DCAF1

研究背景由与E3泛素连接酶配体连接蛋白质靶向配体形成的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的靶向蛋白质降解已成为一种通过蛋白酶体介导的降解致病蛋白质的强大治疗方式。虽然有超过600个E3连接酶，但是大多数PROTAC只利用了Cullin-RING E3泛素连接酶的底物受体——cereblon和VHL。近年来，还发现了许多其他针对其他E3连接酶的募集蛋白，包括cIAP、MDM2、DCAF16、DCAF11、RNF114、RNF4、FEM1B、KEAP1和DCAF1。并不是所有的E3连接酶都对癌细胞活力至关重要，因此，癌细胞中可能会出现耐药机制，从而损害E3连接酶募集并使PROTAC无效。开发针对泛素-蛋白酶体机制核心成分的募集剂，例如针对对细胞活力至关重要的CUL1-CUL7 E3连接酶中的Cullin-RING E3连接酶复合接头蛋白（如DDB1、SKP1 或ELOB/ELOC）的募集剂，可以避免PROTAC可能产生的潜在未来耐药机制。加州大学伯克利分校Nomura课题组研究了CUL1-RING E3连接酶接头蛋白SKP1是否可以被募集用于PROTAC介导的新底物降解。研究内容该课题组在基于凝胶的基于活性的蛋白质分析（ABPP）中筛选了1284个半胱氨酸反应性共价配体，筛选了针对人SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物（图1）。该筛选产生的性能最良好的化合物是EN884（图2）。EN884显示了SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物中人SKP1蛋白的半胱氨酸反应性探针的剂量反应置换（图3）。   图1.半胱氨酸反应性共价配体库筛选结果（针对SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物）图2.EN884结构图3.EN884与半胱氨酸探针反应该课题组对与 EN884 一起孵育的SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物进行了串联质谱（MS/MS）分析，以确定修饰位点（图4），发现了一个被修饰的位点——SKP1上的C160（图5），该位点由于特定的F-Box结构域，表现出独特的构象。因此，该课题组假设EN884可能会利用SKP1和CUL1底物受体之间的集体界面并结合。图4.串联质谱分析图5.结合位点位置 接下来，该课题组合成了两个基于EN884的炔烃功能化探针SJH1-37-m、SJH1-37-p（图6）。基于凝胶的ABPP评估这些探针与SKP1复合物的结合，与对位相比，间位结合能力更佳（图7）。    图6.探针结构图7.探针结合能力值得注意的是，由于C160位置特殊，EN884和SJH1-37m不与单体SKP1结合（图8）。这表明，CUL1复合物的其余部分，或至少是底物受体，是配体与SKP1结合所必需的。图8.探针与单体SKP1结合       该课题组进一步证明，SJH1-37m通过SKP1的下拉在细胞中结合SKP1，而不是不相关的蛋白质，如GAPDH（图9）。   图9.SJH1-37m探针的SKP1下拉接下来，该课题组进行了基于质谱的ABPP，以使用先前建立的同位素脱硫生物素-ABPP（isoDTB-ABPP）鉴定HEK293T细胞中EN884参与SKP1的半胱氨酸。该课题组发现EN884在SKP1上与C160有7%的最小参与（图10）。这种最小参与与已应用在PROTAC（包括DCAF16、DCAF11和RNF114）中的其他共价E3连接酶募集剂观察到的最小参与一致。图10.HEK293T细胞中EN884的isoDTB-ABPP分析为了证明共价SKP1配体可用于PROTAC应用，该课题组合成了四种不同的PROTAC，通过C2、C4、C5或PEG3连接子将EN884的衍生物与BET家族抑制剂JQ1连接起来，分别生成SJH1-51A、SJH1-51B、SJH1-51C和SJH1-51D（图11）。所有四种PROTAC都降解了HEK293T细胞中BRD4的短亚型（图12），其中使用C4烷基接头的SJH1-51B观察到的降解最强。   图11.四种PROTAC结构图12.四种PROTAC降解效果并且，基于串联质量标记（TMT）的MDA-MB-231细胞中SJH1-51B的定量蛋白质组学分析显示BRD4中等选择性降解，其中16种蛋白质的水平显着降低>50%（图13）。   图13.SJH1-51B的定量蛋白质组学与蛋白酶体介导的降解一致，SJH1-51B介导的BRD4降解通过用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理而减弱（图14）。它还显示出对活性Cullin RING E3连接酶所需的NEDD化的依赖性，NEDD化抑制剂MLN4924可减弱BRD4的降解（图15）。最重要的是，该课题组证明SKP1敲低完全减弱了SJH1-51B在HEK293T细胞中对BRD4的降解（图16）。图14.硼替佐米预处理结果图15.MLN4924预处理结果图16.SKP1敲低细胞结果BRD4是一种相对容易被PROTAC降解的蛋白质。因此，该课题组接下来测试了共价SKP1募集剂是否可用于降解另一种新底物蛋白——雄激素受体（AR）。该课题组合成了4种AR PROTAC，将共价SKP1募集剂与来自ARV-110的Arvinas AR PROTAC靶向配体连接起来，没有连接子或C4、C6或C7烷基连接子，分别产生SJH1-63、SJH1-62C、SJH1-62D和SJH1-62B（图17）。该课题组观察到所有4种PROTAC的AR降解，其中带有C7烷基接头的SJH1-62B在LNCaP前列腺癌细胞中显示出最有效和最强大的AR降解（图17）。 图17.四种AR PROTAC结构与降解效果该课题组进一步证明，SJH1-62B介导的AR降解在蛋白酶体抑制剂预处理后减弱（图18）。定量蛋白质组学分析还表明，AR与其他11种蛋白质的选择性降解在5000多种定量蛋白质中也显著降低（图19）。图18.SJH1-62B的硼替佐米预处理结果图19.SJH1-62B的定量蛋白质组学研究总结 该课题组发现了一种SKP1募集物，它共价靶向位于SKP1和CUL1 F-box底物受体界面的SKP1的固有无序C160。这一观察结果为发现仅在含有IDR的蛋白质与其相互作用的蛋白质形成复合物时出现的可连接位点提供了概念证明。他们进一步证明，这种共价SKP1配体可用于PROTAC应用，以降解细胞中的新底物，如BRD4和AR。鉴于SKP1的重要性，SKP1的共价募集可能潜在地克服在癌症治疗中利用非本质E3连接酶的PROTAC的耐药性机制。虽然该课题组证明了在PROTAC中使用Cullin RING E3连接酶衔接蛋白的概念，但SKP1配体仍处于早期阶段，需要进行重大的药物化学优化，以提高效力、选择性和类药物特性。   该课题组的研究结果还强调了使用共价化学蛋白质组学方法来识别泛素-蛋白酶体系统中蛋白质的补充物的实用性，该系统可用于靶向蛋白质降解应用。作者：潘相奕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月29日参考文献Exploiting the Cullin E3 Ligase Adaptor Protein SKP1 for Targeted Protein Degradation ACS Chemical Biology 2024 19 (2), 442-450. DOI: 10.1021/acschembio.3c00642    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

近日，来自诺华公司的Claudio R. Thoma和Martin Schröder 在 Nature Communications上发表了一篇题为《DCAF1- based PROTACs with activity against clinically validated targets overcoming intrinsic- and acquired-degrader resistance》的文章。报道了一种基于E3连接酶受体DCAF1的非共价PROTACs分子开发，DCAF1是CRL4连接酶亚家族中包含WD40重复结构域（WDR）的E3连接酶，作者以核蛋白BRD9和酪氨酸激酶BTK作为降解对象，证明了DCAF1的PROTACs可用于靶向降解，并提供了一种替代策略来解决VHL和CRBN耐药。 靶向蛋白质降解 (TPD) 通过小分子诱导的 E3 连接酶重定向来泛素化新底物并标记它们进行蛋白酶体降解，从而调节蛋白质水平。TPD最近已成为药物发现的关键模式。到目前为止，人类基因组编码超过600种E3连接酶，只有少数E3连接酶被用于TPD，包括 CRBN、VHL、cIAPs、MDM2、DCAF15、DCAF16和KEAP1等，基于这些E3连接酶已经开发了一些E3连接酶配体，包括常见的VHL配体VHL-7, CRBN配体免疫调节抑制药物 （IMiD）泊马度胺、来那度胺及其衍生物等。在TPD应用中，很少有其他非共价配体能与这些E3酶的效果相匹配。E3连接酶的共价配体具有一定的缺点：降低了PROTAC分子的催化性质、可能会阻断天然底物的降解、更容易产生靶向毒性。共价E3配体的不可逆性质也可能使高特异性连接酶配体产生复杂化。用于TPD最广泛的免疫调节药物是沙利度胺及其衍生物，它们已被批准用于治疗多发性骨髓瘤（MM），它是一种依赖IKZF转录因子的浆细胞恶性肿瘤。但IMiD治疗的MM患者中，大约30%的难治性患者的CRBN水平发生了改变，在大多数情况下会出现拷贝丢失，而较低的CRBN含量会导致IMiD介导的IKZF降解减少，进而出现耐药。CRBN是一种基于全基因组CRISPR KO研究的非必需基因，因此，靶向必需的E3连接酶是一种潜在的策略，可以避免或至少延缓治疗耐药性的出现。 近期WDR配体的发现（EED27和WDR52）表明WDR是可靶向的，23年一篇文章报道了DCAF1的WD40 domain的可逆配体，进一步强调了开发基于非共价DCAF1的PROTACs的潜力。在约600个E3连接酶中，作者重点研究了48个含有WDR结构域作为推定识别基序的E3连接酶。DCAF1是CRLDAF1和EDVP复合物的一部分，显示出与DDB1相似的肿瘤重要性。此外，DCAF1已被证明是Cullin4连接酶组合中的首选受体，并且是CRL4 E3连接酶中第二丰富的CRL4受体，仅次于CRBN（图1）。 利用核磁共振、计算机辅助药物设计、生物物理学和结构-活性关系等方法，作者筛选和优化了EED27的WDR配体，发现了化合物13通过伯胺占据DCAF1 WDR donut-hole口袋的支架，另一端的哌嗪位于口袋出口，可以用于后续的衍生。作者于是构建了炔基衍生的化合物16并进行了化学蛋白质组学实验，实验结果表明化合物16可以成功富集到整个CRL4-DCAF1复合物（包括CUL4A/B，DDB1，DDA1和RBX1）（图1）。 考虑到DCAF1主要定位在核质中，作者首先测试了DCAF1 PROTAC能否靶向降解BRD9。作者将已知的BRD9溴结合域配体与化合物13的哌嗪部位偶联，得到了PROTAC分子DBr-1，并通过TR-FRET和SPR评估了其对DCAF1的结合力，结果成功证明了DCAF1- DBr-1-BRD9三元复合物的形成。随后作者在细胞内验证了DBr-1的降解能力，结果显示在HEK293细胞中1000 nM的DBr-1在6 h后成功降解了90%的BRD9，且该过程可以被蛋白酶体抑制剂所抑制。浓度为1000 nM DBr-1的时间梯度降解实验显示，30 min后降解90%并保持6h以上，24h和48h后缓慢反弹。选择性实验也表明，DBr-1在降解BRD9的同时仅对BRD7有微弱的影响（图2）。 基于VHL的BRD9 PROTAC VZ185也可以降解BRD7和9，而CRBN的PROTAC dBRD9可以选择性地降解BRD9。为了评估DCAF1 PROTAC的选择性并对其性能进行测试，作者直接比较了DBr-1与VZ185、dBRD9在HEK293细胞中降解BRD9和BRD7的能力。结果显示，DCAF1的降解效果与CRBN和VHL基本相当（图3）。 在成功降解BRD9之后，作者探索了DCAF1 PROTACs是否也可以介导核外蛋白的降解。dasatinib结合超过30种激酶，并在低纳摩尔浓度下抑制ABL、DDR、TEC、SRC和EPH亚家族的57种酪氨酸激酶。作者将dasatinib偶联到DCAF1配体上，合成了另一个的PROTAC DDa-1。首先通过WB测试DDa-1对四种非受体酪氨酸激酶的作用：C-Src酪氨酸激酶（CSK）、Lck/Yes相关蛋白酪氨酸激酶（LYN）、LIM结构域激酶2（LIMK2）和Abelson蛋白酪氨酸激酶1（ABL1）。结果显示CSK和LIMK2蛋白水平在6小时后以蛋白酶体（26Si）和CRL依赖方式（NAE1i）显著降低，但LYN或ABL1蛋白水平没有下降。与CRBN-dasatinib降解剂CDa-1相比，DDa-1对这两种降解激酶的降解能力有所降低（图4）。 为了深入了解全局蛋白丰度的变化，作者利用蛋白质组学的方法分析了DDa-1处理6小时后的HEK293T细胞。证实了两种激酶CSK和LIMK2的下调，并进一步发现了另外两种非受体酪氨酸激酶TEC和TNK2显示出显著的蛋白水平降低。据报道，TEC和TNK2都优先定位于质膜。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是TEC家族的另一个成员，已被证明是PROTAC介导的劫持CRBN降解的一个有吸引力的靶标。因此作者后续构建了一个BTK筛选系统，在该系统中测试DDa-1验证了内源性BTK降解的发现（图4）。 随后作者使用一个特异性的BTK配体合成了不同的DCAF1-BTK PROTACs。选择了两个分子进行进一步的表征，DBt-5是通过一个长的聚乙二醇linker连接，而DBt-10通过一个更刚性的linker连接DCAF1和BTK配体。通过TR-FRET和SPR评估这两种PROTAC的DCAF1二元亲和性。DBt-5对DCAF1的亲和性略高于DBt-10。在TR-FRET和SPR实验中，额外的BTK增加了DBt-10对DCAF1的亲和力，而降低了更柔性的DBt-5对DCAF1的亲和力（图5）。 作者进一步评估了DCAF1-PROTAC-BTK三元复合物的形成以及两种PROTAC处理后BTK的体外泛素化。DBt-10的初始速度和最大SPR响应高，说明稳定的三元配合物可以提高泛素化效率。尽管DBt-5和DBt-10表现出不同的二元和三元配合物稳定性和细胞渗透性，但DBt-5和DBt-10都能有效降解BTK-GFP。DBt-10的毒性比DBt-5小，因此选择DBt-10进行后续实验，结果表明DBt-10具有高选择性并能显著降解BTK（图5）。以上结果证明DCAF1配体也可以用于开发高选择性的PROTACs。 作者选择缺乏VHL表达的768-O细胞作为模型。基于VHL的降解剂VZ185并不能有效降解BRD9。在相同的实验环境下，DCAF1和基于CRBN的BRD9降解剂DBr-1和DBRD9对BRD9的降解效率基本一致。这些结果证实，在VHL不表达的生物学环境中，DCAF1是PROTACs应用的另一种必需连接酶（图6）。 随后作者又测试在基于CRBN的PROTACs失去降解能力的情况下，必需的连接酶DCAF1是否可以作为替代品。DCAF1和CRBN都需要相同的结合伙伴（如DDB1和CUL4A）来形成活性E3连接酶复合物。使用CRBN-BTK PROTAC敏感和耐药的TMD8细胞来进行研究，研究结果显示用DBt-10检测TMD8 CBt敏感和耐药的细胞，结果显示BTK的降解没有差异，而使用CBt处理这两种TMD8细胞系导致了100倍的增殖抑制差异。以上实验数据表明DCAF1是一种极具潜力CRBN和VHL的替代物（图6）。 内容来源于网络，如有侵权，请联系删除。

▎药明康德内容团队编辑传统的药物发现主要集中在蛋白质活性的直接调控上。蛋白质活性调节剂，特别是抑制剂的开发和应用一直是药物开发的主流。近年来，靶向蛋白降解剂（TPD）快速发展，有望彻底变革药物发现和开发。与传统的小分子抑制剂主要通过阻断蛋白质活性的方法不同，TPD采用的是利用细胞内自身的蛋白清除机制来消除目标蛋白质。这种独特的策略为药物发现带来了多方面的优势，例如，TPD可以影响蛋白的非催化功能，并有望克服以前被视为“不可成药”的靶点。在本文中，药明康德内容团队将结合公开资料，深入探讨TPD的工作机理、特性，以及它与传统小分子抑制剂在哪些方面存在差异。什么是靶向蛋白降解？靶向蛋白降解是一种新的药物发现方法，可以彻底消除蛋白质，而不仅仅是抑制它们的活性。TPD的工作原理是利用细胞自身的蛋白质清除机制，即蛋白酶体和溶酶体途径，选择性地降解致病蛋白质。一般来说，蛋白酶体通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）来消除目标蛋白质（主要为短半衰期的蛋白），溶酶体则通过内吞作用、吞噬作用或自噬途径来降解半衰期较长的蛋白质、不溶性蛋白聚集体，甚至整个细胞器、大分子化合物和细胞内寄生物。经蛋白酶体降解途径发挥作用的TPD包括PROTAC、分子胶、以及双机制降解剂，经溶酶体途径发挥作用的TPD主要有LYTAC、GlueTAC、AbTAC、ATTEC、AUTAC、双特异性核酸适配体嵌合体、AUTOTAC、以及基于分子伴侣介导的自噬（CMA）降解剂。TPD展现出在多个方面的优越性，这包括对“不可成药”蛋白靶点的靶向能力、克服高蛋白水平的影响来发挥作用、对蛋白质的非催化功能产生影响，以及根据E3连接酶的表达情况实现组织选择性等等。总的来说，TPD作为一个新的药物模式，具有巨大的潜力来应对当前的未竟医疗需求。图片来源：123RFTPD与传统小分子的十大区别TPD与传统的小分子抑制方式之间的差异已经得到了理论层面的证明。近年来，临床和体内概念验证研究的推进进一步揭示了这些差异的多个方面。1. 蛋白降解剂与配体作用方式无关与传统小分子不同，蛋白降解剂的作用并不依赖于其靶点的特定作用模式（例如激动、部分激动、拮抗等），它们只需要与目标靶点结合即可有效引导目标蛋白发生降解。这一特点规避了在筛选配体时的复杂情况，因为对于某些靶点，传统小分子的作用表现为拮抗剂或是激动剂并非总是可预测的。这种差异化的表现在雄激素受体（AR）降解剂和雌激素受体（ER）降解剂的实例中尤为明显。AR是前列腺癌治疗的常用靶点，由于肿瘤细胞的AR发生突变导致一些小分子拮抗剂的作用方式由拮抗剂转变为激动剂，从而造成肿瘤生长加速、治疗失败。在这种情况下，如果采用TPD进行治疗，药物分子对于AR的功能效应（激活或抑制）已不再重要，因为目标蛋白会被彻底清除。图片来源：123RF例如，Arvinas开发的第二代可口服的AR降解剂ARV-766，与其前身ARV-110相比，它具有更广泛的基因型覆盖率和更好的立体化学稳定性。最新公布的临床试验数据显示，ARV-766使42%带有AR配体结合域（LBD）突变患者的前列腺特异性抗原（PSA）水平降低≥50%（PSA50）。具有AR L702H突变的5名患者中有3名达到了PSA50，这3名缓解的AR L702H患者都有同时出现的T878/H875突变。在带有AR LBD突变肿瘤的4名RECIST可评估患者中，有两名观察到部分缓解（1名确认部分缓解，1名未确认部分缓解）。类似的情况也发生在乳腺癌治疗中。他莫昔芬主要作为ER拮抗剂发挥作用，但在某些情况下，它可作为ER部分激动剂在长期治疗后导致继发性癌症。对此，针对ER的蛋白降解剂成为了解决方案。比如氟维司群，它既可以拮抗ER功能又能诱导其降解，但其靶点覆盖浓度和药代动力学（PK）属性不佳，因此，研究人员正在开发具有更强ER靶点覆盖能力的口服ER降解剂，这些降解剂不易受到改变靶点作用方式的基因突变的影响。这类新一代ER降解剂包括Stemline Therapeutics开发的elacestrant、基因泰克旗下的giredestrant（GDC-9545）、赛诺菲的amsenestrant、阿斯利康的AZD9833和Arvinas的ARV-471。其中，elacestrant在今年年初已获得美国FDA的批准上市，用于治疗患有雌激素受体阳性（ER+）、人表皮生长因子受体2阴性（HER2-）、ESR1突变的晚期或转移性乳腺癌的绝经后妇女或成年男子，这些患者在接受过至少一线内分泌治疗后出现疾病进展。2. 克服高蛋白质水平克服由非预期目标激活引起的高蛋白水平是药物开发中所面临的挑战之一。比如E3连接酶MDM2是经典抑癌蛋白p53的负调控因子，可以介导p53的降解。MDM2抑制或降解可以阻断p53的降解，然而，靶向MDM2的关键挑战包括健康组织中p53的伴随激活，以及MDM2水平的上升——通常MDM2小分子抑制剂的使用会导致细胞通过反馈通路，生成更多的MDM2蛋白，导致小分子抑制剂失效。Kymera Therapeutics的MDM2降解剂KT-253旨在解决这一难点，在临床前实验中，KT-253可以克服这一反馈通路的影响，它能够稳定p53的水平，并且导致癌细胞的死亡。在动物模型中，单剂KT-253治疗可以导致持久的肿瘤消退。3. 可影响蛋白的非催化功能传统的小分子抑制剂仅能阻断蛋白质的活性，TPD通过完全消除目标蛋白质，不仅可以阻断蛋白的催化功能，还可以影响其他功能，比如蛋白间相互作用、以及组成大型蛋白复合物的能力等等。其中一个应用实例是BRAF蛋白靶点。虽然BRAF突变体是经过临床验证的致癌靶点，然而目前已有的BRAF抑制剂反而可能激活野生型RAF，导致疗效降低，并且激发耐药性突变。具体来说，在某些情况下，与抑制剂结合的BRAF突变体蛋白可以充当支架，招募野生型RAF形成信号复合物，增强野生型RAF信号从而导致继发性癌症。C4 Therapeutics公司开发的创新BRAF降解剂CFT1946可以避免上述情况的发生。CFT1946可以直接降解突变BRAF蛋白，消除其蛋白支架的功能，从而彻底规避RAF信号的异常激活。在临床前研究中，CFT1946导致BRAF-V600E突变体的降解，显著抑制MAPK信号传导，并且在降低BRAF-V600E细胞生存能力的同时并未影响野生型BRAF细胞。在BRAF-V600E小鼠肿瘤模型中，CFT1946也导致肿瘤显著缩小。这种靶向BRAF突变体的蛋白降解策略有望更为有效地阻断BRAF突变体介导的信号传递，获得更为持久的疗效。类似的例子还有针对BRD9蛋白和IRAK4蛋白的药物开发，这两种蛋白都因其独特的蛋白支架功能而参与了癌症或免疫相关疾病的病理过程。通过TPD消除其蛋白支架功能，有望为这些疾病提供更多治疗选择。目前，C4 Therapeutics开发的BRD9蛋白降解剂CFT8634的IND申请已获得批准，启动临床试验的招募工作。在滑膜肉瘤的临床前模型中，CFT8634表现出持续降低肿瘤体积的效果。Kymera Therapeutics开发口服IRAK4抑制剂KT-474的早期临床结果积极，显示出对多种疾病相关细胞因子的广泛和深度抑制，显著缓解了特应性皮炎和化脓性汗腺炎的临床症状。4. 不受限于靶点饱和度与小分子抑制剂不同，TPD无需通过完全占据靶蛋白形成E3酶-降解剂-靶蛋白复合物来发挥作用，因此，降解物和靶蛋白之间所需的结合亲和力理论上远低于小分子抑制剂所需的亲和力。此外，由于靶蛋白的浓度随着时间的推移而降低，TPD的药效学效应可以随着时间的推移而积累，因此可以在较低剂量的慢性给药中获得更深度的疗效。例如，Nurix Therapeutics的BTK蛋白降解剂NX-2127，尽管它对于某些BTK突变体的配体亲和力较低，并且生物利用度不佳，但这并不妨碍它的效果。在1期临床试验中，NX-2127不但强力且持久地降解了B细胞血液恶性肿瘤患者体内的BTK，还让多名患者获得有意义的临床益处，在携带BTK耐药性突变的患者中也观察到部分缓解。图片来源：123RF此外，还有一些TPD能够在较低的生化亲和力条件下发挥作用，如STAT3降解剂。Kymera Therapeutics旗下STAT3降解剂KT-333已迈入临床研究阶段，最新临床数据显示，KT-333显示出剂量依赖性的STAT3降解，在外周血单核细胞中平均最大降解水平达88%，并有STAT3通路受抑制和外周血中炎症生物标记物下调的迹象。5. 体内药代动力学/药效学效应延长GSK开发的一款RIPK2降解剂能够展现出远超基于其PK所预期的长期药效——在给予单剂量RIPK2降解剂治疗后，大鼠体内的RIPK2蛋白被显著降解，并且需要很长时间（240小时）才能恢复到基线水平。这表明此药物可以长时间起作用，在给药后的许多天内也有功能效应。 6. 更广阔的结合位点选择TPD的核心作用在于破坏蛋白质，因此，与小分子抑制剂不同，它们的配体并不需要对目标蛋白质产生直接的功能效应，例如抑制、激活或构象变化等。只要配体的结合能够引发泛素化途径，它们就足以完成其使命。这一特性增加了蛋白降解剂可选择的结合位点的多样性。利用蛋白降解剂这一特性的应用实例主要有变构EGFR降解剂。C4 Therapeutics和罗氏利用非功能性结合位点，合作开发了一种新型口服变构EGFR L858R降解剂。在EGFR中，L858R突变产生了一个在野生型EGFR蛋白中不存在的变构结合位点，这为药物分子靶向突变体而不是野生型EGFR蛋白创造了机会，并且不需要依赖活性位点。TPD将EGFR突变体作为降解的目标，并且以50 mpk PO/BID的剂量在啮齿类动物的脑转移模型中显示出活性，尽管其分子体积巨大，但对突变体EGFR的活性和选择性都非常优秀。▲C4 Therapeutics和罗氏开发的创新EGFR L858R蛋白降解剂化学分子结构（图片来源：参考资料[1]）7. 基于E3连接酶表达差异的组织选择性因为TPD所必需的E3连接酶在不同组织间存在表达差异，使得TPD在某些组织中可能更具选择性，这种选择性超出了TPD对其目标蛋白在靶点结合方面的固有选择性。Dialectic Therapeutics公司的Bcl-XL降解剂DT2216便是基于上述观点而开发产生的。Bcl-XL是一种抗凋亡蛋白，但是针对这个靶标的药物可能会导致血小板水平降低。E3泛素连接酶VHL在血小板中的表达较低，通过使用降解剂募集VHL连接酶，可以靶向特定的肿瘤类型，而不会出现血小板减少的副作用。虽然VHL的表达水平和DT2216对于血小板再生的影响尚未被充分了解，但在临床前研究中，DT2216作为单药或联合化疗在各种血液学和实体瘤中产生抗癌活性。目前该分子正处于1期临床开发阶段。 8. 基于形成蛋白复合物的能力而表现出靶点选择性在针对黑色素瘤的治疗中，突变型BRAF抑制剂发挥着重要作用，但是突变型和野生型BRAF蛋白间的结构差异往往非常微小，这可能导致针对野生型BRAF的非预期抑制效应（脱靶效应）。BRAF蛋白降解剂CFT1946对于突变型BRAF蛋白的选择性远高于野生型BRAF，在实验中甚至未在细胞内检测到对野生型BRAF的活性。这可能是因为野生型BRAF无法被高效地招募至E3连接酶复合体进行泛素化和降解。 9. TPD作用较少依赖于组织分布相较于传统的抑制剂，蛋白降解剂不需要在某些组织中（如大脑）的高水平分布。因为TPD不需要药物饱和，并且可以在低配体浓度下累积药理作用，这为治疗需要穿越血脑屏障、但却受限于药物分子量大的疾病（例如多发性硬化、脑转移病变）提供了可能性。比如，Nurix公司的第二代BTK降解剂NX-5948，据报道其对大脑的渗透率不到5%，但在小胶质细胞中却具有活性。在小鼠模型中，NX-5948能够显著降低动物大脑中的肿瘤负担，并且延长动物的生命。1a期试验的临床生物标志物数据证明了该疗法可以使BTK快速、稳健和持续地降解。另一个例子是C4 Therapeutics和罗氏共同开发的CFT8919，这是一种具有口服生物利用度的变构BiDAC降解剂，对携带EGFR L858R突变的肿瘤具有良好的活性和选择性。在临床前研究中，CFT8919在EGFR L858R驱动的非小细胞肺癌（NSCLC）的体内外模型中具有活性，可靶向广泛的在靶耐药突变并有颅内活性，具有预防或治疗患者脑转移的潜力。图片来源：123RF10. 难以找到配体的蛋白质也能间接地被降解最后，TPD也能够导致传统上难以找到配体的靶标被间接地降解。纽约西奈山医学院（Mount Sinai School of Medicine）的研究人员开发出了一种创新PROTAC策略“桥接PROTAC”，该方法利用与目标蛋白相互作用的蛋白质的小分子配体，将蛋白质复合物招募到E3泛素连接酶附近，以靶向缺乏小分子配体的蛋白质。基于这种桥接PROTAC策略，研究人员开发了细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的降解剂MS28。Cyclin D1是癌症治疗中的一种重要靶点，但目前还没有报道其小分子配体，传统的PROTAC策略对它不适用。已知Cyclin D1可以与CDK4/6形成蛋白复合物，而针对CDK4/6的高选择性、高效小分子抑制剂已经面世，据此，研究人员将CDK4/6抑制剂通过连接子（linker）连接到E3泛素连接酶的配体上，利用CDK4/6招募Cyclin D使其降解。经检测，MS28能有效降解Cyclin D1，并且其降解速度比CDK4/6快。此外，MS28还比CDK4/6抑制剂和降解剂更有效地抑制癌细胞的增殖。TPD未来的方向TPD是药物发现历程中具有革命性意义的创新策略，其未来潜力令人瞩目。首先，在一系列的临床前和临床研究中，TPD展现出与传统小分子不同的作用机制和疗效，这有望为TPD在药物研发领域开拓更广阔的应用范围。TPD领域的新研究不断涌现，带来了许多新的机遇。比如，可透过血脑屏障的蛋白降解剂的出现，为神经疾病治疗提供了全新的可能性。针对跨膜和细胞外蛋白降解剂的研发，可以靶向EGFR、PCSK9和SLC转运蛋白等靶点，这可能会对各类疾病的治疗可能产生深远影响。此外，针对像STAT3这样难以靶向的蛋白质类别的概念验证，也揭示了TPD有能力触及那些之前被认为“无法成药”的靶标。此外，新的连接酶（如DCAF1）的运用、新结合位点的发现（比如AR的变构位点）和新型活性分子的使用（如共价和可逆降解剂），都在提高TPD的多功能性和有效性。最后，Orum Therapeutics公司的总裁及首席执行官SJ Lee博士曾在访谈中指出，我们将看到既定的治疗模式出现更多创造性融合，抗体和TPD的融合将在15年后成为主流。随着这些新策略的广泛应用，我们期待看到更多与传统小分子药物有着显著差异的降解剂问世。总之，我们期待TPD继续繁荣发展，不仅在药物发现领域开辟新天地，同时进一步彻底改变众多医学领域的治疗格局。大家都在看药明康德为全球生物医药行业提供一体化、端到端的新药研发和生产服务，服务范围涵盖化学药研发和生产、生物学研究、临床前测试和临床试验研发、细胞及基因疗法研发、测试和生产等领域。如您有相关业务需求，欢迎点击下方图片填写具体信息。▲如您有任何业务需求，请长按扫描上方二维码，或点击文末“阅读原文/Read more”，即可访问业务对接平台，填写业务需求信息▲欲了解更多前沿技术在生物医药产业中的应用，请长按扫描上方二维码，即可访问“药明直播间”，观看相关话题的直播讨论与精彩回放参考资料：[1] Ten Ways Degraders Differentiate from Traditional Small Molecules，Retrieved July 31, 2023, from https://drughunter.com/resource/ten-ways-degraders-differentiate-from-traditional-small-molecules/?utm_source=Drug%20Hunter&utm_campaign=c11326e6b0-EMAIL_CAMPAIGN_2023_03_14_02_52_COPY_01&utm_medium=email&utm_term=0_-e31d28fdc0-%5BLIST_EMAIL_ID%5D[2] Zhao, L., Zhao, J., Zhong, K. et al. Targeted protein degradation: mechanisms, strategies and application. Sig Transduct Target Ther 7, 113 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00966-4[3] Mares, A., Miah, A.H., Smith, I.E.D. et al. Extended pharmacodynamic responses observed upon PROTAC-mediated degradation of RIPK2. Commun Biol 3, 140 (2020). https://doi.org/10.1038/s42003-020-0868-6[4] Xiong, Yan et al. “Bridged Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Enables Degradation of Undruggable Targets.” Journal of the American Chemical Society vol. 144,49 (2022): 22622-22632. doi:10.1021/jacs.2c09255免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。版权说明：本文来自药明康德内容团队，欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权请在「药明康德」微信公众号回复“转载”，获取转载须知。分享，点赞，在看，聚焦全球生物医药健康创新