beclin-1

外源性细胞因子工程化被认为是增强抗肿瘤T细胞免疫的解决方案之一。常见细胞因子对CAR-T细胞的作用包括：细胞因子对CAR-T细胞特性的影响IL-2增强增殖和效应能力IL-7延长潜在寿命，提高效应功能的持久性IL-9维持T细胞干性，增强效应功能IL-15延长细胞寿命IL-8增强T细胞向肿瘤迁移的能力IL-10通过代谢重编程恢复耗竭T细胞功能IL-12直接上调细胞毒性，调节免疫抑制TMEIL-18增强效应功能，重塑TMEIL-23提高效应功能，减少耗竭表型IL-33调节TMEIL-36γ增强细胞毒性，调节TMEIL-37恢复耗竭T细胞功能在实际开发应用中，把握共表达细胞因子的安全性和有效性依然是一个挑战。近期还是有一些相关研究团队继续关注着细胞因子CAR结构的开发。IL-4IL-4是肿瘤细胞在TME中释放的细胞因子，可以通过与T细胞表面的IL-4受体结合来对抗T细胞效应功能。通过转化细胞因子受体CAR(ICR)是抑制这种免疫抑制作用的常见方法，IL-7和IL-21通常是对应转化细胞因子的选择。华师大的研究团队近期则设计了一款4/15NKG2D-CAR，由基于NKG2D的嵌合抗原受体组成，IL-4R作为细胞外结构域共表达，IL-15R作为跨膜和细胞内结构域共表达，从而将IL-4R抑制信号转化为下游的IL-15R激活信号。(doi:10.1016/j.biopha.2023.115740.)4/15NKG2D-CAR-T在小鼠模型中表现出提高细胞毒性、增殖水平、存活率、未分化表型比例等抗肿瘤作用。IL-7(doi:10.1007/s10565-023-09821-w)研究人员设计了一款GPC3-7-19-CAR-T细胞用于治疗HCCs。杀伤效率是单纯GPC3-CAR-T细胞的1.5-2倍。在小鼠实验中表现出提高浸润CD4+ T细胞亚群比例、募集更成熟的DCs、减少PMN-MDSC和Treg细胞浸润，从而诱导TME重塑。该CAR-T在1例GPC3+ 晚期HCC患者身上展开了临床试验。结果显示，CAR-T治疗后，淋巴结节明显缩小，CT扫描显示CAR-T注射后56天患者纵隔淋巴囊萎缩，CD8+ T细胞的比例(67.9%)远高于基线(16.6%)。采用的患者来源CAR-T细胞阳性率为69%。IL-10IL-10在肿瘤发展和发病机制中的作用似乎是自相矛盾的。IL-10本身具有强大的抗肿瘤作用，通过免疫依赖性机制抑制转移，包括抑制浸润性巨噬细胞和血管生成因子以及激活CD8 + T细胞CTL。但同时，研究也报道了TAM产生的IL-10可以通过抑制APC的功能并随后阻断T细胞效应功能，来减弱抗肿瘤反应。矛盾的IL-10(doi:10.1038/s41587-023-02060-8)2024年1月浙江大学/唐力教授团队合作研究开发了一款表达IL-10的CAR-T，在小鼠实验中表现出能够维持线粒体健康、促进OXPHOS代谢等代谢重编程功能，实现肿瘤的消除。据称该CAR-T已经展开IIT临床试验，至少已有11名复发难治性淋巴瘤或复发难治性急性白血病患者达到完全缓解，CR接近100%。重新认识IL-10：提升CAR-T的CR至100%IL-13Rα2IL-13Rα2则和其他细胞因子的使用不同，其主要是因为在肿瘤上特异性表达而被当做靶点。1.(doi:10.1038/s41591-024-02893-z)近期野马生物/希望之城公布了其IL13Rα2靶向CAR-T MB-101的1期临床数据。所有患者的中位总生存期（中位OS）为8个月，高于复发胶质母细胞瘤的6个月预期生存期，而五项细分亚组中，最大剂量第五组OS达10.2个月。(只剩6个月时，他敲响了CAR-T的门)2.(doi:10.1038/s41591-024-02893-z)同期，吉利德/宾法大学也公布了其靶向EGFR和IL13Rα2的鞘内二价CAR T细胞同样治疗复发性胶质母细胞瘤的1期试验中期结果。该CAR-T会在过表达(EGFR扩增)和/或EGFR胞外结构域突变而发生EGFR 激活失调时激活。接受治疗的6名患者的中位随访时间为2.5个月，所有 6 名患者都观察到增强肿瘤大小的减小，部分肿瘤消退维持在第 +28 天及以后。然而，没有一个达到RANO标准的客观反应标准。IL-15(doi:10.3389/fimmu.2023.1165404)2023年信达生物与苏州大学合作设计的一款H9 CAR-IL15 T细胞，旨在解决其Claudin18.2 CAR-T疗法的长期持久性问题。小鼠 IL-15 修饰赋予肿瘤脉管系统靶向 CAR-T 细胞增强的效应器功能、植入和重编程TME能力，从而在免疫功能正常的小鼠中更好地控制肿瘤。其结果显示，在体外实验中，mIL-15对CAR-T细胞杀伤活性的明显影响仅保持较短时间，在超过三轮刺激后消失，可能和IL-15浓度不足相关。尽管IL-15在体外试验中对CAR-T细胞的总体影响通常不显著，但其在体内的作用是显著的。即使没有淋巴细胞清除预处理，H9 CAR-IL15 T细胞仍然产生明显的肿瘤抑制作用，而未修饰的CAR-T细胞几乎没有效果，从而有机会降低淋巴细胞清除方案造成的毒性作用。IL-24(doi:10.1038/s41416-024-02601-1)IL-24主要是通过靶向肿瘤细胞的干性来影响免疫细胞的疗效，可以通过多种途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡，包括DNA损伤、SARI诱导、AIF、ATM和beclin-1轴。同时IL-24还可促进T细胞活化、中枢记忆分化和增殖，但不影响其凋亡。郑州大学研究人员通过构建IL-24 CAR-T细胞，旨在通过IL-24影响抗原丢失的肿瘤细胞对CAR-T的耐药性。体内模型显示，分泌IL-24的CAR-T细胞能更好地控制晚期肿瘤和复发。小结目前很多细胞因子CAR-T都能在安全性方面有较好表现，但实际有效性还是参差不齐的。其他参考文献：Shi H,et al.(2023) IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front. Immunol. 14:1165404. doi: 10.3389/fimmu.2023.1165404

▲ 详细日程见文末 ▲摘要:伪狂犬病毒（PRV）是一种高度传染性疾病，可感染大多数哺乳动物，猪是唯一的天然宿主，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。先天性免疫是宿主抵御病原体攻击的第一道防线，对于适应性免疫的正常建立至关重要。宿主会利用先天性免疫反应来抵御PRV的入侵，但PRV会利用各种策略来抑制先天性免疫反应，从而促进病毒的复制。目前，世界范围内用于预防猪感染PRV的减毒活疫苗，如Bartha K61。然而，越来越多的数据表明，这些疫苗并不能完全抵御自2011年底以来出现的PRV新变种。本文综述了PRV与宿主天然免疫之间的相互作用以及减毒活疫苗的研究现状，旨在促进新型、高效PRV疫苗的研制。关键词：伪狂犬病毒，先天免疫，免疫逃避，减毒活疫苗，重组疫苗。1背景PRV是导致伪狂犬病（PR）的病原体，也被称为奥杰斯基病（AD，Aujeszky’s disease）。PRV属于α-疱疹病毒亚家族，宿主范围很广，虽然猪是它的天然宿主，但包括人、猫、狗、山羊和牛在内的许多哺乳动物也可能感染。猪感染PRV可引起呼吸道、生殖和神经系统症状。处于不同生长阶段的猪会出现不同的症状。受PRV感染的新生仔猪会出现神经系统症状，死亡率高达 100%，而成年猪一般只表现出轻微的呼吸道症状，但会在神经系统中形成终生潜伏感染，这种潜伏感染可被重新激活，成为病毒的动态贮存库。PRV具有大约143kb 的双链DNA基因组，紧密排列，至少70个开放阅读框，并含有两个反向重复序列。几种 PRV 蛋白发挥调节宿主先天性免疫反应的功能，主要包括干扰素(IFN)系统、细胞凋亡和自噬，以促进病毒的产生。先天免疫对病毒感染反应迅速，但病原体清除和预防再感染的关键依赖于后天免疫系统，而高质量的先天免疫反应是建立后天免疫系统的先决条件。因此，了解 PRV 的先天免疫逃避机制对于疫苗的开发具有重要意义。自PRV流行以来，以 Bartha K61为代表的减毒活疫苗在预防和控制该病方面发挥了重要作用。然而，自2011年以来，中国出现了新的变异。Bartha K61对PRV变异株感染不能提供完全的保护作用。新的疫苗的开发是一个必要条件，一些学者认为，增强先天免疫能引起病毒的衰减。病毒先天免疫逃避的破坏可以减少病毒的毒力，同时建立强有力的免疫应答。本文综述了PRV先天性免疫逃避的多种策略，主要包括干扰素系统、自噬和细胞凋亡，以及PRV减毒活疫苗的研究进展。我们希望这篇综述能够为开发针对新型PRV变异体的疫苗提供一些思路。2PRV的先天免疫调节机制病毒感染诱导先天免疫应答，并通过模式识别受体 (PRR) 识别病原体相关分子模式 (PAMPs) 激活抗病毒先天免疫应答。据报道，宿主可以通过几种PRR识别PRV感染: Toll样受体2 (TLR2)，环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶 (cGAS)，RIG-I样受体 (RLRs)，DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 盒多肽41 (DDX41) 和IFN调节因子的DNA依赖性激活剂。随后，特异性信号传导途径被激活以响应病原体感染而产生干扰素、促炎因子和趋化因子。我们总结了参与先天性免疫系统调控的PRV编码蛋白，重点是那些参与逃避 IFN 介导的免疫反应的蛋白（图1；表1）。图1 PRV通过编码多种蛋白质调节IFN介导的先天性免疫应答表1 PRV 因子与宿主的先天免疫系统相互作用2.1 IFN-I系统IFN-I 介导的先天性免疫应答是宿主抵抗病毒感染最有效的防御策略之一。然而，病毒在长期的进化过程中，已经发展出了各种各样的逃避宿主免疫的策略。PRV 通过几种策略调节宿主的先天性免疫反应。采用微阵列技术，用野生型 PRV 株感染细胞后，IFN-β 通常诱导的一部分基因表达下降。在病毒感染后，病毒 DNA 首先被细胞质 DNA 传感器 cGAS 识别，导致 cGAS 中的构象开关催化第二信使 cGAMP 的产生，然后 cGAMP 与位于内质网上的 STING 结合。它们转运到高尔基体，招募TANK-结合激酶1（TBK1）和IRF3/7，并使IRF3/7磷酸化，最后磷酸化的IRF3/7被转运到细胞核，激活编码IFN-I的基因转录。随后，JAK-STAT通路被IFN-I激活，启动数百个ISGs的转录，从而调节细胞因子。PRV 编码一系列蛋白质来规避 IFN-I 介导的先天免疫，其主要靶标是 cGAS-STING 信号通路和 IFN-I 信号通路（表 1）。STING是cGAS-STING 通路中的关键蛋白之一，一项可靠的研究表明，PRV UL13 招募 E3 连接酶 RING-finger 蛋白 5 (RNF5)，以促进 STING 的 K27-/K29 链接泛素化和降解。过氧化物酶1（PRDX1）通过与TBK1和IκB激酶ε（IKKε）相互作用来促进IFN诱导，Lv等人证实UL13能降解PRDX1，从而抑制IFN的产生，这取决于其激酶活性。研究表明，UL13 可通过泛素化和蛋白酶体介导的降解作用降解 IRF3。Bo等人通过筛选50种PRV蛋白发现UL13限制了ifn-β 转录。进一步的研究发现，UL13利用其激酶活性诱导IRF3磷酸化，从而减弱IRF3与其启动子的结合。gE和US3也以多种方式抑制IRF3活性。gE通过降解irf3的伴侣CREB结合蛋白 (CBP) 来抑制IFN的产生。US3抑制IRF3的活性，通过蛋白酶体途径机械降解IRF3。UL24通过降解irf7损害DNA传感途径。ifn-i介导的先天免疫反应是宿主抵抗病毒感染的最有效防御策略之一。然而，病毒已经开发了各种策略来逃避宿主免疫。在漫长的进化过程中。PRV以几种策略调节宿主先天免疫应答。当使用微阵列技术用野生型PRV株感染细胞时，通常由ifn-β 诱导的基因子集的表达降低。病毒感染后，病毒DNA首先被细胞质DNA传感器cGAS识别，导致cGAS中的构象转换以催化第二信使cGAMP的产生，然后cGAMP与位于内质网上的STING结合。JAK/STAT 信号通路在 IFN-I 介导的 ISG 产生中起重要作用。JAK/STAT 通路受 PRV 广泛调控。PRV 阻断了 JAK/STAT 信号通路重要节点 STAT1的磷酸化。几种病毒蛋白在这一过程中发挥积极作用，包括 EP0，US3，UL24，UL42和 UL50。EP0蛋白是通过抑制 IRF9的转录来拮抗天然宿主干扰素应答所必需的。Bcl-2相关转录因子1(Bclaf1)维持 STAT1和 STAT2磷酸化，并通过与 ISRE 和 STAT2直接相互作用来转录 ISG 来促进 ISGF3与 ISRE 的结合。US3通过蛋白酶体途径降解 Bclaf1抑制 ISG 的产生，促进 PRV 的免疫逃避。此外，UL42还干扰 ISGF3与 ISRE 的结合，其他一些研究发现 UL24抑制 ISG (包括 OASL，ISG20等)的转录。发现 UL50降解 IFN 受体以下调 IFN-α 免疫应答。Janus 激酶磷酸化并传导干扰素的抗病毒信号，最近发现 PRV 通过诱导蛋白酶体降解而降解 Janus 激酶。然而，其中涉及的机制仍不清楚。核因子-κB（NF-κB）在调节免疫、炎症反应、细胞增殖和存活方面起着至关重要的作用。NF-κB 的主要形式是由 p50 和 RelA 亚基组成的异源二聚体，它们以抑制活性的状态与 IκB 家族蛋白结合。当细胞受到应激、细胞因子或病原体入侵等各种刺激时，NF-κB 抑制蛋白 IκBα 被激活并与 NF-κB 分离，通过蛋白酶体途径降解，NF-κB 进一步转运到细胞核，激活各种基因的转录。细胞 NF-κB 信号通路受到 PRV 感染的严重影响。最近的研究发现，PRV编码蛋白UL13通过抑制RIG-I和MDA5的转录来调节NF-κB的活化，从而抑制RLR介导的IFN-β的产生，以逃避先天宿主免疫。此外，UL24 与 p65 相互作用，介导蛋白酶体途径中的 p65 降解，从而影响 NF-κB 的激活。总之，PRV 从多个方面调控 IFN 的功能，包括 IFN 的产生和 IFN 信号通路。病毒抑制 IFN 信号转导的能力与毒力之间存在密切的相关性。通过删除 STAT1/2 拮抗剂可以减弱麻疹病毒。一项重要研究发现，PRV 的糖蛋白 gE/gI 复合物能显著抑制浆细胞树突状细胞（pDCs）分泌 IFN。与野生型（WT）PRV 株相比，删除了 gE/gI 的 Bartha K61 减毒疫苗株通过 pDC 触发了更强的 IFN-I 反应。恢复甚至改善在野生型 PRV 感染中受损的 IFN 系统是一种很有前景的抗病毒策略。尽管 IFN 系统并不是病毒毒性的唯一决定因素，但它仍具有重要作用。PRV 的免疫逃逸因子在病毒感染中所起的关键作用为疫苗和抗病毒药物的开发提供了潜在的目标。2.1 细胞凋亡、自噬和坏死细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，其特征是细胞膜起泡、染色质凝结和 DNA 断裂，同时保持膜的完整性，形成凋亡小泡。细胞凋亡是宿主抵抗病原体入侵的一种手段，它使受感染的细胞过早死亡，导致病毒增殖中止，并通过轻度释放抗原诱导特异性免疫。有报道称 PRV 诱导细胞凋亡。PRV 的 US3 和 gE 蛋白不仅能拮抗 IFN 系统，还能通过不同途径抑制细胞凋亡。研究表明，US3 可激活 PI3K/Akt 和 NF-κB 通路，从而抑制细胞凋亡；gE 可使细胞外信号调节激酶 1/2（ERK1/2）磷酸化，从而降解促凋亡蛋白Bim。DNA 损伤反应（DDR）对维持基因组完整性至关重要，它根据损伤程度导致 DNA 修复、细胞周期停滞和细胞凋亡。PRV 感染会造成宿主细胞的 DNA 损伤，导致细胞凋亡，最近的研究表明 PRV 与 DDR 之间存在更深入的对话。磷酸化的 H2AX 是 DDR 的标志，而 PRV 的 UL13 可与 H2AX 相互作用并磷酸化 H2AX，从而促进其复制。富亮氨酸 PPR 矩阵蛋白（LRPPRC）是一种多功能蛋白，也是第一个独立于 Caspase 蛋白之外的凋亡蛋白。最近，Xu 等人发现 PRV 的 UL16 蛋白与 LRPPRC 相互作用，减弱了 LRPPRC 对 NF-κB 的激活，而 NF-κB 是 PRV 复制的宿主限制因子。这些基因是开发新型减毒活疫苗时有望减弱 PRV 的靶标。自噬可用于修复细胞内成分，并在细胞饥饿时为细胞提供重要的能量和物质。越来越多的研究表明，自噬是免疫反应不可或缺的一部分。PRV 可诱导细胞自噬，通过经典的 Beclin-1-Atg7-Atg5 途径促进复制。Wnt/β-Catenin信号通路调节细胞增殖、分化和存活。最近的研究发现，PRV 感染会显著激活 Wnt/β-Catenin 信号通路，这可能会通过上调病毒诱导的自噬促进病毒增殖。自噬通路似乎被 PRV 利用，Sun等人的研究表明，PRV 对自噬的调控十分精妙，在感染早期诱导细胞自噬，这与病毒复制无关，随着病毒复制的进展，自噬水平下降。进一步的研究发现，US3 可激活 PI3-K/AKT 通路来抑制自噬。US3 对细胞自噬的抑制有利于细胞存活，并可能促进 PRV 的复制。Bcl2-associated athanogene 3（BAG3）参与调节细胞凋亡、发育、细胞骨架组织和自噬。BAG3 可抑制 PRV 复制，PRV 蛋白 UL56 与 BAG3 相互作用，并通过溶酶体途径降解 BAG3；但在 WT PRV感染中却观察不到这种现象。PRV的其他一些蛋白可能会拮抗UL56降解BAG3的活性，具体细节还有待进一步探讨，BAG3可能是生成稳定细胞系以生产高水平PRV减毒活疫苗的潜在靶标。坏死是一种不同于细胞凋亡的细胞死亡形式。在受体相互作用蛋白激酶 3（RIPK3）及其伴侣蛋白（RIPK1、TRIF、DAI 或其他）的帮助下，混合谱激酶结构域（MLKL）被激活，导致细胞破裂，释放出大量与损伤相关的分子，并引发炎症反应。PRV 以依赖 RIPK3 的方式导致细胞坏死，而抑制坏死会促进 PRV 复制。PRV 是否会阻断坏死尚不清楚，但其他一些疱疹病毒，如小鼠巨细胞病毒（MCMV）编码的 M45/vIRA 可阻断 RIPK3 的活性，同样，HSV-1 编码的核糖核苷酸还原酶大亚基（ICP6）可与人体细胞中的 RIPK3 相互作用，从而抑制坏死。这些信息表明，PRV 可能具有某种潜在的能力来抑制细胞坏死，从而促进其复制。细胞凋亡、自噬和坏死是细胞死亡的三种典型形式，随着时间的推移，这些形式的细胞死亡的独立性和相关性得到了越来越多的认识。当细胞受到刺激并相互转化时，可以同时诱导多种类型的细胞死亡。PRV 感染与宿主死亡率之间的关系是复杂的，PRV 与宿主之间的相互作用是研制抗 PRV 感染的新型疫苗和抗病毒药物的基础。3PRV变异体的基因组进化目前，许多欧美国家已宣布自己不再感染 PRV，中国已通过接种 Bartha K61疫苗有效地控制了 PRV 感染。自2011年以来，中国东部和北部的几个养猪场发生了 PRV 感染暴发，更令人担忧的是，这些受感染的猪已经接种了PRV疫苗。2011年以前，尽管不同的 PRV 分离株的生物学特性不同，但只有一种PRV血清型。他等人根据 PRV全长序列构建了最大似然树，结果表明目前的PRV分离株可分为基因型1和基因型2两个不同的分支。利用 gC 基因构建的最大进化枝可信度树证实了 PRV 分为进化枝1和进化枝2，同时表明这两个进化枝已经独立传播了几个世纪。最大似然树分别基于 gB 和 gD 构建，PRV 分为两个进化枝，毫无疑问，Bartha K61和2011年后的变异被分配到不同的进化枝。有趣的是，2011年以后，中国的 PRV 分离株主要是基因型2，这部分解释了为什么 Bartha K61疫苗(基因型1)不能提供对新型 PRV 变异体的完全保护。GB、 gC 和 gD 是主要的抗原基因，易发生突变，因此经常用于 PRV 系统发育分析。抗原基因的独立系统发育分析使得更容易理解疫苗和不同毒力株之间的关系。研究表明，PRV 变异体 gC 和 gD 的突变在逃避 Bartha K61诱导的免疫中起关键作用。天然突变和重组体促进 PRV 菌株多样性的变异。翟等人于2017-2019年间从中国东部的养猪场采集了 PRV 样本。根据 gC 基因，这些 PRVs 属于进化分支2。主要 PRV 糖蛋白 gB，gC，gD 和 gE 的测序分析显示分离物内氨基酸序列分歧最大，分别为4.0,0.7,0.3和1.1% 。与 Bartha K61疫苗株相比，这些分离株在几个蛋白位点有突变，特别是 S41G，R162H 和 S345L 在 gC 上的变化可以改变受体结合和/或糖基化，这可能导致变异 PRV 的出现。自然重组加速了病毒基因组的进化，生物信息学分析表明，在 PRV 基因组中经常发生包被和包被重组。Tan 等人发现了一种新的 HN2019 PRV 毒株，它来源于经典 PRV (如 Ea)和 HB-98疫苗毒株的重组。胡等人利用 Bartha K61对所有中国分离株进行重组预测，得到23个重组事件。Bo 等人发现 Bartha 菌株为重组 JSY13变体提供了部分基因。早期伪狂犬病病毒 SC 株是介于中国地方性病毒株和巴萨疫苗样病毒株之间的重组病毒株。这些报道表明，重组在中国 PRV 的演变中起着关键作用。Bartha K61是近半个世纪前引入中国的，长期免疫对 PRV 的突变和重组有很大的贡献。因此，PRV 的监测和进化分析对于 PR 疾病的预防和控制非常重要，而这些信息可以为 PRV 疫苗的开发和使用提供关键信息。4PRV活疫苗接种疫苗是预防传染病的最有效策略之一。根除 PRV 运动的成功主要归功于应用了优良的 PRV 疫苗。然而，传统的疫苗接种并不是一劳永逸的解决方案，人类与传染病的斗争仍在继续。PRV 变异体在中国的流行促使我们集中精力开发新的和更有效的疫苗来阻止 PRV 变异体大流行。减毒疫苗保留了病原体的大部分自然结构。尽管如此，它们在体内的复制能力和毒力降低，现在普遍认为减毒疫苗提供更好和更完整的免疫保护，特别是 T 细胞介导的免疫(图2)。减毒活疫苗是目前应用最为广泛和发展最为迅速的疫苗。本节总结了目前减毒活疫苗和基于病毒载体的活疫苗研制的进展和关键问题，并对新型活疫苗的研制提供了见解。图2 野生型伪狂犬病毒和减毒活疫苗可诱导体内产生后天免疫系统4.1减毒活疫苗大多数 PRV 疫苗是基于部分基因缺失的减毒活疫苗。PRV的美国区基因US3、 US和US8是主要的毒力基因，被认为是对PRV复制不重要的非核心基因。US2在大多数疱疹病毒中保守，通过调节ERK的定位间接调节MAPK的活性。另一项研究表明，缺失PRV us2基因会增加病毒滴度。US9是一种膜蛋白，在病毒传播过程中发挥着至关重要的作用疱疹病毒(包括 PRV)的顺式神经传输。UL23编码一个与PRV毒力相关的非结构蛋白 PK，几乎不具有免疫原性。目前这些基因常被用作PRV衰减剂。第一株PRV减毒活疫苗 Bartha K61株是最好的改良活疫苗之一。对巴沙 K61疫苗株进行了体外连续传代，获得了减毒特性。后来，研究人员在 Bartha K61的美国区域发现了许多缺失，包括 US8和 US9基因的完全缺失和 US7和 US2基因的部分缺失。随着 PRV 遗传学和分子生物学的进步，PRV 基因的作用还没有被恢复，更多的基因缺失的 PRV 疫苗正在通过各种技术被开发。基因工程技术，如同源重组、细菌人工染色体和 CRISPR/Cas9基因编辑系统，可以快速构建基因缺失的菌株，作为活的减毒性病毒候选菌株。这主要包括单基因缺失、双基因缺失、三基因缺失、四基因缺失和五基因缺失疫苗(表2)。表2 PRV减毒活疫苗概述尽管减毒活疫苗对PR的预防和控制具有重大意义，但一些研究人员对减毒活疫苗在易感动物中的安全性提出了质疑。减毒性病毒菌株rPRvtJ-delgE/gI对猪是无毒的，但对绵羊是致命的，这表明gE和gI的缺失可能不足以减弱。另一组基于PRVΔTK&gE-AH02株构建TK/gE双基因缺失疫苗，导致1日龄无PRV抗体仔猪死亡。基于PRVΔTK和gE-AH02的PK基因缺失导致PRV病毒进一步减弱，并且在接种没有 PRV 抗体的新生仔猪后没有观察到临床症状。最近的一项研究发现，基于gE/TK缺失菌株的 US3基因的进一步缺失在具有更高水平的中和抗体，细胞因子和组织驻留记忆T细胞(TRM)的小鼠中具有更好的免疫原性。值得注意的是 US3编码的PK蛋白，它广泛参与PRV的免疫逃逸，如第1.2节所述。因此US3基因可能成为活体减毒性病毒设计和开发的有希望的目标。越来越多的基于突变体的减毒PRV疫苗已经开发出来，但仍有一些问题需要进一步考虑。首先，减毒剂仅限于US2、 US3、 US7、 US8、 US9和UL23的单个或多个缺失，下一步需要进一步开发新的减毒相关基因; 其次，多基因缺失后的病毒生长特性很少受到关注，一些基因缺失可能会降低病毒滴度，影响减毒活疫苗的生产; 最后，该疫苗在除猪以外的动物中的安全性有待进一步研究，特别是在非人灵长类动物中。为了控制新的 PRV 变种，更新疫苗株以匹配循环株是最关键的。因此，必须继续监测现场菌株的变化，并据此构建新的候选疫苗。我们的一般概念是，疫苗的安全性与毒力相关基因缺失的数量呈正相关，但更多的基因缺失对疫苗株的免疫原性和产量有更大的影响。减弱病毒免疫逃避是构建减毒疫苗的一种策略。先前的研究显示，US3、 US8、 UL13、 UL16、 UL24、 UL42、 UL50和 EP0有助于 PRV 逃避宿主的先天免疫，因此这些基因具有构建减毒性病毒的潜力。免疫逃逸基因的引入可以降低 PRV 的毒力，提高其安全性。例如，Wang 等人构建的 PRV EP0缺失突变体对 IFN-α 介导的抗病毒免疫更敏感。另一个研究小组构建了一个 UL50缺失的 PRV 突变体，该突变体对 IFN-α 介导的病毒抑制类似敏感。尽管缺乏动物研究来验证这些基因降低毒力的能力，将 PRV 免疫逃逸基因导入目前的减毒活疫苗是一个有希望的策略来产生新的 PRV 活疫苗。4.2. 抗多种病原体的减毒重组PRV活疫苗猪至少受到40种病原体的威胁，其中包括16种病毒、15种细菌、8种寄生虫和1种原生动物。近年，猪只传染病如非洲猪瘟、口蹄疫、猪只繁殖与呼吸系统综合症、猪细小病毒和流感等已被广泛记录。针对每一次潜在的疫情爆发，采用适当的疫苗接种是最有效的方法，但现场存在许多混合感染。不同疫苗在短期培养周期内多次正确接种是很难实现的。异源抗原基因在病毒基因组中的插入和表达导致额外的免疫保护或增强的免疫效应是一个令人兴奋的研究课题。PRV 有一个很大的基因组，如前所述，一些基因的缺失使其减弱而不会显著影响其生长能力和免疫原性。几种基于伪狂犬病毒的载体疫苗已经研制成功。例如，共同表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)的 PrM-E，经典猪瘟病毒(CSFVs)的 E2，口蹄疫病毒 p12A 和3C，PPV VP2，猪三角冠病毒(PDCoV)穗(S) ，PRRSV gP5和 M，ASFV 和SARS-CoV-2S 或 N 的 CP204L (p30) ，CP530R (pp62) ，E183L (p54) ，B646L (p72)和 EP402R (CD2v)基因。这些多价疫苗对许多疾病具有预防作用，但其在猪体内的安全性和有效性仍有待进一步研究。这些研究表明，基因缺失的减毒 PRV 病毒可以作为一种有前途的载体来开发针对两种或两种以上病原体的多价疫苗。分子佐剂通过多种机制调节免疫系统，从而提高疫苗的效力。设计合适的分子佐剂来构建基于基因缺陷PRV的重组活疫苗是一个很有前景的方向。Zheng等人构建了表达PPV VP2蛋白和猪IL-6的重组PRV，显著增加了 PPV 特异性淋巴细胞的增殖。将Fms相关酪氨酸激酶3配体（Flt3L）插入到TK和gE缺陷的PRV中，构建重组HNX-TK-/gE--Flt3L，可显著促进树突状细胞的成熟和活化(DCs)。5结论PRV仍然是猪的主要传染源之一。此外，人类感染PRV的持续发生增加了 PRV 的风险水平。PRV利用多种策略逃避宿主先天免疫。先天性免疫逃逸基因的修饰或缺失是开发新型减毒活疫苗的一个有前途的策略。减毒性病毒活菌株也是研制新型多价疫苗的良好载体，可对抗病毒、细菌和支原体等两种或多种病原体，特别是与呼吸道有关的病原体。另外，合适的分子佐剂的插入可以大大提高疫苗的保护效率。尽管已有几种 PRV 疫苗应用于临床，但加快新型疫苗的研制是当前PRV变种和其他病原体流行的迫切需要。参考资料：Nie Z, Zhu S, Wu L, Sun R, Shu J, He Y, Feng H. Progress on innate immune evasion and live attenuated vaccine of pseudorabies virus. Front Microbiol. 2023 Mar 3;14:1138016. doi: 10.3389/fmicb.2023.1138016. PMID: 36937252; PMCID: PMC10020201.为了推动兽用生物制品行业交流，共同探讨该领域的最新研发进展、产业化现状及未来发展趋势，生物制品圈联合四叶草会展、乘风济海将于2024年4月17日-18日在南京共同举办“兽用生物制品研发和产业化大会”，系中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）中的一个分领域专业会议。诚邀全国相关领域研究者共享学术盛会。名称：兽用生物制品研发和产业化大会时间：2024年4月17日-18日（周三-周四）地点：南京国际展览中心主办单位：生物制品圈、抗体圈、四叶草会展，乘风济海媒体支持：药时空、细胞基因研究圈报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请（严格审核通过）。大会日程注：大会日程以会议现场为准。中国医药全产业链新资源大会（CBC大会）是一场将“政、产、学、研、用、管、投”各方精英围绕全产业链新资源展开的合作大会，将于2024年4月16日-18日在南京国际展览中心举办。大会将主打“全产业链新资源对接”，围绕投资、立项、临床前研发、临床研究、生产、供应链国产化、销售、MAH合作、国际品种合作、公司股权合作与并购全产业链，为中国医药同仁带来全新的资源与商机。大会下设的同期会议包括：宠物药品、食品、保健品新资源大会兽用生物制品研发和产业化大会透皮技术研发生产与注册开年分享会吸入制剂研发、生产与注册新机遇新进展分享会中国改良新药与缓控释制剂全产业链合作大会陆续更新中......识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

引言Von Hippel-Lindau（VHL）蛋白在明确细胞肾细胞癌（ccRCC）中经常发生突变，是氧化应激中涉及的缺氧诱导因子（HIF）的主要调节因子。然而，VHL是否具有HIF-独立的抑制肿瘤活性仍然不太清楚。2024年2月15日，浙江大学许大千、吕志民及哈尔滨医科大学雷博共同通讯在EMBO Journal 在线发表题为“VHL suppresses autophagy and tumor growth through PHD1-dependent Beclin1 hydroxylation”的研究论文，该研究证明VHL抑制营养应激诱导的自噬，其在散发性ccRCC标本中的缺失与自噬水平显著升高，并与患者预后较差相关。在机制上，VHL直接结合自噬调节因子Beclin1，其在Pro54上的PHD1介导的羟基化之后。这种结合抑制Beclin1-VPS34复合物与ATG14L的结合，从而抑制了营养缺乏时的自噬起始。非羟基化的Beclin1 P54A的表达使VHL介导的自噬抑制失效，并显著减少了VHL的肿瘤抑制效应。此外，Beclin1 P54-OH水平与野生型VHL表达的人ccRCC标本中的自噬水平呈负相关，并与患者预后不良相关。此外，将VHL缺失的小鼠肿瘤与自噬抑制剂和HIF2α抑制剂联合治疗能够抑制肿瘤生长。这些发现揭示了VHL抑制肿瘤生长的一个意想不到的机制，并暗示了通过联合抑制自噬和HIF2α治疗ccRCC的潜在方法。Von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因的体细胞突变在散发性肾细胞癌（RCC）中普遍存在，其中明确细胞肾细胞癌（ccRCC）是最常见的亚型。VHL蛋白（VHL）作为一个伏林支架蛋白（CUL2）-环泛素连接酶复合物的底物识别模块，结合到缺氧诱导因子（HIF）1/2α上。这种结合依赖于HIF1/2α中两个保守脯氨酸残基的水化，由脯氨酸羟化酶酶（PHD1，又称EGLN2）、PHD2（EGLN1）和PHD3（EGLN3）催化，这些酶需要氧气作为辅基质。因此，PHD介导的HIF1/2α水化导致VHL介导的HIF1/2α泛素化和在正常氧化条件下降解，但在低氧条件下，PHD的活性被低氧水平抑制，导致增强的HIF1/2α表达诱导下游基因表达。VHL患者肾脏中出现的VHL缺陷病变显示出HIF和HIF靶基因的增加，小鼠VHL–/– ccRCC异种移植实验显示HIF2α促进肿瘤的作用，而HIF1α限制肿瘤的作用。然而，一些VHL–/–ccRCC细胞系不受HIF2α活性操纵的影响，一些VHL突变的ccRCC对HIF2α抑制剂治疗具有抵抗性，这表明VHL缺陷通过尚未确定的和与HIF2α无关的机制促进肿瘤发展。模式图（Credit: EMBO Journal）自噬在癌细胞中经常失调，并在肿瘤发生中起着关键作用。癌细胞可以具有高水平的基础自噬，通过利用自噬分解产物，如氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂肪酸，进行生物合成和能量生成，来增加自噬，从而生存于微环境应激，并增加生长和侵袭性。在自噬启动期间，自噬体核形成需要一个复合物，在这个复合物中，哺乳动物Beclin1（酵母中的APG6）招募III型磷脂酰肌醇3激酶VPS34来生成磷脂酰肌醇3磷酸（PI（3）P），以便结合具有PI（3）P结合结构域的蛋白质，从而调节细胞内的内部运输和自噬体形成。与VPS34形成复合物的ATG14L与Beclin1相互作用，并将VPS34以及其膜锚VPS15靶向到前自噬体结构，并促进自噬体-内吞体融合。除了通过含有ATG14L的Beclin1/VPS34调节自噬外，Beclin1/VPS34还形成与UV辐射抵抗相关基因（UVRAG）的不同复合物，以调节内吞运输。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）、雷帕霉素抑制的机械靶向拉帕霉素样激酶-1（ULK1）、磷酸甘油酸激酶-1（PGK1）和Bcl-2依赖的调节Beclin1/VPS34/ATG14复合物在自噬活动中发挥重要作用。然而，肿瘤抑制因子是否以肿瘤类型特异的方式直接和差异地调节Beclin1/VPS34/ATG14L复合物活性和自噬仍然未知。该研究证明VHL通过直接与由PHD1水化的Beclin1结合并抑制ATG14与Beclin1/VPS34的结合来抑制ccRCC细胞中营养应激诱导的自噬。Beclin1 P54A敲入表达使VHL介导的自噬抑制失效，并促进肿瘤生长。原文链接https://doi.org/10.1038/s44318-024-00051-2责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文Nature | 癌症与神经系统的致命舞蹈