EIF4G1

引言 信使RNA (mRNA) 作为一类新兴药物，因其优异的可编程性和安全性被广泛应用于疫苗，肿瘤免疫疗法，基因治疗和蛋白质替代疗法等重要研究领域。传统mRNA药物往往具有较短的半衰期和有限的蛋白生产能力，这限制了mRNA药物在具有更高治疗阈值疗法（如蛋白替代疗法）中的有效性。王潇团队近年致力于发展下一代mRNA设计及优化方法，课题组过去曾通过结合寡聚核糖核酸化学合成和mRNA酶合成方法，可控地在线性mRNA 3′端引入化学和拓扑学修饰以提高其功能稳定性，而翻译效率则是mRNA药物有效性的另一维度。 翻译起始是mRNA指导蛋白合成的限速步骤，在这一过程中，真核翻译起始因子（eIFs）通过与mRNA的N7-甲基-鸟嘌呤 (m7G) 帽结构相互作用进一步招募细胞质中的核糖体等内源蛋白翻译机器，从而开启mRNA翻译。大量此前研究表明，mRNA帽以及5′非翻译区域的化学修饰对于mRNA翻译及稳定性具有重要调控作用并展现出了改善治疗性mRNA药物性质的巨大潜力。尽管如此，现有基于RNA聚合酶的mRNA合成技术由于受到RNA合成酶结构兼容性的限制，难以引入更为多样化的mRNA化学或拓扑结构的修饰。与此同时，具有外切酶抗性的环状RNA (circRNA) 作为更稳定的治疗性蛋白表达载体近年来也收到了广泛关注。然而，环状RNA依赖于由内部核糖体进入位点 (IRES) 驱动的蛋白翻译效率远低于经典mRNA帽依赖的翻译，导致环状RNA的蛋白表达能力较低。因此，通过环状RNA拓扑结构改造引入帽结构有望在保持环状RNA稳定性的同时提高其翻译效率。 2024年9月23日，美国麻省理工学院化学系/Broad研究所王潇课题组在Nature Biotechnology发表了题为Chemical and topological design of multicapped mRNA and capped circular mRNA to augment translation 的研究论文。研究人员通过基于连接的mRNA-寡聚核苷酸组装策略（RNA LEGO），利用化学酶法实现了汇聚式mRNA模块化组装，在更大的化学空间上探索了mRNA 5′和3′以及环状RNA化学修饰和拓扑结构改造，大幅提高了mRNA在细胞与小鼠体内的蛋白生产能力，为mRNA翻译起始机制及相关化学修饰设计提供了新见解。 图1: LEGO，一种位点特异性对mRNA/circRNA进行化学/拓扑修饰的策略（Credit: Nature Biotechnology） 为了实现对mRNA及环状RNA的化学修饰及拓扑结构改造，王潇团队提出基于多种连接酶的mRNA-寡聚核苷酸组装策略（RNA LEGO），利用化学酶法实现了汇聚式mRNA模块化组装。首先，通过化学加帽法及反向高效液相色谱，研究者利用RNA LEGO策略合成并筛选了mRNA帽以及5′非翻译区域的多种天然或非天然化学修饰，并通过组合多种单一有效的化学修饰成功将荧光素酶报告mRNA的蛋白表达提高了近10倍。同时，基于事实上eIF在结合5′帽后，翻译起始复合体的组装完全依赖于蛋白-蛋白相互作用，课题组认为在5′非翻译区域引入非天然链接结构可能能被翻译起始机制兼容；与此同时，受课题组先前多尾RNA工作的启发，课题组推论在5′端引入多个帽结构以增加mRNA-eIF的结合位点可能加速翻译起始复合体的形成。基于这些假设，研究者结合化学加帽反应和点击化学组装策略构建了含有双帽结构的枝状寡聚核苷酸，并通过T4连接酶引入mRNA的5′末端，形成多帽mRNA，并发现其可以提高mRNA的蛋白表达。通过对多帽mRNA拓扑结构的改造优化，研究者确定了最佳的主链及支链长度，从而实现mRNA蛋白表达水平的最大化。最终，结合mRNA 5′ 化学修饰、双帽拓扑结构改造以及该课题组前期发展的mRNA 3′ 化学修饰策略，研究者将荧光素酶报告mRNA的峰值蛋白表达水平提高了近20倍。 图2: 多帽mRNA的设计思路（Credit: Nature Biotechnology） 为了研究优化后帽及邻近的化学/拓扑修饰增强翻译的机制，作者首先应用连接有含帽的寡多聚核糖核酸磁珠及同位素标记定量蛋白沉降质谱对可能的作用蛋白进行了全局表征。作者观察到包括帽结合蛋白eIF4E1（13倍）及其他翻译相关蛋白如eIF4G1（42倍），eIF4G3（28倍），eIF4A（6倍）的显著富集。除此之外，化学修饰只增强了翻译相关帽结合蛋白eIF4E1的富集，而对其余翻译不相关的帽结合蛋白如NCBP1的富集却下降了33倍，显示化学修饰对翻译相关机制的选择性。通过电泳迁移率检测实验，作者在体外用提纯蛋白确认了优化后的化学修饰或多帽结构能增强eIF4E1的结合，并且更显著的是，化学修饰也提高了帽-eIF4E-eIF4G共聚物的总体稳定性。除了结合翻译起始蛋白，帽结构同时也具有保护mRNA从5′端被外切酶降解的作用，这一过程被脱帽蛋白hDcp2调控。在这一方面，作者发现除了对帽本身的修饰，对5′非翻译区的化学修饰显著增强了mRNA对脱帽酶的抗性，最优修饰的mRNA在体外脱帽酶6小时的作用下仅被脱帽30%，而天然的帽0/1结构在同样条件下15分钟内就被完全脱帽。最后，通过课题组自主发明的空间转录/翻译组技术STARmap和RIBOmap，作者发现双帽mRNA在细胞内显著增加了核糖体结合的mRNA比例，验证了化学修饰及双帽结构双帽结构通过提高mRNA与翻译起始因子eIF4E的相互作用提高翻译起始速率进而提高翻译效率。 图3: 含帽的环状RNA的设计思路（Credit: Nature Biotechnology） 接下来，利用RNA LEGO的汇聚式合成策略，作者通过结合T4 RNA连接酶和RtcB连接酶介导的连接反应构建了一种不依赖于内含子的环状RNA环化及位点特异性修饰方法，首次合成了带有枝状帽结构的环状RNA并命名为”QRNA”。结合对枝状mRNA帽结构的化学修饰，研究者证明了环状RNA利用帽依赖机制进行翻译的可行性，并在体外和体内实现了对环状RNA翻译效率的大幅提高。通过对多种具有不同拓扑结构RNA翻译的研究，研究者提出了“帽临近驱动的翻译”模型：当5′帽以及非翻译序列通过天然磷酸二酯键、非天然共价或非共价互补配对等方式与mRNA相互作用时，在mRNA蛋白编码区附近的帽结构便可以招募核糖体并以“插入(slot-in)”的模式着陆于帽结构下游或上游约20碱基的mRNA编码区内并启动蛋白翻译。这一机制的揭示标明了mRNA翻译对各种不同拓扑结构的兼容性，并为后续的mRNA药物结构设计以及可能的天然mRNA翻译调控过程提供了新的启示。 图4: 帽临近驱动翻译模型（Credit: Nature Biotechnology） 最后，研究者分别测试了该技术在mRNA疫苗和蛋白替代疗法中的治疗效果。结果表明， 相比于未修饰的mRNA，经优化的编码人促红细胞生成素(hEPO)的双帽mRNA-LNP复合物能够在小鼠体内产生总共近8倍的hEPO蛋白表达并显著提高小鼠血液中网织红细胞的比例，显示其用于蛋白质疗法的优越性。而在针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗应用中，经优化的mRNA不仅能够在注射后七天内产生抗体免疫反应，而且在加强针免疫一周后产生4倍于未修饰mRNA组的抗体滴度。通过运用空间转录/翻译组学技术对小鼠淋巴的表征显示，优化后mRNA显著提高了抗原呈递细胞的激活程度；通过流式细胞术对小鼠脾细胞的表征，优化后mRNA疫苗显著增加了T细胞响应，这些结果表明了化学修饰和拓扑结构改造在提高mRNA治疗应用方面的潜力。 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41587-024-02393-y 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

PolyA 尾缩短是细胞 mRNA 降解的关键步骤，并且 PolyA 尾对于帽依赖性翻译是不可或缺的。在最为广泛的帽依赖性翻译机制模型中，真核生物翻译起始复合物由识别帽结构的 eIF4E、解开 5'UTR 二级结构的 eIF4A 以及充当支架蛋白的 eIF4G 组装完成。PABPC 可识别结合 PolyA 尾巴，并且同 eIF4G 发生相互作用，使得 mRNA 首尾互连，形成闭环。PABPC 具有双重作用，一方面与翻译起始复合物结合启动翻译，另外一方面遮盖 PolyA 尾部。以防止脱腺苷化反应，延长 mRNA 半衰期。鉴于内源性去腺苷化机制依赖于 3' →5' 核酸外切酶复合物，并且去腺苷化是细胞内 mRNA 衰变的限速步骤，那么，我们对 PolyA 尾巴序列加以修饰，使其变得耐受核酸酶，保证PolyA 序列完整性和功能，理论上就可提升 mRNA 半衰期，从而增加其蛋白表量。   mocRNA—酶法合成与有机合成的完美结合2022 年，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所王潇团队曾经在 ACS Chemical Biology 发表文章：Chemically Modified mocRNAs for Highly Efficient Protein Expression in Mammalian Cells，他们构建了一种新颖的 mocRNA，将化学合成的修饰寡核苷酸与 IVT 合成的 mRNA 桥接起来，以保护 PolyA 尾巴免于降解，同时，又不影响翻译能力。令人兴奋的是，3' 末端含有硫代磷酸酯 (PS) mocRNA 在 HeLa 细胞中的蛋白质产量增加 2-4 倍，在原代大鼠皮质神经元培养物中的蛋白表达量增加 10 倍。在 mocRNA 中，修饰寡核苷酸包括以下结构：在寡核苷酸 5'末端，存在一个 5'磷酸基团+至少 6 个 A。通过 T4 RNA 连接酶，IVT-mRNA 3'末端将会与寡合酸 5'磷酸基团形成磷酸二酯键。为防止寡核苷酸自连，在其 3'末端存在一个阻断保护基团：ddC（2'-3'-双脱氧胞苷）或者 InvdT（反向 2'-脱氧胸苷）。中间部分是由修饰核苷酸组成的可变序列，包括硫代磷酸酯(PS) 连接或者 A-G 替换、脱氧腺苷以及源自端粒的 DNA 四链体 。王潇团队开发的 mocRNA，是一种模块化的合成策略，可以同其他类型的 RNA 修饰联合使用，例如，结合 PABP 的寡核苷酸、耐水解 7-甲基鸟苷帽、修饰的 5' UTR 区域及 mRNA 体内其他类型的修饰核苷酸。mocRNA 将 mRNA 的酶法合成与有机合成整合在一起，能够对 mRNA 进行非常精准的多样化学修饰，极大地改善 mRNA 的稳定性，提升蛋白表达量。   多尾 mRNA 拥有蛋白表达超能力2024 年 3 月 22 号，王潇团队在 Nature Biotechnology 发表重磅文章：Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA（点击文末阅读原文可获取PDF），他们设计创建了具有多个 PoyA 分支的多尾 mRNA，使得 polyA 尾巴对核酸外切酶具有更强的抵抗能力，从而增加 mRNA 的稳定性，延长蛋白表达时间，提升蛋白表达水平。多尾 mRNA 由来自 IVT 合成的 mRNA 与化学修饰的多尾寡核苷酸通过 T4 连接酶桥接而成。多尾寡核苷酸具有以下特征结构：30nt 茎区：在其 5'末端具有 5'磷酸基团，用于后续酶连；内部序列上镶嵌有多个 5-辛二炔基脱氧尿苷分支点(OU)，相互之间间隔 12nt，便于 PABPC 结合，每个分支点可与含有 5'-叠氮化物手柄的 30nt PolyA 分支尾耦合。30nt PolyA 分支尾：含有 5'-叠氮化物手柄。在 30nt 茎区和 PolyA 分支尾 5'末端均具有 2'-3'-双脱氧胞苷，用来防止自连；末端的最后 6 个碱基采用硫代磷酸酯(PS)连接，以便阻止去腺苷酸化。铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）反应中，会产生具有 1~3 个 PolyA 尾分支的多尾 mRNA，可利用 HPLC 将其分离开来。研究人员将各种不同化学修饰（PS、脱氧核苷及 2'-O-甲氧基乙基修饰（2MOE））和拓扑结构(1~3 个 PolyA 尾分支数量)的寡核苷酸与 IVT-Fluc mRNA 连接，转染 HeLa 细胞，在所有测试的构建体中，构建体 8 表达最强荧光信号，其结构具有 3 个 PloyA 尾分支并在茎和分支尾 PloyA 上协同掺入 2MOE 和 PS 修饰。采用眼球后静脉注射单剂量 40 μg/kg 的编码分泌型纳米荧光素酶 (NLuc) 的多尾 NLuc mRNA-LNP，从 6 小时到第 2 天，多尾 mRNA 要比未连接的 Mock lig mRNA 对照组发光信号高 3.3-5.0 倍，比无分支的 mod mRNA 高 1.6-2.2 倍。而且，在稍后的时间点检测到显着更高的发光信号，多尾 mRNA 的表达比无分支的 mod mRNA 高 7.5 倍，比未连接的 Mock lig mRNA 高 47 倍。多尾 mRNA 以最小剂量在小鼠肝脏中对治疗家族性高胆固醇血症的临床相关基因 Pcsk9 和 Angptl3 进行高效多重基因组编辑，即使用 0.7mg/kg 剂量的多尾 Cas9 mRNA 在 Pcsk9 和 Angptl3 基因上分别实现了 46%和 54%的编辑效率，相比较而言，未连接的 Mock lig mRNA 的编辑效率分别仅为 14% 和 6%。Pcsk9 和 Angptl3 血清蛋白水平的下降最终转变为血清中总胆固醇和甘油三脂的下降。   小结一句话，王潇团队对 PolyA 尾实施化学修饰，改变其拓扑结构，目的是避免mRNA尾巴去腺苷酸化，从而增强 mRNA 稳定性，延长蛋白表达时间，提升蛋白表达水平。这种构想非常新颖大胆，但是，未来要想将其转化应用于mRNA疫苗或者药物中，还需要进一步优化学合成工艺和下游纯化工艺，以确保多尾 mRNA 的关键质量属性和批间稳定性。PS：相关阅读这种多尾 mRNA 的设计，让我想到日本人将一些的短的 dsRNA 连接到 mRNA 上，就像是为 mRNA 序列镶嵌了一排“牙齿”，dsRNA“牙齿”能够激活细胞内的天然免疫受体，充当佐剂，增强 mRNA 疫苗免疫效果。详情见往期内容：PNAS|mRNA序列嵌合dsRNA“牙齿”,增强免疫原性。真核生物mRNA翻译起始过程，详情见往期内容：改变5'UTR结构，控制翻译效率我们曾介绍过，一个非常有意思的发现，在巨噬细胞中，转染 24h 时，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列平均延长 20A，能够增加至 200A。到转染 72h 时，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列又重新回到初始的 100A 左右。详情见往期内容：首次发现新冠mRNA疫苗体内聚腺苷酸化，增长PolyA尾巴识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024年1月4日，西湖大学解明岐团队、浙江大学邵佳伟团队和之江实验室王慧团队在Cell Research杂志上联合发表了题为Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells的最新研究成果，报导了一套新型基因表达控制系统，全面实现各种基因疗法的智能化精准调控。通过对人体细胞中蛋白质翻译起始的“mRNA首尾环化过程”进行工程化改造，该系统不仅能够接收不同的外源信号来远程、高效调控多种治疗蛋白药物的表达和生产，从而实现安全、可控的药物递送，还突破了胞质内肿瘤标记物的识别瓶颈，在探测到肿瘤组织中特异性标记物后，可自主识别并彻底清除癌细胞。该调控策略对未来基因治疗在临床中的安全性、可控型和精准化应用具有重要意义。精准控制基因表达对于实现高效、安全的基因和细胞治疗至关重要。目前，合成生物学基因开关大多基于转录调控系统，不仅信号感知和决策速率慢，而且在应对位于细胞质内的疾病标记物时，表现的束手无策。虽然一直以来翻译调控系统有潜力解决这些弊端，但目前已报导的系统因调控效率低，仅在细胞层次上表现出一定的潜力，很难真正应用到体内的疾病治疗。本工作巧妙地打造了新型的基因环路，将mRNA自身的多聚腺苷酸尾(poly-A)区域替换成人工合成的“特异性结合域”，利用“首尾环化”机制实现目标基因的精准、高效和特异性调控，最终突破了现有翻译系统效率低的瓶颈，成功将转录后调控策略引入基因疗法的赛道。经典真核生物翻译起始过程由多种翻译起始因子(initiation factor)eIFs和多聚腺苷酸结合蛋白(PABP) 协同完成。其中eIF4E在翻译起始前，结合到成熟mRNA的5’帽端（5’UTR），并招募中心支架蛋白eIF4G，而PABP蛋白则通过同时结合eIF4G和mRNA 3’ 非翻译区（3’UTR）的 poly-A，使mRNA的5’UTR和3’UTR 相结合来形成环状的“首尾相连”结构，最终招募43S前翻译起始复合物而促进蛋白质的生物合成。由此可见mRNA的首尾环化在翻译起始过程中发挥重要作用。哺乳动物细胞中的翻译起始利用此环化机理，研究人员开发了“可控环化“的翻译调控系统。该系统的基础框架为定制化mRNA和人工翻译起始因子(synthetic translation initiation factor, STIF)。打造定制化mRNA的关键步骤是将原mRNA的poly-A切除，同时在3’UTR区域引入特异性结合STIF因子的核酸适配体序列，从而形成“人工定制化尾巴（poly-A surrogate）”。STIF由RNA结合蛋白MCP/L7Ae和可结合5’UTR的轮状病毒来源的NSP3蛋白相融合，一端结合到”尾部“的核酸适配体区，另一端直接招募eIF4G及相关的翻译起始复合物，最终促进定制化mRNA“成环”来起始目标基因的翻译（图1）。该设计彻底解决了长期存在的翻译表达调控效率低的难题，有效提高基因调控系统在体外和体内工作效率，使其有望应用于未来可控型基因治疗的临床应用中。图1. 由工程化poly(A)替代物介导的翻译调控。在此翻译控制系统的基础上，研究人员进一步构建了拆分型翻译起始因子，将不同的二聚或三聚蛋白对分别与RNA结合蛋白和NSP3融合，赋予了翻译调控系统响应光照（红光、蓝光），小分子(Grazoprevir，Danoprevir，脱落酸，赤霉酸，雷帕霉素)，或者细胞内特定蛋白质靶标和信号的能力（图2）。图2. 使用多部分STIF设计框架定制响应性基因表达。其中响应Grazoprevir的翻译调控基因开关在调控基因治疗方面表现突出。该基因开关可以适配现有各种基因治疗载体，包括DNA、体外转录RNA以及AAV表达系统。以糖尿病的基因治疗为例，通过搭载该基因开关，口服Grazoprevir便可以调控上述不同治疗载体在体内进行糖尿病治疗，实现疾病治疗的智能化。而Grazoprevir作为FDA批准的小分子药物将进一步有助此基因开关在临床上的应用开发（图3）。图3. Grazoprevir开关在哺乳动物细胞和基因治疗应用中的翻译调控。翻译调控系统的重要优势在于能够识别转录系统无法企及的细胞质内的生物元件(图4)。研究人员进一步挖掘此优势，通过将NSP3和RNA结合蛋白分别与蛋白标记物的特异性纳米抗体相连，得到了功能强大的蛋白质传感器。该感受器具有独特的空间感知优势，可以感知定位于不同细胞质的蛋白靶标。而基于转录起始的蛋白感受器只能感应存在于细胞核中的信号（图4）。图4. 识别细胞内靶蛋白的基因编码传感器该蛋白质传感器成功弥补了现有基因线路无法感知只存在于细胞质里的肿瘤异常蛋白的技术空白（如一系列癌症特异性的融合蛋白）。将相关基因环路原位导入小鼠皮下荷瘤模型中后，其能自主探测到肿瘤胞质内的特异性标记物，通过形成关键性的“首尾相连”结构，启动凋亡基因Bax的表达，来最终实现异常组织的自我清除（图5）。图5. 靶标特异性蛋白质传感器的工程设计研究人员进一步将该系统与其它类型的基因传感器相结合，通过多输入的“生物计算”系统来精准化识别更加复杂病理环境。最终可为多种复杂疾病定制出诊断、治疗、预防一体化的智能化基因疗法（图6）。图6. 治疗性生物计算系统的设计总而言之，该研究通过工程化改造“翻译成环”过程，开发了新的基因调控机制，丰富了合成生物学方面的细胞工程策略（工具箱）。在应用方面，该策略极大的提升了翻译调控系统应用于基因治疗的潜力，克服了当前基因治疗策略不可控的安全隐患，同时也可将治疗目标扩展到需要实时监控和动态干预的疾病中，而不仅仅是局限于需要长期无间断干预的疾病治疗。另外，本研究开发的蛋白传感器首次成功赋予mRNA基因治疗手段响应蛋白信号的功能。该功能将推动癌症、微生物感染等多种复杂疾病的精准、智能化疗法的临床开发。参考资料[1]Shao J, Li S, Qiu X, Jiang J, Zhang L, Wang P, Si Y, Wu Y, He M, Xiong Q, Zhao L, Li Y, Fan Y, Viviani M, Fu Y, Wu C, Gao T, Zhu L, Fussenegger M, Wang H, Xie M. Engineered poly(A)-surrogates for translational regulation and therapeutic biocomputation in mammalian cells. Cell Res. 2024 Jan;34(1):31-46. doi: 10.1038/s41422-023-00896-y.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。