PSMD1

摘要：疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病负担方面发挥着重要作用。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限的资源下迅速设计和生产出安全有效的疫苗。在这里，我们关注从传统的预防性疫苗到针对慢性疾病和癌症的治疗性疫苗的广泛领域的疫苗开发，提供了八种不同疫苗形式（减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗、多肽疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗）以及针对五种实体瘤（肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肝癌和胃癌）、三种传染病（人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒引起的疾病）和三种常见慢性疾病（高血压、糖尿病和血脂异常）的治疗性疫苗的最新进展的全面概述。我们旨在提供有关疫苗技术、平台、应用和潜在下一代预防性和治疗性疫苗技术的新的见解，为未来疫苗设计铺平道路。 1.引言 疫苗接种是保护易感人群和控制传染病最经济有效的手段。因此，疫苗被认为是20世纪十大公共卫生成就之一。疫苗的使用使人类能够在全世界范围内根除天花，消除大多数国家的脊髓灰质炎，并控制白喉、百日咳、破伤风、腮腺炎、麻疹、风疹、流感嗜血杆菌B型等传染病，在世界部分地区显著降低了发病率和死亡率。然而，由SARS-CoV-2引起的当前COVID-19大流行已导致超过5亿确诊病例和超过600万人死亡。新出现的传染病和疫情对疫苗开发提出了新的挑战，这要求在有限资源下迅速开发安全有效的疫苗。此外，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）和Epstein-Barr病毒（EBV）在内的几种由传染性病原体引起的严重疾病尚未开发出疫苗，需要新的疫苗开发策略。总的来说，疫苗使人们能够过上更健康、更长寿的生活。然而，随着预期寿命的增加，非传染性疾病（NCDs）的负担，如癌症、自身免疫疾病、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病等，已经增加。NCDs，也称为慢性疾病，是由遗传疾病以及生理、环境和生活方式因素的组合引起的，并且可以持续很长时间。根据世界卫生组织报告，每年有4100万人死于NCDs，占全球死亡人数的71%。这种疾病负担的转变加剧了治疗NCDs的疗法的迫切需求。传统的预防性疫苗通过向健康个体接种抗原来预防疾病，从而建立特异性免疫，这主要发生在传染病上。治疗性疫苗用作暴露后治疗，以增强免疫系统对抗诸如慢性感染、癌前病变或癌症等先前存在的疾病。治疗性疫苗旨在调节人体免疫系统，并诱导细胞介导的免疫反应，以针对与NCDs相关的细胞或分子，而不是病原体或病原体感染的细胞。治疗性疫苗与预防性疫苗在一些重要方面有所不同。由于预防性疫苗通常给予健康人，这些人对不良事件的容忍度很低。相比之下，治疗性疫苗通常是暴露后治疗，并且患者高度耐受。成熟的传统疫苗和快速增长的新型疫苗技术促进了全球预防性和治疗性疫苗的开发。近年来，免疫学、分子生物学和基因组学的进步导致了更有效的疫苗成功。mRNA疫苗（Comirnaty、Spikevax、AWcorna）和病毒载体疫苗（Convidecia、AZD1222、Ad26.COV2.S）针对COVID-19大流行，是有史以来开发最快的疫苗。肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗（Prevnar13、Prevnar 20）基于蛋白结合疫苗技术。人乳头瘤病毒（HPV）疫苗（Gardasil、Gardasil 9、Cervarix、Cecolin和Wozehui），基于基因工程技术设计，通过表达病毒样颗粒（VLP）预防与HPV相关的癌症。脑膜炎球菌B型疫苗（Trumenba、Bexsero）代表了从基因组到疫苗的“反向疫苗学”策略。最后，新型佐剂重组带状疱疹疫苗，Shingrix，扩大了免疫功能低下人群的免疫力。疫苗的不断发展提高了我们对免疫学和免疫基础的理解，针对NCDs的疫苗成为研究的新“热点”。目前，有前列腺癌疫苗（Provenge）、膀胱癌疫苗（TheraCys）、结肠癌疫苗（OncoVAX）、黑色素瘤疫苗（M-VAX和Melacine）、肾细胞癌疫苗（Oncophage）、肺癌疫苗（Racotumomab和CIMAvaxEGF）等。此外，治疗性疫苗在高血压、慢性乙型肝炎等疾病领域也取得了巨大进展。本综述旨在提供我们对最新疫苗技术、平台、应用和潜在下一代疫苗技术的当前进展和理解的概述。本综述将讨论预防性疫苗和治疗性疫苗。根据疫苗的成分，预防性疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、多糖和多糖结合疫苗、重组亚单位疫苗、多肽疫苗、DNA和mRNA疫苗。此外，根据疾病分类，治疗性疫苗可分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性疾病的疫苗。我们相信，本综述将为疫苗技术和开发提供见解。 2.预防性疫苗开发的进展 2.1.减毒活疫苗 减毒活疫苗是通过保留抗原性但通过化学或其他方法遗传工程改造或减毒（减弱）的有机体创建的。通常，这些疫苗能够诱导具有长期持久性的体液和细胞免疫反应；然而，仍然存在毒力逆转的风险，这使得疫苗不适合对抗高度致病性变体。此外，减毒疫苗的有效期较短，热稳定性差，对储存和运输有严格的要求；这在大流行情况下会导致响应缓慢。由于减毒疫苗可能恢复到有毒形式，它们也可能在免疫功能低下的人中引起严重疾病。尽管存在这些问题，并且因为好处大于风险，减毒活疫苗仍然是疫苗开发中一个宝贵的平台。目前许可的减毒疫苗列表包括天花（牛痘）（ACAM2000）、麻疹、腮腺炎和风疹病毒（M-M-RII）、结核病（卡介苗（BCG））、霍乱（Vaxchora）、流感（FluMist）、登革热（Dengvaxia；四价）、轮状病毒（Rotarix）、水痘病毒、伤寒（Vivotif）、黄热病（YF-Vax）等等（表1）。 表1 中国目前许可的疫苗类型 根据世界卫生组织发布的一份文件（https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines），有两种减毒活COVID-19疫苗正在进行临床试验：由Codaenixin与印度血清研究所合作开发的COVI-VAC，以及由Meissa Vaccines，Inc.开发的MV-014-212。正在进行研究以提高减毒活疫苗的安全性并进一步减少其毒力；这通过增加复制保真度、通过密码子去优化以及通过病毒基因组的工程改造进行了测试。Vignuzzi等人试图利用通过增加复制保真度限制病毒种群多样性的观察，这可以显著降低组织嗜性和病毒致病性。结果表明，在动物感染模型中，具有减少遗传多样性的脊髓灰质炎病毒变种激发了保护性免疫反应。这种限制病毒准种群多样性为RNA病毒的稳定减毒疫苗工程提供了一种新方法。密码子对去优化（CPD）是另一种有效的病毒减毒策略，它利用次优密码子对来减毒重编码病毒。Groenke等人通过改变同步密码子的位置，在重编码基因组中增加了次优密码子对和CpG二核苷酸的数量。他们在流感A病毒上的研究显示，次优密码子对引起了减毒，而CpG二核苷酸比例的增加没有效果。此外，他们表明次优密码子对可以降低去优化密码子对mRNA的稳定性和翻译效率。因此，蛋白质产量的减少直接导致病毒减毒。最近，Trimpert等人构建了一个COVID-19候选减毒活疫苗，名为sCPD9，通过大规模编码SARS-CoV-2基因组（通过CPD方法修改），并在罗布罗夫斯基矮仓鼠中评估了疫苗的免疫原性和保护效果。作者表明，sCPD9的单次鼻内接种激发了针对当前四个SARS-CoV-2变体的交叉中和抗体反应：B.1.1.7（阿尔法）、B.1.351（贝塔）、B.1.1.28.1（伽马）和B.1.617.2（德尔塔），保护免受类似COVID-19的疾病。一种减毒活COVID-19疫苗，COVI-VAC，通过使用同义次优密码子对编码病毒刺突蛋白的一部分而开发。作者发现，该疫苗在仓鼠模型中刺激了高水平的中和抗体，高度减毒的COVI-VAC在单次鼻内剂量下具有保护性。该疫苗现在正在进行III期临床试验（ISRCTN15779782）。安伯（amb）突变是使减毒活疫苗更安全、更有效的一种新策略。这种方法通过将遗传密码扩展到流感病毒基因组中，显示出在产生活体但复制无能力的病毒疫苗方面的前景。研究人员通过含有正交翻译机制的转基因细胞系扩展了流感A病毒基因组的遗传密码。这种方法在转基因细胞系中创建了早终止密码子（PTCs）——携带病毒足够具有感染力但在常规细胞中无法复制，同时在转基因细胞系中产生高繁殖力和遗传稳定的后代病毒。在小鼠、雪貂和豚鼠模型中，这种活疫苗激发了对亲本和抗原性不同的菌株的强大免疫反应。另一种有前景的基因工程减毒病毒的方法是工程化病毒基因组。研究人员报告了一种脊髓灰质炎病毒2型疫苗株（nOPV2）的开发，他们在其中引入了对Sabin2基因组的50个非翻译区域的修改，以稳定减毒决定因素。在这种方法中，2C编码区域防止重组，3D聚合酶限制了病毒的适应性。这种菌株在遗传上比原始的Sabin2菌株更稳定，不太可能恢复毒力。在临床前和临床研究中，nOPV2具有免疫原性，并可能导致脊髓灰质炎病毒的完全根除。另一组合理设计了一种减毒水痘疫苗候选物，v7D，其中删除了毒力因子ORF7。该病毒在MRC-5成纤维细胞和人类PBMC（VZV传播载体）中的复制类似于野生型病毒，但在感染人类皮肤和神经细胞时严重受损。然而，v7D在体外和各种小动物中具有与vOka相当的免疫原性。最后，v7D在非人类灵长类动物中耐受性良好且具有免疫原性。这种疫苗目前正在中国进行II期试验（ChiCTR1900022284）。未来减毒疫苗的开发应该专注于选择更稳定的病毒株，并采用基因编辑策略来稳定减毒因素。 2.2.灭活疫苗 灭活疫苗是从病原体（如病毒或细菌）的灭活形式中提取的，这些病原体经过培养后，通过物理或化学方法灭活，使其不再具有传染性或毒性。灭活疫苗包括全灭活疫苗或部分灭活疫苗（Toxoid疫苗）。Toxoid疫苗使用细菌产生的灭活毒素，这些毒素的毒性已被抑制，但保留了免疫原性。与减毒疫苗和基因工程疫苗相比，灭活疫苗具有开发周期短、生产工艺相对成熟、非传染性、高安全性等优点。灭活疫苗的生产成本通常较低，并且由于它们耐温，可以长时间储存。灭活疫苗通常诱导体液免疫反应，而细胞免疫较弱。通常需要多次接种才能产生保护性免疫，从而降低疫苗依从性。在灭活过程中，病毒抗原可能在结构上受损，导致抗原性降低，疫苗的免疫原性降低。有许多批准的灭活疫苗：代表性的例子包括甲型肝炎病毒疫苗（HAVRIX和VAQTA）、脊髓灰质炎病毒疫苗（IPOL）、日本脑炎病毒（IXIARO）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳（INFANRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳吸附和灭活脊髓灰质炎病毒疫苗（KINRIX）疫苗、白喉和破伤风类毒素和无细胞百日咳疫苗吸附（DAPTACEL）疫苗、流感疫苗（Fluarix四价）、人类狂犬病疫苗（RabAvert和Imovax）、肠道病毒71型（Inlive）、肾综合征出血热疫苗、蜱传脑炎疫苗（FSME-Immun），以及COVID-19疫苗（CoronaVac、WIBP-CorV、BBIBP-Cor）（表1）。在撰写本文时，全球已有11种针对COVID-19疾病的灭活疫苗获得有条件或紧急使用批准（包括中国5种疫苗）。从其他病原体研究中，已开发出一种寨卡病毒灭活疫苗候选物（PIZV）。在两次免疫剂量后，含铝佐剂的候选PIZV在CD-1和AG129小鼠中显示出高度免疫原性，从而支持PIZV候选物进入临床开发（NCT03343626）。历史上，手足口病（HFMD）的爆发主要由肠道病毒71和柯萨奇病毒A16引起。最近，柯萨奇病毒A6和A10与全球散发HFMD病例和爆发的增加有关。在一项研究中，柯萨奇病毒A6、A10和A16（CA6、CA10和CA16）在不同条件下通过甲醛或b-丙内酯（BPL）灭活，并检查了免疫效果。作者发现，CA10和CA16在BPL灭活（BI）后的免疫效果优于甲醛处理。此外，双三价治疗诱导了足够的中和抗体和细胞介导的免疫反应，表明BI-CA6、CA10和CA16作为潜在的多价疫苗候选物。灭活疫苗平台相对成熟，高度安全，可用于快速应对新出现的病原体，因此对于应对爆发至关重要。 2.3.多糖和多糖-蛋白结合疫苗 多糖疫苗是由基于碳水化合物的聚合物制成的，如来自细菌病原体的荚膜结构的壁酸或肽聚糖。一些针对细菌荚膜多糖的疫苗，例如脑膜炎球菌A/C/Y/W-135疫苗（Meningune-A/C/Y/W-135）、肺炎球菌疫苗（Pneumovax 23）和伤寒Vi多糖疫苗（Typhim Vi）（表1），已被批准用于预防侵袭性脑膜炎和伤寒疾病。然而，由于多糖不像蛋白质那样在主要组织相容性复合体（MHC）分子上被处理和展示，多糖疫苗通常显示出较弱的免疫原性、持久性差，并且只产生T细胞非依赖性免疫反应。没有T细胞的参与，这些疫苗不会引起记忆免疫反应或亲和力成熟，并且诱导的抗体——主要是IgM和IgG2——不适合激活补体，导致免疫保护无效且短暂。 多糖结合疫苗可以克服多糖疫苗的缺点。多糖结合疫苗是通过将病原体的荚膜多糖共价连接到蛋白载体上制备的，例如白喉类毒素（DT）、破伤风类毒素（TT）、改良的白喉毒素称为CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物（OMPC）或H. influenzae蛋白D HiD。蛋白载体和多糖同时出现在MHC-II上，导致T细胞受体（TCR）识别并激活Th反应。Th与B细胞之间的相互作用将改善和塑造抗体的滴度和质量以及B细胞记忆反应。共价结合方法包括标准化学交联和生物结合技术。目前批准的多糖结合疫苗通常是通过化学方法生产的，包括肺炎球菌13价、15价和20价结合疫苗（Prevnar 13, Vaxneuvance, Prevnar 20）、B型流感嗜血杆菌结合疫苗（Liquid PedvaxHIB, HIBERIX, ActHIB）和两种脑膜炎球菌结合疫苗（A, C, Y, W, MenQuadfi；A, C, Y和W-135, MENVEO, Menactra）（表1），等等。最近，Enotarpi等人报告了使用MenA，一种稳定的糖模拟结合疫苗，诱导针对A群脑膜炎奈瑟菌的保护性抗体。该团队生成了一系列未乙酰化的carbaMenA寡聚体，这些寡聚体被证明比荚膜多糖（CPS）更稳定，并表明八聚体（DP8）的随机O-乙酰化改善了抗MenA CPS抗体结合的抑制，并在与CRM197结合后诱导了抗MenA保护性小鼠抗体。这种方法可用于生成稳定的新糖结合疫苗。 生物结合技术允许多糖和载体蛋白在微生物内生物合成，通常是大肠杆菌。然后通过来自N-连接蛋白糖基化系统的特定寡糖转移酶在体内偶联蛋白质。近年来，生物合成因其经济性、快速性和效率而受到青睐。由这项技术生产的第一种多糖结合疫苗候选物是志贺氏菌多糖结合疫苗（GVXN SD133），由瑞士GlycoVaxyn AG开发，已完成I期临床试验（NCT01069471）。研究证明了GVXN SD133疫苗的良好安全性，所有测试剂量均能引起对志贺氏菌O1多糖的显著体液反应。蛋白载体也产生了功能性抗体，证明了这种新技术在保持碳水化合物和结合蛋白表位方面的优势。另一种针对志贺氏菌flexneri 2a（Flexyn2a）的生物结合疫苗在I期研究（NCT02388009）的所有时间点和所有组别中，接种后均引起了统计学上显著的S. flexneri 2a脂多糖（LPS）特异性体液反应。结果表明Flexyn2a具有令人满意的安全性，产生了强大的体液反应。这种疫苗目前正在进行IIb期（NCT02646371）。总体而言，多糖结合疫苗平台比其他平台显示出更多的潜力，并提供了解决细菌疫苗紧迫问题和挑战的解决方案，通过逐步使用生物合成技术。 2.4.重组亚单位疫苗 重组亚单位疫苗采用基因工程方法，在合适的宿主细胞中表达病原体特异性基因，如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞等。重组亚单位疫苗通常具有良好的安全性和稳定性。然而，由于外源蛋白通常显示MHC II类反应，通常不会产生强烈的T细胞反应，因此需要佐剂刺激和多次接种以增强免疫原性，这可能不适用于呼吸道黏膜免疫。目前批准的人类重组亚单位蛋白疫苗包括流感疫苗（FluBlok）、带状疱疹疫苗（Shingrix）、脑膜炎球菌B群疫苗（Trumenba、Bexsero）和COVID-19疫苗（ZF2001、Nuvaxovid）（表1）。近年来，随着反向疫苗学、结构生物学、基因组学和蛋白质组学理论和技术的进步，重组亚单位疫苗免疫原逐渐进入理性设计的新时代。反向疫苗学的过程是利用自下而上的方法从基因组到疫苗开发疫苗。2013年批准的Bexsero脑膜炎B群疫苗是反向疫苗学的经典案例。它基于对致病微生物的关键保护或毒力抗原的全基因组预测和筛选，然后开发新疫苗；这样的例子包括三个抗原：淋病奈瑟菌肝素结合抗原（NHBA）、因子H结合蛋白（fHbp）和淋病奈瑟菌粘附素A（NadA）。Shingrix是葛兰素史克开发的重组亚单位佐剂疫苗，由水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白gE重组蛋白组成，并补充了新的佐剂AS01B。对带状疱疹的整体疫苗效力在老年人（≥50岁）中为97.2%。Shingrix的成功强调了佐剂在疫苗开发中的关键作用。NVXCoV2373（Nuvaxovid）是一种含有昆虫细胞表达的S-三聚体和Matrix-M佐剂的重组蛋白疫苗。最近的临床结果显示，该疫苗对任何关注或感兴趣的变体的疫苗效力为92.6%。结核病亚单位疫苗M72/AS01E（葛兰素史克）包含两个M72重组融合免疫原（MTB32A和MTB39A）与佐剂系统AS01E结合，并为M. tuberculosis感染、HIV阴性成年人提供约50%的疾病进展到活动性肺结核的保护约3年。此外，另一种重组亚单位结核病疫苗（GamTBvac）被证明由两个结核分枝杆菌抗原融合（Ag85A和ESAT6-CFP10）组成，与明胶结合域固定在明胶上，并与由DEAE-明胶核心和CpG寡脱氧核苷酸（TLR9激动剂）组成的佐剂混合。II期的结果显示出有希望的安全性和耐受性，诱导了抗原特异性干扰素-γ反应、表达Th1细胞因子的CD4+ T细胞和IgG反应。结构生物学也有助于疫苗的理性设计。RSV表面融合（F）蛋白存在于两种构象中：前融合（pre-F）和后融合（post-F）构象。基于前F和抗体的高分辨率复合物结构，F蛋白被修改以在前融合状态下稳定（DS-Cav1）。I期临床显示，针对前融合特异性表面RSV F的血清抗体的中和活性增加了10倍以上。其他人设计并获得了一种基于结构探究的稳定RBD-sc-dimer疫苗分子。RBD的C末端的N602残基与另一个RBD的N末端串联设计，提高了RBD二聚体的稳定性和中和抗体反应。根据官方报告，疫苗的III期临床数据显示，该疫苗对18岁及以上人群的任何严重程度的COVID-19的保护效力为81.43%（NCT04646590）。这些结果代表了基于结构的疫苗设计的临床证据，预示着精准疫苗学的新时代的曙光。重组亚单位疫苗平台具有技术优势，如安全性和效率，以及良好的稳定性和成熟的产业。然而，安全有效的佐剂对提高疫苗效力至关重要。结构生物学、反向疫苗学和新型佐剂的新技术将促进重组蛋白疫苗的设计。 2.5.病毒样颗粒和纳米颗粒疫苗 病毒样颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米尺寸（20-200纳米）颗粒，它们的结构和免疫原性与天然病毒相似。VLPs不包含病毒遗传物质，因此可以模拟病毒抗原性而不具致病性。VLPs具有高度重复的抗原表位阵列，有利于被树突状细胞（DCs）吞噬并呈现给MHC I类和II类分子。它们可以激活身体，诱导强烈的细胞和体液免疫反应，使其成为疫苗开发的理想平台。目前批准的VLPs疫苗包括乙型肝炎疫苗（Hepavax-B、Engerix-B、Recombivax HB、HBVaxPro、Heplisav-B、Fendrix、Hepavax-Gene）、HPV疫苗（Cervarix、Gardasil、Gardasil 9、Cecolin和Wozehui）、乙型肝炎E疫苗（Hecolin）、疟疾疫苗（Mosquirix）和COVID-19疫苗（Covifenz）（表1）。此外，多种基于VLPs的预防性疫苗已进入临床试验阶段，主要针对诺如病毒、轮状病毒、BK多瘤病毒、狂犬病、RSV、HIV、流感病毒等。疟疾疫苗的研发仍然是一个巨大的挑战。GSK的科学家使用截短的环孢子蛋白（CSP）结合乙型肝炎表面抗原（HBsAg）生成名为RTS的蛋白质。然后，RTS与另一个游离的HBsAg在酵母细胞中共表达，生成RTS,S VLPs。然而，尽管RTS,S/AS01的三剂疫苗最初对临床疟疾具有一定的保护作用，但疫苗的效力随时间减弱，在高于平均水平的疟疾寄生虫暴露中效果较差。然而，RTS,S疫苗的开发大大提高了我们实现开发有效安全疟疾疫苗的长期目标的机会。最近，提出了VLPs的嵌合设计，以保护免受多型病原体的侵害。作者用系统发育上密切相关的环区域替换了HPV L1环区域。HPV33/58/52 VLPs的三型嵌合体在小鼠和非人灵长类动物中诱导的中和滴度与三种野生型VLPs混合物相当。作者目前正在开发基于这一策略的七种交叉疫苗，针对20种HPV变体。Medicago Inc.开发的一种基于植物的VLPs COVID-19疫苗最近在加拿大获得授权使用。该疫苗含有SARS-CoV-2刺突（S）蛋白（原始菌株）的VLPs以及AS03佐剂，显示出71%的效力，保护18至64岁的试验参与者（https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/covid19-industry/drugs-vaccines-treatments/vaccines/medicago.html）。 纳米颗粒疫苗（NPVs）使用纳米材料作为载体、链接器或免疫调节剂，通过物理或化学方法将特定抗原和佐剂连接起来。这种基于纳米载体的传递系统可以保护疫苗免于过早降解，提高其稳定性，并促进免疫原传递到抗原呈递细胞（APCs），特别是DCs。此外，纳米颗粒提供了合适的疫苗给药途径，并增强了具有缓慢释放特性的抗原摄取，从而产生强烈的体液、细胞和粘膜免疫反应。纳米颗粒可以来自脂质体、VLPs以及金属或非金属无机、聚合物和脂质。但与其他疫苗候选物一样，NPVs的生产充满了许多困难和挑战。例如，一些NPVs可能会引发系统性或局部炎症反应，而一些纳米材料会在细胞中积累，导致其在体内长期保留，可能导致血管血栓形成。此外，在生产和储存成本方面仍存在一些限制。 自组装蛋白支架也在疫苗开发中得到广泛应用；例如I53-50、铁蛋白、mi3和IMX313颗粒。I53-50是通过计算工程设计的双组分蛋白，可自组装成二十面体纳米颗粒。该系统已用于RSV、流感病毒和HIV疫苗的开发，这些I53-50疫苗候选物在动物模型中诱导了强烈的抗体反应。在COVID-19疫苗开发中，一种多价SARS-CoV-2刺突受体结合域纳米颗粒（RBD-NP）疫苗在小鼠中显示出保护作用，仅需一次免疫。这种RBD-NP疫苗在非人灵长类动物中引发了多样化的多克隆抗体反应，目前正在进行临床试验（NCT04742738，NCT05007951）。另一项研究展示了一种疫苗，该疫苗显示了SARS-CoV-2刺突蛋白的多个副本，以诱导强烈的中和抗体反应，从而提供对高剂量SARS-CoV-2挑战的保护。铁蛋白是一种天然蛋白笼，由24聚体结构组成，具有八个三重轴，可用于展示三聚体抗原，如流感血凝素（HA）或HIV Env蛋白。一种基于铁蛋白的疫苗候选物目前正在进行针对EBV（传染性单核细胞增多症、各种癌症和自身免疫疾病的原因）的I期临床试验（NCT04645147）。一些COVID-19疫苗也被设计为使用铁蛋白来展示RBD或刺突三聚体，形成纳米颗粒，这两种疫苗候选物在临床前研究中都显示出了提高的抗体反应。最后，mi3 NP是理性设计的i301纳米笼的突变形式，显示出比原始形式更高的产量、均匀性和稳定性。基于RBD的mi3疫苗可以诱导针对SARS-CoV-2变体和SARS-CoV的中和抗体。mi3已被用于开发流感、典型猪瘟和疟疾疫苗。通过遗传融合、标签/捕手组装或化学交联可以实现抗原到支架的展示。与基于蛋白质的纳米颗粒疫苗相关的主要挑战是在融合到或展示在支架上时保持抗原的结构构象。纳米颗粒疫苗是一个激动人心的平台，用于灵活的抗原展示，在疫苗开发中具有巨大的潜力。 2.6.病毒载体疫苗 病毒载体疫苗使用减毒病毒疫苗株或非复制病毒作为载体，有效地将抗原基因代码传递到宿主细胞核中以诱导免疫反应。病毒基因组可以稳定地接受大基因片段的插入并表达特定抗原，从而可以使用病毒载体技术开发多种疫苗。抗原可以精确合成、修改并针对宿主中的特定细胞。病毒载体诱导的身体反应类似于对自然感染的反应，导致强烈的体液和细胞免疫反应。病毒基础疫苗的主要关注点是针对载体的预先存在的免疫力，这削弱了疫苗引起的抗体诱导和T细胞反应。目前，许多病毒载体，如人类和黑猩猩腺病毒（Ad和ChAd）、水泡性口炎病毒（VSV）、改良的安卡拉牛痘病毒（MVA）、麻疹病毒（MV）、痘病毒、新城疫病毒（NDV）和其他病毒已被用作疫苗开发的载体。批准的病毒载体疫苗包括埃博拉病毒疫苗和COVID-19疫苗。由CanSino Biotechnology, Inc.开发的首个获得许可的埃博拉病毒疫苗基于腺病毒（Ad5）载体，已获得国家药品监督管理局（NMPA）的批准（表1）。其他包括由Merck开发并由食品药品监督管理局（FDA）批准的复制能力VSV基础埃博拉疫苗ERVEBO；由Janssen Cilag International N.V.（Janssen）开发的编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白的腺病毒Ad26，Zabdeno；Mvabea，一种MVA，编码扎伊尔埃博拉病毒、苏丹埃博拉病毒和马尔堡病毒的糖蛋白，以及由Janssen开发的Tai Forest埃博拉病毒的核蛋白。迄今为止，已有五种批准的病毒载体COVID-19疫苗：由CanSino开发的基于腺病毒载体的Ad5；基于重组ChAdOx1腺病毒载体（ChAd）平台的AZD1222（Vaxzevria），由AstraZeneca开发；由印度血清研究所有限公司开发的Covishield（ChAdOx1_nCoV-19）；由Janssen开发的Ad26.CoV2.S疫苗；以及基于Ad26和Ad5载体的Sputnik V，由俄罗斯加马利亚研究所开发。 中国疾病预防控制中心（中国疾控中心）已开发出一种基于DNA疫苗与复制能力天坛牛痘（rTV）疫苗结合的HIV疫苗（DNA/rTV），该疫苗包含gag、pol和env基因。这种疫苗在恒河猴中对同源和异源挑战后的病毒获取具有保护作用。DNA/rTV疫苗在I期（ChiCTR-PRC-10001287）中安全并诱导免疫反应。2021年11月，使用DNA/rTV疫苗的II期临床试验（ChiCTR1900021422）已完成。研究人员还构建了一种包含刺突蛋白的复制能力重组病毒（rVSV-SARS-CoV-2）的COVID-19疫苗。结果显示，通过鼻内（i.n.）给药的rVSV-SARS-CoV-2疫苗在猕猴中诱发的中和抗体水平是肌肉注射（i.m.）途径的8倍。同样，基于NS1-del基础的减毒流感病毒载体的结核病疫苗也已进入I期临床试验（NCT03017378）。厦门大学、香港大学和北京万泰生物药业开发了一种基于减毒流感病毒的COVID-19疫苗，DelNS1-2019-nCoVRBD-OPT1（鼻内流感基础-RBD），目前正在进行III期临床试验（ChiCTR2100051391）。 由于其制造平台的多功能性和在流行病或大流行期间的响应时间，病毒载体疫苗越来越多地用于预防性疫苗的生产。然而，罕见的风险事件仍然是一个需要解决的重要问题，以充分利用这一平台在未来的潜力，这在传染病和癌症中具有重要意义。 2.7.肽疫苗 免疫系统对抗原作出反应，通常集中在少数氨基酸（aa）或肽段上，主要是B细胞和T细胞表位。肽疫苗旨在识别病原体上的肽序列，这些序列能够诱导保护性免疫反应，然后使用这些肽序列来全合成疫苗物质。由于它们是合成的，没有突变或逆转的风险，肽抗原可以快速修改以产生特定的反应。然而，这种方法在实践和理论上仍然存在困难。肽疫苗本身通常免疫原性不足，需要多次免疫才能有效。免疫原性可以通过将表位肽与载体蛋白融合、将表位肽与载体蛋白化学链接或人工合成相关肽的重复序列来增强。表位通常不是简单的氨基酸序列；然而，结构表位——具有精确构象——有时可能是抗体结合所必需和充分的。因此，以构象依赖的方式呈现肽是肽疫苗设计的重要考虑因素。先进的肽疫苗目前正在临床试验中，包括针对流感病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1、疟疾和阿尔茨海默病的疫苗。 最近，图宾根大学医院开发了一种基于肽的COVID-19疫苗候选物，名为CoVac-1，由来自SARS-CoV-2的多个病毒蛋白（刺突、核衣壳、膜、包膜和开放阅读框8（ORF8））的T细胞表位组成。这与Toll样受体1/2激动剂XS15结合，在Montanide ISA51 VG中乳化。在I期，开放标签试验（NCT04546841）中，CoVac-1显示出有利的安全性，并且在所有参与者中诱导了针对多种疫苗肽的SARS-CoV-2特异性T细胞反应，由多功能Th1 CD4+和CD8+ T细胞介导。这些发现表明CoVac-1诱导了一种广泛、强大且与关注变体无关的T细胞反应。 一种疟疾疫苗PEV3B含有来自恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）和环孢子蛋白（CSP）的两个多肽。临床试验Ia（NCT00400101）和Ib（NCT00513669）阶段证明了病毒体配方的PEV3B的安全性和免疫原性。事实上，在大多数时间点上，AMA-1和CSP肽抗原特异性IgG滴度显著高于对照组。这些发现为进一步开发针对疟疾的多价病毒肽疫苗提供了坚实的基础。 一种新型通用流感疫苗Multimeric-001（M-001），由BiondVax Pharmaceuticals Ltd.开发，包含来自A型和B型流感病毒的HA、NP和M1蛋白的保守表位，旨在保护免受多株和多季节流感病毒株的侵害。七个已完成的临床试验表明，该疫苗安全、耐受性好，并对广泛的流感毒株具有免疫原性。然而，在2020年10月，M-001的III期临床试验（NCT03450915）并未显示安慰剂组和接种组在减少流感疾病方面有显著差异。在HIV疫苗研究中，一种融合肽（FP）共价链接到关键孔虫血蓝蛋白（KLH）的赖氨酸残基上，命名为FP-KLH，被设计为在Env三聚体初次免疫后作为增强剂。这种组合免疫方案在小鼠中诱发了单克隆抗体，中和了高达31%的208种HIV-1跨亚型菌株。对豚鼠和猕猴的免疫诱导了类似的广泛的融合肽导向的中和反应，表明HIV-1融合肽是疫苗诱导广泛中和抗体的靶标。 肽疫苗的开发作为一种方法吸引了各种治疗领域的关注，包括癌症、阿尔茨海默病和丙型肝炎病毒。尽管如此，肽疫苗仍然存在挑战，包括较弱的免疫原性和不一致的免疫反应，这应该通过表位设计、载体优化和新佐剂的结合进一步改进和发展。 2.8.DNA和mRNA疫苗 核酸疫苗由DNA疫苗和mRNA疫苗组成。DNA疫苗使用编码蛋白质的细菌质粒，在哺乳动物启动子下，然后驱动宿主细胞中的抗原表达。DNA疫苗可以诱导体液和细胞免疫，具有长期免疫反应，并且易于制造和扩大规模。针对流感、乙型肝炎、HIV、疟疾、SARS-CoV-2和癌症等传染性和非传染性疾病的DNA疫苗已在数百项人类临床试验中进行了测试。最近，印度在2022年批准了第一种用于人类紧急使用的DNA疫苗。由Zydus Cadila开发的ZyCoV-D疫苗采用了非复制和非整合的质粒DNA，携带SARS-CoV-2的基因。ZyCoV-D使用无针系统，将免疫以狭窄的流体流形式传递到皮肤中，显著减少了副作用。在III期临床试验的中期报告中，ZyCoV-D疫苗的有效性达到了约66.6%。治疗组中诱发的不良事件的发生相似。总的来说，ZyCoV-D疫苗在III期试验中被验证为有效、安全和具有免疫原性。然而，许多DNA疫苗的免疫原性低于其他疫苗平台，并且与在其他哺乳动物中看到的临床结果相比，临床结果令人失望。此外，安全性问题，如质粒DNA整合到基因组DNA中。过去对DNA疫苗整合进行了广泛研究，但没有证据表明发生了整合。DNA疫苗受到其较弱的免疫原性的限制，需要施用更大的剂量。此外，它们有效的递送仍然是未来研究的问题。 mRNA疫苗通过将与病原体特定蛋白相对应的信使RNA（mRNA）引入宿主细胞而发挥作用。mRNA疫苗主要包括传统的非复制型mRNA和自复制mRNA（SAM）。获得许可的COVID-19疫苗BNT162b2和mRNA-1273都是非复制型mRNA疫苗。自复制RNA（SAM）具有编码RNA复制因子的完整基因。与传统mRNA相比，SAM具有更持久和更高水平的抗原表达。SAM疫苗所需的剂量也远低于传统mRNA疫苗。非复制型和SAM疫苗在引入细胞质时表达高水平的异源基因。mRNA疫苗可以激活先天免疫系统并发挥固有的佐剂效应。mRNA疫苗具有免疫原性；被模式识别受体（PRRs）如TLR3和TLR7/8识别；在接种部位产生细胞因子；并招募和驱动先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的激活和成熟。对于适应性免疫，mRNA的翻译过程在细胞质中完成以产生目标抗原，然后被有效加工成多肽并呈现给MHC-I分子，引发细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。翻译后的抗原随后被分泌并在MHC-II蛋白上呈现给辅助T细胞（Th），以引发CD4+ T细胞反应，这通过炎症细胞因子刺激B细胞产生中和抗体并激活吞噬细胞。与传统疫苗类似，为了克服脂质双层并将mRNA疫苗转移到细胞质中，已开发了各种mRNA疫苗的递送方法，包括基因枪、电穿孔、脂质纳米颗粒（LNPs）等。 COVID-19 mRNA疫苗Comirnaty（BioNTech/Pfizer）是FDA于2021年8月首次批准用于人类的mRNA药物；Spikevax（Moderna）疫苗也于2022年1月在美国获得授权，并随后在其他国家使用（表1）。Comirnaty和SpikeVax是LNP配方的、修饰核苷的mRNA疫苗，编码SARS-CoV-2的S蛋白的前融合稳定形式。在一项涉及43,548名参与者的研究中，接种两剂疫苗后BNT162b2预防COVID-19的有效性为95%。严重不良事件的发生率很低，疫苗组和安慰剂组之间相似。在涉及30,420名志愿者的III期临床试验中，mRNA-1273疫苗预防COVID-19的有效性为94.1%，同样，严重不良事件很少见。另一种mRNA疫苗（CVnCoV），由CureVac开发，已进入IIb/III期临床试验。然而，CVnCoV对有症状的COVID-19的有效性为48.2%，随着SARS-CoV-2变种的出现，该试验被暂停。另一种mRNA疫苗ARCoV，由中国的Walvax Biotechnology开发，已于2022年9月获得印尼药品机构的紧急使用授权。ARCoV热稳定，可在室温下至少存放一周。ARCoV在I期临床研究中被证明是安全且耐受性良好，并能诱导强大的体液和细胞免疫反应，支持进一步的大规模临床研究和人类使用。 目前，有超过25种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗候选物正在进行临床试验。此外，还有许多针对其他传染病的mRNA疫苗的临床试验，包括寨卡病毒（NCT04064905）、流感病毒（NCT03345043, NCT03345043）、巨细胞病毒（NCT04232280, NCT03382405, NCT03382405）、RSV（NCT04528719）、基孔肯雅病毒（NCT03829384, NCT03325075）和狂犬病（NCT02241135, NCT04062669）。 环状mRNA（circRNA）是一种非编码单链RNA，通过添加内部核糖体进入位点（IRES）和/或通过在5′UTR中纳入特定的核苷修饰，可以实现蛋白表达。这一新平台已被证明由于转录本的延长半衰期，在真核细胞中产生强大且稳定的翻译。最近，Qu等人报告了一种SARS-CoV-2 Omicron circRNA疫苗，该疫苗在小鼠和猴子中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并有效抵抗SARS-CoV-2。 与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有类似活病毒的免疫反应机制，没有感染或整合到宿主基因组的风险，更稳定，能够有效表达抗原蛋白，并且通过快速且成本效益高的大型生产过程生产。从理论上讲，mRNA疫苗的开发只需要在成熟的技术平台上替换抗原序列；因此，在预防和控制新出现的传染病方面提供了相当大的优势。然而，mRNA疫苗在翻译效率和稳定性方面仍然存在一些挑战。此外，了解安全性和抗体反应的持续时间需要更长期的数据。总体而言，mRNA技术为疫苗、治疗以及更多领域提供了一个令人兴奋和有希望的途径。 2.9.当前和未来的中国预防性疫苗市场 中国是目前少数几个能够通过其工业基础设施提供足够疫苗供应能力的国家之一。近年来，中国在疫苗研发方面做出了巨大努力，并取得了显著进展，其疫苗市场正逐渐繁荣起来。根据NMPA批准的药品信息，中国市场上有94种预防性疫苗，可以预防38种疾病（表2）。其中，80种疫苗是国内生产的，11种来自国外；国产疫苗作为市场的主力，而一些战略性疫苗的供应，如白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌联合疫苗（DTwP/Hib）、五价轮状病毒疫苗、四价和九价HPV疫苗以及带状疱疹疫苗仍然依赖外部制造商。最近，国产HPV疫苗和肺炎球菌疫苗的批准展示了中国在疫苗开发和制造领域的巨大潜力。中国还开发了手足口病疫苗（EV71）、戊型肝炎疫苗和埃博拉疫苗等新型疫苗。这些成就为SARS-CoV-2出现后多技术疫苗突破的快速部署奠定了坚实的基础。目前中国市场上的传染病疫苗包括流感、水痘、脑膜炎球菌性脑膜炎、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、狂犬病、白喉、百日咳、破伤风、b型流感嗜血杆菌、脊髓灰质炎、结核病、霍乱、轮状病毒、脓疱疮、气管炎、手足口病、破伤风、伤寒、副伤寒、黄热病、钩端螺旋体病、蜱传脑炎、日本脑炎、麻疹、腮腺炎、风疹、鼠疫、肺炎球菌肺炎、炭疽、布鲁氏菌病、COVID-19、宫颈癌、细菌性痢疾、埃博拉出血热、肾综合征出血热、带状疱疹。然而，与全球市场相比，中国仍然缺乏一些疾病的疫苗，如登革热、B群脑膜炎球菌和疟疾。同时，值得注意的是，中国大多数疫苗目前基于传统疫苗平台，如灭活或减毒活疫苗、基因工程疫苗。第三代疫苗技术如病毒载体和核酸疫苗的开发才刚刚开始，中国市场上还没有核酸疫苗。 表2 中国当前许可的疫苗市场 对于重要疾病，如HIV、RSV、寨卡病毒和巨细胞病毒疫苗，尚未在全球成功开发和上市。此外，主要传染病病原体的其他亚型或突变逃逸株也在不断演变。因此，带来了许多挑战，如现有疫苗覆盖不足，如COVID-19、流感、结核病等疫苗。此外，一些现有的传染病疫苗对某些特定类型预防效果较差，如B群脑膜炎球菌疫苗、人类乳头瘤病毒疫苗、肠道病毒EVD68、超级细菌疫苗等。此外，中国无法独立满足高风险或特殊人群的疫苗需求，如老年人的带状疱疹疫苗。最后，联合疫苗是一线可以预防多种疾病并让人们通过较少的注射获得保护的疫苗。未来，应加强新一代疫苗技术的开发，如病毒载体疫苗和核酸疫苗。 3.治疗性疫苗的发展进展 与预防性疫苗不同，治疗性疫苗是指在已经感染病原体或患有特定疾病的患者中诱导特异性或非特异性免疫反应以治疗疾病进展的生物制品。因此，治疗性疫苗的主要目标是诱导肿瘤消退、根除微小残留病、建立持久的抗肿瘤记忆以及避免非特异性或不良反应。治疗性疫苗主要分为四类：基于肽/蛋白的疫苗、基于细胞的疫苗、基于DNA或RNA的疫苗和基于病毒载体的疫苗。根据疾病分类，治疗性疫苗可以分为针对肿瘤的疫苗、针对传染病的疫苗和针对慢性病的疫苗。首个获得FDA批准的癌症疫苗，Sipuleucel-T（Provenge，由Dendreon公司商业化），目前用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。Provenge是一种自体的、基于树突状细胞的疫苗，装载有与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）融合的前列腺酸性磷酸酶（PAP）抗原；这种疫苗首次实现了利用患者的自身免疫细胞攻击癌细胞的理念。迄今为止，已有超过30,000名男性患者接受了Provenge治疗，临床上已证明可以延长晚期疾病男性患者的生命。Provenge的批准在治疗性疫苗领域内具有重要意义，并强调了抗癌疫苗可以发挥作用的事实，从而为进一步投资癌症疫苗开发提供了动力。 3.1.治疗性疫苗在癌症方面的应用 3.1.1.治疗性疫苗在肺癌方面的应用 肺癌（LC）是最常被诊断出的癌症，也是导致癌症相关死亡的主要原因，由于预后不佳和临床结果差，给全球公共卫生带来了沉重负担，5年生存率为19%；实际上，肺癌占癌症总病例的11.4%，占全球癌症总死亡人数的18.0%。LC分为两个主要组织类型：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。传统的抗癌疗法（手术、放疗和化疗）在遏制进展方面的有效性有限，因此，全球范围内正在积极开展针对LC的治疗性疫苗设计研究（表3）。2008年，古巴开发了世界上第一个有效的治疗性疫苗CIMAvax EGF用于NSCLC，后来在古巴、秘鲁和委内瑞拉批准用于一线化疗后的晚期（IIIB和IV期）NSCLC治疗。CIMAvax EGF由人重组表皮生长因子（EGF）与脑膜炎奈瑟菌重组P64K蛋白共价结合而成。EGF调节细胞生长和分裂，NSCLC患者中EGF的过度表达与细胞生长和分裂失控有关。CIMAvax EGF通过刺激免疫系统产生特异性针对EGF的抗体，抑制其与癌细胞上的相应受体结合，从而减缓癌细胞的无控制生长。II期和III期临床试验表明，CIMAvax EGF耐受性良好，并延长患者生存期，特别是60岁以下患者的中位总生存期（OS）分别为18.53个月和7.55个月。另一种疫苗Vaxira是一种免疫治疗剂，由小鼠γ型抗异型单克隆抗体Racotumomab和氢氧化铝组成。Racotumomab特异性诱导针对在多种实体瘤中过度表达的Neu-糖基化GM3神经节苷脂（NeuGcGM3）的抗体反应。目前正在评估多种癌症适应症，包括黑色素瘤、乳腺癌和肺癌。Vaxira治疗NSCLC的临床试验结果显示，中位生存时间为8.23个月，略高于对照组的6.8个月；Vaxira治疗组的中位无进展生存时间为5.33个月，对照组为3.9个月，证明了Vaxira优于安慰剂。基于II/III期研究的有希望的结果，Racotumomab于2013年在古巴和阿根廷推出，作为晚期NSCLC患者的皮下注射治疗。Tedopi是一种基于新表位的疫苗，具有针对HLA-A2+的限制性修饰新表位，针对肺癌中经常表达的五种肿瘤相关抗原：CEA、HER2、MAGE2、MAGE3和P53。在II期试验中，Tedopi在预处理的晚期NSCLC患者中显示出17.3个月的OS，并具有可管理的安全性。ATALANTE-1——一项随机、开放标签、两步、III期研究——比较了Tedopi与标准治疗（SoC）在HLA-A2+ NSCLC患者中的疗效，这些患者在ICI治疗后疾病进展的第二或第三线治疗。Tedopi通过刺激杀手T细胞，使它们能够发现并消除癌细胞，这是治疗疾病的关键过程。结果显示，在63名Tedopi组患者中，有29名患者至少存活了12个月，12个月生存率为46%，远高于预定的25%。一名54岁的晚期LC患者，在接受了五次Tedopi注射后，肿瘤迅速缩小（从39毫米缩小到23毫米）。在本报告发布时，患者的生存期已超过20.6个月，仍在观察中。现在，由于其出色的临床数据，Tedopi已获得美国FDA的孤儿药指定，用于治疗HLA-A2阳性NSCLC。 表3 市场上或处于临床开发阶段的针对不同疾病的治疗性疫苗 3.1.2.治疗性疫苗在乳腺癌方面的应用 乳腺癌（BC）是全球第二常见的恶性肿瘤，每年有超过226万例新病例。它也是女性癌症相关死亡的主要原因。迄今为止，截至2021年6月23日，共有44项正在进行的（即活跃的、不招募；招募；尚未招募）临床试验正在研究BC的治疗性疫苗。就疫苗平台而言，大多数BC疫苗是基于肽的（N=20，45.5%），而大约有10项（22.7%）的临床试验正在测试基于细胞的BC疫苗；新技术开发的病毒载体疫苗占6项（13.6%），而基于基因的BC疫苗正在8项（18.2%）临床试验中进行评估。 人表皮生长因子受体-2（HER2）是乳腺癌疫苗的理想靶点，是一种细胞表面受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在高达75%的BC中表达。HER2在细胞生长、存活和分化中发挥着极其重要的作用。针对HER2的基于肽的疫苗能够诱导持久的特异性细胞和体液免疫反应，以抑制HER2阳性肿瘤细胞的生长，显示出高免疫原性、强特异性和良好的安全性。在II期临床试验（NCT00524277）中，HER2衍生的肽疫苗GP2，即HER2跨膜域（TMD）的亚优势表位，与GM-CSF（一种FDA批准的免疫佐剂）结合使用。这种组合刺激了抗原呈递细胞（如DC等）的增殖，并进一步诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）识别和摧毁表达HER2/neu的癌细胞。此外，GP2疫苗耐受性良好，没有严重的不良反应，接受GP2疫苗治疗的BC患者在手术后以及Herceptin治疗后5年的无病生存率达到100%。此外，与单独接受GM-CSF治疗的患者相比，BC复发率为0%，而后者为89.4%。基于E75（HER2/neu 369-377，KIFGS LAFL）的疫苗是治疗BC患者最广泛研究的策略。然而，目前的结果表明，E75疫苗仅对三阴性BC患者并且在治疗与曲妥珠单抗联合使用时对表达HLA-A24的患者提供了显著的临床益处；需要进一步评估这些效果。其他基于肽的疫苗也在临床试验中（表3）：AE37（HER2/Neu 776-790，GVGSPYVSRLLGICL；II期临床试验中），TPIV100（一种使用sargramostim作为佐剂的多表位疫苗，针对HER2；II期临床试验中），MVFHER-2（aa597-626；I期临床试验中）和MVF-HER-2（aa266-296；I期临床试验中）（MVF-HER2是两种嵌合型曲妥珠单抗样（MVF-HER2，aa597-626）和小扰素样（MVF-HER2，aa266-296）HER2 B细胞肽基疫苗的组合）。此外，基于细胞的治疗性疫苗是患者特定的，需要一种安全的方法进行个性化疫苗开发（Arab等人，2020年）。目前有多种针对HER2的基于细胞的疫苗正在开发中（表3）：DC细胞（NCT02061423，NCT04348747），PBMC细胞（APC8024），以及同种异体细胞（NCT00847171）已被用作免疫原进行免疫。初步结果表明，这些疫苗耐受性良好，并提供了特异性抗HER2细胞免疫反应。目前，正在考虑用于提高BC治疗性疫苗效果的各种方法：包括选择合适的细胞亚群、佐剂的选择以及不同的工程方法（如基于VLP或基于基因的疫苗）。然而，这些优化的临床益处仍有待验证。 3.1.3.治疗性疫苗在结直肠癌方面的应用 结直肠癌（CRC）是世界上第三常见的癌症，仅次于LC和BC，发病率为10.0%，死亡率为9.4%。CRC的标准治疗是手术、化疗和放疗，这些治疗可能结合使用。然而，这些治疗有许多副作用，许多患者在一系列治疗后仍然会复发。因此，为这一患者群体开发替代的有效治疗方法至关重要。尽管，目前还没有FDA批准的CRC疫苗，但已评估了多种疫苗用于治疗CRC，包括自体、DC、肽和基于病毒载体的疫苗。OncoVAX是一种自体结肠癌疫苗，与活的卡介苗（BCG）混合，用作CRC切除术后患者的辅助治疗。III期临床试验（NCT02448173）结果表明，OncoVAX对III期结肠癌患者没有显著影响，但在平均5.8年的随访期间。OncoVAX显著延长了II期结直肠癌患者的无复发期，并降低了总体复发风险和死亡风险。作为一种主动特异性免疫治疗（ASI），OncoVAX在免疫调节佐剂（BCG）的帮助下增强了患者肿瘤细胞的免疫原性，以刺激患者对自体（患者特定）肿瘤细胞的免疫反应。基于ASI的治疗程序通常假定患者肿瘤细胞上存在不同的肿瘤抗原，并且这些抗原在正常细胞中不存在或浓度较低。 最近的研究报告了一种基于腺病毒的疫苗，用于治疗结直肠癌（CRC），并在I期临床试验（NCT01972737）中取得了积极结果。研究发现，CRC抗原鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）能够在小鼠中引发针对肿瘤的抗原特异性CD8+ T细胞反应，而不是CD4+ T细胞，从而在不引起自身免疫的情况下提供抗肿瘤免疫。由人类5型腺病毒（Ad5）（作为载体）、PADRE（在大多数人类HLA分子背景下活跃的CD4+ T细胞表位）和GUCY2C组成的Ad5-GUCY2C-PADRE疫苗也经过了测试：在I/II期临床试验中，10名CRC患者接受了疫苗接种，并在6个月内进行了随访。作者发现Ad5-GUCY2C-PADRE安全地产生了针对抗原的细胞毒性CD8+细胞，但没有产生自身免疫性CD4+ T细胞，且没有严重的不良反应。 在2020年美国临床肿瘤学会（ASCO）大会上，梅奥诊所报告了一种新的治疗方法疫苗PolyPEPI1018，专门为MSS型CRC设计，可以有效延缓肿瘤进展。PolyPEPI1018是一种多肽疫苗，由六种合成肽组成。这些肽段包括来自7种保守的癌症睾丸抗原（CTAs）（TSP50、EpCAM、Survivin、CAGE1、SPAG9、MAGE-A8、FBXO39）的12个独特的免疫原性表位，这些抗原在mCRC中经常表达。这种疫苗经过优化，以诱导持久的CRC特异性T细胞反应。在OBERTO临床I/II期试验（NCT03391232）中，共有11名患者接受了PolyPEPI1018疫苗接种：3名患者进一步肿瘤进展，5名患者病情稳定，3名患者部分肿瘤缓解，2名患者的肿瘤缩小到可以接受手术的程度。值得注意的是，在手术后原发肿瘤中没有发现存活的肿瘤细胞，表明肿瘤细胞被杀死了。因此，这些初步发现表明PolyPEPI1018对MSS mCRC肿瘤具有早期临床活性，可以有效延缓肿瘤进展。因此，需要进一步研究以调查PolyPEPI1018的疗效。此外，还有多项旨在寻找正确的抗原刺激物的试验正在进行中。 3.1.4.治疗性疫苗在肝癌方面的应用 肝癌是全球最常见的癌症之一，发病率为4.7%，死亡率为8.3%。肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，通常发生在由酗酒、代谢综合征或乙型肝炎（HBV）或丙型肝炎（HCV）病毒感染引起的慢性肝病背景下。事实上，HBV和HCV感染被认为是HCC的主要风险因素。尽管HCC有各种治疗方法，包括预防性疫苗，包括HBV疫苗，已被报告可以降低HCC的发病率；尽管如此，患者总体生存率的变化仍然远未令人满意，对于更有效的治疗方法存在巨大的未满足需求。癌胚抗原糖蛋白-3（GPC3）在80%的HCC中特异性高表达，但不在正常组织中表达，因此被认为是抗原特异性免疫治疗的理想靶点。事实上，Nobuhiro等人已经发现GPC3肽可以在小鼠中诱导免疫反应，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抗肿瘤活性，而不会引发自身免疫现象。因此，大多数基于肽的HCC疫苗主要针对GPC3抗原。 在一项II期临床病例对照研究（UMIN-CTR，UMIN000002614）中，比较了接种和未接种GPC3肽疫苗的患者的无病生存（DFS）、总生存（OS）和CTL诱导。研究证实，无论是否接种GPC3肽疫苗，80%的患者都会复发。然而，术后辅助疫苗接种可能会使1年复发率降低约15%，5年和8年生存率分别提高约10%和30%。此外，GPC3 IHC染色阳性的患者更有可能诱导CTLs，60%的患者生存超过5年。另外两种肽鸡尾酒疫苗（ONO-7268MX1 [JapicCTI-121933]和ONO-7268MX2 [JapicCTI-142477]），包含GPC3、在HCC中上调的含有WD重复的蛋白（WDRPUH）和类似内切核酸酶VIII的三个表位（NEIL3），在两项I期研究中评估了晚期HCC。除了GPC3，WDRPUH和NEIL3也被确定为HCC中的潜在免疫治疗靶点。其中，WDRPUH具有促进生长的活性，抑制WDRPUH可以延缓癌细胞的生长，而NEIL3作为一种肿瘤抗原，其编码基因在HCC中表现出高频的杂合性丧失，表明它可能是一个潜在的肿瘤抑制基因，在DNA修复中发挥作用。接种ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的HCC患者显示出良好的耐受性，并诱导了CTL反应。一些患者还表现出长期疾病控制，ONO-7268MX1和ONO-7268MX2的疾病控制率分别为52.9%和35.7%，报告了9名和5名患者的病情稳定。这些结果暗示了这些疫苗在治疗HCC方面的潜在用途。 IMA970A是一种由16种新发现的在HCC患者肿瘤组织中过度表达的肿瘤相关肽（TUMAPs）组成的基于肽的HCC疫苗。IMA970A与免疫刺激剂CV8102一起给药，可以诱导平衡的Th1/Th2免疫反应。在这些TUMAPs中，有7种限制在HLA-A02上，5种限制在HLA-A24上，4种限制在HLA-II类上。处于非常早期、早期和中期HCC的患者被纳入接受单次低剂量环磷酰胺的预疫苗输注，然后是9次皮内疫苗接种。初步结果显示疫苗具有良好的安全性，但免疫原性数据尚未公布（NCT03203005）。此外，甲胎蛋白（AFP）作为HCC最广泛使用的血清标志物，可以改善预后并用于监测治疗反应；AFP衍生肽疫苗的安全性和有效性也在临床试验中得到了验证。 另一种HCC的治疗性疫苗是基于个性化肽疫苗。2017年，一项I/II期研究评估了一种新的治疗方法对晚期HCC的疗效和安全性：基于个性化肽疫苗（PPV-DC-CTL）的细胞免疫治疗与放疗相结合。结果显示疫苗耐受性良好，未引起严重副作用，研究中的9名患者病情控制良好，有效率（RR）为33%，疾病控制率（DCR）为66%。治疗效果明显优于单独报告的经导管动脉化疗栓塞（TACE）、索拉非尼和化疗。另一种个性化肽疫苗是使用仅来自恶性肿瘤细胞的非同义突变表位肽作为抗原（称为新抗原）；这些肽与MHC一起在肿瘤中表达，因此被T细胞特异性识别，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。最近，刘团队发现个性化新抗原疫苗策略在预防HCC术后复发方面安全、可行且有效，并且通过ctDNA中的相应新抗原突变监测HCC进展也很有用；实际上，这为HCC患者的个性化医疗提供了可靠信息。在一项I期临床试验（ChiCTR1900020990）中，10名有血管侵犯的HCC患者在接受HCC诊断后2个月内进行了根治性手术切除和预防性TACE。通过肿瘤和周围组织全外显子测序鉴定非同义体细胞单核苷酸变异。对于疫苗，使用了6-20个体细胞点突变或RNA编辑新抗原长肽（27aa），并与ploy:IC佐剂混合作为抗HCC复发治疗。结果显示没有明显的治疗相关不良事件：新抗原疫苗可以有效地诱导和激活HCC患者的特异性免疫反应，并相应地延长这些患者的无复发生存期。患者的中位RFS为7.4个月，证实了个性化新抗原疫苗预防HCC患者术后复发的安全性和可行性。总之，我们讨论了几个涵盖癌症治疗肽疫苗的积极结果的例子，表明在人类中诱导CTLs是有希望的。但到目前为止，还没有观察到完全和明确的康复病例。需要进一步设计和筛选具有高免疫原性的有效的肽序列，辅以高效佐剂，或与其他免疫疗法结合，以实现更好的肿瘤消退。 3.1.5.治疗性疫苗在胃癌方面的应用 人们一直在推动研究癌症疫苗在各种肿瘤组中的作用，包括胃肠道癌症。胃癌（GC）是世界第五大癌症，2020年的发病率为5.6%，死亡率为7.7%。大多数GC患者在晚期被发现，局部晚期疾病或转移性扩散导致的不可切除病变的5年OS率仅为5%至15%。近年来，在免疫检查点抑制剂的治疗下，GC取得了巨大进展，但GC的治疗性疫苗仍处于临床阶段（表3）。因此，许多研究正在探索将免疫检查点抑制剂与化疗和其他药物或疫苗结合使用的潜力。例如，在之前的一项研究中，晚期GC患者接受了人类白细胞抗原（HLA）-A24限制性的人类血管内皮生长因子受体1（VEGFR1）-1084和VEGFR2-169多肽疫苗与S-1加顺铂的组合治疗，中位生存时间达到14.2个月。另一种选择，胃泌素-17-白喉毒素免疫原（G17DT；Gastrimmune），一种抗胃泌素17免疫原，已确认可以提高针对胃泌素17的高亲和力中和抗体，可以阻断胃泌素刺激的生长并抑制胃泌素与CCK-2受体的相互作用。G17DT现在已经在许多肿瘤治疗中用于被动和主动免疫治疗，包括原发性和转移性疾病。实际上，作者证实，当与5-氟尿嘧啶加顺铂结合使用时，G17DT可以刺激体内的免疫反应，并且有免疫反应的患者生存时间更长。 如上所述，肿瘤特异性抗原是免疫治疗的潜在靶点。通过比较GC样本和正常组织之间的差异蛋白表达研究，已经鉴定出四种癌症特异性抗原——FOXM1、DEPDC1、KIF20A和URLC10；这四种抗原在肺癌、食管癌、膀胱癌和其他癌症中也上调。 血管生成是肿瘤进展的关键机制，血管内皮生长因子（VEGF）是已知最有效和特异性最强的血管生成促进因子，因此，它被用作许多疫苗的靶点。OTSGC-A24是一种针对FOXM1、DEPDC1、KIF20A、URLC10和VEGFR1的HLA-A24:02结合肽疫苗混合物。在I/Ib期临床试验（NCT01227772）中，观察到24名携带HLA-A24:02单倍型的晚期胃癌患者的显著CTL反应，患者的总生存期为5.7个月（Sundar等人，2018年）。 除了肿瘤抗原，新抗原或识别新抗原的T细胞存在于大多数癌症中，为个性化疫苗设计提供了特异性和高度免疫原性的目标。I/II期临床试验（NCT03480152）评估了一种名为mRNA-4650的mRNA疫苗，该疫苗由多达20种不同的mRNA组成，编码定义的新抗原、驱动基因的突变和HLA-I预测的表位。在转移性胃肠道癌症患者中，疫苗被证明是安全的，并诱导了针对预测新表位的突变特异性T细胞反应，这些反应在疫苗接种前未被检测到。然而，尚未观察到客观的临床反应，疫苗可能只与其他免疫疗法结合使用以增强治疗效果。 最近，Ursula Wiedermann团队开发了一种治疗性B细胞表位疫苗（IMU-131/HER-Vaxx），并在Ib期临床试验（NCT02795988）中验证了其在HER2/neu过度表达的胃食管腺癌（GEA）患者中的免疫原性和有效性。IMU-131/HER-Vaxx由来自HER2/neu细胞外域的三个融合B细胞表位（P4、P6和P7）组成，与CRM197偶联，并用Montanide佐剂。针对IMU-131肽的抗体通过结合HER2受体的三个不同区域并参与二聚体环，阻止两个HER2受体的二聚体化，从而抑制细胞内信号传导。这种阻断HER2信号通路被认为比单独使用曲妥珠单抗更有效。相比之下，CRM197（CRM；交联材料），一种酶失活的非类毒素白喉毒素形式，已被成功用作各种疫苗的伴侣，可以快速激活具有异质性Th1和Th2细胞因子谱的CD4+ T细胞，用于激活B细胞和调节诱导抗体的数量。在大多数14名接种GEA患者中，检测到针对HER2的特异性抗体和T细胞反应，IMU-131显示出良好的耐受性和安全性。 3.2.治疗性疫苗在病毒性传染病方面的应用 3.2.1.治疗性疫苗在乙型肝炎病毒方面的应用 乙型肝炎病毒（HBV）属于Hepadnaviridae家族，是一种部分双链的包膜DNA病毒。如上所述，HBV感染是导致HCC的重要因素之一，但并非所有HBV感染都会发展成癌症。相反，由HBV引起的慢性乙型肝炎（CHB）对公共卫生的影响更大。尽管经过数十年的积极疫苗接种，全球有20亿人的乙型肝炎血清学特征，其中2.5亿人患有慢性乙型肝炎。目前，只有两种批准用于CHB的药物：核苷类似物和聚乙二醇干扰素（IFN），这两种药物在抑制病毒复制方面有效，但无法清除病毒基因组或从感染肝细胞的血清中清除HBV表面抗原（HBsAg）。因此，迫切需要探索新的治疗途径。目前，有2种治疗性疫苗（NASVAC和YIC）已完成III期临床试验。此外，还有3种疫苗已完成II期临床试验，其中2种（GS-4774和HB02 VAC-ADN）未达到主要终点，1种（εPA-44）达到了治疗终点并进入III期临床试验。还有3种治疗性疫苗（CVI-HBV-002、VBI-2601和HepTcell）处于II期临床试验中，许多处于I期临床试验中（表3）。 乙型肝炎病毒（HBV）衣壳主要由乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和HbxAg组成。目前，大多数HBV治疗性疫苗侧重于HBsAg和HBcAg作为主要免疫原。在一项III期临床试验中，对CHB的初治患者使用NASVAC进行治疗，NASVAC是一种包含HBsAg和HBcAg的治疗性疫苗。作者发现，在80名接受NASVAC疫苗接种的患者中，有85%的患者丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平升高，并清除了HBeAg。另一项III期临床试验评估了一种含铝佐剂的治疗性乙型肝炎疫苗（YIC），由抗原（HBsAg）-抗体（HBIG[乙型肝炎免疫球蛋白]）免疫复合物组成。本研究旨在通过改变患者体内HBV抗原的过程和存在来消除免疫耐受。不幸的是，疫苗的III期结果未能达到临床终点，即在患者中实现HBeAg血清转换。 一项II期试验（NCT02174276）评估了GS-4774疫苗的疗效，该疫苗由HBs、HBc和HBx融合抗原组成。结果显示，尽管GS-4774安全并对CD8+ T细胞有强烈的免疫刺激作用，但它未能降低患者体内的HBsAg水平。计划探索该药物与其他抗病毒药物联合使用的疗效。 最近的一项研究报告了HBxAg单独作为主要免疫原的潜力。HBxAg在携带HBV的小鼠中诱导了全身HBx特异性CD4+和CD8+ T细胞反应，并显示出明显的HBs和HBV-DNA耗竭，保护作用至少持续30天。尽管这项研究仅处于临床前阶段，疫苗展示的HBV清除效果使其未来的发展充满希望。另一种目前有前景的疫苗是基于脂质体的纳米脂肽疫苗εPA-44（NCT00869778）。在HLA-A2阳性的进展性CHB患者中，900微克的εPA-44有限浓度导致HBeAg血清转换率显著高于安慰剂组，并具有持续的停药后效果。正在进行一项III期临床试验（ChiCTR2100043708）。 基于病毒载体或基因组的其他CHB治疗性疫苗也在进行中。一项I期临床试验（NCT02431312）评估了INO-1800（编码HBsAg和HBcAg的DNA质粒）单独或与INO-9112（编码人类白细胞介素12的DNA质粒）疫苗联合使用的安全性、耐受性和免疫原性。初步免疫学数据显示，接受INO-1800治疗的患者可以产生识别HBV核心成分的T细胞，并通过干扰素γ释放的方式从肝脏清除HBV。此外，INO-1800可以激活和扩增CD8+杀手T细胞；尽管其他临床数据尚未公布（https://clinicaltrials.gov）。 在另一项I/II期临床试验中，一种名为ANRS HB02 VAC-AND的基于DNA的疫苗，编码HBsAg，在用NAs治疗的CHB患者中诱导了持久的HBV特异性CD4+ T细胞反应，但大多数患者在停用NAs后经历了病毒学反弹。 3.2.2.人乳头瘤病毒治疗性疫苗 宫颈癌是女性中第四常见的癌症，主要由持续感染高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）引起。根据世界卫生组织的数据，2020年全球约有604,127名女性新诊断为宫颈癌，死亡341,831人。尽管有多种预防性疫苗可用，宫颈癌的发病率和死亡率仍然很高，没有批准的非手术治疗方法。因此，研究HPV治疗性疫苗是必要的。与专注于HPV L1蛋白的预防性疫苗不同，治疗性疫苗主要针对在肿瘤细胞中高度表达的HPV早期蛋白E5、E6和E7。基于E6/E7蛋白的疫苗有多种不同形式已进入临床试验（表3），数据显示具有良好的开发潜力。实际上，五种不同的DNA治疗性疫苗（GX-188E、VGX-3100、pNGVL4a-CRT/E7（解毒）、pNGVL4a-Sig/E7（解毒）/HSP70、MEDI0457）被证明耐受性良好且临床有效。其中，VGX-3100疫苗已进入III期临床试验。 VGX-3100是第一种针对与HPV相关的宫颈癌前病变的免疫疗法。它包含HPV16和18的E6和E7 DNA，并使用CELLECTRA 5PSP电穿孔技术进行肌肉注射。结果显示，VGX-3100可以引发全身免疫反应，在三剂疫苗接种者中有49.5%的组织病理学退行，HPV清除率为40.2%，高于安慰剂接种者（30.6%和15.4%）。目前正在进行一项III期试验（REVEAL），以确认VGX-3100在HPV16/18阳性高度鳞状病变（CIN2/3）女性中的疗效、安全性和耐受性。 考虑到与宫颈癌完全缓解相关的疫苗单药治疗结果有限，使用疫苗和免疫疗法药物的联合治疗可能提供更强大的免疫反应。另一种基于DNA的疫苗pgDE7h（编码与1型单纯疱疹病毒（HSV-1）糖蛋白D（gD）融合的HPV16 E7）被发现与吉西他滨（Gem）联合具有协同抗肿瘤效果，吉西他滨是一种在临床上用于多种肿瘤的核苷类似物。这种组合诱导了肿瘤特异性细胞毒性CD8+ T细胞并根除了现有肿瘤。此外，一项研究发现，pembrolizumab与GX-188E（一种设计用于表达HPV16和HPV18的E6和E7蛋白，与Flt3L的细胞外域和组织型纤溶酶原激活剂的信号序列融合的基于DNA的疫苗）联合使用为CIN3患者提供了一种新的可能方案。 蛋白基疫苗由抗原呈递细胞（APCs）处理，导致通过HLA I类和II类呈现抗原，用于产生无类型限制的CD8+和CD4+ T细胞反应。TVGV1是一种融合蛋白基疫苗，由两种抗原组成，铜绿假单胞菌外毒素和KDEL内质网保留信号，与HPV16 E7融合，并用CpG ODN或GPI-0100佐剂。这种疫苗已被证明可以诱导T细胞反应，并为HPV16转化的B6肿瘤提供强大的抑制。目前正在进行一项IIa期临床试验，针对高危HPV宫颈感染的女性（NCT02576561）。 还有几种基于多肽的疫苗使用非E6/E7蛋白作为免疫原。PDS0101是一种基于肿瘤相关抗原MUC1的非MHC限制性疫苗，该抗原在肿瘤中高度表达。这种疫苗使用R-1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（R-DOTAP）（一种激活TLR7的脂质体载体）作为佐剂。在I期剂量递增试验（NCT02065973）中，发现PDS0101安全且耐受性良好。疫苗接种以非MHC限制性方式在所有患者中解决了CIN。已启动几项将PDS0101与其他免疫调节疗法结合使用的II期试验（表3）。 3.2.3.治疗性疫苗在人类免疫缺陷病毒方面的应用 自20世纪80年代初首次临床观察到艾滋病并随后分离出病因性逆转录病毒HIV以来，尽管进行了40年的深入研究，HIV/AIDS疫情仍然是对人类构成重大全球健康威胁的疾病。实际上，截至2020年，仍有3800万人感染HIV。目前的治疗策略包括使用抗逆转录病毒疗法（ART），这已帮助将艾滋病从一种危及生命的疾病转变为一种可管理的慢性病，并显著延长了HIV感染者的预期寿命。然而，由于存在由潜伏感染细胞形成的病毒库，患者需要接受终身维持治疗。在缺乏有效的HIV-1根除策略的情况下，HIV研究工作集中在开发治疗方法上。 SARS-CoV-2大流行向世界介绍了一种有效的基于mRNA的疫苗，该疫苗封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。ICVAX是一种基于PD1的HIV-1 DNA疫苗，编码由人类可溶性PD1结构域与两个马赛克Gag-p41抗原融合的重组抗原，可以诱导针对不同HIV-1亚型的广泛和多功能T细胞反应；这些发现突出了将基于PD1的DNA疫苗方法转化为临床使用的巨大潜力。一项II期临床试验（NCT01492985）评估了基于DNA的疫苗（GTU-MultiHIV B clade）与基于多肽的疫苗（HIV-LIPO-5）联合治疗的疗效，并发现DNA和LIPO-5疫苗的主要-增强免疫接种比单独疫苗诱导了更广泛的多功能T细胞，但在中断抗逆转录病毒治疗后未能控制病毒血症，表明将疫苗策略与其他基于免疫的干预措施结合的重要性。其他疫苗形式，如AGS-004，由成熟的自体树突状细胞和体外转录的自体HIV抗原编码RNA组成，正在IIb期临床试验中进行验证。与安慰剂组相比，AGS-004诱导了强烈和多功能的HIV特异性T细胞反应。然而，未检测到抗病毒效果。另一项研究将单核细胞衍生的树突状细胞（MD-DC）基疫苗（装载大量HIV-1热灭活自体抗原）与聚乙二醇化干扰素α-2a（IFNα-2a）结合使用，在慢性HIV-1患者中取得了次优结果。总的来说，开发针对HIV的疫苗还有很长的路要走。 3.3.治疗性疫苗在慢性病方面的应用 心血管疾病（CVD）是全球主要的慢性疾病死因，高血压、血脂异常和糖尿病是CVD的主要原因。高血压、血脂异常和糖尿病的疫苗研究已有60多年的历史。随着各种疫苗构建模型的逐步改进，目前许多治疗性疫苗正在进行临床试验，但由于治疗依从性差，还没有疫苗上市。 3.3.1.治疗性疫苗在高血压方面的应用 肾素-血管紧张素系统（RAS），包括肾素、血管紧张素I（Ang I）、血管紧张素II（Ang II）和AT1R，是高血压治疗性疫苗的主要靶点。最早的高血压疫苗针对肾素。然而，由于对肾脏的损害，它们最终被终止。随后，针对AngI的高血压疫苗的疗效，如PMD2850和PMD3117，也在许多临床试验中得到验证，但都以失败告终。Ang II是许多高血压疫苗的另一个主要靶点，如瑞士Cytos公司在2007年开发的CYT006-AngQb（由Ang II结合噬菌体Qβ（AngQb）VLP组成的疫苗）。该疫苗耐受性良好，并在所有受试者中诱导了抗Ang II抗体，半衰期约为4个月。同样基于Ang II，Koriyama等人构建了编码Ang II和HBcAg融合蛋白的Ang II DNA疫苗，可以有效降低血压至少6个月。2022年，进行了一项安慰剂对照剂量递增研究，以调查针对改良Ang II DNA疫苗（AGMG0201）的安全性、耐受性和免疫反应。结果显示AGMG0201耐受性良好，也可以诱导抗血管紧张素II抗体。 除了针对RAS的疫苗外，廖团队还开发了一种针对交感神经系统α1D-肾上腺素受体的降压疫苗（ADRQβ-004），在大鼠中显示出良好的降血压效果，并且能够有效预防高血压动物的血管结构重塑、心肌肥大和纤维化以及肾脏损伤。吴等人设计了来自人类L型钙通道（CaV 1.2）的表位CE12，并分别将其结合到Qβ VLPs和HBcAg VLPs上，以测试该表位在高血压动物中的疗效。Qβ-CE12和HBcAg-CE12-CQ10疫苗都能有效地降低高血压啮齿动物的血压，HBcAg-CE12-CQ10还改善了L-NAME诱导的肾脏损伤。戴等人开发了一种针对内皮素-1（ET-1）类型A受体（ETAR）的疫苗ETRQβ-002，并证实该疫苗可以显著减少由单羧胺（MCT）和Sugen/低氧引起的大鼠肺动脉高压；它还改善了肺动脉的任何病理重塑。总之，针对RAS的Ang II和AT1R、SNS的α1DAR肾脏和LCaCd、ETAR的疫苗构成了一系列高血压治疗性疫苗的候选物，并为高血压疫苗的联合治疗奠定了基础。 3.3.2.治疗性疫苗在糖尿病方面的应用 糖尿病（DM）是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，是全球成人中高度流行的慢性疾病。全球估计有3.82亿人患有DM，预计到2035年这一数字将接近6亿。DM可以根据疾病的发病机制分为1型和2型。1型DM是一种自身免疫性疾病，自身免疫T细胞攻击产生胰岛素的β细胞。谷氨酸脱羧酶（GAD）是1型DM自身免疫反应的主要靶点；尽管几项基于GAD的疫苗临床试验产生了矛盾的结果。令人惊讶的是，卡介苗（BCG）疫苗被用于1型DM患者。一项为期8年的随访临床试验显示，BCG疫苗提供了长期效果：它被良好地耐受，并且在DM患者中导致血糖和Treg特征基因的表观遗传变化稳定减少。2017年，李等人设计的D41-IA2(5)-P2-1疫苗被认为是1型DM的一种有希望的治疗方法。D41-IA2(5)-P2-1由DPP4的肽段、胰岛素瘤抗原-2（IA-2）的抗糖尿病B表位和来自人类热休克蛋白60（HSP60）的P277肽的Th2表位（P2：IPALDSLTPANED）组成，可以显著控制高血糖。与D41-IA2(5)-P2-1类似，由李Z等人设计的U-IA-2(5)-P2-1（UIP-1）嵌合疫苗也能在免疫后成功增加小鼠的胰岛素水平并降低血糖水平。 尽管2型DM的病理机制尚不清楚，但已知有4个靶点：脂肪组织抗原、生长抑素、依赖葡萄糖的胰岛素变性多肽（GIP）和胃饥饿素。白细胞介素-1β（IL-1β）是2型DM发病机制中的主要促炎底物，有证据表明减少IL-1β活性可能成为2型DM的新治疗策略。由全长重组IL-1β与Qβ VLPs偶联组成的疫苗hIL1bQb，在2型DM患者的临床前和临床、随机、安慰剂对照、双盲研究中进行了测试。结果显示，针对IL-1β的Hil1bQb疫苗安全且耐受性良好，在这些患者中，接种6剂900微克剂量后可检测到中和IL-1β特异性抗体反应。目前，DM的发病机制和葡萄糖代谢的关键靶点仍然不清楚。在糖尿病疫苗领域的进一步探索预计将提供新的解决方案。 3.3.3.治疗性疫苗在血脂异常方面的应用 血脂异常是CVD的关键风险因素，通常以高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇、低高密度脂蛋白（HDL）胆固醇或高甘油三酯血症为特征。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/胰蛋白酶9型（PCSK9）通过受体内化和随后的溶酶体降解调节LDL受体表达，是已知的抗高脂血症药物或疫苗靶点。迄今为止，抑制PCSK9最先进的方法是单克隆抗体（mAbs），如众所周知的alirocumab和evolocumab，它们于2015年获得FDA批准，并为PCSK9疫苗的开发提供了坚实的临床证据。AT04A和AT06A是两种AFFITOPE肽疫苗候选物，通过诱导PCSK9特异性抗体治疗高胆固醇血症。I期临床试验（NCT02508896）的结果显示，AT04A和AT06都是安全和免疫原性的，但只有AT04A表现出显著的LDLc降低活性。还有其他针对PCSK9的疫苗；例如，基于Qβ VLP的疫苗PCSK9Qβ-003。这种疫苗可以显著降低Balb/c小鼠和LDLR+/−小鼠的总胆固醇和PCSK9表达，并上调肝脏LDLR、SREBP-2、肝细胞核因子-1α（HNF-1α）和HMG CoA还原酶水平。此外，由PCSK-9短肽与KLH融合组成的疫苗在男性载脂蛋白E（ApoE）缺乏小鼠中引起了针对PCSK9的显著长期抗体反应。一个免疫原性肽段，称为免疫原性融合PCSK9-破伤风（IFPT），使用DSPE-PEG-马来酰亚胺脂质（L-IFPT）结合到纳米脂质体表面，并吸附到Alhydrogel上（L-IFPTA+）；这种疫苗候选物在高胆固醇血症小鼠中诱导了针对PCSK9肽段的高IgG抗体反应，并降低了高达58.5%的血浆浓度。 最近，血管生成素样蛋白（ANGPTL）3作为降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酯（TG）水平的新靶点受到了关注。针对ANGPTL3的抗体、反义寡核苷酸和小干扰RNA作为靶向ANGPTL3抑制剂已经开发出来，并正在进行临床试验（NCT03409744、NCT03452228、NCT03747224）。Fukami等人设计了3种针对ANGPTL3的表位肽基疫苗（E1-E3），其中E3（32EPKSRFAMLD41）肽段没有引起细胞毒性，并显著降低了ob/ob小鼠循环中的甘油三酯、LDL-C和小而密的LDL-C（sd-LDL-C）水平；它还减少了肥胖引起的脂肪肝病。除了PCSK9和ANGPTL3的靶点外，还需要研究其他与胆固醇和甘油三酯代谢相关的靶点疫苗，如ApoB-100，以加速推广有效抑制血脂异常的疫苗。 4.结论和未来展望 疫苗是公共卫生的重要工具，在减轻人群中传染病的负担方面发挥着重要作用。在过去20年中，可以有效预防的疾病类型持续增加到40多种。实际上，HPV疫苗对相关恶性肿瘤的预防效果的出现以及前列腺癌治疗性疫苗的推出，标志着疫苗的效用从传统的预防进一步扩展到治疗。然而，许多重大传染病的病原体因素和潜在干预措施仍然不明确，特别是那些由复杂病原体感染（如艾滋病和结核病）和以肿瘤和代谢性疾病为代表的慢性疾病引起的疾病。这些疾病的疫苗开发是世界级的。对于SARS-CoV-1和SARS-CoV-2等突发重大传染病，弱免疫反应或意外的免疫反应（如抗体介导的感染增强、ADE）是创新疫苗研究中难以解决的问题。 因此，新一代更有效疫苗的开发需要在以下四个方向上做出努力。 (i) 佐剂：与佐剂相关的有几个重要因素需要考虑。需要控制和改进佐剂的物理化学性质，优化生产流程，并深入研究分析佐剂的作用机制，以充分了解它们对免疫系统的影响。我们还需要继续探索佐剂和肿瘤抗原的最佳组合，以增强疫苗的免疫原性，并致力于设计针对不同病原体的亚单位抗原、蛋白质或肽的新复杂佐剂；这将得到化学和新材料合成技术的帮助，以增强抗原向免疫细胞的靶向传递（下一点），并克服肿瘤免疫抑制微环境对抗原呈递的抑制。这也可能有助于激活肿瘤特异性T细胞在免疫耗竭和衰老状态下，并促进记忆T细胞的形成。 (ii) 传递系统：药物/疫苗传递系统的最终目标是将货物传递到目标部位，并具有预定的释放动力学和作用持续时间。没有单一的工具适合所有形式的治疗，不同的疫苗形式各有优势和劣势，需要优化以实现传递和治疗。实际上，需要了解人与人之间、人与动物之间在药物吸收、分布、代谢和消除方面的差异，并探索不同疫苗抗原或药物与传递系统的最佳组合。COVID-19大流行提醒我们，未来是不确定的，我们需要不断发展新的传递系统，以适应多样化和精确疫苗发展的趋势。还应注意传递系统的效率和靶向性，更多关注传递系统本身的安全性和临床转化可行性。 (iii) 新抗原的发现和筛选：结合临床和实验室研究成果，全面运用和评估多组学数据和其他自动化高通量功能筛选工具，积极发展新的理论和技术，用于各个领域独特或通用疫苗靶点的筛选和发现。此外，通过下一代测序和生物信息技术，需要设计更有效的预测算法，提高发现有效的肿瘤抗原作为疫苗靶点的几率。 (iv) 联合治疗：由于肿瘤的异质性和复杂的免疫抑制微环境，单一免疫治疗往往无法提供良好的结果，通常导致低反应率或继发性耐药。因此，免疫治疗通常倾向于与不同的治疗方法联合使用。免疫疗法，如免疫检查点抑制剂（ICI）和过继细胞疗法（ACT），已经彻底改变了癌症治疗，特别是对于转移性癌症。实际上，这已经通过在设计肿瘤疫苗时结合多个肿瘤靶点，以及在补充使用免疫疗法来多样化肿瘤治疗中看到。的确，发挥这些优势并避免弱点可以显著改善癌症患者的治疗。 疫苗在历史上已经证明可以提供健康和福祉，新技术为应对传统方法失败的挑战提供了新的可能性。然而，关于新技术的安全性的数据有限，需要考虑疫苗生产和转化的可行性，以及人类免疫反应的复杂性。新技术和策略将有助于解决现在或未来人类面临的复杂或严重疾病，这些知识对于设计有效的疫苗将非常重要。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要：改进的疫苗接种需要更好地传递抗原并激活自然免疫反应。在这里，我们报告了一种脂质纳米颗粒系统，该系统具有携带包括mRNA和蛋白质在内的抗原的能力，通过表面装饰有刺突蛋白形成病毒样结构，展示了对SARS-CoV-2变体的应用。该策略使用Omicron BA.1上的S1蛋白在表面传递XBB.1的S1蛋白mRNA。病毒样颗粒通过表面S1蛋白与ACE2或DC-SIGN受体的相互作用，能够在人类呼吸道上皮细胞和巨噬细胞中特异性增强mRNA的表达。通过相同的受体结合，展示了巨噬细胞和树突状细胞的激活。与单独的mRNA和蛋白质疫苗相比，蛋白质和mRNA的结合在BALB/c小鼠中增加了抗体反应。我们对这种强大免疫机制的探索表明，它可能涉及交叉呈递给从激活的先天免疫信号到适应性免疫信号的不同亚群的树突状细胞。 1.引言 自2019年底由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行开始以来，已经开发并上市了多种针对该疾病的疫苗。然而，这些疫苗的应用并未完全限制大流行的传播，流行病学调查中发现的抗体水平显示出有限的持续时间和对病毒变种的低效性。这些发现表明，SARS-CoV-2与宿主免疫系统之间的相互作用在很大程度上尚不清楚，需要开发新型疫苗。幸运的是，基于脂质纳米递送系统的成功开发，mRNA疫苗取得了突破性进展，提供了新的技术可能性。通过人工脂质膜与细胞质膜的融合，将编码抗原的mRNA通过脂质纳米颗粒（LNP）传递到细胞内，可在细胞内有效表达病毒刺突蛋白（S蛋白）抗原，并诱导随后的S抗原呈递，通过树突状细胞（DCs）和巨噬细胞激活先天/适应性免疫。 根据病毒免疫学研究，在细胞内病毒复制过程中产生的结构和/或非结构抗原可以被先天免疫系统的细胞模式识别受体在宿主免疫反应的抗原信号刺激的首次事件中识别。这意味着mRNA具有通过这种自然免疫途径引发免疫反应的优势；其策略在某种程度上类似于膜状病毒SARS-CoV-2的感染机制，尽管活病毒通常利用病毒膜中的S蛋白与细胞膜中的ACE2受体特异性结合以实现病毒基因组的内化。 因此，当脂质递送颗粒在其表面装载S蛋白时，这些脂质颗粒可能具有类似病毒的结构（VLS），通过受体靶向细胞。特别是，SARS-CoV-2的S蛋白被发现与DC和巨噬细胞表面表达的ACE2或DC-SIGN受体相互作用。这些发现导致合乎逻辑的推断，如果能够构建所提出的VLS系统，它将不仅与注射局部组织的肌肉细胞或上皮细胞相互作用，还与携带ACE2受体或DC-SIGN的先天免疫细胞（例如DCs和巨噬细胞）。先前报道了一种可吸入的纳米疫苗，其具有仿生冠状病毒结构，模拟病毒遗传物质由脂质体包裹，表面装载有S蛋白的受体结合域（RBDs）作为“刺突”以模拟病毒结构，表明VLS的可能性。因此，本研究的目的是设计一种VLS颗粒来包裹mRNA分子并装载蛋白质，并研究其免疫学特性，特别是其通过表面S1蛋白特异性结合到DCs和巨噬细胞上的DC-SIGN来在小鼠模型中引发免疫反应的能力。所获得的数据表明，通过VLS结构将mRNA特异性地传递到DCs的这种策略与常规mRNA疫苗相比具有非常重要的意义。 2.结果 2.1.VLS的特性描述 SARS-CoV-2 mRNA疫苗的早期开发中一个重要的技术基础是通过静电吸引和氢键将mRNA分子与阳离子脂质结合，这导致了mRNA分子被LNPs包裹。在我们的VLS设计中，需要一个脂质载体来包裹mRNA，并装载表面蛋白，这可能需要更大的阳离子脂质电荷容量以在离子环境中进行电荷复合。为了使脂质颗粒同时携带mRNA和蛋白的能力更强，我们的设计包括了两种阳离子脂质分子，((2-(2-羟乙氧基)乙基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)和1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷；一种中心磷脂，1,2-二油酰-磷脂酰胆碱；以及一种聚聚乙二醇(PEG)分子，甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k。通过微流控工艺生产了这种脂质组成和编码SARS-CoV-2 XBB.1株S1蛋白的mRNA的LNP（补充图1a）。这些特征粒子的结构参数（扩展数据表1）和与脂质定量相关的识别mRNA分子（补充图1a）表明了mRNA疫苗的典型特征。此外，这种LNP能够以剂量依赖性的方式将其包裹的mRNA传递到293细胞中（图1a,b）。此外，表达并纯化的S1重组蛋白（补充图1a）被装载在包裹mRNA的脂质颗粒上，以构建具有与mRNA疫苗相似结构特征的VLSs（扩展数据表1）。我们的电子显微镜观察表明装载过程是不可逆的（补充图1b），并且这种VLS的形态特征显示，与单独包裹mRNA的LNP相比，粒子表面有一些凸起，存在差异（图1c）。添加S抗体可以通过抗体桥使颗粒聚集（图1c）。通过免疫沉淀法对VLSs进行结构分析，使用特定的S抗体表明，沉淀的VLS颗粒含有mRNA分子和S1蛋白（图1d）。这些数据支持在我们的设计模型中使用VLS颗粒。 图1 | VLS和LNP的特征。a，荧光显微镜显示LNP、包裹GFP mRNA的LNP和VLS中GFP表达显著。比例尺，250微米。b，通过西方印迹分析检测293T细胞转染LNPs或VLSs 48小时后的S1蛋白。左图：与LNPs相比，293T细胞转染EGFP或S1 mRNA后的S1蛋白表达；右图：转染不同剂量S1 mRNA的VLSs后，293T细胞中S1蛋白的表达。GAPDH作为蛋白装载对照。西方印迹上信号的强度（条带上方）通过ImageJ（版本1.8.0.112）进行密度分析定量。c，LNPs、包裹S1 mRNA的LNPs、VLS和用特定抗S1抗体处理的VLSs的电子显微镜图像。比例尺，200纳米。a-c中的实验均重复了两次。d，总样品、渗透和洗脱中的蛋白（S1或N）和mRNA含量。“IP-S1”表示样品在与特定抗S1抗体孵育过夜后进行了测试，“IP-N”表示样品与抗N抗体孵育。实验装载量相等，并通过西方印迹和SDS-PAGE银染（Input）鉴定。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。 2.2.VLSs使细胞转染并靶向ACE2/DC-SIGN分子 与mRNA疫苗的LNPs相比，当蛋白装载在表面时，VLSs提高了mRNA的传递能力。S1蛋白与ACE2或DC-SIGN分子的结合可能导致VLSs靶向局部组织中具有这两种受体的细胞。我们的研究表明，VLSs不仅能高效转染293细胞（图2a），而且还能增强16HBE细胞培养中的mRNA表达，这不仅显示了目标mRNA的拷贝数（图2b），而且还表达了蛋白质（图2a），并且在添加针对S或ACE2的抗体后呈现恢复（图2c,d）。THP-1细胞也是如此（图2a,b）。基于我们对大约16HBE细胞表达ACE2和THP-1细胞表达ACE2/DC-SIGN的识别数据（补充图2），两种细胞系中mRNA表达的增强可能是由于ACE2或DC-SIGN与S1蛋白的相互作用介导的。此外，用针对DC-SIGN的特定抗体处理THP-1细胞也干扰了VLS mRNA的表达（图2c,d）。这表明VLSs能够通过S1与ACE2和DC-SIGN受体的相互作用，将mRNA传递到人类巨噬细胞中，这与报告的数据一致。此外，表达DC-SIGN的小鼠DCs（JASWIIs）被发现与S1蛋白相互作用（补充图3a）。这些细胞与VLS包裹的EGF或S1 mRNA的转染导致了明显比单独转染LNP包裹的mRNA更大的mRNA表达，因为针对S或DC-SIGN的特定抗体的阻断消除了这种效应（图2c,d和补充图3c）。使用表达DC-SIGN的小鼠RAW264.7巨噬细胞的相同实验也提供了类似的结果（图2c和补充图3b）。基于先前确认的数据，显示人类DCs和巨噬细胞由于表达ACE2/DC-SIGN而被SARS-CoV-2感染，我们的结果表明，VLS与ACE2或DC-SIGN受体的相互作用可能参与了先天免疫的激活。 图2 | VLS通过S1蛋白靶向ACE2/DC-SIGN分子增强细胞转染，实现mRNA传递。a，不同细胞中S1蛋白的表达通过西方印迹进行检测。c，使用不同细胞的受体或S1（N）蛋白的抗体阻断后，通过西方印迹检测VLSs中S1蛋白的表达。LNPs和包裹S1 mRNA的VLSs与293T细胞、16HBE细胞、THP-1细胞、DCs和RAW264.7细胞共孵育。a和c中的实验均重复了两次。b，通过qRT-PCR评估转染到不同细胞的mRNA拷贝数。d，使用细胞受体的抗体阻断或S1（N）蛋白的抗体阻断后，通过qRT-PCR评估转染到细胞的mRNA拷贝数。b、d中，n=3个独立样本，均值±标准差。黄色框架中的蓝色文本显示了不同抗体处理的样本或细胞。显著性差异是通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定的。 2.3.VLSs与DCs和巨噬细胞的相互作用 先前的数据表明，LNPs对mRNA疫苗在细胞中诱导的强烈转录反应是由于LNPs引起的外源性损伤，被认为是mRNA疫苗的不良反应。我们研究了是否可以通过S1蛋白与受体的结合来降低我们VLS的活性。在我们的研究中，用VLSs处理的16HBE细胞中具有免疫激活作用的一些分子的表达倾向于增加（图3a），在THP-1细胞中检测到免疫调节因子的表达增加和炎症介质如肿瘤坏死因子（TNF）的表达减少（图3b）。此外，在小鼠DCs的JAWSII菌株中，包括TNF和GATA-3在内的分子表达倾向于减少，而干扰素（IFN）家族成员的表达倾向于增加（图3c）。在RAW264.7小鼠巨噬细胞中观察到免疫调节因子和炎症因子的转录概况轻微且平衡的上调（图3d）。有趣的是，上皮细胞中干扰素家族成员的上调表达与DCs和巨噬细胞中的相似（图3a,c）。这些结果表明VLSs在先天免疫中具有某种免疫激活作用，这与mRNA/LNPs不同，并支持我们的假设，即S1蛋白对VLS表面的影响不仅可以导致mRNA传递，还可以激活DC中的DC-SIGN信号通路。 图3 | LNPs和VLSs转染细胞的免疫基因转录。a-d，16HBE（a）、THP-1（b）、JASWII DC（c）和RAW264.7（d）细胞在转染只包裹S1 mRNA的LNPs或同时包裹S1 mRNA和S1蛋白的VLSs后24小时的免疫反应相关主要基因的表达谱。蓝色代表只包裹S1 mRNA的LNPs，黑色代表VLSs。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.4.用VLSs对小鼠进行免疫接种引发免疫信号传导的差异 我们对VLSs与免疫系统之间的相互作用的研究表明，无论VLS中包裹的mRNA编码GFP还是S1蛋白，它都在局部组织中动态表达（补充图4），类似于mRNA疫苗的报告。有趣的是，VLS组小鼠局部组织中S1抗原与DCs或巨噬细胞的共定位率大于mRNA或单独蛋白组小鼠（图4a和补充图5a,b）。在初次免疫后3-7天，VLS组小鼠脾脏中CD86+ DCs与CD83+ DCs的比率，这表明由Toll样受体（TLR）信号刺激的DCs的成熟度，大于mRNA或蛋白组小鼠（图4b）。 脾脏中特定CD4+与CD8+记忆T细胞的比率在增强型VLS组以及接受用VLS预处理的DCs组中也大于其他两组（图4c,d），这表明VLSs通过S1蛋白特异性结合到DC-SIGN受体与小鼠DCs的相互作用，随后mRNA的有效表达增强了DCs的活化效率，随后激活T细胞是显著的。进一步的抗体测量显示，在注射后第21天，接受用VLS预处理的DCs的小鼠的抗体滴度大于接受用mRNA或蛋白疫苗预处理的DCs的小鼠（图4e）。在免疫后24至48小时，对接种实验VLS疫苗的小鼠局部组织中各种重要免疫分子的转录水平进行后续分析，发现与单独用mRNA或蛋白免疫的小鼠相比，与DCs和巨噬细胞活化直接相关的一些功能分子的表达增加，如CXCL10和MHCI（图4f）。CXCL10的千倍增加表明，由VLSs激活的DCs可以被分类为cDCs21。进一步对接种免疫的小鼠脾脏中收集的淋巴细胞在免疫后不同时间点进行的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）同源转录组分析显示，与mRNA和蛋白组相比，VLS组显示出特征性的动态轮廓（图4g）。所有转录轮廓的变化表明，接种VLSs和mRNA或蛋白的个体宿主免疫反应存在差异。 图4 | VLSs在小鼠中诱导了先天免疫反应。a，代表性共定位率显示，与肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠相比，在24小时和48小时后S1表达与DCs/巨噬细胞在肌肉中的情况。b，小鼠在免疫后3天和7天，脾脏中CD86+与CD83+ DCs的比率，这些小鼠接受了VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的免疫。c，d，在接受加强和DC处理的输血VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs后，特异性记忆T细胞（c）和活化T细胞（d）中带有CD8标记分子的比率。e，在不同处理组DCs输血后第21天的小鼠抗体滴度。f，小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs后24小时和48小时，与炎症和先天免疫反应相关的主要基因表达谱。g，在初次免疫后7天、14天和28天以及加强免疫后21天，与免疫调节的激活或分化、细胞过程、信号转导和炎症相关的主要基因表达谱的淋巴结。颜色条代表与LNP组数值相比的log2（倍数变化）。颜色越红，基因转录水平上调越明显。组织中炎症细胞因子的相对表达水平通过比较Ct（ΔΔCt）法归一化至空白对照组（LNP）的水平。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.5.VLSs在小鼠中引发更强的免疫反应 基于对我们的VLS疫苗和当前在人群中使用的mRNA疫苗（III期临床试验）（18岁以上）（补充图6）的分析差异，我们的免疫学数据表明，与mRNA或蛋白疫苗中mRNA和蛋白含量相等的VLSs在接种的BALB/c小鼠中引发强大的免疫反应，接种后对Omicron株S抗原的结合抗体水平远高于单独接种mRNA或蛋白的小鼠；高水平维持了八个月以上（图5a），并且小鼠对武汉、Beta和Delta株的S抗原表现出明显的反应性，水平略低（图5b）。使用假病毒和真病毒同步检测变异株的中和抗体也显示了类似的结果（图5c），其中对变异株的中和抗体达到了高于1:103的水平，这在先前对动物和人类的免疫保护研究中被确认为有效。对武汉、Omicron和XBB.1株的RBD的抗体水平在VLS组中大于其他两组（图5d）。与其他两组相比，接种VLS后，尤其是加强免疫后，VLS组小鼠在上呼吸道和血清中分泌的IgA水平增加（图5e）。此外，比较VLS组和mRNA组小鼠淋巴结中活化B细胞的比率表明，VLS组中活化B细胞的比率大于mRNA组（图5f）。重要的是，针对IFNγ和白介素-4（IL-4）的ELISpot检测显示，在免疫后第90天，VLS组的T细胞反应比mRNA和蛋白组更强烈（图5g）。由于观察到IL-4反应的明显加强，同时对这些小鼠的血清中的多种细胞因子进行了检测，结果表明VLS组的大多数细胞因子水平低于mRNA或蛋白组（图5h）。所有数据表明，VLSs引发的免疫反应应与基于VLSs对先天免疫的已知激活效应的mRNAs或蛋白质引发的免疫反应不同。 图5 | VLSs在小鼠中诱导了适应性免疫反应。a,b, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron（a）和野生型（WT）、Beta和Delta（b）株的SARS-CoV-2特异性抗体滴度。样本在初次注射后的第35、49、120、180和240天获取。c, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron真实病毒株BA.5和假病毒的中和抗体（NAb）滴度。d, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron株、XBB.1株和WT株RBD的IgG抗体滴度。e, 由VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs在小鼠中诱导产生的针对Omicron株刺突蛋白的IgA抗体滴度，在免疫后的第21和49天在小鼠BALF（支气管肺泡灌洗液）和血清中。f, 观察到的经VLS和mRNA疫苗处理的小鼠淋巴结中的活化B细胞。g, 在初次免疫后第49天，经肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的小鼠的IFNγ和IL-4的ELISpot反应。橙色框架代表包裹5、10、20和40μg S1 mRNA的LNPs，从浅到深；蓝色边框代表5、10、20和30μg S1肽；蓝色边框中的橙色框架从浅到深代表不同剂量的RNA和肽的不同组合的LNPs。SFC，形成斑点的细胞。h, 加强免疫后第28天，用VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs免疫的小鼠血清中的细胞因子。所有测定值都通过减去空白小鼠血清中检测到的值来计算。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 2.6.VLSs在ACE+/+小鼠中引发的有效免疫保护 在我们的病毒挑战测试中，涉及ACE+/+小鼠和仓鼠（补充图7），结果表明VLSs完全保护了挑战的小鼠免受Omicron BA.5株、XBB.1和武汉株的侵害，因为没有观察到症状（扩展数据表2）。在感染期间，在小鼠的各个器官中检测到很少或没有病毒复制（图6a,b和补充图8-10），并且没有检测到组织病理学变化（扩展数据表3）。值得注意的是，在与VLS阴性小鼠相比，用XBB.1挑战的VLS免疫小鼠的主要器官中没有检测到活病毒（图6c）。此外，对BA.5挑战的小鼠的淋巴细胞在第3天进行了转录组分析。结果表明，与功能反应相关的差异表达基因与免疫系统在VLS组明显不同于其他两组（图6d）。B细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的分类表明，更多的DEGs百分比集中在CD4+细胞和B细胞群体中（图6d）。这些基因主要是与淋巴细胞增殖相关的转录调节分子。结合ACE+/+小鼠VLS组中出色的免疫保护效果，这种独特的转录组轮廓表明，通过VLSs与DCs的稳健结合，通过系统激活DCs在VLS刺激下基于不同信号的整合效应引发的免疫学结果。 图6 | VLSs对C57-hACE+/+小鼠中Omicron BA.5和XBB.1株挑战的影响。a, 在Omicron BA.5株感染后，通过RT-qPCR测定了肌肉注射VLS、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的hACE+/+小鼠在肺、大脑和脊髓中的病毒载量。b,c, 在Omicron XBB.1株感染后，通过RT-qPCR测定了肌肉注射VLS和LNPs的hACE+/+小鼠在大脑、肺、淋巴、气管和脊髓中的病毒载量（b），并通过病毒斑点形成测定了病毒滴度（c）。基线是根据未感染的阴性小鼠中检测到的值定义的。FFU，聚焦形成单位；dpi，感染后天数。d, 在Omicron BA.5株感染后3天，从小鼠肌肉注射VLSs、包裹S1肽的LNPs或包裹S1 mRNA的LNPs的淋巴结组织中分离的CD8+ T、CD4+ T和B细胞的激活或分化相关的显著差异表达基因。颜色条代表与LNP组相比的log2（倍数变化）。颜色越红，表示基因转录水平上调越明显。数据以三个独立实验（n=3）的平均值±标准差表示。显著性差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定。 3.讨论 在过去几年的COVID-19大流行期间，mRNA疫苗为我们提供了新的疫苗研究技术和疫苗设计和开发的新思路。这种技术方法诱导了对传染因子的生物学模仿，并为下一代COVID-19疫苗的开发提供了新的可能性。基于这一进展，我们的工作建立了一个改进的脂质系统，扩大了抗原携带能力，包括mRNA和蛋白。这个系统依赖于由两种阳离子脂质、一种中心磷脂和一种聚-PEG分子组装成的专门脂质颗粒的结构，该结构由mRNA和病毒蛋白组成。这种脂质系统能够有效地包裹编码S1抗原的mRNA，并在其表面携带S1蛋白。此外，我们的结果揭示了表面S1蛋白能够与ACE2/DC-SIGN受体结合，促进mRNA进入细胞并增加抗原表达，除了通过LNP融合到细胞膜的表达之外。因此，我们进一步表明，VLS表面S1蛋白在引导mRNA/LNPs靶向DCs和巨噬细胞方面发挥重要作用，这导致免疫系统对抗原的摄取显著增加。对这些细胞的转录概况的进一步分析表明，VLS能够以平衡的方式激发多种免疫调节因子和炎症介质的表达的一般趋势与mRNA/LNPs不同，这表明了VLS作为疫苗免疫原的重要性。这种设计通过体内免疫学分析进一步得到验证；我们观察到在接种VLS的个体的局部组织中，S1抗原与DCs或巨噬细胞的共定位程度更高，以及在接种VLS的个体的淋巴器官中活化DCs群体的百分比更高，与接种mRNA/LNPs的个体相比。进一步使用体外用VLS预处理的DCs的BALB/c小鼠进行的调查揭示了VLS组中活化T细胞的比例比mRNA疫苗组更高。重要的是，接种VLS的小鼠表现出比接种mRNA/LNPs的小鼠更强烈的抗体反应和更强的细胞毒性T淋巴细胞反应。有趣的是，检测到了从上呼吸道和血清中分泌的特异性IgA。基于进一步的保护性动物测试，我们发现这种增强的免疫力为对抗Omicron BA.5、XBB.1或武汉株提供了更有效的保护。进一步的调查揭示了在VLS组的ACE+/+小鼠在挑战时CD4+细胞群体中大多数基因的系统上调和B细胞和CD8+细胞群体中50%以上基因的上调的差异。这些发现表明，接种VLS的小鼠具有特征性的系统性免疫反应，可能因为来自先天免疫系统的多种信号的综合效应。这些数据支持我们的推测，即VLSs能够与各种细胞相互作用，这不仅导致mRNA的内源性抗原蛋白表达和细胞内TLRs26识别的mRNA分子，而且还有DCs的不同亚群的质膜中的其他TLRs27识别外源性S1蛋白，类似于与DC-SIGN或ACE2的结合。此外，通过脂质融合转染VLSs的上皮细胞的抗原趋化效应使DCs激活以摄取抗原并产生一定的抗原信号。在VLS免疫期间引发的这些事件可能导致不同亚群的DCs和巨噬细胞对T细胞和B细胞的抗原交叉呈递，并可能导致对VLS免疫的强烈免疫反应（扩展数据图1）。因此，我们假设基于在DCs和巨噬细胞中特异性诱导mRNA表达的策略可能有助于开发病毒样疫苗候选物，使其能够引发综合免疫反应，以提供比当前COVID-19 mRNA疫苗更有效的针对病毒变种的保护。 然而，这项研究缺乏足够的数据来解释VLSs的物理化学结构以及它们与细胞（特别是DCs或巨噬细胞）的相互作用机制、在这些细胞中引发的信号以及VLS免疫个体的系统免疫学过程，这值得进一步深入研究。 4.方法 4.1.伦理声明 四周至五周龄的K18-hACE2 C57BL/6小鼠（人类ACE2基因敲入C57BL/6小鼠）由Cyagen Biosciences提供（动物许可证号码SCXK (Su) 2022-0016）。BALB/c小鼠和七至八周龄的金黄仓鼠从Vital River购买（动物许可证号码SCXK (Jing) 2021-0006和SCXK (Jing) 2021-0011）。所有动物都在特定病原体自由的隔离设施中饲养（实验室许可证号码SYXK (Lu) 2020-0019）。实验动物的照顾和使用遵循“3R”原则和动物福利指南。动物实验过程及与动物相关的护理和福利已经山东威高利彤生物制品有限公司的动物实验伦理委员会审查和批准（批准号码LACUC-RD3-2022-006）。 4.2.细胞系 HEK-293T和16HBE细胞在含有10%胎牛血清（FBS；HyClone，GE Healthcare）、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific）中培养。JASWII树突状细胞在含有20% FBS和5 ng/ml小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（HY-P7361，MCE）的MEM Alpha（Thermo Fisher Scientific）中培养。RAW264.7细胞在含有10% FBS的最小Eagle培养基（MEM；Thermo Fisher Scientific）中培养。THP-1细胞在含有10% FBS和0.05 mM β-巯基乙醇（M917637，Macklin）的RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）中培养。所有细胞均从ATCC购买，并在37℃、5% CO2条件下维持。 4.3.病毒 新型冠状病Omicron BA.5株（H株）于2022年12月从COVID-19患者中分离出来。完整的基因组序列已上传至NCBI GenBank（OQ179919.1）。新型冠状病KMS-2株（武汉）于2020年2月从云南省传染病医院的COVID-19患者中分离出来。 4.4.动物实验设计 C57BL/6-ACE2（BALB/c或金黄仓鼠）小鼠被随机分为五组（补充图7）。 扩展数据图7| 推测的VLS疫苗与宿主免疫系统相互作用并引发小鼠免疫反应的机制。➀ 注射的VLS疫苗被上皮细胞内吞。从内体逃逸并进入细胞质后，mRNA在核糖体中被翻译成蛋白质。翻译后的抗原蛋白可分泌到细胞外空间。DCs和巨噬细胞可被VLS引起的局部炎症所吸引。分泌的抗原和VLS疫苗表面的抗原均可被招募的DCs和巨噬细胞摄取，随后激活并呈递给Tfh/Th1和B细胞。➁ 注射的VLS疫苗通过S1蛋白特异性结合DC-SIGN或ACE2受体介导，被DCs和巨噬细胞内吞。传递的mRNA被翻译成内源性抗原，可激活DCs和巨噬细胞。这些激活的免疫细胞能够将抗原呈递给Tfh/Th1和B细胞，以激活特异性免疫反应和B细胞的特异性增殖，产生抗体反应，同时引发特异性CTL反应。➂ VLS疫苗表面的S1蛋白抗原作为外源性抗原，被DCs和巨噬细胞识别和内吞，随后激活并呈递给Tfh/Th1和B细胞。这些途径的所有抗原信号都能激活并增强特异性免疫反应。 在A组（免疫实验组，n=35），C57BL/6-hACE2小鼠被分为四组：对照组、VLS组、mRNA组和肽组。VLS包含20μg mRNA和10μg蛋白；mRNA组小鼠接种20μg mRNA，肽组小鼠接种10μg蛋白。所有小鼠在初次免疫后的第21天进行加强免疫。在初次免疫后的24、48和72小时，从免疫部位获取组织，进行qRT-PCR测量细胞因子表达的免疫荧光检测。此外，在初次免疫后的3、7和14天以及加强免疫后的28天，从淋巴结中分离出B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，进行转录组测序。 在B组（免疫实验组，n=36），C57BL/6-hACE2小鼠被分为三组：对照组、VLS组和mRNA组。用于探索mRNA分子与传递系统的组织部位的mRNA。在肌肉注射后的第1、3、5和7天收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、大脑和淋巴结，进行组织免疫荧光检测。 在C组（免疫实验组，n=72），BALB/c小鼠被分为12组：N1-N12。N1-N4为mRNA疫苗组，N5-N8为VLS疫苗组，N9-N12为肽疫苗组。N1-N4分别包含5、10、20和40μg mRNA。N5-N8包含5μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和5μg肽、10μg mRNA和10μg肽、20μg mRNA和10μg肽。N9-N12分别包含5μg、10μg、20μg和30μg肽。所有小鼠在初次免疫后的第21天进行加强免疫。在免疫后的第35、49、120、180和240天，从尾静脉采集血液样本进行抗体检测。加强免疫后的第28天，收集血液进行中和抗体和结合抗体测试，脾脏进行淋巴细胞分离和ELISpot检测。同时，比较SARS-CoV-2疫苗的免疫滴度。 在D组（免疫保护实验组；C57BL/6-hACE2，n=75；金黄仓鼠，n=40），加强免疫后的第28天，对照组、VLS组、mRNA组和肽组小鼠分别通过鼻内途径用SARS-CoV-2 Omicron BA.5（10^4.5 50%细胞培养感染剂量（CCID50））、SARS-CoV-2野生型（10^4 CCID50）或SARS-CoV-2 Omicron XBB.1（10^4.5 CCID50）进行挑战。在病毒感染后的第3、5和7天收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、气管、大脑、脊髓、淋巴结和性器官，进行病毒载量定量。同时，在挑战后第3天，从C57BL/6-hACE2小鼠的淋巴结中分离出B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，进行转录组测序。 在E组（输血实验，n=27），DCs用LNPs-肽、LNPs-mRNA和VLSs处理12小时。体外处理的DCs（每只小鼠3×10^5个细胞）通过尾静脉输注到小鼠体内。在移植后的第3和5天获取脾脏和腹股沟淋巴结，进行流式细胞术和qRT-PCR。输血后21天测量抗体滴度。上述动物挑战实验由武汉生物制品研究所委托进行。 4.5.LNP传递系统的合成和配方 根据((2-(2-羟乙氧基)乙基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷、1,2-二油酰-磷脂酰胆碱和甲氧基聚(乙二醇)-N-十四烷基十四酰胺-1-2k的分子量，分别在绝对乙醇（优级试剂）中溶解至20%、10%、20%和10%的分子浓度。所有四个组分以30.68:6.84:15.2:1的摩尔比在乙醇中混合，以准备LNP传递系统。mRNA根据请求比例在20 mM醋酸钠、2.5 mM KCl和0.1%海藻糖的缓冲液中稀释。通过NanoAssemblr Ignite+ LNPs（Precision Nanosystems）将空白LNPs与mRNA以1:3的重量比混合制备LNP-mRNA。脂质颗粒进一步通过Zetasizer Ultra光谱仪进行表征。 4.6.SARS-CoV-2 S1 mRNA的合成 通过PCR技术将SARS-CoV-2的S1序列扩增并插入到PVAX载体中。将黄热病病毒的5′-非翻译区（UTR）扩增并插入到Kozak序列之前，将人类线粒体核糖体的3′-UTR扩增并插入到S1序列之后，作为S1序列的5′-UTR和3′-UTR。构建的质粒用BamHI（目录号R0136V，NEB）在37℃下线性化3小时进行体外转录反应。通过体外转录反应（HiScribe T7 ARCA mRNA Kit，目录号E2060S，NEB）合成N1mψ修饰的S1 mRNA。反应混合物用DNase I处理，并使用氯化锂沉淀进行纯化。 4.7.VLS疫苗的制备 通过将LNP-mRNA和肽添加到缓冲液（0.1%海藻糖和3.5%葡萄糖）中，在室温下以30 r.p.m.混合30分钟，然后在4℃旋转混合10 r.p.m.过夜。VLS疫苗进一步通过Zetasizer Ultra光谱仪进行表征。 4.8.LNP转染的mRNA和VLS细胞 然后，将0.5、1、2、5和10μg的mRNA通过LNP传递系统转染到293T细胞中，并在转染后24小时进行西方印迹检测。同时，将mRNA和VLSs转染到16HBE、JASWII DCs、THP-1细胞和RAW264.7细胞中，在24小时后进行西方印迹分析和qRT-PCR测量。 4.9.共免疫沉淀 向LNP包裹的mRNA和VLS疫苗（VLS疫苗装载了BA.1 S1蛋白或N蛋白）中加入抗S1和抗N抗体。然后，加入50μl的磁性珠（BeaverBeads Protein A Matrix Antibody Purification Kit，目录号20102，苏州）并孵育30分钟，在室温下30 r.p.m.。接下来，在磁场中吸附含磁性珠的样品2-3分钟，室温下，上清液用于mRNA和蛋白含量测量。然后，用洗涤缓冲液洗涤珠，加入洗脱缓冲液进行洗脱，并通过qRT-PCR和ELISA测量mRNA和蛋白含量。 4.10.qRT-PCR 通过qRT-PCR测量VLS和mRNA疫苗中的mRNA含量。根据指南，引物的结合位点设计在SARS-CoV-2 S1基因区域，S1基因的一部分构建在pUC57质粒中。体外转录的mRNA用作标准样品。引物为F：TGGATCTGGAGGGAAAGCAGGCAACT和R：CCGATTGGCAGATCCACCAGAGGTTC，TaqMan探针（Sangon Biotech）的序列为5′-6FAM-ATGGCTACTTCAAGATCTATAGCAAGC-TAMRA-3′。通过绝对定量的qPCR确定组织中的病毒载量。根据世界卫生组织的指南，引物的结合位点设计在SARS-CoV-2 N基因区域，N基因构建在pUC57质粒上。引物为F：GAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCT和R：TTGTTGGCCTTTACCAGACATTTTGCT，TaqMan探针（Sangon Biotech）的序列为5′-6FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3′。使用RNAiso Plus（T9108，Takara）从组织中提取病毒基因组RNA，使用一步PrimeScript RT-PCR试剂盒（Perfect Real Time）（TaKaRa，代码RR064A）进行反应。 组织和细胞中细胞因子的相对表达，使用RNAiso Plus（T9108，Takara）提取总RNA。基因表达以与LNP注射的小鼠或未感染病毒的细胞中的水平的倍数变化（2−∆∆Ct）表示，这些水平用于校准。使用一步SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒（TakaRa，代码RR096A）进行反应。使用的具体引物列在扩展数据表4和5中。 4.11.免疫荧光和共聚焦显微镜 收集肌肉组织并立即在液氮中冷冻。组织切片嵌入OCT（Tissue-Tek OCT Compound 4583，Sakura）中，并在冰晶切片机上切成5μm厚（CM1850，Leica）。组织切片固定和用5% BSA封闭。检测病毒抗原时，切片依次用小鼠抗SARS-CoV-2 S抗体（Sino Biological，目录号40150-V08B1）和Alexa Fluor 647偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）孵育。使用抗CD11c抗体（Abcam，目录号ab33483-N418）检测DCs，使用抗F4/80抗体（Zhengneng，目录号263101-31B1），Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗和647偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（Invitrogen）检测巨噬细胞。所有细胞核均使用4,6-二氨二苯吲哚检测，并使用共聚焦显微镜（TCS SP2，Leica）分析。 4.12.病毒滴定 病毒滴度通过斑点测定法确定，按照标准协议进行，如前所述。简而言之，病毒经过梯度稀释并加入六孔板。羧甲基纤维素用作液体覆盖的基质，结晶紫用作染色以增强斑点可视化，细胞在37℃、5% CO2条件下培养7天。 4.13.中和试验 简而言之，血清在56℃下灭活30分钟，连续稀释1:4，并与病毒以100倍CCID50/100μl的滴度混合，在37℃下孵育2小时。混合物加入六孔板，并使用羧甲基纤维素作为基质，结晶紫用作染色以在37℃、5% CO2条件下培养后增强斑点可视化。同时，测量假病毒的血清中和滴度，50%抑制稀释（EC50）定义为血清稀释度，与病毒对照孔（病毒+细胞）相比，相对光单位减少了50%，减去只有细胞的对照组的背景相对光单位。简而言之，假病毒（Acro，目录号PSSO-HLC016）与测试样品的连续稀释1:64在37℃下孵育1小时，与病毒对照和细胞对照孔一起。然后，将293T-ACE2细胞加入每个孔中。在37℃、5% CO2环境中孵育48小时后，测量发光。 4.14.IFNγ特异性和IL-4特异性ELISpot检测 对于ELISpot检测，根据制造商的协议使用小鼠IFNγ和IL-4 ELISpot试剂盒（Mabtech）。简而言之，用脾淋巴细胞接种板，然后加入3μg的刺激物（XBB Spike RBD蛋白，目录号40592-V08H144，Sino Biological；B.1.1.529 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522e，Acro；BA.4/BA.5 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522R，Acro；BA.2.12.1 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522q，Acro；BQ.1.1 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C5240，Acro；BA.2.75.2 Spike RBD蛋白，目录号SPD-C522z，Acro），然后将细胞加入并37℃孵育30小时。接下来，去除细胞和培养基，显色发展。使用ELISpot阅读器（Mabtech）计数有色斑点。 4.15.从小鼠淋巴结中分离B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞 在无菌条件下分离淋巴结并轻轻研磨，将淋巴细胞分离成悬浮液。使用MajoSort小鼠CD19纳米珠（目录号SPD-C522R，Acro 480002，BioLegend）富集B细胞，使用EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒（目录号SPD-C522R，Acro 19852A，Stemcell）富集CD4+ T细胞，使用EasySep小鼠CD8a+选择试剂盒（目录号SPD-C522R，Acro 18953，Stemcell）富集CD8+ T细胞。 4.16.B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞的转录组分析 通过淋巴结分离B细胞、CD4+ T细胞和CD8a+ T细胞。使用TRIzol（目录号DP421，天根）提取总RNA。使用NanoDrop系统和Bioanalyzer评估RNA数量和完整性，并根据Illumina的说明准备样品并测序（Gene Denovo Biotechnology）。在京都基因与基因组百科全书分析中，选择表达变化2倍或更大的基因在P < 0.05，并按功能类别进行分组。所有转录组测序结果已上传至GSA；提交的指定访问号码为CRA010542。 4.17.酶联免疫吸附试验（ELISA） 使用SARS-CoV-2 Spike Protein ELISA Kit（Acro，目录号RAS-A039）定量S1抗原，并使用SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit（Jiya Biotechnology）定量核蛋白。使用SARS-CoV-2 RBD (Wild-Type) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目录号DD3201-01）、SARS-CoV-2 RBD (Omicron BA.4/5) Antibody (IgG) Detection Kits（Vazyme，目录号DD3214-01，中国）和Mouse Anti-2019-nCoV (S) IgA Elisa Kits（FineTest，目录号1906）进行S1-RBD IgG检测。使用Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.1.529) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T061）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T045）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.351) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T084）、Mouse Anti-SARS-CoV-2 (B.1.617.2) Antibody IgG Titer Serologic Assay Kit (Spike S1)（Acro，目录号RAS-T086）进行S1抗体检测。光密度值至少比阴性对照高2.1倍的血清样本被视为阳性。终点滴度定义为产生阳性光密度值的最高血清稀释度。几何平均滴度计算为每组阳性血清样本的终点滴度的几何平均值。 4.18.西方印迹法 蛋白质通过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用5%牛血清白蛋白-三羟甲基氨基甲烷缓冲液与Tween-20（Sigma-Aldrich）封闭，并与抗SARS-CoV-2 S1抗体（MHC0102，云南乐鹏科技）、抗ACE2抗体（Abcam，目录号ab15348）和抗DC-SIGN抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号sc-74589）孵育2小时；洗涤三次，然后用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Sigma）孵育1小时。最后，PVDF膜洗涤三次，用ECL超敏化学发光试剂（NCM Biotech，目录号P10100）覆盖，并在Bio-Rad凝胶成像仪上曝光和显色。 4.19.SDS-PAGE的银染 用试剂盒（Fast Silver Stain Kit，目录号P0017S，Beyotime）对制备的SDS-PAGE凝胶进行银染。SDS-PAGE凝胶的银染分为十个步骤：固定、用30%乙醇洗涤、水洗、增感、水洗、银染、水洗、显色、终止和水洗。 4.20.流式细胞术分析 在疫苗初次和加强免疫后的第3天和第7天收集淋巴结和脾脏，并分离淋巴细胞。用于检测DC激活表面标记的流标抗体为PE/Cy5-CD45（目录号MA5-38732，Thermo Fisher）、PE/Cy7-CD11c（目录号A15849，Thermo Fisher）、FITC-CD80（目录号A14722，Thermo Fisher）、APC-CD83（目录号ab234119，Abcam）和PE-CD86（目录号12-0862-82，Thermo Fisher）。用于检测特定T细胞表面标记的流标抗体为BV421-CD44（目录号103019，BioLegend）、APC-CD25（目录号102011，BioLegend）、PE/Cy5-CD3（目录号100205，BioLegend）、FITC-CD4（目录号100405，BioLegend）、APC/Cy7-CD8（目录号100713，BioLegend）和PE-Tetramer（Helixgen COVID-19 MHC-I Tetramer）。用于检测活化B细胞表面标记的流标抗体为FITC-CD19（目录号115505，BioLegend）、PerCp/Cy5.5-GL7（目录号144609，BioLegend）和PE-S1（Expedeon，目录号336-005）。细胞在4℃下染色30分钟，流式细胞分析（LSR Fortessa，BD）前洗涤两次。 4.21.Luminex分析 根据制造商的说明进行Bio-Plex Mouse 23-Plex Panel试剂盒（目录号M60009RDPD）检测。简而言之，通过将重组标准品连续稀释，生成了从1.6到10,000 pg/ml的标准曲线。通过向每个孔中移液200μl的检测缓冲液来阻断滤板。10分钟后，通过真空吸引弃去检测缓冲液，向指定的样品孔中加入25μl的检测稀释液，向标准品孔中加入RPMI 1640 with GlutaMAX（Gibco）。然后，向相应的孔中加入标准品或样品，以及25μl的抗体包被的荧光珠子。生物素标记的二抗和链亲和素-荧光素标记的抗体随后通过交替孵育和洗涤步骤加入到孔中。然后，向孔中加入100μl的鞘液，立即使用Bio-Plex阵列阅读器在高和低RP1目标上使用五参数逻辑回归曲线进行读取。 4.22.统计分析和可重复性 对于西方印迹和电子显微镜、免疫荧光检测至少重复两次；对于ELISA，定量分析至少重复三次。所有数据表示为均值±标准误差。组间显著性差异通过GraphPad Prism进行分析。统计显著性设为P < 0.05。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

2024年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）年会将于当地时间9月13日至17日在西班牙巴塞罗那召开。ESMO年会作为全球规模最大、学术水平最高、最具权威的肿瘤学会议之一，汇集来自世界各地肿瘤学领域的一流专家、临床医生以及临床研究人员，共同探讨全球肿瘤诊疗先进治疗理念和前沿临床及转化研究热点。 在本次大会上，荣昌生物原创原研的我国首个获批上市的国产抗体偶联（ADC）药物维迪西妥单抗入选1项口头报告，10项壁报展示，研究涉及泌尿系统肿瘤、乳腺癌、胃癌、宫颈癌等领域，全面展示创新ADC药物在多个肿瘤治疗领域取得的突破性进展。小荣带您先睹为快，敬请期待！ 01 口头报告 #1967MO  维迪西妥单抗联合帕博利珠单抗在初治HER2表达阳性局部晚期或转移性尿路上皮癌中的初步疗效和安全性 Preliminary Efficacy And Safety Of Disitamab Vedotin (DV) With Pembrolizumab (P) In Treatment (Tx)-Naive HER2-Expressing, Locally Advanced Or Metastatic Urothelial Carcinoma (la/mUC): RC48G001 Cohort C 展示形式：简短口头报告 讲者：M. Galsky 教授 美国纽约西奈山医学中心 时间：9月15日，09:40 - 09:45 地点：Bilbao Auditorium - Hall 2 02 壁报展示 泌尿系统肿瘤 #1979P  一项维迪西妥单抗(DV)联合特瑞普利单抗(T)用于不可切除的局部晚期或转移性尿路上皮癌(la/mUC)的Ib/II期研究的长期结果 Disitamab vedotin (DV) plus Toripalimab (T) in unresectable locally advanced or metastatic urothelial carcinoma (la/mUC): Long-term outcomes from a phase Ib/II study  主要研究者：郭军教授 盛锡楠教授，北京大学肿瘤医院 展示时间：9月15日 #1984P 维迪西妥单抗联合吉西他滨新辅助治疗肌层浸润性膀胱癌的疗效和安全性：一项多中心、单臂的Ⅱ期试验 Efficacy and safety of disitamab vedotin combined with gemcitabine as neoadjuvant therapy for muscle-invasive bladder cancer: A multi-center, single-arm, phase II trial 主要研究者：胡志全教授 杨春光教授，华中科技大学同济医学院附属同济医院 展示时间：9月15日 #2002P 维迪西妥单抗联合免疫新辅助治疗肌层浸润性膀胱癌患者的疗效及生物标志物分析：一项多中心真实世界研究 Efficacy and biomarker analysis of neoadjuvant disitamab vedotin combined immunotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer: A multi-center real-world study 主要研究者：祖雄兵教授 严鲁哲教授，中南大学湘雅医院 展示时间：9月15日 #2009P PUNCH02：MIBC患者通过替雷利珠单抗联合维迪西妥单抗保膀胱治疗达到尿液肿瘤DNA（utDNA）定义的临床完全缓解（cCR）的Ⅱ期研究主要结果 PUNCH02: Primary results from a phase II study of tislelizumab combined with disitamab vedotin as a bladder preservation therapy for urine tumor DNA (utDNA)-defined clinical complete response (cCR) MIBC patients 主要研究者：陈俊星教授 黄斌教授，中山大学附属第一医院 展示时间：9月15日 #2018P 选择高危上尿路尿路上皮癌 (UTUC) 患者的保留肾单位手术联合围手术期全身治疗:一项前瞻性II期试验的试点研究 Nephron-sparing Surgery Combined with Perioperative Systemic Therapy in Select High-risk Upper Tract Urothelial Carcinoma (UTUC) Patients: A Pilot Study for a Prospective Phase 2 Trial 主要研究者：魏强教授 鲍一歌教授 陈泽昱教授，四川大学华西医院 展示时间：9月15日 乳腺癌 #317TiP 一项评估维迪西妥单抗(HER2-ADC)联合特瑞普利单抗或序贯化疗新辅助治疗HR阴性、HER2低表达乳腺癌患者的安全性和疗效的随机、多中心、开放标签的Ⅱ期研究 A Randomized, Multicenter, Open-Label Phase II Neoadjuvant Study to Evaluate the Safety and Efficacy of HER2-ADC Disitamab Vedotin in Combination Toripalimab or Sequence Chemotherapy in Participants With HR-negative, HER2 Low-expressing Breast Cancer  主要研究者：邵志敏教授 复旦大学附属肿瘤医院 展示时间：9月16日 #384P 维迪西妥单抗(RC48)用于既往经治的伴PAM通路异常激活的HER2表达转移性乳腺癌：一项前瞻性的单臂Ⅱ期临床试验的结果 Disitamab vedotin (RC48) for previously treated HER2-expressing metastatic breast cancer with abnormal activation of PAM pathway: Results from a single-arm, prospective phase II clinical trial 主要研究者：马飞教授 莫红楠教授，中国医学科学院肿瘤医院 展示时间：9月16日 胃癌/食管癌 #1474TiP 一项比较维迪西妥单抗(DV)联合特瑞普利单抗和化疗、维迪西妥单抗联合特瑞普利单抗以及单纯化疗用于HER2表达的局部晚期胃或胃食管结合部腺癌(GC/GEJ)围术期治疗的随机Ⅱ期研究 A randomized phase 2 study of Disitamab Vedotin (DV) plus toripalimab and chemotherapy versus DV plus toripalimab versus chemotherapy as perioperative treatment for HER2-expressing locally advanced gastric or gastroesophageal junction adenocarcinoma (GC/GEJ)  主要研究者：李子禹教授  北京大学肿瘤医院 展示时间：9月16日 #1467P 维迪西妥单抗联合卡瑞利珠单抗和S-1用于HER2过表达局部进展期胃癌新辅助治疗的疗效和安全性:一项前瞻性、单臂的Ⅱ期研究的初步结果  Efficacy and safety of Disitamab vedotin (RC48) combined with camrelizumab and S-1 for neoadjuvant therapy of locally advanced gastric cancer with HER2 overexpression: Preliminary results of a prospective, single-arm, phase II study 主要研究者：柴杰教授 王龙刚教授，山东省肿瘤医院 展示时间：9月16日 宫颈癌 #794TiP 维迪西妥单抗与赛帕利单抗联合立体定向体放射治疗（SBRT）用于治疗复发性、转移性宫颈癌的单臂、开放标签的Ⅱ期研究 Disitamab Vedotin and Zimberelimab combined with Stereotactic Body Radiation Therapy for the Treatment of Recurrent, Metastatic Cervical Cancer: A Single-Arm, Open-Label, Phase II Study 主要研究者：徐沁教授 福建省肿瘤医院 展示时间：9月14日 关于维迪西妥单抗 维迪西妥单抗是由荣昌生物自主研发的我国首个获批上市的靶向HER2的原创性抗体偶联药物(ADC)新药。作为我国首个获得美国FDA、中国国家药监局突破性疗法双重认定的ADC药物，维迪西妥单抗目前已有胃癌、尿路上皮癌两大适应症获批上市，且被纳入国家医保药品目录。该药物采用全新的、亲和力更强、内吞效果更好的人源化抗体，并使用先进的连接子和小分子细胞毒药物，具有专一的靶向性、更高的疗效及更好的安全性。目前，荣昌生物正在探索维迪西妥单抗与PD-1、化疗等联合方案治疗多种实体瘤的潜力。 来源 | ESMO官网 编辑 | 春媛 荣昌生物 科创板上市  |  港交所上市 挺进医保  |  License out 维迪西妥单抗  |  泰它西普 RC28  |  RC108  |  RC118