Steroid hormone receptor

１. 为什么我们需要分子胶？分子胶有望成为细胞生物学和药物发现中不可成药靶标的突破性策略。传统上，小分子药物已成功用于调节酶的活性，由于它们的具有功能明确的结合口袋，能够结合细胞中的代谢物、配体和其他小分子。最适合药物化的蛋白质家族实际上是激酶和蛋白质受体，例如 GPCR 或核受体。然而，据估计，只有 10% 的编码基因组可通过传统小分子抑制剂进行药物化。其余 90% 包括参与蛋白质复合物或 DNA/RNA 结合的蛋白质，由于其功能，这些蛋白质往往具有平坦或突出的表面，并且已适应与其他蛋白质或核酸相互作用，但不与小分子相互作用。此外，转录因子和其他支架蛋白本质上往往是无序的，仅在蛋白质辅助因子存在的情况下折叠，因此通常无法与小分子结合。从概念上讲，PROTAC 通过结合并降解蛋白质作为治疗策略，增加了可药物靶点的数量，将非酶蛋白质包括在内。然而，PROTAC 却需要两个小分子配体，一个识别 E3 连接酶上的口袋，另一个结合感兴趣的靶标，因此，它们仍然需要靶标包含药物结合口袋。相反，分子胶很好地利用了不可成药的空间，通过创建或填充仅当两种蛋白质在胶水分子存在下结合时才出现的口袋。这为传统上不可成药的靶标的不同类型的调节提供了机会，例如，通过将靶标粘合到不同类型的效应蛋白上。分子胶的合理设计主要采用两种方法：即筛选以招募非天然效应物或增加对已知相互作用物的亲和力。IMiD 专注于蛋白质降解，通过招募转录因子作为 CRBN E3 连接酶的新底物，使药物转录因子成为可能；indisulam通过招募RNA 结合蛋白RBM39 降解为 DCAF15 E3 连接酶复合物，使药物成为可能。为了增加与天然 E3 连接酶的亲和力，Nurix 分子胶经过合理设计，可将 β-TrCP 募集到其天然底物 β-catenin（一种转录因子）上，且β-catenin的降解决定因子不存在磷酸化，正常情况下磷酸化后 E3 亲和力更高。在这种情况下，分子胶位于因β-catenin上缺乏磷酸基团而释放的口袋中，并且它重建了与β-TrCP的高亲和力表面。CypA 作为环孢菌素与钙调神经磷酸酶粘合以抑制其活性的效应蛋白而闻名 30 多年；然而，直到最近，CypA 才作为一种效应蛋白出现，可以更广泛地用于设计分子胶抑制剂，用于传统上难以药物治疗的靶点，例如 KRAS，作者应用结构引导设计来开发一种针对活性药物的分子胶。KRAS 的状态；这种分子胶将CYPA招募到 KRAS 上，阻断其他致癌相互作用，从而抑制 KRAS 驱动的细胞增殖。同样，分子胶被开发出来将 CRAF 粘合到其天然抑制蛋白14-3-3上。分子胶会锁定 CRAF/14-3-3 复合物，即使没有 CRAF 磷酸化（使复合物与 14-3-3 稳定在抑制性构象中所必需的）。下面，我们描述了一系列检测方法，这些检测方法将促进利用这些功能相互作用的分子胶的开发。分子胶可以彻底改变我们调节疾病相关蛋白质的能力，但它们的合理开发需要一个新颖的平台，其中的筛选方法和化学设计是重点，就像经典药物开发的情况一样。主要包括几种无细胞和细胞筛选方法，这些方法侧重于检测作为分子胶的小分子。２. 基于生化技术的分子胶筛选分子胶可使用一系列生化方法进行了鉴定，这些方法用于直接或间接监测蛋白质的接近或结合。通常，这些方法需要事先了解靶标和潜在效应蛋白。２.1 DEL胶筛选DNA 编码库 (DEL) 筛选是一种亲和力选择过程，可以筛选潜在的数万亿种化合物。每种化合物都单独标记有独特的 DNA 序列，然后可以对其进行扩增并用作化合物识别条形码。通常，使用拆分和库合成方法对库进行编码。简而言之，起始结构单元被标记有DNA序列，并且在添加第二个结构单元之后，DNA标签被延伸。通常，最多可以组装三个或四个结构单元的化合物，每一步都会产生数千个不同标记结构单元的混合物，从而形成巨大的 DNA 编码文库。DEL 筛选使用高蛋白质浓度（通常在 μM 范围内）来驱动配体结合复合物形成的平衡，读数与目标配体复合物的丰度相关。DEL 筛选（图1 A）已用于鉴定目标 BRD9 与 E3 连接酶 VHL 的分子胶。在这种方法中，BRD9 蛋白被固定，并使用 2 种不同的实验方法来鉴定潜在的小分子胶。将文库与固定化 BRD9 预孵育（允许形成二元复合物），或者将文库首先添加到 VHL，然后添加到固定化 BRD9（允许形成三元复合物）。为了控制非特异性结合，在不存在BRD9 的情况下将文库添加到固定基质中。洗涤 3 次后，蛋白质变性以释放结合物，并且 DNA 条形码经过 PCR 扩增和测序以鉴定结合化合物。为了计算富集，将二元结合的计数除以对照，将三元结合的计数除以二元结合，得到三元富集与二元富集的比率。较高的呈递物比率表明化合物与 BRD9 的结合更依赖于 VHL 的存在，这意味着更高程度的协同作用。该呈递物比率用于选择在与 BRD9 和 VHL 结合的三元复合物中具有不同程度协同性的小分子。筛选结果产生了一系列不同的结合行为，这取决于 VHL 配体和三嗪、BRD9 靶向核心之间的连接体的性质。然而，所有已识别的富集连接子本质上都相对较短且可循环。图１ .生化筛选技术被用来筛选分子胶。(A) DNA 编码文库涉及筛选带有独特 DNA 识别条形码标记的化合物，以找到促进相互作用的化合物。(B) 在束缚片段筛选中，将具有暴露的半胱氨酸残基的效应蛋白与目标肽和含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将与半胱氨酸紧密结合，并在检测中（通常通过 MS 或 FA）进行富集。(C) 在 TR-FRET 中，靶蛋白用供体荧光团标记，效应蛋白用受体荧光团标记。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(D) AlphaScreen 是一种基于珠子的方法，依赖于两种感兴趣的蛋白质与特定珠子的结合。相互作用伙伴的紧密接近导致能量从一个珠子转移到另一个珠子并产生化学发光信号。(E) 在 E3 驱动的微阵列中，靶蛋白被固定到表面，并在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入一系列效应器结合配偶体以测试任何相互作用。２.２ 束缚片段筛选(tethered fragment screen)束缚依赖于片段和目标蛋白质之间可逆共价键的形成。如果靶蛋白在靶位点附近含有半胱氨酸残基，则可以直接使用，或者可以使用定点诱变在方便的位置引入半胱氨酸残基。然后在部分还原条件下将蛋白质与含有二硫键的片段文库一起孵育。对蛋白质具有固有亲和力的片段将靠近半胱氨酸结合，并且相对于非结合片段，硫醇-二硫化物平衡将有利于这些片段。因此，结合片段被蛋白质有效地选择并在检测中被富集。２.３ 质谱检测先前已经表明，靠近可配体口袋的天然或工程半胱氨酸残基可用于促进稳定蛋白质-蛋白质相互作用的化合物的发现。这种二硫化物束缚方法已用于识别稳定 14−3−3 和 ERα 之间相互作用的化合物。此处，在存在或不存在ERα磷酸肽的情况下，将含有半胱氨酸的同种型 14−3−3 与含有二硫键的片段文库一起孵育。然后通过完整蛋白质质谱 (MS) 对蛋白质片段缀合物进行表征。２.４ 荧光各向异性(Fluorescence anisotropy，FA) 检测在束缚方法的一种形式，使用雌激素相关受体 γ 的 DNA 结合域 (ERRγ DBD) 的 14−3−3 结合基序中发现的天然半胱氨酸残基来构建可用于 FA 筛选的磷酸肽探针方法。ERRγ-磷酸肽用荧光探针标记，通过 FA 的增加来监测片段诱导的磷酸肽与 14−3−3 的结合，图1 B。在该筛选方法中，荧光标记的含半胱氨酸的肽是最初与 14−3−3 的结合较弱，由低 FA 出发（低各向异性）证明。观察到的各向异性的增加证明了在还原条件下与二硫化物文库孵育后通过化合物结合来稳定蛋白质-肽复合物（14-3-3 与标记肽的结合增加）。使用 FA（或荧光偏振）筛选包含 350, 000 个小分子的库。鉴定到了 NRX-1532，它们能够增加 β-TrCP 和突变 β-连环蛋白肽之间的结合亲和力。证明双磷酸化肽 (pSer33/pSer37) 与 β -TrCP 的结合亲和力为 2 nM，而非磷酸化肽 (Ser33/Ser37) 与 β -TrCP的结合亲和力明显较低 (>100 μM)。２.５ 时间分辨率荧光共振能量转移 (TR-FRET)基于 FRET 的方法的基本原理是供体和受体荧光团之间的能量转移。当这些部分彼此靠近时，入射光对供体的激发导致能量转移到受体。然后受体发射特定波长的荧光信号。因此，可以通过在每个伙伴上附加荧光标记并测量能量转移程度来监测分子之间的分子相互作用。Wang等人使用免疫调节药物 (IMiD) 衍生物 ALV-02–146–03 。在建立基于 TR-FRET 的 CRBN:Helios 二聚化测定之前，证明了与 CRBN 的参与。他们使用这种方法筛选了一个小型、集中的化合物库。经过几轮优化后的筛选导致了 ALV1 的设计，它已被证明可以诱导 Helios 的 CRBN 依赖性降解，图1 C。２.６ AlphaScreenAlphaScreen（ALPHA，放大发光邻近均质测定）是一种基于微珠的方法，用于研究微孔板形式中分子之间的相互作用。其原理依赖于将两种感兴趣的蛋白质结合到特定的珠子上。当两个分子之间发生相互作用时，这会导致两个珠子非常接近，在激光激发供体珠子时，使周围的氧气转化为更激发的单线态，然后扩散以与受体发生反应产生化学发光信号的珠子。该方法已用于测量 CDK12KD/CCNKΔC 和 DDB1 之间的相互作用。这里将生物素化的 FLAG-Avi-DDB1 构建体与 6HisCDK12KD/6HisCCNKDC（WT 或 G731 突变体）一起使用，从而可以证明存在改进的 AlphaScreen 信号/相互作用HQ461，表观 EC 50为 1.9 µM。AlphaScreen 测定还用于显示 THZ531 抑制 CDK12KD/CCNKΔC/DDB1 复合物的 HQ461 依赖性形成的竞争效应，图1 D。２.7 E3驱动的微阵列在诺华公司在未发表的通讯中描述的另一种方法中，1 个蛋白质微阵列用于筛选 VHL 和数千种蛋白质之间化合物诱导的相互作用，展示了一种 E3 连接酶驱动的目标不可知的分子胶发现方法。蛋白质微阵列是一种高通量方法，可用于并行监测许多蛋白质的相互作用。该方法由结合有捕获蛋白阵列的支持表面组成。随后，这允许在存在和不存在假定的胶分子的情况下引入结合配偶体，并监测相互作用，图1 E。发现几个小分子可以稳定 VHL 和 CDO1 之间的相互作用，CDO1 是一种参与调节的蛋白质。半胱氨酸代谢。这些化合物随后被证明可以促进 CDO1 的多泛素化和蛋白酶体降解。在使用微阵列的另一个例子中，人类蛋白质组微阵列被用来识别天然产物衍生的分子胶，用于靶向 E2F2 降解。３ 基于细胞的分子胶筛选方法从历史上看，分子胶的发现基本是是偶然发生的，而不是通过应用设计的策略。主要是通过基于活力/毒性的细胞筛选或基于报告分析的其他表型筛选来鉴定分子胶，并且它们作为分子胶的作用模式只是随后发现的。在过去几年中，为了寻找分子胶，出现了几种细胞方法。在下面描述总结这些方法（图 2）。图2 .基于细胞的筛选技术。已使用一系列方法来筛选分子胶引起的接近和降解。(A) 在 TR-FRET 中，裂解细胞并添加针对每个相互作用伙伴的特异性标记抗体。相互作用伙伴的紧密接近导致从供体荧光团到受体荧光团的 FRET。(B) 在 Nano-BRET 中，相互作用的伴侣被表达为与生物发光蛋白供体（例如荧光素酶）或荧光蛋白受体的融合蛋白。相互作用伙伴的接近导致从供体到受体的 BRET。(C) 在免疫共沉淀中，将结合伴侣和化合物添加到固定靶标中，然后对复合物进行免疫沉淀并通过 SDS-PAGE 进行分析。(D)在邻近连接测定中，POI表达为与混杂的生物素连接酶(例如BioID)的融合蛋白。添加生物素后，POI 附近的蛋白质被生物素化，随后在 MS 分析之前用链霉亲和素珠捕获。 (E) 酶片段互补依赖于用小标签（例如 HiBiT）标记 POI，该小标签可以与其互补亚基相互作用以形成纳米荧光素酶。POI 降解后，不会产生荧光素酶信号。(F) 在信号降解增益测定中，在 GFP 表达细胞中，POI 表达为与脱氧胞苷激酶(dCK) 的融合蛋白，将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物。POI 降解后，细胞活力得以保留，并且可以测量GFP 。应当指出的是，免疫共沉淀和邻近连接是较低通量的筛选方法。3.1　活力/毒性测定活力测定测量细胞的代谢活动。例如，MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）−2,5-二苯基溴化四唑）测定基于代谢活跃的细胞将黄色四唑盐MTT 还原为紫色甲臜。甲臜的吸光度可以在酶标仪中测量。相反，细胞毒性测定测量由于细胞死亡而发生的膜完整性的变化。这种名为 Cell tox green 的检测方法使用一种染料，该染料被排除在活细胞之外，但优先对死细胞的 DNA 进行染色。当染料与 DNA 结合时，其荧光特性显着增强。活细胞的荧光没有明显增加。因此，染料与死细胞 DNA 结合产生的荧光信号与细胞毒性成正比。Indisulam最初是通过 MTT 活力测定发现的一种抗肿瘤药物。其作为 DCAF15 和 RBM39 胶合剂的作用机制于 2017 年才被确立。他们生成了具有Indisulam耐受性的 HCT116 克隆，并通过外显子组测序鉴定了错义突变。RBM39基因在3个克隆中发生突变。用 WT 或突变 RBM39 瞬时转染 HCT-116 细胞，然后用 indisulam 处理，结果表明 RBM39 突变赋予对 indisulam 抗性。蛋白质印迹分析显示，胰岛素中毒需要 RBM39 降解。从用 indisulam 处理的 CRISPR 工程 RBM39–3xFLAG HCT116 细胞裂解物中纯化抗 FLAG，然后进行胰蛋白酶消化和 MS 分析，结果显示 DCAF15 是招募伙伴。Stabicki等人使用了一种不同的方法。发现另一种Cyclin K 分子胶 CR8 。他们挖掘数据库，将临床和临床前小分子的细胞毒性与数百种人类癌细胞系中 E3 连接酶成分的 mRNA 表达水平关联起来。然后，通过对已识别的 E3 连接酶成分进行 CRISPR 介导的失活来验证这种依赖性，并检查这是否可以挽救相应的药物引起的毒性。他们确定了 CR8 毒性与 DDB1 mRNA 水平之间的相关性。运用定量蛋白质组 MS 来检查用 CR8 处理细胞后的蛋白质丰度，发现 Cyclin K 是唯一受影响的蛋白质。Cyclin K 的降解可以通过抑制蛋白酶体、 neddylation 或 E1 泛素激活酶来挽救。然后，他们进行了以 E3 泛素连接酶为重点的 CRISPR-Cas9 抗性筛选，并确定了 DDB1、CUL4B、RBX1、NEDD8、NAE1 和 UBA3 为涉及的关键蛋白。GSPT1/2 降解剂是通过使用细胞活力测定 CellTiter-Glo在五种患者来源的细胞系中筛选沙利度胺衍生物的重点文库来鉴定的。他们鉴定了几种有效的靶标（EC50 < 1 µM），其中一些在所有五种细胞系中均具有活性，而另一些则表现出选择性，暗示了不同的作用机制。他们通过在高浓度来那度胺存在下进行配体竞争实验以及在 CRBN 敲除细胞中进行细胞活力测定，证实了 CRBN 依赖性作用机制。他们通过对一些命中的免疫印迹显示新底物 GSPT1 的降解，但在与抗增殖效力相关的 Caspase-Glo 测定中诱导细胞凋亡，而不是 IKZF1。基于多重 MS 的蛋白质组学分析表明，化合物 6 (SJ6986) 在对 MV4-11 细胞（一种急性白血病细胞系）进行处理后，选择性降低了约 9000 种蛋白质中 GSPT1 和 GSPT2 的丰度。这是第一个报道具有生物利用度的 GSPT1 降解剂。3.2　报告基因检测报告基因测定通过将报告基因与感兴趣的转录因子的调控序列连接来测量基因表达，该报告基因的产物可以很容易地检测和定量。然后报告基因充当转录因子活性的替代物。常见的报告基因包括β-半乳糖苷酶、荧光素酶、β-内酰胺酶、碱性磷酸酶和GFP（绿色荧光蛋白）。吸光度、荧光或发光检测方法通常用于测量表达的报告基因蛋白图2 E。在 A549 细胞中使用报告基因测定，HQ461 被鉴定为来自 NRF2 高通量筛选的命中结果。对 A549-HQ461 抗性细胞进行的全基因组 CRISPR-Cas9 敲除筛选表明，HQ461 毒性需要 DDB1、RBX1 和泛素蛋白酶体降解系统的其他调节因子。按照之前针对 indisulam 发表的相同策略，他们生成了 HQ461 抗性 HCT116 克隆，并通过全外显子组测序鉴定了 CDK12 中的错义突变。用WT或突变CDK12瞬时转染HCT-116细胞，然后用HQ461处理表明CDK12突变赋予对HQ461的抗性。Western Blot 研究表明，HQ461 会诱导 Cyclin K 降解，并且在存在蛋白酶体或 neddylation 抑制剂的情况下可以抑制这种降解。3.3　TR-FRET 检测虽然 TR-FRET 测定主要用于筛选 PPI 抑制剂，但它们已成功用于分子胶的发现，图2 A.Tang等人发表了一种细胞裂解物 TR-FRET 测定法来筛选 SMAD4-SMAD3 相互作用的调节剂。通过使用细胞裂解物，他们避免了对纯化蛋白质成分的需要。2022 年，开发了一种内源性细胞 TR-FRET 测定法，测量靶标参与和降解，以分析 BRD4 的 PROTAC。它依赖于使用 BRD4 抗体、标记的抗物种纳米抗体作为供体，荧光标记的 BRD4 抑制剂 JQ1 示踪剂作为受体。该测定使用未修饰的细胞系，并且可以部署到其他感兴趣的蛋白质，这些蛋白质具有特定的抗体，并且可以识别示踪剂，甚至非特异性的示踪剂。3.4　NanoBRET 检测NanoBRET（纳米荧光素酶生物发光共振能量转移）是一种用于测量活细胞中的结合事件、信号传导途径或受体运输的检测技术。在 BRET 中，能量转移发生在荧光素酶供体和荧光团受体之间，图2 B。2023 年，研究人员使用 NanoBRET CRBN 占用测定来研究基于 CRBN 的降解剂的药理学。该测定测量活细胞中荧光 CRBN 示踪剂从 NanoLuc 标记的 CRBN 中置换后 BRET 信号的剂量依赖性减少。他们筛选了 14 种沙利度胺衍生物来建立构效关系。他们特别关注两种新底物：IKZF1（一种转录因子）和 GSPT1（一种翻译终止因子）。他们还对两种蛋白质进行了降解测定，以量化每种化合物所实现的降解。他们的数据为设计没有 GSPT1 活性的降解剂提供了方向，从而避免了广泛的细胞毒性。3.5　蛋白质降解：酶片段互补 (EFC) 测定EFC 基于两种重组 β-半乳糖苷酶 (β-gal) 酶片段，它们充当酶受体 (EA) 和酶供体 (ED)。单独地，这些片段是无活性的，但当组合时，它们形成一种活性β-半乳糖酶，水解其底物以产生化学发光信号。这些检测方法是 DiscoverX 几年前开发的，具有多种应用，其中之一是 PathHunter 降解检测方法，图2 E。在这种情况下，目标蛋白用小肽片段标记，而大 β-gal 片段则用小肽片段标记。包含在孵育时间结束时添加到裂解缓冲液中的检测试剂中。Bonazzi等人使用PathHunter发现了一种促进锌指转录因子 IKZF2降解的分子胶。锌指转录因子是具有挑战性的靶标，因为它们基本上是非结构化的并且没有配体结合位点。然而，密切相关的 TF（IKZF1 和 IKZF3）已成为 IMiD 的目标，IMiD 与 CRBN E3 连接酶结合，然后招募 IKZF1/3，诱导降解。基于这些理论，使用 IKZF1 分子胶降解剂泊马度胺作为 SAR 的起点。泊马度胺结合的 CRBN 与 IKZF1 锌指 2 中的甘氨酸 β-发夹结合。IKZF1 和 IKZF2 的锌指 β-发夹有一个氨基酸不同，这介导了泊马度胺对 IKZF1 的选择性。因此，作者旨在找到一种可以容纳IKZF2 锌指 2 中组氨酸的化合物。他们使用 PathHunter 细胞降解测定法对 ProLabel 标记的 IKZF2 或 IKZF1 进行 SAR，以鉴定促进 IKZF2 而不是 IKZF1 降解的化合物。使用 CRBN 敲除细胞系证实降解依赖于 CRBN，并报告化合物 DKY709 作为 IKZF2 的选择性分子胶降解剂。NanoBiT 和 HiBiT 系统是酶片段互补技术的其他示例，该技术依赖于用酶的小亚基标记感兴趣的蛋白质 (POI)，该酶的小亚基可以与其互补亚基相互作用形成发光复合物，图2 E与 PathHunter 类似，NanoBiT 和 HiBiT 系统的区别在于用于创建 POI 融合的小肽标签，通常只有 11 个氨基酸。较小尺寸的肽标签很有吸引力，因为它适合内源蛋白的 CRISPR-Cas9 基因组编辑，而且因为它不太可能干扰细胞内 POI 的正常生物功能。该方法首先是使用工程荧光素酶 NanoLuc 开发的，这是一种源自深海发光虾的 19 kDa 酶。NanoBiT 报告系统使用 11 个氨基酸肽 (SmBiT) 和 18 kDa多肽(LgBiT)，每个都与目标蛋白融合。两个亚基弱关联（Kd > 100 µM），因此它们的互补由靶蛋白的相互作用决定。该小组后来开发了 HiBiT 报告系统，该系统利用高亲和力（LgBiT Kd = 700 pM）11 氨基酸肽标签实现发光定量。在此系统中，HiBiT 标记的 POI 可以在细胞裂解并添加 LgBiT 和 NanoLuc 底物 Furimazine 后进行定量。研究小组表明，发光信号与细胞中的蛋白质水平呈线性相关，并且可以在低至 1 amol 的浓度下检测到该信号，相当于每个细胞约 10 个分子。HiBiT 技术已用于分子胶发现。例如 ，使用 HiBiT-BRD4 降解剂测定来鉴定在用分子胶化合物“1a”处理后参与 BRD4 降解的连接酶。他们使用泛素蛋白酶体系统中包含 1158 个基因的 CRISPR/Cas9 敲除文库，发现沉默 DCAF-16（Cul4 连接酶复合物的底物识别成分），在用 1a 处理后可以挽救 BRD4-HiBiT 信号。3.6　蛋白质降解：信号分析增益通过信号减少来测量活性的降解测定的一个局限性是筛选输出被诱导细胞毒性的化合物污染。2021 年，Koduri等人设计了信号增益测定来寻找 IKZF1 的降解剂。他们在 293 细胞中将脱氧胞苷激酶(dCK)的修饰（一种将非天然核苷2-溴乙烯基脱氧尿苷 (BVdU) 转化为毒物的酶）与 IKZF1 融合（图2 F）。因此，蛋白质降解可防止形成毒素并给出抗性的正选择读数。在 BvdU 存在的情况下，对文献中先前未表征的 IMiD 类分子进行化学筛选，结果将 MI-2-61 和 MI-2-197 鉴定为分子胶降解剂。3 MAPPIT哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱捕获（MAPPIT，mammalian protein-protein interaction trap）是一种基于 JAK-STAT 信号转导途径的用于研究 PPI 的二杂交系统。诱饵蛋白和靶蛋白（感兴趣的靶标和选择的效应蛋白）与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当特定诱饵和靶蛋白嵌合体之间发生 PPI 时，活性会恢复，JAK-STAT 信号传导导致报告基因表达受 STAT3 响应启动子控制。该系统已扩展到包括各种适应，例如用于识别 PPI 调节剂的反向 MAPPIT、用于分析化合物和蛋白质之间相互作用的 MASPIT（哺乳动物小分子-蛋白质相互作用陷阱） 、用于高通量的阵列 MAPPIT阵列蛋白质的筛选。Petschnigg等人开发了一种类似的方法，称为 MaMTH，用于哺乳动物膜双杂交测定。在此测定中，膜诱饵蛋白标记有泛素的 C 端一半 (Cub) 和嵌合转录因子 (TF)，而胞质或膜结合的靶蛋白则标记有泛素的 N 端一半 (Nub) 。诱饵和猎物相互作用后，形成假泛素，该假泛素被胞质去泛素化酶识别，导致 TF 裂解并表达荧光素酶报告基因。4. Tango 和 split TEV 检测另一种有前途的方法是使用分离 TEV 或 Tango 检测。2006 年，有人开发了 Split-TEV 技术来监测哺乳动物细胞中的 PPI。该方法基于功能性 TEV 蛋白酶片段互补和随后的报告蛋白水解激活，因此结合了裂解酶和报告基因介导的检测的优点。他们证明这种方法可用于研究受体二聚化、受体信号传导、诱导型胞质 PPI 或受体酪氨酸激酶(RTK) 激活。他们还表明，当分子胶雷帕霉素诱导时，split-TEV 技术可用于测量细胞质中 FKBP 和 FRB 的相互作用。他们使用了“仅蛋白水解”分裂 TEV 报告基因测定，其中 FKBP 和 FRB 的相互作用导致 TEV 活性，导致荧光素酶的释放，该酶可以翻转荧光素以产生光。在该测定中，雷帕霉素浓度的增加导致发光单位的增加。2008年修改了Split-TEV方法，研究了三类受体，即G蛋白偶联受体、RTK和类固醇激素受体，并将其称为Tango。他们发现细胞内受调节的定位足以区分游离的和相关的 TEV 和转录因子融合伴侣，因此不需要裂解 TEV蛋白酶。因此，在他们的检测中，转录因子通过含有特定病毒蛋白酶 TEV 切割位点的接头与膜受体结合。受体的激活会招募与蛋白酶融合的信号蛋白，两个伙伴之间的相互作用导致转录因子的裂解和释放，该转录因子易位到细胞核，在那里激活荧光素酶报告基因。5. 分子胶表征的较低通量测定下面我们描述两种方法，更传统的 IP 和最近的邻近标记技术，可用于细胞中分子胶相互作用的低通量表征。5.1 IP 或亲和纯化分析在免疫共沉淀 (co-IP) 测定中，目标蛋白与固定在支持物上的特异性抗体结合。添加感兴趣的小分子后，对目标蛋白进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和蛋白质印迹分析检测免疫沉淀蛋白及其结合配偶体的存在，图2 C如果小分子促进两种蛋白质之间的相互作用，则会检测到 co-IP 信号的增加，并表明该化合物作为潜在的分子胶成功稳定了蛋白质-蛋白质相互作用。沙利度胺是第一种分子胶，最初由 CIBA 于 1952 年发现，随后由格伦泰化学公司于 1957 年作为镇静剂开发，现在因其抗炎和抗肿瘤特性而被使用，直到 2010 年才被验证为分子胶。研究人员使用沙利度胺磁珠对细胞裂解物进行亲和纯化，并鉴定出与沙利度胺相互作用的 CRBN 和 DDB1as 蛋白。使用纯化的蛋白质，他们表明沙利度胺与 CRBN 结合，并由于其与 CRBN 的相互作用而与 DDB1 间接相互作用。2014 年，多个研究小组表明，沙利度胺类似物来那度胺可增加 CRBN 泛素化和降解 IKAROS 蛋白家族成员的活性。沙利度胺与 CRBN-DDB1 复合物的晶体结构确定了其作为分子胶的作用。5.2 .邻近连接分析BioID（邻近依赖性生物素识别）是一种依赖于大肠杆菌生物素连接酶 BirA的邻近标记方法，该酶在 R118G 处发生突变。POI在细胞中以BioID融合蛋白的形式表达，添加生物素后，会释放生物素酰-5'AMP，导致10 nm距离内蛋白质赖氨酸残基的混杂生物素化。然后用链霉亲和素包被的珠子沉淀蛋白质，并使用 MS 进行分析，图2 D。然而，BioID 的标记动力学很慢，因此需要足够的时间进行生物素标记（18-24 小时）。这限制了其在研究瞬态、短期 PPI 方面的应用。由此，设计了两种高效、混杂的 BirA 突变体，称为 TurboID 和较小的 miniTurbo，只需 10 分钟即可实现邻近标记。然而，TurboID 和 miniTurbo 都在哺乳动物细胞中表现出毒性。AirID（用于邻近依赖性生物素识别的前体 BirA）是另一种用于邻近标记的酶，由于其毒性降低，因此比 TurboID 有优势，但它需要更长的标记孵育时间。UltraID 是邻近连接酶库的最新成员；它的分子量为 19.7 kDa，是迄今为止设计的最小的酶，并且表现出高效的生物素化，而没有使用 TurboID 观察到的高水平背景标记。邻近连接测定已用于分子胶的研究。使用 AirID-CRBN 融合物，并检测到在用已知的分子胶泊马度胺处理后，SALL4 和 IKZF1 的生物素化有所增加。5. 结论和未来展望生化方法可能非常适合邻近诱导分子胶的识别和表征，并且预计它们在分子胶的合理筛选中的使用会增加。然而，由于其不同的作用机制和细胞系统内潜在复杂的相互作用，下游优化和验证仍然具有挑战性，这将需要结合下面将简要提到的方法。我们这里描述了一系列可用于创建先进的生化和细胞测定的技术，以系统筛选和验证潜在的分子胶。然而，需要仔细考虑这些测定的构建，以确保在测定中可以充分测量和控制蛋白质-蛋白质复合物浓度变化的检测（图3）。图3. 筛选考虑因素和未来机会。总结了筛选分子胶时的一些注意事项，以及未来可用于分子胶筛选的一些筛选技术的示例。(A) 在 MAPPIT 中，诱饵和猎物蛋白与缺陷的细胞因子受体嵌合体相关。当分子胶诱导诱饵和猎物接近时，嵌合体活性恢复，JAK-STAT 通路被激活，导致报告基因表达。(B) 在天然 MS 中，靶蛋白可以与各种效应蛋白和推定的胶一起孵育，并且可以使用 MS 直接测量未结合的蛋白质和/或所得复合物。(C) 在 Split-TEV 报告系统中，每个相互作用伙伴都用 N 端 TEV 或 C 端 TEV 标记，在分子胶诱导相互作用伙伴接近时，TEV 活性导致荧光素酶释放，在底物的存在。(D) 二聚化考虑因素。在旨在识别诱导二聚化的分子胶的 FRET 测定中，需要考虑可能有助于信号的复合物。在此示例中，不同批次的蛋白质分别用供体和受体标记，只有 50% 的胶诱导复合物会产生信号。(E) 信号窗口（背景信号和最大信号之间的差异）取决于相互作用蛋白的浓度、靶标和效应器之间的亲和力 (KTE)、胶水和效应器之间的亲和力 (KEG) 以及协同因子 α 。高通量筛选平台随后提供了一种从大型化合物库中识别潜在分子胶的有效方法。无论选择哪种方法，都应设计测定方法来测量测试化合物对感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用的影响。在初步筛选中鉴定活性物质后，应采用正交方法，例如表面等离子共振(SPR)，以定量评估化合物引起的 PPI 变化。当然，增强 HTS 活性物质和那些正交验证的命中的相关性需要基于细胞的测定来评估细胞环境中的分子胶活性。与传统药物发现一样，结构信息对于理解分子胶调节 PPI 的分子机制至关重要。在可以表达和纯化蛋白质的地方，应利用 X 射线晶体学或冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 来探索如何填充口袋以提高亲和性或协同性和选择性。此外，核磁共振（NMR）光谱可用于阐明潜在分子胶与其结合伴侣的结合模式。除了考虑筛选方法和要粘合的蛋白质试剂之外，决定在生化测定中筛选哪些文库也同样重要。这应该与分子胶通常的运作机制有着复杂的联系。总之，与 PROTAC 相比具有更多药物特性的小分子可以有效诱导蛋白质接近并调节靶蛋白功能和浓度，这一发现为集中精力合理设计和发现提供了动力。我们正处于进入分子胶药物发现领域的激动人心的阶段，幸运的是，现在可以将分析方法、生物物理和结构研究以及人工智能驱动的机器学习方法方面的技术进步结合起来，以帮助更好地理解促进新的和增强的蛋白质-蛋白质相互作用的小分子的分子特性。我们可能正在见证药物发现的一场革命，这可能会带来广泛的新的靶向治疗机会。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

11月14日，国家药监局官网显示，曙方医药医药引进的Vamorolone口服混悬液拟被纳入突破性治疗，适应症为用于治疗2岁及以上患者的杜氏肌营养不良（DMD）。今年9月Vamorolone首次被CDE纳入突破性治疗，适应症为2岁的杜氏肌营养不良（DMD）患者，此次进一步将临床用药患者拓展至2岁以上。2023年10月26日，美国食品药品管理局（FDA）正式批准Vamorolone用于治疗2岁及以上的杜氏肌营养不良（DMD）患者。糖皮质激素具有多种作用机制，包括反式激活、反式阻抑、对细胞膜的理化作用、与其他类固醇激素受体（盐皮质激素受体）的交叉反应等。在DMD中，通过反式阻抑途径（NF-κB抑制）的抗炎作用可能是临床起效的主要原因。然而，其它副作用会导致降低患者生活质量的副作用，例如对骨骼结构和功能的影响，以及刺激肌肉萎缩途径（也通过反式激活诱导atrogenes）。Vamorolone是糖皮质激素受体（GR）部分激动剂，属于解离型抗炎药，在引发抗炎症效果的同时，具有一定潜力避免传统类固醇所带来的副作用，有望替代目前的糖皮质激素而成为杜氏肌营养不良儿童和青少年患者的标准治疗方案。交易背景Vamorolone最初由ReveraGen Biopharma公司开发，2018年，Santhera公司获得了该药的全球研发许可（除日本和韩国以外）2022年1月4日，曙方医药与瑞士Santhera制药宣布就罕见病新药Vamorolone达成独家授权协议，获得在大中华区开发和商业化Vamorolone用于杜氏肌营养不良（DMD）及其他罕见病适应症的独家权益，协议总金额达1.24亿美元。根据协议，曙方医药将支付千万美元级别的首付款及美国注册申报相关里程碑款项，总计2000万美元。曙方医药还将支付两位数百分比的特许权使用费。参考文献1）CDE官网2）ReveraGen Biopharma官网3）曙方医药官网

前列腺癌作为男性的“专属”癌症，在我国已经成为了男性发病率第六的恶性肿瘤，多发于65岁以上老人，且至今发病率依然在攀升，也因此成就了上百亿美元的市场。雄激素受体（AR）在前列腺癌的发展有着重要的影响，因此AR也成为治疗前列腺癌的重要靶点，AR抑制剂成为治疗前列腺癌的重要手段之一。随着国产大军的加入，国内AR抑制剂市场再度涌动，且愈加剧烈。半壁江山随着安斯泰来恩扎卢胺用于治疗转移性激素敏感性前列腺癌（mHSPC）新适应症获CDE受理，使得这款畅销药在中国即将集齐前列腺癌三大适应症（mHSPC、mCRPC、nmCRPC）“大满贯”。在美国市场，恩扎卢胺早已在2019年12月获批扩展适应症，成为全球第一款可治疗三种不同形态晚期前列腺癌（mHSPC、mCRPC、nmCRPC）的口服药物。2019年，恩扎卢胺在全球前列腺癌药物市场份额中的占比已达到33.9%，2022年更是创下46亿美元的销售额，成为前列腺癌治疗领域名副其实的“药王”。恩扎卢胺的实力超群，主要归功于其作用靶点——雄激素受体（AR）。来源：安斯泰来官网前列腺癌作为男性新发及死亡最高的瘤种之一，新发患者正在逐年增加。近年来，我国前列腺癌发病率已呈现快速上升趋势，且患者在就诊时大多数已处于晚期，5年生存率显著低于发达国家。前列腺癌属于多阶段进行性疾病，其多个演变阶段具有不同的分子特征、药物反应和耐药机制，因此需在不同的演变阶段更换不同的治疗方案。具体来看，前列腺癌可分为几种类型：局限性前列腺癌、转移性激素敏感性前列腺癌（mHSPC）、非转移性去势抵抗性前列腺癌（nmCRPC）和转移性去势抵抗性前列腺癌（mCRPC）。其中，mCRPC是前列腺癌的主要致死因素，进展至mCRPC者平均中位生存时间少于2年。目前，市场上治疗前列腺癌的药物超过10种，其中以雄激素剥夺治疗（ADT）和雄激素受体（AR）治疗占据主要市场份额。在未来10年，前列腺癌治疗领域AR抑制剂仍然将会是市场上销售额最大的品种。来源：参考资料2由于前列腺癌具有雄激素依赖性，因此通过控制雄激素能达到治疗前列腺癌的目的。雄激素受体（AR）是一种类固醇受体，作为调节基因表达的DNA结合转录因子，通过结合雄激素，包括睾酮和二氢睾酮在细胞质中，然后易位到细胞核，从而调节一系列基因的转录。AR抑制剂的作用机制，就是内源性阻断雄性激素与AR的结合，从而抑制AR信号通路的正常激活，阻断雄性激素和AR的结合，让雄性激素无法发挥其生物学效应，进而影响前列腺癌细胞的生长与增殖，达到治疗前列腺癌的目的。在前列腺癌的治疗中，AR抑制剂是个十分重要的治疗手段，可贯穿早期内分泌治疗至去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。基于AR抑制剂在前列腺癌治疗方面出色的疗效，AR抑制剂在前列腺癌药物占比达56%，随着二代产品市场份额增加及联用疗法的探索，到2029年占比有望达57.8%，这其中恩扎卢胺依旧雄风不减。独领风骚截至目前，全球范围内已上市的治疗前列腺癌的AR抑制剂有7款，分别为第一代AR抑制剂氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺和第二代AR抑制剂恩扎卢胺、阿帕鲁胺、达洛鲁胺和瑞维鲁胺，其中瑞维鲁胺为国产原研药物。来源：药渡数据以比卡鲁胺为代表的一代非甾体类AR抑制剂曾经是治疗前列腺癌的一线用药，但是由于对晚期前列腺癌疗效不显著，并有可能激活促进肿瘤的生长，逐渐退出了历史舞台，而以恩扎卢胺为首的二代AR抑制剂逐渐成为了主流治疗药物。2021年，美国市场二代AR抑制剂已全面替代一代药物，其中恩扎卢胺在美国前列腺癌药物市场占比达38%。安斯泰来的恩扎卢胺软胶囊于2012年在美国获批上市，用于治疗化疗失败后的mCRPC，此后还获批了未经化疗的mCRPC、nmCRPC和mHSPC等适应症，贯穿前列腺癌治疗的多个阶段。2021年、2022年全球销售额分别高达41亿美元、46亿美元。在国内市场，前列腺癌诊疗中仍以第一代AR药物为主。根据药渡数据，2022年，比卡鲁胺为AR抑制剂中销售额最高的产品，总销售规模达8.3亿元，由于纳入集采，同比下降44.07%。其中阿斯利康市占率46.66%、朝晖药业18.28%、振东制药17.58%、海正药业15.14%等；氟他胺总销售额2930万元，由天士力和复旦复华瓜分。国内2022年比卡鲁胺市场竞争格局来源：药渡数据恩扎卢胺等二代产品由于上市时间较晚，目前市场份额占比较低，但二代AR抑制剂进入医保后放量可期，且具备广阔的一代AR药物迭代的市场空间。根据药渡数据，2022年，恩扎卢胺总销售规模3.1亿元，原研厂家安斯泰来和首仿豪森药业瓜分市场，市占率分别为95.28%、4.72%；阿帕鲁胺总销售规模2.34亿元，仍由原研厂家杨森独占。国内2022年恩扎卢胺市场竞争格局来源：药渡数据在二代AR抑制剂仍由外资企业把持的局面下，我们欣慰地看到，国内药企正在不断奋进中，并且已经取得了阶段性胜利。谁与争锋恒瑞医药的瑞维鲁胺（艾瑞恩）是中国首个自主研发的第二代AR抑制剂，于2022年6月获批高瘤负荷的转移性激素敏感性前列腺癌适应症。根据CHART研究结果表明，与标准治疗相比，瑞维鲁胺联合雄激素剥夺疗法（ADT）可显著延长患者的总生存期，并显著降低患者死亡和疾病进展风险分别达42%和54%。在Fast-follow的策略下，恒瑞医药的速度果真无人能比。来源：恒瑞医药官网HC-1119国产在研管线中，海创药业研发的HC-1119（氘恩扎鲁胺）已提交了新药上市申请，并于今年3月获受理。HC-1119是恩扎卢胺的氘代化合物，海创药业2023年半年报显示，HC-1119相比恩扎卢胺的优势在于其开发策略是针对二线、三线的mCRPC患者，临床使用剂量仅有恩扎卢胺的一半，并不影响有效性，安全性和病人依从性大大提高，有成为Best-in-class（同类最佳）品种的潜力。普克鲁胺开拓药业的普克鲁胺的前列腺癌适应症也处于临床III期。普克鲁胺是个悲情角色。在新冠疫情初期，普克鲁胺被用于开发成新冠特效药，并且在巴西的临床试验收获了惊艳的临床数据。然而，这一数据遭到了美国FDA的质疑，不得不在美国本土再次开展试验。结果，2021年12月，开拓药业公布III期临床中期试验未达到统计学显著性。尽管后来再次验证普克鲁胺可有效降低轻、中症患者住院率及死亡率，但无奈市场风向已转变，普克鲁胺也逐渐销声匿迹。而作为前列腺癌适应症的普克鲁胺，正在国内开展联合阿比特龙一线治疗mCRPC多中心、随机、双盲III期临床试验，预计2023年下半年或2024年上半年完成试验。此外，普克鲁胺治疗恩扎卢胺或阿比特龙耐药的mCRPC患者的二线疗法在美国开展的II期临床试验也接近尾声。从市场空间看，前列腺癌治疗的市场天花板较高，不同的治疗路径也使得前列腺癌治疗药物市场的容量加剧攀升。以AR为靶点的药物研发是长期以来倍受关注的热点，也持续推动了多种药物进入临床应用。AR抑制剂市场布局企业较多，目前全球范围内还有多款AR抑制剂处于临床研究阶段，随着研发进程加快，AR抑制剂种类将日渐丰富，与此同时，AR抑制剂市场竞争也将加剧。根据药渡数据，全球范围内在研 AR 抑制剂相关项目已超 105个，国内除上述药企布局外，还包括普恒医药、正大天晴等也有布局。部分AR抑制剂相关研发管线来源：药渡数据整理结语随着前列腺癌患者增加，前列腺癌药物仍将保持增长态势，AR抑制剂作为主流治疗要求，未来亦具有广阔发展空间。此外AR靶点潜在适应症广泛，目前已开展临床试验的适应症涵盖乳腺癌、脱发、避孕、女性激素依赖性疾病等领域，为药企们提供了丰富的研发思路。目前国产替代虽然已由恒瑞医药开启，但仍有较大替代空间，未来可期。后续发展如何，药渡还将持续关注。参考资料1、各大药企官网、公告等2、《恒瑞、开拓、海创围猎前列腺癌「药王」》，赛柏蓝，2023-10-093、《前列腺癌为世界最常见恶性肿瘤：全球AR抑制剂市场超 200亿美元》，财闻网，2023-07-13