CD19 x CD28 x PD-1

导语：CAR-T 细胞治疗作为癌症治疗的 “革命性武器”，已成功挽救无数血液肿瘤患者的生命。但临床数据显示，约 10%-20% 的 CAR-T 治疗失败源于起始细胞质量问题：这个被称为 CAR-T “种子” 的细胞群体，从采集那一刻就决定了治疗的成败概率。 今天从 4 个核心维度，全面解析起始细胞的关键作用。CAR-T的起始细胞主要分两大阵营：患者自身的“自体细胞”和健康供体的 “异体细胞”。两者的“出身差异 直接导致CAR-T的质量天差地别。本文主要关注自体起始细胞。 一、自体起始细胞的“出身”，决定 CAR-T的“先天资质” ·自体起始细胞：“量身定制” 却难逃个体局限 目前已上市的 CAR-T（如诺华的Kymriah、吉利德的Yescarta等）均为自体来源，优势是能避免免疫排斥，但短板也十分明显，质量完全依赖患者自身状态。 ·核心问题：质量波动大，制造失败风险高 癌症患者常因化疗、放疗或疾病本身，导致T细胞数量减少、功能“耗竭”。研究显示，难治性淋巴瘤患者的起始T细胞上，PD-1、TIM-3等“耗竭标志物” 表达量是初治患者的2-3倍，直接导致CAR-T体外扩增效率下降30%-50%（《Leukemia》2021）。 ·隐藏风险：肿瘤细胞污染可能导致治疗耐药，细菌污染可能导致生产失败 若采集的起始细胞中混入循环肿瘤细胞，CAR基因可能误转导到肿瘤细胞上，形成 “抗原伪装”。《Blood》2020年报道的临床案例显示，这种污染会导致患者输注CAR-T后快速复发。 也有真实世界文献报道，有小部分起始细胞带有细菌污染，且在最初单采血检测时因抗生素影响检测，显示为假阴性。 二、患者自身状态：3 个核心因素左右起始细胞质量 对自体起始细胞，患者的疾病程度、治疗史和年龄也会显著影响细胞“成色”。 1.疾病状态：肿瘤负荷越高，起始细胞越 “弱” 肿瘤负荷高（如LDH升高、骨髓浸润严重）的患者，起始T细胞往往处于“疲态”： ·T 细胞功能衰退：TCR多样性降低，IL-2、IFN-γ 等细胞因子分泌减少，导致 CAR-T 转导效率下降 20%-40%（《Clinical Cancer Research》2021）； ·抑制性细胞污染：当 MDSCs比例＞10% 时，CAR-T 扩增倍数会降低 50% 以上（《Cancer Immunology Research》2020）。 2.既往治疗：化疗药对起始细胞的 “隐形伤害” 不同抗肿瘤药物对起始细胞的影响不同，需严格控制 “洗脱期”： ·烷化剂：接受高剂量美法仑后 3 个月内采集的细胞，CAR-T 扩增率比 6 个月后采集的低 40%-60%（《Journal of Clinical Oncology》2022）； ·皮质类固醇、来那度胺：需在单采前 2-4 周停用（《Blood Advances》2021）； ·双特异性抗体：洗脱期＜2 周会使“增殖不足”风险升至 30%-40%（《Leukemia & Lymphoma》2023）。 3.年龄：老年患者起始细胞的“先天缺陷” ≥65 岁患者的起始细胞存在两大问题： ·T 细胞亚群失衡：naive T 细胞和 TSCM 比例比年轻患者低 50%-60%，导致 CAR-T 体内存活时间缩短（老年患者 2-3 个月 vs 年轻患者 6-8 个月）（《Aging Cell》2022）； ·代谢功能下降：细胞毒性降低 25%-35%，更易引发 CRS 等毒性反应（《Nature Aging》2021）。 三、起始细胞的“质量三要素”：选对标准，事半功倍 评估起始细胞质量，主要看亚群组成、活性、纯度三个核心指标，它们直接决定 CAR-T 的 “战斗力”。 1.亚群组成：记忆 T 细胞是 “黄金指标” ·TSCM 和 TCM：CAR-T 的 “长寿密码” 研究显示，起始细胞中 TSCM 比例＞15% 时，淋巴瘤患者 3 年无复发生存率达 40%；若 TSCM＜5%，仅为 15%（《New England Journal of Medicine》2022）。 ·CD4/CD8 比例：平衡是关键 起始细胞中 CD4/CD8 比值建议维持在 0.8-1.2。通过磁珠分选调控比例后，CAR-T 体外杀伤效率可提升 20%-30%（《Clinical Immunology》2021）。 2.活性：活率低 = 制造失败风险高 ·活率与凋亡率：起始细胞活率需＞90%，活率＜80% 时制造失败率升至 25%-35%（《Cytotherapy》2022）； ·功能测试：CD3/CD28 激活后 48h 增殖率＜2 倍，会导致 CAR-T 扩增减少 50% 以上（《Journal of Immunological Methods》2021）。 3.纯度：杂质细胞是 “隐形杀手” ·抑制性杂质：单核细胞比例＞20% 时，CAR-T 扩增下降 60% 以上，磁珠分选可使效率提升 30%-40%（《Stem Cell Research & Therapy》2022）； ·非免疫杂质：红细胞、血小板会导致转导效率下降 20%-25%（《Transfusion》2021）。 四、起始细胞处理：新鲜 vs 冷冻，富集 vs 未富集？ 采集后的处理方式直接影响起始细胞的 “后续表现”，需根据制造需求选择。 1.新鲜 vs 冷冻：各有优劣，按需选择 ·新鲜起始细胞：活性高（活率＞95%）、转导效率比冷冻细胞高 15%-20%，但需 24-48h 内启动制造，运输需 2-8℃冷链（《Biopreservation and Biobanking》2022）； ·冷冻起始细胞：可长期储存在 - 130℃以下，优化冷冻方案（5%-10% DMSO、-1℃/min 降温）后，与新鲜细胞的扩增差异可缩小至10%以内（《Cryobiology》2021）。 2.富集纯化：提升纯度，优化疗效 ·磁珠分选：可将T细胞纯度从40%-60%提升至 90% 以上，多发性骨髓瘤患者客观缓解率从55%提升至 80%（《Journal of Clinical Investigation》2023）； ·阴性分选：去除 CD14+单核细胞、CD19+B细胞，可保留更多TSCM，使制造成功率提升 20%-30%（《Molecular Therapy》2022）。 五、起始细胞:CAR-T 质量的“基石”与未来方向 起始细胞通过三个层面决定 CAR-T 的最终质量：制造可行性、产品功能、临床疗效。目前面临一些挑战，有待在CAR-T研究工作中完善： 1.缺乏标准化质量标准：尚无统一的 TSCM 最低比例、杂质细胞上限等指标； 2.个体化优化不足：针对老年、多次治疗患者的起始细胞 “修复” 策略仍在探索； 3.预测标志物缺失：需开发基于起始细胞的 TCR 多样性、代谢组学标志物。 参考文献 1.Smith A J, et al. Impact of starting T-cell quality on CAR-T cell manufacturing and clinical outcomes. J Hematol Oncol, 2022, 15(1): 123. 2.Li X, et al. Tumor cell contamination in starting material compromises CAR-T cell therapy efficacy. Blood, 2020, 136(15): 1721-1729. 3.Wang Y, et al. Allogeneic CAR-T cells from healthy donors: superior quality and therapeutic potential. Nat Biotechnol, 2023, 41(3): 385-395. 4.Zhang L, et al. Chemotherapeutic agents impair starting T-cell function for CAR-T cell production. J Clin Oncol, 2022, 40(28): 3254-3263. 5.Rodriguez M, et al. Age-related immune senescence affects CAR-T cell persistence. Aging Cell, 2022, 21(5): e13612. 6.Chen J, et al. Memory T-cell subsets in starting material determine CAR-T cell longevity. N Engl J Med, 2022, 387(10): 927-937. 7.Liu H, et al. Optimization of cryopreservation for starting T cells in CAR-T cell manufacturing. Cryobiology, 2021, 101: 104589. 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

过去十年中，免疫肿瘤学的方法已进入临床实践，T细胞治疗领域取得了巨大进展。本文概述了双特异性T细胞接合器（BiTE）疗法的现状，以及扩大BiTE治疗适应症的新策略。阐明耐药机制、免疫逃逸机制，以及用于药物开发的新技术，为开发更有效的新型疗法和合理的联合治疗方案铺平了道路。 背景 随着抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗获批用于B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）的治疗，肿瘤的靶向免疫治疗于20世纪90年代末首次进入临床实践。利用T细胞靶向识别和杀死肿瘤细胞潜力的策略开创了肿瘤治疗的新时代，并促进了广泛的免疫疗法的发展。目前临床常规使用的T细胞免疫疗法主要分为三大类：（1）免疫检查点抑制剂（ICIs）；（2）双特异性抗体；（3）基因修饰的T细胞，特别是嵌合抗原受体（CAR）T细胞。 BiTE结构和作用机制 T细胞重定向双特异性抗体通常采用能够同时结合特定肿瘤相关抗原（TAA）和T细胞受体（TCR）复合物的恒定成分（CD3链）的设计。通过整合这两种不同特性，这类药物能够诱导靶向T细胞介导的肿瘤细胞的杀伤（图1）。BiTE由两个不同单链可变片段（scFv）通过小连接肽共价连接而成，这些片段来源于抗CD3和抗TAA抗体的抗原结合域。BiTE的小体积、高灵活性以及效应细胞与靶细胞之间的高亲和力连接是其最重要的特性，也是其发挥疗效的关键因素。 图1 BiTE作用机制、耐药机制及恢复T细胞功能的策略 a）正常主要组织相容性复合物（MHC）依赖性T细胞通过TCR靶向肿瘤抗原；b）TAA的MHC非依赖性靶向作用：BiTE将TAA与TCR复合物的CD3ε连接以激活T细胞；短暂形成的BiTE诱导的细胞溶解突触通过激活半胱天冬酶蛋白水解信号通路，释放穿孔素和颗粒酶破坏肿瘤细胞；c）由抑制性免疫检查点介导的BiTE治疗期间的免疫逃逸机制：活化T细胞上表达的程序性细胞死亡受体1（PD-1）与肿瘤细胞上表达的程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）的连续结合，导致T细胞无反应性；d）通过ICIs联合BiTE恢复T细胞功能的策略；e）新型检查点抑制性T细胞接合器（CiTE）可同时靶向TAA、CD3和PD-L1，有望克服导致BiTE耐药的免疫检查点表达；f）TAA表达下调或缺失导致的BiTE耐药机制。 与BiTE类似，CAR-T也能通过特定的TAA靶向抗原结合域识别肿瘤细胞，但其激活不通过内源性TCR复合物，而是通过源于CD3和共刺激分子的胞内信号转导结构域。通过CAR结构转导，能够使效应细胞重定向至选定的靶TAA，进而实现MHC非依赖性肿瘤细胞杀伤。目前已有两种靶向CD19的CAR-T细胞（tisagenlecleucel与阿基仑赛）获得FDA批准用于治疗特定类型的复发难治性（R/R）B-NHL成人患者，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。其中tisagenlecleucel还获批用于治疗儿童及25岁以下成人的R/R前体B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），CAR-T细胞疗法在血液肿瘤领域展现出广阔前景。 用于血液系统恶性肿瘤的BiTE NHL CD19是B细胞受体复合物的重要组成部分，也是B细胞恶性肿瘤免疫治疗中可靠的细胞表面靶点，一项针对持续静脉注射靶向CD19 BiTE贝林妥欧单抗的Ⅰ期临床试验的长期随访分析显示，获得缓解患者的8-10年总生存（OS）率超过50%，无进展生存（PFS）率和无治疗生存率均约40%。在接受最大耐受剂量（MTD）60μg/m²/天治疗的患者中，中位OS为5.8年，中位PFS为1.5年；而接受低于60μg/m²/天剂量治疗的患者中位OS为1.1年。这些数据表明，贝林妥欧单抗在R/R B-NHL患者中具有潜在治愈作用，但需使用至少60μg/m²/天的剂量才能获得长期临床获益。 B-ALL 观察到低剂量贝林妥欧单抗可能足以清除外周血和骨髓中的靶细胞后，研究人员在一系列Ⅱ期临床试验中评估了该药物对B-ALL患者的疗效，数据显示，贝林妥欧单抗在R/R ALL患者中的血液学完全缓解（CR）率介于30%~69%之间。Ⅲ期TOWER试验证实，在成人Ph- ALL患者中，与标准治疗方案相比，贝林妥欧单抗可显著改善OS和无事件生存期，同时提高生活质量。 AML CD33表达于急性髓系白血病（AML）细胞，AMG 330是一种抗CD33-CD3 BiTE，首次人体（FIH）试验表明，AMG 330在R/R AML患者中具有抗白血病活性，在目标剂量水平下使4例患者达到CR。 浆细胞疾病 B细胞成熟抗原（BCMA）可在浆细胞和多发性骨髓瘤（MM）细胞上表达，AMG 420是一种靶向BCMA的新型BiTE，一项针对AMG 420的FIH剂量递增试验，共纳入了42例R/R MM患者。结果显示，在接受MTD治疗的10例患者中，总体缓解率（ORR）为70%，7例应答者中有5例达到了微小残留病（MRD）阴性的严格意义的完全缓解。与该发现一致的是，在一项使用抗BCMA CAR-T细胞疗法的Ⅰ期临床试验中，R/R MM患者的ORR为81%。 当前和未来前景 深入理解BiTE或CAR-T细胞相关的逃逸、耐药及毒性机制，或许能揭示通过靶向不同的TAA和/或免疫抑制性肿瘤微环境，进一步提升基于T细胞疗法的有效性和改善患者长期预后的机会。例如双功能检查点抑制性T细胞接合器（CiTE）、同时多重相互作用T细胞接合器（SMITE）、三特异性杀伤接合器（TriKE）、分泌BiTE的CAR-T细胞（CART.BiTE细胞）以及免疫动员单克隆TCR疗法（ImmTAC），这类分子可以拓展T细胞疗法的应用范围（图2）。 图2 新型杀伤细胞接合器（基于抗体或TCR的肿瘤细胞靶向治疗）示意图 a）BiTE：基于抗体的分子，由两个抗原结合scFv通过柔性连接肽基因融合而成，能够重定向T细胞对抗表达TAA的肿瘤细胞。b）双亲和重定向（DART）双特异性抗体：采用交叉结构设计，将一条臂的可变重链（VH）与另一条臂的可变轻链（VL）通过非共价键相连，并通过二硫键稳定结构，并可引入Fc结构域延长血清半衰期。c）使用CrossMAb技术，设计了一种靶细胞与T细胞化合价比为2：1的基于非对称IgG的双特异性T细胞接合结构，以提高疗效并延长循环半衰期。TAA包含两个结合部分，通过增强亲和力更好地与靶细胞结合，同时包含单个CD3ε结合域避免不必要的T细胞激活。d）为克服免疫逃逸，BiTE的结构修饰取得了重大进展。CiTE将局部免疫检查点抑制功能与BiTE的T细胞重定向功能整合于单一分子。e）SMITE由两个独立BiTE组成，可同时识别不同TAA及效应T细胞表面的CD3/CD28，提供共刺激信号并克服抗原逃逸或异质性难题。f）CART.BiTE细胞：工程化CAR-T细胞共表达并局部分泌BiTE分子，能够联合靶向不同和/或特异性表达较低的抗原，以克服肿瘤异质性并降低靶向毒性。g）为了进一步增强效应细胞的细胞毒性，新型TriKE将自然杀伤（NK）细胞导向肿瘤细胞，将双特异性杀伤细胞接合结构与刺激性细胞因子如IL-15组合，进而驱动NK细胞扩增。h）ImmTAC：双功能试剂，将一种对细胞内或细胞外的肿瘤特异性抗原具有亲和力的可溶性TCR与抗CD3 scFv效应结构域相结合，能够促进多克隆效应性T细胞的募集，并将其重定向至肽-MHC复合物呈递的肿瘤特异性抗原。 总  结 随着进入临床试验的双特异性抗体和细胞疗法不断增加，对靶向特定肿瘤类型的最佳结构的认知正逐步深化。这些知识积累有望提升T细胞介导的疗法的抗肿瘤疗效、预防疾病复发，并推动该领域的未来发展。 「参考文献」 Goebeler ME, Bargou RC. T cell-engaging therapies - BiTEs and beyond. Nat Rev Clin Oncol. 2020 Jul;17(7):418-434. 审批编号：CN-167199 过期日期：2025-11-30 声明：本材料由阿斯利康提供支持，仅供医疗卫生专业人士参考 撰写：Crane 审校：Arya 排版：Atai 执行：Atai 本平台旨在为医疗卫生专业人士传递更多医学信息。本平台发布的内容，不能以任何方式取代专业的医疗指导，也不应被视为诊疗建议。如该等信息被用于了解医学信息以外的目的，本平台不承担相关责任。本平台对发布的内容，并不代表同意其描述和观点。若涉及版权问题，烦请权利人与我们联系，我们将尽快处理。

摘要：嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）治疗在过去数十年间取得了突破性进展，已获批用于治疗多种血液系统恶性肿瘤，且在非肿瘤疾病领域的潜力也逐步显现。然而，当前临床级 CAR-T 细胞的体外制造流程复杂、耗时且成本高昂，限制了其广泛应用。本文将系统梳理 CAR-T 细胞的结构与发展历程，深入分析体外 CAR-T 治疗面临的制造难题与毒性风险，重点阐述体内 CAR-T 细胞生成技术的研究进展，包括病毒载体与纳米载体递送系统的应用，同时探讨 CAR-NK、CAR-M 等其他免疫细胞的体内工程化潜力，最后展望该领域的未来方向，为读者全面呈现 CAR-T 细胞治疗从体外到体内的技术变革。 一、CAR-T 细胞：结构解析与发展历程（一）CAR-T 细胞的核心结构 嵌合抗原受体（CAR）是 CAR-T 细胞发挥作用的关键，其典型结构呈模块化设计，主要包含胞外域（Ectodomain）、跨膜域（Transmembrane Domain, TMD和胞内域（Endodomain）三个核心部分，各部分又由多个功能结构组成（图 1A）。 胞外域：负责以不依赖主要组织相容性复合体（MHC）的方式识别肿瘤细胞表面抗原，是 CAR-T 细胞靶向性的基础。它包含抗原结合域和铰链域（Hinge Domain, HD）： 抗原结合域：目前最常用的是单链可变片段（scFv），但 scFv 存在免疫原性强、易自聚集导致 CAR-T 细胞过早耗竭的问题。作为替代方案，纳米抗体（又称 VHH 域）凭借更小的分子体积，能更轻松地接触到实体肿瘤中 scFv 难以抵达的表位，为实体瘤治疗提供了新可能。 铰链域：又称 “间隔区”，连接抗原结合域与跨膜域，为 CAR 提供稳定性和灵活性。基于免疫球蛋白（Ig）的铰链域需特别注意 ——IgG 分子的 CH2 区域可能与先天免疫细胞表面的 Fcγ 受体结合，引发非特异性免疫反应。不过，通过突变或完全删除 CH2 区域，可减少这类反应，同时提升 CAR-T 细胞的存活时间和抗肿瘤效果。此外，铰链域的长度需根据抗原表位与细胞膜的距离设计：较长的铰链域能增加灵活性，适用于识别膜近端表位或复杂糖基化抗原；较短的铰链域则更适合靶向膜远端表位。 跨膜域：连接胞外域与胞内信号域，虽主要起结构支撑作用，但对 CAR 在 T 细胞表面的表达水平、稳定性及功能影响显著。例如，跨膜域参与抗原结合后的 CAR 二聚化过程，并通过与内源性信号分子相互作用传递激活信号，不同类型的跨膜域可调控 CAR 的功能。 胞内域：位于细胞质内，负责将胞外的抗原识别信号转化为胞内信号，激活 T 细胞并触发免疫反应。它通常包含 T 细胞激活域和一个或多个共刺激域： 激活域：目前所有美国食品药品监督管理局（FDA）获批的 CAR-T 产品均采用 CD3ζ 链作为激活域，其胞质域中的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs）可招募蛋白激酶 ZAP70，启动信号级联反应。即便 CAR-T 细胞形成的是非经典免疫突触，在识别抗原后仍能激活 ZAP70，确保信号传递的有效性。 共刺激域：共刺激信号对 CAR-T 细胞的活化、增殖、存活至关重要，也是 CAR-T 细胞代际升级的核心标志，不同共刺激域会引导 CAR-T 细胞产生不同的功能特性。（二）CAR-T 细胞的五代发展历程 自 1987 年 Kuwana 等人提出 “T-bodies” 概念，将单克隆抗体片段与 T 细胞受体（TCR）融合，实现 MHC 非依赖的抗原识别以来，CAR 结构不断优化，至今已发展至第五代（图 1B）。 第一代 CAR-T 细胞：仅包含 scFv 抗原结合域和 CD3ζ 链（或 FcγR）激活域。早期研究显示，基于 CD3ζ 链的 CAR-T 细胞因含多个 ITAMs，细胞毒性显著优于 FcγR 基 CAR-T 细胞。但在临床研究中，第一代 CAR-T 细胞存在存活时间短、抗肿瘤效果弱的问题，无法满足长期治疗需求。 第二代 CAR-T 细胞：在第一代基础上加入一个共刺激域，是目前临床应用最广泛的类型。共刺激域主要来自 CD28 受体家族（如 CD28、ICOS）或肿瘤坏死因子受体家族（如 4-1BB、OX40），不同共刺激域赋予 CAR-T 细胞不同特性： 第三代 CAR-T 细胞：整合两个不同共刺激域（如 CD28+4-1BB），旨在结合不同共刺激域的优势，实现 “双重信号激活”。例如，CD28 提供的快速杀伤能力与 4-1BB 带来的长期存活特性结合后，可显著提升 CAR-T 细胞的抗肿瘤效果。在白血病、非霍奇金淋巴瘤（NHL）等疾病的早期临床研究中，第三代 CAR-T 细胞展现出更强的扩增能力和更长的存活时间，但也有研究指出，第二代 CAR-T 细胞可能通过形成超分子信号复合体，激活更强烈的信号，在部分场景下抗肿瘤能力更优。 CD28 共刺激域：与抗原呈递细胞（APCs）表面的 CD80/CD86 结合后，可促进 IL-2 分泌，增强初始 T 细胞的存活、增殖和代谢活性，使 CAR-T 细胞快速发挥抗肿瘤作用，但可能引发过度激活和 T 细胞耗竭，导致长期疗效不佳。 4-1BB 共刺激域：仅在 T 细胞激活后表达，与配体结合后能促进记忆 T 细胞形成，延长 CAR-T 细胞在体内的存活时间，且 tonic 信号（非特异性持续激活信号）较弱，细胞耗竭程度低，但细胞扩增速度和早期杀伤效率不及 CD28 基 CAR-T 细胞。 OX40 与 ICOS 共刺激域：OX40 可增强 T 细胞的持久性，ICOS 则在调控体液免疫、炎症反应及 Th17 细胞发育中发挥作用，且 ICOS 基 CAR-T 细胞的体内存活时间优于 CD28 基 CAR-T 细胞。 第四代 CAR-T 细胞（TRUCKs）：又称 “通用细胞因子杀伤 T 细胞”，在第二代 CAR 结构基础上，加入受核因子活化 T 细胞（NFAT）调控的转基因 cassette，可在识别肿瘤抗原后诱导表达 IL-2、IL-12、IL-15 等细胞因子。这些细胞因子能招募先天免疫细胞（如巨噬细胞、NK 细胞），在肿瘤微环境（TME）中形成协同抗肿瘤效应，同时避免细胞因子对全身的毒副作用。 第五代 CAR-T 细胞（下一代 CAR）：在第二代 CAR 基础上，插入 IL-2 受体 β 链（IL-2Rβ）的截短胞质域（位于 CD28 共刺激域与 CD3ζ 链之间），并引入 STAT-3/5 转录因子结合基序。抗原结合后，CD28、CD3ζ 链与 JAK-STAT 3/5 通路同时激活，可进一步增强 CAR-T 细胞的功能、增殖能力和存活时间。此外，为应对免疫检查点抑制（如 PD-1/PD-L1 通路）导致的 CAR-T 细胞耗竭，研究人员开发了 PD-1/CD28 嵌合开关受体 —— 其胞外域为 PD-1，可结合肿瘤细胞表面的 PD-L1，胞内域为 CD28 的共刺激信号区，能将 PD-1 介导的抑制信号转化为激活信号。在一项 IB 期研究中，靶向 CD19 的 PD-1/CD28 嵌合开关受体 CAR-T 细胞（CD19-PD-1/CD28-CART）展现出持久的临床疗效。 图 1 CAR-T 细胞结构与五代发展示意图A：CAR-T 细胞的核心结构，包含胞外域、跨膜域和胞内域；B：从第一代到第五代 CAR-T 细胞的结构演变，展示各代共刺激域、细胞因子诱导元件等的差异 （三）实体瘤 CAR-T 治疗的特殊优化 尽管 CAR-T 治疗在血液系统肿瘤中成效显著，但目前尚无针对实体瘤的 CAR-T 产品获批，主要瓶颈在于肿瘤微环境（TME）的抑制作用和肿瘤特异性抗原缺乏。为突破这些限制，研究人员从多个方向对 CAR 进行优化： 改善 TME 浸润：实体瘤基质中富含硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）和透明质酸，会阻碍 CAR-T 细胞进入肿瘤内部。通过在 CAR-T 细胞中表达肝素酶（降解 HSPG）或透明质酸酶（降解透明质酸），可破坏基质屏障，提升 CAR-T 细胞的浸润能力；同时，让 CAR-T 细胞表达肿瘤微环境中趋化因子的受体（如 CXCR1、CXCR2、CCR4），可引导 CAR-T 细胞向肿瘤部位迁移。 逆转免疫抑制：通过基因工程让 CAR-T 细胞分泌 IL-12、IL-15、IL-18 等促炎细胞因子，可直接改善肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性。 解决抗原异质性与逃逸：实体瘤抗原表达具有高度异质性，单一抗原靶向易导致抗原逃逸。双重靶向 CAR-T 策略成为解决方案： 提升治疗安全性：为降低 “脱靶毒性”（On-target/Off-tumor Toxicity），研究人员开发了 “抑制性 CAR（iCAR）”。iCAR 识别正常组织表达而肿瘤组织缺失的抗原，其胞内域含 PD-1 或 CTLA-4 的抑制性信号区。当 CAR-T 细胞接触正常组织时，iCAR 激活抑制信号，阻止 CAR-T 细胞活化，从而保护正常组织。 混合 CAR-T 细胞（Pooled CAR-T）：将靶向不同抗原的 CAR-T 细胞联合输注。例如，在肺癌小鼠模型中，输注靶向 EphA2 和 FAPα 的混合 CAR-T 细胞，抗肿瘤效果显著优于单一 CAR-T 细胞。 双特异性 CAR-T 细胞（biCAR-T）：单个 T 细胞同时表达两种靶向不同抗原的 CAR。在胶质母细胞瘤模型中，同时表达 HER2 和 IL13Rα2 CAR 的 biCAR-T 细胞，抗肿瘤效果优于单一 CAR-T 细胞或混合 CAR-T 细胞。 双价 CAR-T 细胞（Bivalent CAR-T）：一个 CAR 分子包含两个不同的 scFv，可识别两种抗原，分为 “串联型”（两个 scFv 的 VL-VH 直接连接）和 “环型”（两个 scFv 的 VL-VH 通过间隔序列分开）。二、体外 CAR-T 治疗的挑战：制造难题与毒性风险（一）体外制造流程的复杂性与高成本 目前临床获批的 CAR-T 细胞均为自体产品，需从患者体内采集 T 细胞，经体外工程化改造后再回输，整个制造流程耗时 3-4 周，单患者成本通常超过 40 万美元，部分甚至突破 100 万美元，其复杂性主要体现在以下环节（图 2 左半部分）： T 细胞采集与分离：通过白细胞分离术（Leukapheresis）从患者外周血中获取白细胞，再分离纯化 T 细胞； 激活与转导：用抗 CD3/CD28 抗体激活 T 细胞后，通过病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒）或非病毒载体（如转座子）将 CAR 基因导入 T 细胞； 体外扩增：在含细胞因子（如 IL-2）的培养基中培养 T 细胞，使其大量增殖，达到临床所需剂量； 质量控制与回输：对扩增后的 CAR-T 细胞进行无菌性、存活率、纯度、效价等指标检测，合格后回输患者。 自体 CAR-T 制造还面临物流与时效性挑战：白细胞分离术需专业设备和团队，采集后的细胞需快速转运至 GMP 级实验室，且 CAR-T 细胞保质期短，需在规定时间内回输，这对物流和生产效率提出极高要求。 为降低成本，异基因 CAR-T 细胞（从健康供体获取 T 细胞进行工程化）成为研究方向。异基因 CAR-T 细胞可批量生产，形成 “现货型”（Off-the-shelf）产品，大幅缩短治疗周期并降低成本。但异基因 CAR-T 细胞存在两大关键问题： 移植物抗宿主病（GvHD）：供体 T 细胞表面的 TCR 可能识别患者正常组织的抗原，引发致命性的 GvHD； 宿主抗移植物反应（HvG）：患者免疫系统可能将异基因 CAR-T 细胞视为 “异物” 并清除，导致 CAR-T 细胞在体内存活时间缩短，治疗失效。（二）CAR-T 治疗相关毒性 尽管 CAR-T 治疗疗效显著，但常伴随严重的系统性毒性，其中细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS） 最为常见且危险。 细胞因子释放综合征（CRS）：CAR-T 细胞识别并激活后，会大量释放 IL-6、IFN-γ 等细胞因子，引发 “细胞因子风暴”，临床表现为发热、低血压、器官衰竭等。CRS 的严重程度与 CAR-T 细胞输注剂量相关，且接受环磷酰胺联合氟达拉滨预处理的患者，CRS 发生率更高。这是因为预处理会清除体内的 “细胞因子 sink 细胞”（如调节性 T 细胞），导致支持 CAR-T 细胞增殖的细胞因子积累，进一步加剧 CAR-T 细胞的过度激活和扩张。 免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）：通常在 CRS 发生后出现，且严重程度与 CRS 相关，临床表现为头痛、意识障碍、癫痫等。其发病机制与全身性炎症反应、内皮细胞活化导致血脑屏障破坏相关。目前尚无获批的 CRS 或 ICANS 预防药物，只能通过对症治疗（如使用 IL-6 受体拮抗剂托珠单抗治疗 CRS）缓解症状，因此优化 CAR 设计、降低毒性成为关键。 图 2 体外与体内 CAR-T 细胞生产流程对比左半部分：体外 CAR-T 生产流程，包含白细胞分离、T 细胞分离激活、转导、扩增、回输等步骤；右半部分：体内 CAR-T 生产流程，通过静脉注射病毒载体或纳米载体，直接在体内完成 T 细胞的转导与 CAR 表达。 三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台 为解决体外制造的弊端，体内 CAR-T 细胞生成技术应运而生 —— 通过注射携带 CAR 基因的递送载体，直接在患者体内完成 T 细胞的工程化改造，无需体外操作（图 2 右半部分）。该技术不仅能简化流程、降低成本，还可避免体外扩增导致的 CAR-T 细胞耗竭，同时可能减少毒性反应。目前主要的递送平台分为病毒载体和纳米载体两大类（表 1）。（一）病毒载体递送系统 病毒载体因转导效率高、可实现 CAR 基因稳定表达，是体外 CAR-T 制造的 “金标准”，也被用于体内 CAR-T 生成，主要包括腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）。 腺相关病毒（AAV）：AAV 具有安全性高、可在分裂与非分裂细胞中实现长期 episomal 表达（不整合到宿主基因组）的优势。Nawaz 等人在研究中，通过注射携带 CAR 基因的 AAV，成功在体内重编程免疫细胞，实现肿瘤消退。但 AAV 也存在局限性：携带基因片段的容量有限，且大规模生产 GMP 级 AAV 成本较高，同时仍有极低概率发生随机整合，存在插入突变风险。 慢病毒（LV）：慢病毒可将 CAR 基因稳定整合到宿主基因组，实现长期表达，且转导效率高、宿主范围广。为提高体内转导的靶向性（避免转导非 T 细胞），研究人员对慢病毒进行改造 —— 在病毒表面融合 T 细胞特异性配体（如抗 CD8 scFv、纳米抗体），实现对循环 T 细胞的精准靶向。例如，Pfeiffer 等人将 CD8-scFv 融合到尼帕病毒假型慢病毒表面，通过腹腔注射到移植人 CD34 + 细胞的 NSG 小鼠体内，成功实现 CD19-CAR-T 细胞的体内生成；Michels 等人开发的 “VivoVec” 慢病毒平台，无需预处理即可实现 CAR-T 细胞在体内的有效扩增和存活，解决了体外 CAR-T 细胞需预处理才能存活的问题。 慢病毒的主要风险在于插入突变——CAR 基因随机整合到宿主基因组可能导致原癌基因激活或抑癌基因失活，引发二次肿瘤；同时，慢病毒可能转导生殖细胞或抑制性免疫细胞（如调节性 T 细胞），导致生殖细胞基因改变或抗肿瘤效果削弱。此外，大规模生产 GMP 级慢病毒流程复杂、成本高昂，也限制了其临床应用。三、体内 CAR-T 细胞生成：技术突破与递送平台（二）纳米载体递送系统 为规避病毒载体的安全性与成本问题，非病毒纳米载体成为体内 CAR-T 递送的重要方向。这类载体具有制备简单、可规模化生产、安全性高的优势，且可通过设计实现 T 细胞靶向递送，主要包括聚合物基纳米载体和脂质基纳米载体（如脂质纳米颗粒 LNPs）。 聚合物基纳米载体：常用材料包括聚乙烯亚胺（PEI）、聚（β- 氨基酯）（PβAE）、聚乙二醇（PEG）等，可通过静电作用与带负电的 CAR 基因（DNA 或 mRNA）结合，形成稳定的纳米复合物。Moffett 等人的研究显示，PβAE 聚合物负载 CAR-mRNA 后，可高效转染原代 T 细胞，且毒性极低；Yu 等人则利用 PEG、PEI 和聚酰胺 - 胺（PAMAM）自组装形成的纳米颗粒（SNPs）包裹 CAR 质粒 DNA（pDNA），在 Jurkat 细胞（一种人 T 细胞白血病细胞系）中的转染效率达到 Lipofectamine 2000（常用转染试剂）的 10 倍，证明了聚合物纳米载体在 T 细胞基因递送中的潜力 。聚合物纳米载体的核心优势在于可通过化学修饰调整性能：例如，PEG 修饰可减少载体被免疫系统清除，延长体内循环时间；表面偶联 T 细胞特异性配体（如抗 CD3 抗体、CD5 靶向肽）可提升对循环 T 细胞的靶向性，降低对肝脏、脾脏等器官的非特异性毒性 。但部分聚合物（如高分子量 PEI）存在一定细胞毒性，且体内转导效率仍需进一步提升，是当前研究需突破的关键。 脂质基纳米载体：主要包括脂质体（Liposomes）和脂质纳米颗粒（LNPs），凭借良好的生物相容性和基因包载能力，成为体内 mRNA 递送的主流平台之一。 脂质体：由磷脂双分子层形成的闭合囊泡，可根据电荷分为阳离子、阴离子和中性脂质体，其中阳离子脂质体因能与带负电的核酸快速结合，被广泛用于 CAR 基因递送。其结构中的磷脂双分子层可模拟细胞膜成分，降低免疫原性，同时通过表面修饰（如靶向配体）实现 T 细胞精准递送。 脂质纳米颗粒（LNPs）：由阳离子可电离脂质、辅助脂质、PEG 化脂质和胆固醇组成，能高效包载 CAR-mRNA 或 pDNA。研究表明，可电离 LNPs 介导的 CAR 表达效率与电穿孔（体外 T 细胞转染常用技术）相当，但 T 细胞存活率显著更高 —— 电穿孔可能导致 T 细胞膜损伤，而 LNPs 通过内吞作用进入细胞，对细胞完整性破坏更小 。 脂质基纳米载体的临床转化潜力已得到验证：Zhou 等人设计的 LNPs 同时包裹 IL-6 shRNA（抑制 IL-6 表达以降低 CRS 风险）和 CD19 靶向 CAR-pDNA，静脉注射到急性淋巴细胞白血病（ALL）异种移植小鼠模型后，体内生成的 CAR-T 细胞展现出与传统体外 CAR-T 细胞相当的抗肿瘤效果；Smith 等人则利用 PβAE 聚合物纳米载体包裹白血病特异性 CAR-pDNA，通过反复静脉注射，在白血病、前列腺癌和乙肝病毒（HBV）诱导的肝癌小鼠模型中，均观察到体内 CAR-T 细胞介导的显著肿瘤消退。不过，脂质基纳米载体仍面临 器官靶向性不足的问题：静脉注射后，大部分 LNPs 易被肝脏中的肝细胞吞噬，导致肝脏毒性风险增加，同时降低 T 细胞转导效率。为解决这一问题，研究人员通过表面修饰实现靶向优化 —— 例如，Rurik 等人将 CD5 抗体偶联到 LNPs 表面，使载体能特异性结合 T 细胞表面的 CD5 分子，显著提升 T 细胞转染效率，同时减少肝脏蓄积。 表 1 体内 CAR-T 细胞生成递送系统对比 （三）体内 CAR-T 技术的关键挑战 尽管体内 CAR-T 细胞生成展现出巨大潜力，但仍存在三大核心挑战，需通过技术优化逐步解决： 精准靶向 T 细胞：当前递送载体难以实现 100% T 细胞靶向，可能转导调节性 T 细胞（Treg）或恶性细胞，影响治疗效果或引发安全风险。例如，若载体转导 Treg 细胞，CAR-Treg 可能抑制效应 T 细胞的抗肿瘤活性；若转导肿瘤细胞，肿瘤细胞表面表达的 CAR 可能 “遮蔽” 靶抗原，导致 CAR-T 细胞无法识别（即 “抗原掩盖”）。在一例儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中，体外 CAR-T 治疗时因单个白血病细胞被 CAR 基因转导，最终导致治疗耐药。解决方案包括：在载体表面偶联高亲和力 T 细胞特异性配体（如抗 CD3、CD8 scFv）、设计 T 细胞特异性启动子（如 CD4/CD8 启动子，仅在 T 细胞中启动 CAR 基因表达）。 CAR 表达的持久性调控：CAR 表达时间需与治疗需求匹配 —— 血液系统肿瘤可能需要长期 CAR 表达以防止复发，而实体瘤或非肿瘤疾病（如自身免疫病）可能需要短期表达以降低毒性。慢病毒载体因能稳定整合 CAR 基因，单次注射即可实现长期表达，但无法灵活调整；纳米载体（尤其是 mRNA 载体）介导的 CAR 表达为暂时性，需通过多次注射控制表达时长，但多次注射可能增加免疫原性（如载体引发的抗体反应）。未来需开发 “可控表达系统”，例如利用小分子药物调控 CAR 基因的开关，实现 “按需表达”。 毒性控制：体内 CAR-T 细胞虽可避免体外预处理相关毒性（如感染风险），但仍可能因 CAR 设计或过度激活引发 CRS、ICANS 等毒性。例如，含 CD28 共刺激域的 CAR-T 细胞比 4-1BB 基 CAR-T 细胞更易引发早期毒性。当前主流解决方案是在 CAR 中引入 “安全开关”： 自杀基因：如诱导型半胱天冬酶 9（iCas9），当出现严重毒性时，注射小分子药物（如 AP1903）可激活 iCas9，诱导 CAR-T 细胞凋亡； 清除标志物：在 CAR-T 细胞表面表达 CD20 或截短型表皮生长因子受体（tEGFR），毒性发生时注射相应抗体（如利妥昔单抗、西妥昔单抗），通过抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或补体依赖的细胞毒性（CDC）清除 CAR-T 细胞； 可逆抑制分子：如酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼（Dasatinib），可抑制 CD3ζ 和 ZAP70 的磷酸化，暂时阻断 CAR 信号，毒性缓解后停药即可恢复 CAR-T 细胞功能，避免不可逆的细胞清除 。四、超越 CAR-T：CAR-NK、CAR-M 细胞的体内工程化潜力 为突破 CAR-T 细胞在实体瘤治疗中的局限（如 TME 浸润差、毒性高），研究人员将目光转向其他免疫细胞，通过 CAR 工程化改造，开发出 CAR-NK（自然杀伤细胞）、CAR-M（巨噬细胞）等新型细胞疗法，且其体内生成技术也成为研究热点。（一）CAR-NK 细胞：低毒、现货型治疗新选择 NK 细胞是先天免疫的核心细胞，无需抗原致敏即可杀伤肿瘤细胞，且具有以下优势，使其成为 CAR 工程化的理想对象： 低毒性：NK 细胞不依赖 TCR 识别抗原，不会引发移植物抗宿主病（GvHD）；同时，NK 细胞在体内存活时间短（通常数周至数月），可减少 CRS、ICANS 等长期毒性； 现货型潜力：异基因 NK 细胞（如脐带血来源）无需基因编辑即可避免 GvHD，可批量生产为 “现货型” 产品，解决自体 CAR-T 的时效性问题； 双重杀伤机制：CAR-NK 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（识别肿瘤抗原后释放穿孔素、颗粒酶）和 “CAR 非依赖途径”（如激活受体 NKG2D 识别肿瘤细胞表面应激分子）杀伤肿瘤，降低抗原逃逸风险（图 3A、B）。1. CAR-NK 的结构优化 CAR-NK 的基础结构与 CAR-T 类似，但需加入 NK 细胞特异性信号域以增强功能：例如，在胞内域引入 NKG2D 相关信号分子（如 DAP10、DAP12），可激活 NK 细胞特有的杀伤通路，提升细胞毒性；此外，NK 细胞的体内存活时间短，可通过工程化使其表达 IL-2、IL-15 等细胞因子（如第四代 CAR-NK），延长存活并增强增殖能力。例如，Liu 等人开发的脐带血来源 CAR-NK 细胞，同时表达 CD19-CAR 和 IL-15，在白血病小鼠模型中展现出长期存活和强效抗肿瘤活性。2. CAR-NK 的体内生成进展 目前体内 CAR-NK 生成的研究仍处于早期阶段，仅 Andorko 等人报道了初步成果：他们设计了一种靶向 CD7（NK 细胞表面标志物）的慢病毒载体，包裹抗 CD20 CAR 基因，静脉注射到小鼠体内后，可特异性转导 NK 细胞，生成的 CD20-CAR-NK 细胞能有效清除 CD20 阳性肿瘤细胞。未来需进一步优化载体的 NK 细胞靶向性，同时提升转导效率，以满足临床需求。（二）CAR-M 细胞：实体瘤 TME 的 “破局者” 巨噬细胞具有强大的吞噬能力和 TME 重塑能力，在实体瘤治疗中展现出独特优势： 强效 TME 浸润：巨噬细胞可主动迁移至实体瘤内部，且能耐受 TME 中的免疫抑制因子（如 IL-10、TGF-β），不易发生细胞耗竭 ； TME 重塑功能：CAR-M 细胞可通过吞噬肿瘤细胞、分泌促炎细胞因子（如 TNF-α、IL-1β），将 “免疫抑制型 TME”（以 M2 型巨噬细胞为主）转化为 “免疫激活型 TME”（以 M1 型巨噬细胞为主），同时激活适应性免疫（如 T 细胞）； 双重杀伤途径：与 CAR-NK 类似，CAR-M 细胞可通过 “CAR 依赖途径”（抗原特异性吞噬）和 “CAR 非依赖途径”（如 Fc 受体介导的 ADCC、ROS/iNOS 介导的细胞毒性）杀伤肿瘤（图 3C、D）。1.CAR-M 的临床前证据 Klichinsky 等人开发的 HER2 靶向 CAR-M 细胞，在乳腺癌、卵巢癌小鼠模型中，不仅能直接吞噬 HER2 阳性肿瘤细胞，还能分泌 IL-12 等细胞因子，招募并激活 T 细胞，形成 “CAR-M-T 细胞协同抗肿瘤效应”；此外，CAR-M 细胞的毒性极低，临床前研究中仅观察到轻微发热、体重下降，未出现 CRS 或 ICANS 。2.CAR-M 的体内生成探索 目前 CAR-M 的体内生成研究集中在纳米载体递送：由于巨噬细胞具有较强的吞噬能力，可通过 “被动靶向”（如利用纳米载体的尺寸效应，被巨噬细胞主动吞噬）实现 CAR 基因递送。例如，研究人员利用 PEG 修饰的脂质纳米颗粒包裹 CAR-mRNA，静脉注射后可被脾脏、肿瘤中的巨噬细胞吞噬，实现 CAR-M 细胞的体内生成 。未来需进一步提升载体对肿瘤部位巨噬细胞的靶向性，减少对正常组织（如肝脏、脾脏）巨噬细胞的影响。 图 3 CAR-NK 与 CAR-M 细胞的杀伤机制对比A：CAR-NK 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，释放穿孔素、颗粒酶 B 杀伤肿瘤细胞，同时分泌促炎细胞因子激活 T 细胞；B：CAR-NK 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过激活受体（如 NKG2D）、FasL/Fas 通路、CD16 介导的 ADCC 杀伤肿瘤；C：CAR-M 细胞的 CAR 依赖杀伤途径：CAR 识别肿瘤抗原后，通过特异性吞噬清除肿瘤细胞，分泌细胞因子激活 T 细胞；D：CAR-M 细胞的 CAR 非依赖杀伤途径：通过非特异性吞噬、MHC-I 介导的抗原提呈、ROS/iNOS 介导的毒性杀伤肿瘤。（三）CAR-Treg 细胞：自身免疫病治疗的新方向 调节性 T 细胞（Treg）是维持免疫耐受的关键细胞，通过 CAR 工程化改造后（即 CAR-Treg），可特异性抑制针对自身抗原的免疫反应，用于治疗自身免疫病（如类风湿关节炎、1 型糖尿病）。与 CAR-T 细胞不同，CAR-Treg 细胞通过分泌 IL-10、TGF-β 等抑制性细胞因子发挥作用，而非直接杀伤细胞 。 当前 CAR-Treg 细胞的研究以体外制造为主，但面临 “表型不稳定性” 问题 —— 体外扩增过程中，Treg 细胞可能丢失抑制功能，转化为促炎效应 T 细胞，反而加剧炎症。体内 CAR-Treg 生成技术可能解决这一问题：直接在体内对 Treg 细胞进行工程化，避免体外培养的 “人工环境干扰”，维持其抑制表型。例如，Fransson 等人通过体外制造靶向髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的 CAR-Treg 细胞，成功缓解了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，多发性硬化症动物模型）的症状 ；若能实现体内生成，将大幅简化治疗流程，提升临床转化潜力。不过，目前体内 CAR-Treg 生成尚未见报道，需突破 Treg 细胞特异性递送、CAR 表达调控等技术瓶颈。五、总结与未来展望（一）技术总结：从体外到体内的核心变革 CAR-T 细胞治疗历经数十年发展，已从早期的体外自体制造，逐步向体内通用型技术演进。体外制造虽在血液系统肿瘤中疗效显著，但受限于高成本、长周期、高毒性三大瓶颈；体内生成技术通过病毒或纳米载体直接在患者体内完成 T 细胞工程化，可同时解决这三大问题 —— 无需体外操作降低成本、单次注射缩短治疗周期、避免体外扩增减少细胞耗竭与毒性。此外，CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的兴起，进一步拓展了 CAR 技术的应用边界：CAR-NK 以低毒、现货型优势补充血液系统肿瘤治疗，CAR-M 则凭借 TME 重塑能力突破实体瘤治疗瓶颈，而 CAR-Treg 为自身免疫病提供了精准调控方案 。 从技术成熟度来看，体外 CAR-T 仍是当前临床主流，但体内技术已展现出不可替代的潜力：病毒载体（如慢病毒、AAV）凭借高转导效率成为体内递送的 “基准平台”，纳米载体（如 LNPs、聚合物颗粒）则以安全性和规模化优势成为未来方向。不过，无论是哪种技术路径，精准靶向（避免非靶细胞转导）、可控表达（匹配治疗需求调节 CAR 时长）、毒性控制（降低 CRS/ICANS 风险）仍是需持续突破的核心难题。（二）未来研究方向：从技术优化到临床转化1.载体技术：提升靶向性与安全性 T 细胞特异性递送：当前载体对 T 细胞的靶向效率仍不足 50%，需通过 “双靶向策略” 进一步优化 —— 例如，在慢病毒表面同时融合 CD3 和 CD8 scFv，或在 LNPs 表面偶联 CD5 抗体与 T 细胞特异性肽，实现 “双重识别” 以提升靶向精度；同时，可利用 T 细胞特异性启动子（如 IL-2 启动子），确保 CAR 基因仅在 T 细胞中表达，即使载体转导非靶细胞，也不会产生功能性 CAR 。 非整合型载体开发：为规避慢病毒的插入突变风险，需推动非整合型病毒载体（如无整合慢病毒、高容量腺病毒）和非病毒载体（如 mRNA-LNPs、转座子纳米颗粒）的研发。例如，mRNA-LNPs 介导的 CAR 表达为暂时性，且无基因组整合风险，已在小鼠模型中实现安全的体内 CAR-T 生成，未来需解决 mRNA 易降解、需多次注射的问题。2.CAR 设计：适配体内生成特性 体内生成的 CAR-T 细胞无需体外扩增，需通过 CAR 结构优化增强其体内存活与功能： 代谢适配：体外 CAR-T 细胞依赖有氧糖酵解快速扩增，而体内 T 细胞更依赖脂肪酸代谢维持长期存活，因此可在 CAR 胞内域加入调控代谢的信号分子（如 AMPK 激活域），促进体内 CAR-T 细胞向记忆表型分化 ； TME 抗性：针对实体瘤，可设计 “装甲型 CAR”—— 例如，在 CAR 中加入 PD-L1 抗体片段或 TGF-β 受体阻断域，使体内生成的 CAR-T 细胞能抵抗 TME 的免疫抑制； 多靶点识别：为应对实体瘤抗原异质性，可开发体内双价 CAR 生成技术 —— 例如，利用双启动子载体同时递送两种 scFv，使单个 T 细胞表达能识别 HER2 和 IL13Rα2 的双价 CAR。3.联合治疗：拓展体内 CAR 技术的应用场景 与免疫检查点抑制剂联用：体内生成的 CAR-T 细胞虽可通过 PD-1/CD28 开关受体抵抗 TME 抑制，但联合 PD-1 抗体仍可进一步增强疗效。例如，在黑色素瘤小鼠模型中，体内 CD19-CAR-T 细胞联合 PD-1 抑制剂，可使肿瘤完全消退率从 30% 提升至 60%； 与化疗/放疗联用：低剂量化疗（如环磷酰胺）可清除体内抑制性 Treg 细胞，为体内生成的 CAR-T 细胞提供 “存活空间”。研究显示，在淋巴瘤小鼠模型中，低剂量环磷酰胺预处理可使体内 CAR-T 细胞的扩增效率提升 2 倍 ； 跨疾病应用：除肿瘤外，体内 CAR 技术可拓展至非肿瘤领域。例如，Rurik 等人利用 CD5 靶向 LNPs 递送 FAP-CAR mRNA，在小鼠心脏纤维化模型中，体内生成的 FAP-CAR-T 细胞可特异性清除活化成纤维细胞，恢复心脏功能 ；未来还可探索用于治疗 HIV（靶向 CD4-CAR）、自身免疫病（靶向自身抗原的 CAR-Treg）等。4.临床转化：建立标准化体系 质量控制标准：体内 CAR 载体需建立严格的质量控制指标，包括载体纯度（如病毒载体的复制 competent 病毒检测、纳米载体的粒径均一性）、转导效率（体外 T 细胞转导效率需≥70%）、安全性（如内毒素含量、细胞毒性）； 剂量探索：需通过临床 I 期试验确定载体的安全剂量范围 —— 例如，慢病毒载体的剂量过高可能引发炎症反应，过低则转导效率不足，需在安全性与疗效间找到平衡； 生物标志物监测：开发非侵入性生物标志物（如外周血中 CAR 基因的 ctDNA、细胞因子水平），实时监测体内 CAR-T 细胞的扩增、存活与毒性，为临床剂量调整提供依据。（三）结语 从 1989 年 Gross 等人首次提出 CAR-T 概念，到 2025 年体内 CAR 技术进入临床前验证阶段，CAR 细胞治疗已实现从 “实验室” 到 “临床” 的跨越，但其发展仍处于 “上半场”。体外制造技术的优化（如自动化 GMP 生产）与体内生成技术的突破（如靶向纳米载体）将并行推进，而 CAR-NK、CAR-M 等新型细胞疗法的加入，将构建起 “覆盖血液瘤 - 实体瘤 - 非肿瘤疾病”的 CAR治疗体系。 未来 5-10 年，随着载体靶向性、CAR 设计与联合治疗策略的持续优化，体内 CAR 技术有望实现三大目标：一是将治疗成本降至 10 万美元以下，使更多患者可及；二是实现实体瘤的 CAR 治疗突破，填补当前临床空白；三是拓展至自身免疫病、纤维化等非肿瘤领域，成为 “泛疾病” 的免疫治疗平台。当然，这一过程仍需克服技术、临床与伦理层面的多重挑战，但可以肯定的是，从“体外定制”到“体内生成” 的变革，将重新定义 CAR 细胞治疗的未来。 识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。