免了向VLPs插入抗原时的空间阻碍，但化学偶联的修饰率通常低于100%，并且反应过程不如遗传修饰那样易于控制和复制。化学修饰的复杂性和成本也会增加，这可能会从制造角度阻碍工业化进程。 3.6.表达平台 为了克服市场准入的障碍，应该认真考虑及时、可复制、低成本、高产量和安全地生产VLPs疫苗。因此，在VLPs疫苗的生产过程中，表达平台的重要性得到了认真的认可。目前，已经开发了一些表达宿主用于VLPs疫苗生产，包括细菌、酵母、昆虫细胞、植物、哺乳动物细胞、无细胞表达系统和活体动物。 细菌系统（尤其是大肠杆菌表达系统）可能是最广泛使用且特性良好的VLPs表达系统。大约30%的VLPs在此系统下通过强细菌启动子进行克隆和密码子优化表达。与其他表达平台相比，该宿主提供了高表达产量、短培养时间、低成本和简单的过程控制。然而，在表达过程中可能会遇到此宿主的缺点，包括无法进行翻译后修饰（PTMs）、溶解度问题和内毒素的引入。在某些情况下，引入的糖基化不会影响目标蛋白的免疫原性，因此当在细菌宿主中生产VLPs疫苗时，无法进行PTMs可能不是主要问题。通过降低培养温度、将基因序列克隆到低温质粒载体（如pCold载体）或将目标基因与高度可溶性蛋白标签（如GST标签）遗传融合，可以缓解溶解度问题。在形成包涵体的情况下，可以引入变性和复性步骤，以帮助目标蛋白形成天然结构。通过使用内毒素结合基质对蛋白产品进行抛光，也可以将内毒素污染降低到可接受的水平。自从FDA批准了第一个针对HBV的HBV S蛋白VLPs疫苗和针对HPV的HPV L1 VLPs疫苗以来，酵母表达系统（特别是毕赤酵母、汉逊酵母和酿酒酵母菌株）已被证明是VLPs疫苗生产的验证宿主。尽管总体产量通常低于细菌系统，并且与哺乳动物细胞相比PTMs不同，但酵母宿主可以提供诸如糖基化或磷酸化等PTMs，这会影响VLPs疫苗的表面电荷、疏水性、稳定性和功能。酵母表达宿主也用于表达更复杂的结构，如包膜VLPs。昆虫细胞-杆状病毒表达系统正变得越来越受欢迎，因为它提供了诸如类哺乳动物PTMs、高产量和快速培养时间等优势，与细菌和酵母宿主相比。使用此宿主作为表达平台时，我们可能需要注意污染问题。 哺乳动物细胞是生产生物制药产品最广泛使用的宿主之一，包括VLPs疫苗。哺乳动物系统不仅提供了更完整的PTMs，还可以共表达多种蛋白，从而允许构建更复杂的VLPs疫苗结构。然而，与细菌表达系统相比，生产成本更高，下游处理更复杂。基于植物的表达系统是疫苗生产的一种成本效益高且可扩展的平台，但可能需要根据当地生态状况进行严格监管。利用植物叶绿体基因组的高度多倍体特性（每个细胞多达10,000个拷贝），将外源VLPs基因整合到叶绿体基因组中，从而实现高水平的蛋白表达。无细胞系统是表达对活细胞有毒的蛋白或在VLPs疫苗中引入非天然氨基酸时的一个有吸引力的替代方案。 活体动物是表达VLPs疫苗的另一个来源。原生动物利什曼原虫（L. tarentolae）表达系统提供了类似哺乳动物的翻译后修饰机制，并且对人类无害。原生动物衍生的诺罗病毒GII.4 VP1 VLPs具有免疫原性，可以刺激产生中和抗体。诺罗病毒GII.4 VP1被克隆到家蚕核型多角体病毒载体中，并在家蚕幼虫中表达。家蚕脂肪体裂解物经过蔗糖梯度离心和固定金属亲和色谱的两步纯化，最终诺罗病毒VLPs的纯度在90%以上。活体动物表达系统的优点包括更完整的PTMs、相对较低成本、鲁棒性和与其他系统相比的易于大规模生产。 4.抗病毒VLPs疫苗的应用和最近的临床试验  VLPs是疫苗开发的理想候选物，因为它们具有其亲本病毒的许多特性。它们保留了病毒的强大免疫原性，因为它们展示了高度重复的表面抗原表位，可以刺激免疫细胞。缺少病毒核酸也提高了VLPs作为疫苗平台的安全性。在这一部分，我们回顾了抗病毒VLPs疫苗的应用，我们在表2中展示了VLPs疫苗近五年的临床试验。 4.1.乙型肝炎（HBV）疫苗 自从1986年FDA批准基于VLPs的乙型肝炎疫苗Engerix-B（GSK）和Recombivax（Merck）以来，引起了广泛的兴趣和研究。这些基于乙型肝炎表面抗原HBsAg（S蛋白，226个氨基酸）的疫苗形成了带有宿主细胞（酵母、哺乳动物）糖基化的22纳米球形壳层。尽管这些疫苗的响应率仅为90-95%，因为疫苗表面缺少Pre-S表位，但它们能激发持久的免疫保护。在接种Engerix-B疫苗的男婴中，中枢神经系统炎症性脱髓鞘的风险高三倍。为了克服这些问题，结合了S、Pre-S1和Pre-S2表面抗原的基于VLPs的HBV疫苗Sci-B-Vac已经获得许可。这种疫苗诱导针对S抗原的高滴度抗体，同时还有额外的Pre S1和Pre S2抗体，可以作为治疗慢性HBV疾病的治疗性疫苗。一项长期跟踪研究表明，通过Engerix-B或Sci-B-Vac进行单次加强疫苗接种，巴勒斯坦儿童体内针对HBV表面抗原的抗体滴度显著增强。 4.2.人乳头瘤病毒（HPV）疫苗 默克公司开发的第一种预防性HPV疫苗Gardasil于2006年获得FDA批准，用于对抗人类HPV感染。Gardasil是一种重组蛋白，由HPV 6、11、16和18型的L1主要衣壳蛋白（VLPs）组成。与Gardasil相比，2007年获得FDA批准的Cervarix（GSK）由HPV 16和18型的L1蛋白组成。尽管这种疫苗只产生2种血清型，与Gardasil的4种血清型相比，但由于其配方中的单磷酸脂A，Cervarix诱导了更强和更持久的免疫反应。默克公司在2014年推出的Gardasil9，提供了广谱的9种血清型，包括HPV 31、33、45和58型，以及Gardasil的血清型。对于15岁以下的青少年，世界卫生组织在2014年将最初的3剂初次加强注射时间表改为出生时和6个月或12个月时接种2剂。对于已许可的疫苗，有限的证据表明，在初次接种剂量后，3、6和8年间隔的加强疫苗接种将引发强烈的记忆反应。作为Gardasil9的替代品，来自9种HPV基因型的L1突变体（C175A和C428A）的等摩尔化学计量比共组装成帽状体-杂交病毒样颗粒，能够在小鼠中产生与Gardasil9相当的中和抗体滴度。尽管L1 VLPs疫苗具有很强的免疫原性，但L1蛋白并不保守，因此在不同HPV类型之间提供很少的交叉保护。与此同时，次要衣壳蛋白L2在不同HPV类型中高度保守，这使其成为开发广泛保护性HPV疫苗时的有吸引力的候选物。与L1蛋白相比，L2的免疫原性较低，无法自行形成VLPs，将L2蛋白展示在VLPs平台上可能增强其作为交叉保护HPV疫苗的免疫原性。AAVLP-HPV（2A Pharma）由展示在腺相关病毒VP3 VLPs上的HPV 16和31的L2肽组成。这种疫苗在临床前测试中显示出对20多种HPV类型的保护，并已完成临床I期试验（NCT03929172）。类似地，在噬菌体MS2 VLPs表面展示HPV31/16 L2肽提供了与Gardasil9相似的保护水平。 4.3.甲型流感疫苗 在开发重组流感疫苗时，血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）和基质蛋白M1被认为是主要的抗原来源。针对HA和NA等表面糖蛋白的抗体可以中和病毒感染并瘫痪其入侵机制，在初始阶段阻碍病毒进展。FluBlok是2013年获得FDA批准的第一种重组流感疫苗，它以包膜糖蛋白HA作为主要靶标。针对HA头部的疫苗可能需要每年更新，因为该区域的抗原漂移特性。然而，HA茎部区域在不同流感病毒株之间在进化上更稳定，因此可能为构建“通用”流感疫苗提供解决方案，这种疫苗能引发广泛的免疫保护，并且不需要每年更新。基于NA的VLPs疫苗尚未上市，正在积极研究和测试中。流感M1蛋白在结构上类似于其亲本病毒，并且能够在用同源和异源流感病毒挑战的小鼠中诱导体液和细胞免疫反应。M1蛋白也被用作VLPs骨架蛋白，在表面展示不同的流感抗原，如HA、NA和M2。流感离子通道蛋白M2是通用流感疫苗设计的另一个遗传保守靶标，特别是M2外域（M2e，23个氨基酸）在不同人类流感亚型中高度保守。在流感VLPs表面（HA的跨膜和细胞质域）展示来自不同物种（包括人类、猪和禽类）的异源M2e串联重复序列，在小鼠中诱导针对不同流感A H1和H3亚型的交叉保护抗体。这种结构的经皮疫苗接种（AS04佐剂）在用H3N2流感A病毒挑战的小鼠中诱导细胞和体液免疫反应。在另一项研究中，流感M2e和HA都通过SpyTag-SpyCatcher连接附着在诺罗病毒VLPs载体（VP1衣壳）表面。有趣的是，体外数据表明，针对HA而不是M2e的高抗体反应被诱导。在昆虫细胞中共表达NA和M1产生NA VLPs（NA和M1混合笼），可用于诱导针对流感A病毒感染的保护性免疫。用NA1和NA2 VLPs同时接种疫苗，可产生抗NA血清IgG，保护小鼠免受H1N1和H3N2病毒的致命挑战。在临床前研究中，用未佐剂的H6N1-VLPs混合笼（由病毒HA、NA、M1和M2蛋白组成）在第0天和第21天进行两次肌肉注射，可在小鼠中引发持久的抗体免疫。 4.4.HIV-1疫苗 由于无法产生足够的针对HIV-1和猴免疫缺陷病毒(SIV)的中和抗体、生产和纯化障碍以及在维持原始HIV-1表面糖蛋白表位构象真实性方面的困难，目前市场上尚无临床批准的预防性HIV-1疫苗。第一种基于VLPs的HIV-1疫苗25年前进入临床试验。来自Gag（群抗原）衣壳的HIV-1 p24-VLP是第一种达到I/II期临床试验的VLPs疫苗，尽管p24-VLP显示出良好的安全性，但其低免疫原性并未在体液和细胞免疫反应中引起显著增强。另一种HIV-1疫苗RV144结合了表达HIV Gag、蛋白酶和gp120的重组金丝雀痘病毒载体（ALVAC）作为初次接种，以及基于Gag衣壳蛋白的gp120分泌VLPs（AIDSVAX）作为加强接种。这项临床试验在泰国实现了部分保护，对HIV-1感染的保护效力低至31.2%。HIV-1 gp120的V3环中的P18I10肽（RGPGRAFVTI）被插入到HPV L1衣壳的D-E环中，产生的嵌合VLPs疫苗名为L1P18，在酵母中表达，旨在引发针对HPV和HIV的保护效果。将来的研究将对这种结构进行进一步的效率测试。在另一项研究中，包含SIV Gag衣壳和HIV-1 Env（包膜）蛋白的mRNA疫苗VLPs能够产生中和抗体，并在恒河猴中实现了79%的每次暴露风险降低。舌下免疫以其诱导粘膜和系统免疫反应的效率而闻名。与C1q（CD91配体）表面结合的CD40L/HIV VLPs疫苗在小鼠舌下给药时结合并穿过上皮层，引发IgA唾液抗体产生和细胞免疫反应。由于高效的埃博拉包膜糖蛋白（EboGP）介导的病毒进入人类巨噬细胞和DCs，用HIV包膜C2-V3-C3（134个氨基酸）区域替换EboGP的粘蛋白样域，产生的嵌合VLPs能够在小鼠中比单独的GP120引发更高滴度的HIV-1抗体。通过用流感H5 HA的相应域替换HIV-1 Env的跨膜和细胞质域构建的嵌合VLPs疫苗。然而，这导致针对HIV-1的中和抗体反应减少，表明在这种情况下可能需要全长gp120。在使用基于Pr55Gag的嵌合HIV-1 VLPs（其C端融合了逆转录酶或Tat-Nef蛋白）作为加强接种，以及HIV-1 DNA疫苗作为初次接种时，在小鼠中诱导了针对HIV-1的强烈细胞免疫反应。诱导的细胞免疫是单独HIV-1 DNA疫苗接种的2-3倍。当使用带有V3-糖蛋白免疫原的HIV-1包膜VLPs作为初次接种，以及类原生Env-VLPs作为加强接种时，在非人灵长类动物（NHPs）中诱导了异源中和抗体，这种效果比单独Env-VLPs疫苗接种更强。 4.5.诺罗病毒疫苗 武田的双价诺罗病毒VLPs疫苗（TAK-214）目前正在进行II期临床试验。这种疫苗由诺罗病毒GI.1和GII.4c主要衣壳蛋白VLPs组成，在肌肉注射后8天引发中和抗体，抗体水平至少在一年内保持在基线以上。对异型GII.2基因型的交叉基因型保护也被观察到。另一种双价疫苗结合了诺罗病毒GII.4 VLPs和肠病毒71型（EV71）VLPs，在临床前研究中显示出对EV71感染的中和效果和GII.4-VLP与粘液的结合。在杆状病毒昆虫细胞系统中表达了诺罗病毒GII.17的主要衣壳蛋白VLPs。临床前研究表明，这种疫苗能在免疫小鼠中产生针对NoV GII.17的保护性抗体。在另一项研究中，在杆状病毒系统中表达的重组GII.P16-GII.2 VLPs疫苗使巨噬细胞极化为M1型，以诱导CD4+ Th1导向的免疫反应。在小鼠的临床前研究表明，遗传上接近的诺罗病毒VLPs抗原的初次加强免疫可能引发强烈的阻断抗体反应，并且同时使用这些VLPs抗原的疫苗接种在这项研究中优于顺序免疫。 4.6.SARS-CoV-2疫苗 Medicago的CoVLP可以产生高滴度的中和抗体，并已进入III期临床试验。CoVLP的SARS-CoV-2 S蛋白（带有S2P, GSAS替换）的跨膜和细胞质域被流感A HA（H5）的相应域替换，形成了异源VLPs疫苗。 另一种名为VBI-2902a的嵌合SARS-CoV-2 VLPs疫苗由处于预融合状态的S蛋白和水泡性口炎病毒的跨膜细胞质域组成。这种疫苗在单剂量下就能在SARS-CoV-2挑战的仓鼠中产生保护性免疫，目前正在进行I/II期临床试验。在另一项研究中，使用SpyTag-SpyCatcher技术将S蛋白的受体结合域（RBD）融合到细菌噬菌体骨架（Acinetobacter phage AP205衣壳蛋白）上。这种名为ABNCoV2（AdaptVac）的VLPs疫苗在临床前研究中引发了高滴度的中和抗体，目前正在进行I/II期临床试验。SpyTag-SpyCatcher连接技术也使得SARS-CoV-2 RBD能够展示在乙型肝炎表面抗原VLPs表面。这种结构在非人灵长类动物中引发了针对SARS-CoV-2挑战的保护性中和抗体，并已进入I/II期临床试验。烟草花叶病毒衣壳被用来展示与人类IgG1 Fc结构域融合的SARS-CoV-2 RBD。这种疫苗候选物在临床前研究中触发了中和抗体的产生，非佐剂VLPs疫苗诱导了平衡的Th1和Th2反应，而CpG 7909佐剂配方则引发Th1导向的反应。为了协同BCR信号和TLR信号，开发了一种含有宿主细胞来源RNA作为TLR配体的噬菌体（Acinetobacter phage AP205）衍生VLPs，并在其表面展示SARS-CoV-2 RBD。这种VLPs结构在非人灵长类动物中诱导了Th1偏向的反应和高滴度的中和抗体，并具有持久的记忆。改良的S1 AP205能在小鼠中产生针对SARS-CoV-2变体（武汉和UK/B.1.1.7）的中和抗体。SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合基序和融合肽（S2结构域，817-855氨基酸）都展示在CuMVTT VLPs（带有通用Th激活破伤风毒素表位的黄瓜花叶病毒）上，以诱导中和抗体。值得注意的是，这种疫苗候选物及其仅融合肽版本的候选物都能在小鼠中引发中和抗体，表明S2融合肽作为免疫刺激剂的潜在应用。一个十二面体腺病毒VLP被修饰有60份SARS-CoV-2 RBD副本，这种疫苗的初次接种在小鼠中诱导了中和体液反应，并通过同一结构的单次加强接种得到增强。在另一项体外研究中，CPMV或Qβ VLPs被修饰有SARS-CoV-2 S蛋白的抗原表位肽，这些结构的初次加强给药诱导了中和抗体。 6.未来展望和结论  基于VLPs的疫苗在对抗紧急病毒感染和其他疾病的战斗中展现出光明的未来。尽管到目前为止已经取得了进展，但在基于VLPs的抗病毒疫苗开发中仍然存在障碍。需要强调的是VLPs疫苗生产中的技术难度，尤其是包膜VLPs疫苗，因为VLPs的结构复杂性可能会导致在使用当前表达平台进行表达和纯化过程中免疫原性下降。需要开发新的策略和表达系统，使用稳定的转基因细胞系来表达具有复杂结构和PTMs的蛋白。在VLPs疫苗开发中需要在诱导CD8+ T细胞反应方面取得实质性改进。通过在VLPs的外部或内部表面修饰免疫佐剂，能够诱导MHC I表面的交叉呈递，这可能会帮助研究人员解决这一问题。为了控制免疫反应的强度，生物信息学和蛋白质结构预测将为调节VLPs疫苗与免疫细胞受体之间的相互作用以及筛选大量VLPs组装以获得最佳免疫反应的过程提供指导。我们希望这篇综述能在设计基于VLPs的抗病毒疫苗时提供一般背景和有用的指导。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。