更新于：2024-04-01

RAG-1

recombination activating 1

更新于：2024-04-01

基本信息

别名

E3 ubiquitin-protein ligase RAG1、Endonuclease RAG1、MGC43321

+ [7]

简介

Catalytic component of the RAG complex, a multiprotein complex that mediates the DNA cleavage phase during V(D)J recombination. V(D)J recombination assembles a diverse repertoire of immunoglobulin and T-cell receptor genes in developing B and T-lymphocytes through rearrangement of different V (variable), in some cases D (diversity), and J (joining) gene segments. In the RAG complex, RAG1 mediates the DNA-binding to the conserved recombination signal sequences (RSS) and catalyzes the DNA cleavage activities by introducing a double-strand break between the RSS and the adjacent coding segment. RAG2 is not a catalytic component but is required for all known catalytic activities. DNA cleavage occurs in 2 steps: a first nick is introduced in the top strand immediately upstream of the heptamer, generating a 3'-hydroxyl group that can attack the phosphodiester bond on the opposite strand in a direct transesterification reaction, thereby creating 4 DNA ends: 2 hairpin coding ends and 2 blunt, 5'-phosphorylated ends. The chromatin structure plays an essential role in the V(D)J recombination reactions and the presence of histone H3 trimethylated at 'Lys-4' (H3K4me3) stimulates both the nicking and haipinning steps. The RAG complex also plays a role in pre-B cell allelic exclusion, a process leading to expression of a single immunoglobulin heavy chain allele to enforce clonality and monospecific recognition by the B-cell antigen receptor (BCR) expressed on individual B-lymphocytes. The introduction of DNA breaks by the RAG complex on one immunoglobulin allele induces ATM-dependent repositioning of the other allele to pericentromeric heterochromatin, preventing accessibility to the RAG complex and recombination of the second allele. In addition to its endonuclease activity, RAG1 also acts as an E3 ubiquitin-protein ligase that mediates monoubiquitination of histone H3. Histone H3 monoubiquitination is required for the joining step of V(D)J recombination. Mediates polyubiquitination of KPNA1 (By similarity).

关联

项与 RAG-1 相关的药物

MB-110

靶点

RAG-1

作用机制

RAG-1刺激剂

在研机构

Mustang Bio, Inc.

原研机构

Leids Universitair Medisch Centrum [+1]

在研适应症

胶质母细胞瘤

非在研适应症

重症联合型免疫缺陷

最高研发阶段临床前

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

100 项与 RAG-1 相关的临床结果

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100 项与 RAG-1 相关的转化医学

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0 项与 RAG-1 相关的专利（医药）

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3,213

项与 RAG-1 相关的文献（医药）

2024-02-14·Molecular biology reports

Mutational analysis in different genes underlying severe combined immunodeficiency in seven consanguineous Pakistani families.

Article

作者: Hajra Fayyaz ; Atteaya Zaman ; Sheeba Shabbir ; Zara Khalid Khan ; Nighat Haider ; Ali Faisal Saleem ; Wasim Ahamad ; Imran Ullah

BACKGROUND:

Severe Combined Immunodeficiency (SCID) is an autosomal recessive inborn error of immunity (IEI) characterized by recurrent chest and gastrointestinal (GI) infections and in some cases associated with life-threatening disorders.

METHODOLOGY AND RESULTS:

This current study aims to unwind the molecular etiology of SCID and also extended the patients' phenotype associated with identified particular variants. Herein, we present 06 disease-causing variants identified in 07 SCID-patients in three different SCID related genes. Whole Exome Sequencing (WES) followed by Sanger Sequencing was employed to explore genetic variations. The results included identification of two previously reported heterozygous variants in homozygous form for the first time in RAG1gene [(p.Arg410Gln);(p.Arg737His)], followed by a recurrent variant (p.Trp959*) in RAG1, a novel variant in IL2RG (p.Asp48Lfs*24), a recurrent variant in IL2RG (p.Gly271Glu) and a recurrent variant in DCLRE1C (p.Arg191*) gene.

CONCLUSION:

To conclude, the immune-profiling and WES revealed two novel, two as homozygous state for the first time, and two recurrent disease causing variants contributing valuably to our existing knowledge of SCID.

2024-02-08·Mucosal immunology

Intraepithelial Lymphocytes Promote Intestinal Regeneration through CD160/HVEM Signaling.

Review

作者: Jiaoyan Huang ; Xin Zhang ; Hongkai Xu ; Liuhui Fu ; Yuke Liu ; Jie Zhao ; Jida Huang ; Zuodong Song ; Mingzhao Zhu ; Yang-Xin Fu ; Ye-Guang Chen ; Xiaohuan Guo

Chemotherapy and radiotherapy frequently lead to intestinal damage. The mechanisms governing the repair or regeneration of intestinal damage are still not fully elucidated. Intraepithelial lymphocytes (IELs) are the primary immune cells residing in the intestinal epithelial layer. However, whether IELs are involved in intestinal epithelial injury repair remains unclear. Here, we found that IELs rapidly infiltrated the intestinal crypt region and are crucial for the recovery of the intestinal epithelium post-chemotherapy. Interestingly, IELs predominantly promoted intestinal regeneration by modulating the proliferation of transit-amplifying (TA) cells. Mechanistically, the expression of CD160 on IELs allows for interaction with HVEM on the intestinal epithelium, thereby activating downstream NF-κB signaling and further promoting intestinal regeneration. Deficiency in either CD160 or HVEM resulted in reduced proliferation of intestinal progenitor cells, impaired intestinal damage repair, and increased mortality following chemotherapy. Remarkably, the adoptive transfer of CD160-sufficient IELs rescued the Rag1 deficient mice from chemotherapy-induced intestinal inflammation. Overall, our study underscores the critical role of IELs in intestinal regeneration and highlights the potential applications of targeting the CD160-HVEM axis for managing intestinal adverse events post-chemotherapy and radiotherapy.

2024-02-08·International journal of molecular sciences

GATOR1 Mutations Impair PI3 Kinase-Dependent Growth Factor Signaling Regulation of mTORC1.

Article

作者: Maéline Muller ; Jasmine Bélanger ; Imane Hadj-Aissa ; Conghao Zhang ; Chantelle F Sephton ; Paul A Dutchak

GATOR1 (GAP Activity TOward Rag 1) is an evolutionarily conserved GTPase-activating protein complex that controls the activity of mTORC1 (mammalian Target Of Rapamycin Complex 1) in response to amino acid availability in cells. Genetic mutations in the GATOR1 subunits, NPRL2 (nitrogen permease regulator-like 2), NPRL3 (nitrogen permease regulator-like 3), and DEPDC5 (DEP domain containing 5), have been associated with epilepsy in humans; however, the specific effects of these mutations on GATOR1 function and mTORC1 regulation are not well understood. Herein, we report that epilepsy-linked mutations in the NPRL2 subunit of GATOR1, NPRL2-L105P, -T110S, and -D214H, increase basal mTORC1 signal transduction in cells. Notably, we show that NPRL2-L105P is a loss-of-function mutation that disrupts protein interactions with NPRL3 and DEPDC5, impairing GATOR1 complex assembly and resulting in high mTORC1 activity even under conditions of amino acid deprivation. Furthermore, our studies reveal that the GATOR1 complex is necessary for the rapid and robust inhibition of mTORC1 in response to growth factor withdrawal or pharmacological inhibition of phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K). In the absence of the GATOR1 complex, cells are refractory to PI3K-dependent inhibition of mTORC1, permitting sustained translation and restricting the nuclear localization of TFEB, a transcription factor regulated by mTORC1. Collectively, our results show that epilepsy-linked mutations in NPRL2 can block GATOR1 complex assembly and restrict the appropriate regulation of mTORC1 by canonical PI3K-dependent growth factor signaling in the presence or absence of amino acids.

项与 RAG-1 相关的新闻（医药）

2024-02-18

·药时代

Science子刊颠覆性结论：体内免疫细胞越多，新冠症状反而更明显！

COVID-19由SARS-CoV-2引起，是一种严重疾病，导致全球广泛发病和死亡。我们对 SARS-CoV-2 和 COVID-19 的认识在 2020 年迅速发展。截至 2020 年 12 月，美国已有超过 30 万人死亡，冬季病例增长异常迅速。尽管疾病的严重程度与免疫失调相关，但人们对 COVID-19 炎症的细胞机制和发病机制仍知之甚少。近日，来自康奈尔大学的研究团队使用小鼠适应的 SARS-CoV-2 菌株 MA10 来研究适应性免疫细胞在疾病中的作用。研究结果表明，虽然适应性免疫细胞对于清除 SARS-CoV-2 感染很重要，但这是以炎症和病理增加为代价的。该研究题为“Adaptive immune cells are necessary for SARS-CoV-2–induced pathology”，发表在Science Advence杂志。SARS-CoV-2 通过人类血管紧张素转换酶 2 (hACE-2) 受体进入宿主细胞，这限制了已建立的动物模型用于研究影响疾病的免疫因素的用途。在研究病毒感染过程所需的主要小鼠模型依赖于hACE-2 受体的过度表达或转导。虽然 hACE-2 过表达和转导模型很有价值，但在解释宿主反应时需要注意一些问题。为了解决这个问题，研究人员开发了小鼠适应病毒 SARS-CoV-2 MA10，该小鼠模型的一个主要优点是受体在预期组织中以内源水平表达，类似于观察到的 hACE-2 表达模式，此外，它允许使用完善的基因小鼠模型来研究特定免疫细胞在病毒感染过程中的作用。研究人员首先通过鼻内感染 SARS-CoV-2 MA10 的rag1−/− 小鼠，每天监测体重，直到感染后 3、7 或 14 天(dpi) 对动物实施安乐死。作者观察到，受感染的 3 个月大的对照组小鼠在体重减轻峰值时体重减轻了约 3%，但出乎意料的是，在rag −/−小鼠中没有观察到这种情况。进一步研究发现，与感染SARS-CoV-2 MA10的野生型动物相比，rag−/-小鼠在感染早期的病毒复制较少，并且在30 dpi内不能清除病毒，它们不会发展出疾病和病理的严重程度。免疫学分析表明，与rag−/−小鼠相比，在感染后体重减轻高峰期间，对照组小鼠的肺中性粒细胞和促炎细胞因子有所升高。此外，rag −/−小鼠在感染早期表现出炎症抑制的特征。由于淋巴细胞在对照组小鼠的 SARS-CoV-2 MA10 病理学中起主要作用，研究人员希望分离出关键细胞参与者的潜在贡献。辅助T1细胞和细胞毒性 CD8+T 细胞是重要的 αβT 细胞亚群，参与对病毒感染的反应，表达高水平的抗病毒效应子。作者用 SARS-CoV-2 MA10 感染 6 个月大的缺乏αβT细胞的tcrα−/−小鼠，随后监测体重减轻并收集肺部以分析 4 和 14 dpi 时的病理学和病毒载量。结果表明 αβT 细胞至少部分负责这种感染的免疫发病机制，但它们并不单独起作用，也不完全负责rag −/−小鼠之间的全部表型差异。SARS-CoV-2 感染后先天性和适应性免疫系统的失调会导致免疫病理学。为了研究将循环淋巴细胞引入rag−/−小鼠中是否可以重现对照组小鼠感染后观察到的体重减轻，作者收集了 6 个月大的对照组小鼠的脾细胞并在感染前7天注射 5 × 10 7个细胞，结果发现在 3 dpi 时，对照组小鼠在感染后比rag−/−小鼠损失的体重明显更多。值得注意的是，只有WT小鼠细支气管中的上皮细胞脱落或坏死，而rag -/-小鼠则没有。总体而言，该研究已经证明，在感染 SARS-CoV-2 MA10 后，缺乏适应性免疫系统的动物比具有强大适应性免疫系统的动物的发病率更低。将免疫细胞瞬时转移到免疫功能低下的动物中不足以诱导在对照组动物中观察到的病理学，这暗示了肺部驻留免疫细胞（包括 T 细胞）在驱动疾病中的作用。此外，与对照组小鼠相比， rag-/−小鼠表现出减弱的促炎特征，同时仍限制病毒复制。作者提出了一个模型，为理解适应性免疫在驱动 COVID-19 病理学中的作用提出了新问题，未来的研究将寻求揭示适应性免疫细胞驱动 COVID-19 疾病的机制和途径。这些发现反过来可能对其他冠状病毒引起的传染病产生重要影响。封面图来源：123rf为什么说这一疗法获批上市，是一个历史性时刻？司美格鲁肽片剂技术解构及其隐性知识的启示RSV疫苗：GSK赚了15亿，辉瑞赚了8.9亿，中国市场或成下一个重点！点击这里，欣赏更多精彩内容！

临床结果临床研究

2023-09-14

·生物探索

一种新型的免疫缺陷猴模型

严重联合免疫缺陷(SCID)包括一系列遗传性疾病，导致免疫系统的严重恶化。在与SCID相关的关键基因中，RAG1和IL2RG起着至关重要的作用。IL2RG对于T、B和NK细胞的发育、分化和功能至关重要，而RAG1在淋巴细胞成熟过程中通过促进V(D)J重组而对适应性免疫起关键作用。携带这些基因突变的动物模型在其免疫系统中表现出明显的缺陷。非人灵长类动物(NHPs)是非常适合生物医学研究的模型，因为它们在遗传和生理上与人类相似。胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)是精确、有效地修饰基因组中单碱基突变的有力工具。它们的成功应用已经在人类细胞、小鼠和作物物种中得到证实。2023年9月4日，暨南大学闫森及涂著池共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39）在线发表题为“Generation of inactivated IL2RG and RAG1 monkeys with severe combined immunodeficiency using base editing”的研究论文，该研究提出了一种使用CBE4max系统使IL2RG和RAG1基因失活来构建免疫缺陷猴模型的方法。经过碱基编辑的猴子表现出严重受损的免疫系统，其特征是淋巴细胞减少、淋巴样器官萎缩和成熟T细胞缺乏。此外，这些经过基因编辑的猴子能够承载和支持人类乳腺癌细胞的生长，从而导致肿瘤的形成。总之，该研究已经成功开发了一种免疫缺陷猴模型，该模型具有使用CBE4max系统促进肿瘤生长的能力。这些免疫缺陷猴子显示出作为推进生物医学和转化研究的宝贵工具的巨大潜力。严重联合免疫缺陷(SCIDs)包括一组遗传性疾病，严重破坏免疫系统的功能。这导致来自胸腺和骨髓的T细胞和B细胞的缺失或减少，导致细胞和体液适应性免疫受损。SCID的发病机制主要涉及由于嘌呤代谢缺陷、通过常见γ链依赖性细胞因子受体的信号传导异常、V(D) J重组异常以及前TCR/TCR信号传导缺陷导致的前体淋巴细胞过早死亡一些基因突变已被确定为SCIDs的诱因，包括MALT1、ZAP70、IL21R、FOXN1、CORO1A、RAG1/2、IL2RG、AK2、IKBK2、UNC119、LCK、TTC7A、CARD11和BCL10。其中，IL2RG，也被称为公共γ链，作为IL-21、IL-15、IL-9、IL-4和IL-7受体共有的IL-2受体的亚基。 IL2RG突变导致X连锁严重联合免疫缺陷(X-SCID)，这是最常见的SCID形式，占所有病例的50%。在X-SCID中，T和NK细胞缺失或明显减少，而B细胞表现出功能障碍，其数量正常或增加。另一个与SCID相关的基因是RAG1，它通过促进发育中的淋巴细胞V(D)J重组在适应性免疫中起关键作用RAG重组酶(RAG1/2)将可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因片段随机组合，生成V(D)J外显子，编码T细胞受体和抗体的可变区。许多丧失功能的RAG1突变体已被确定为人类SCID的致病因素。这些突变体的特征是部分蛋白表达和T细胞和B细胞的有限产生，同时保持正常NK细胞的功能。免疫系统受损的动物可分为先天性突变引起的遗传免疫缺陷或通过生物技术方法人工诱导的遗传免疫缺陷。目前，有几种类型的遗传免疫缺陷动物模型，如小鼠、大鼠和猪。这些免疫缺陷动物在肿瘤学、干细胞治疗、免疫系统研究和传染病等领域有广泛的应用。人源化小动物模型在免疫肿瘤学研究中特别有价值，因为它们提供了临床转化的潜力。然而，针对具体情况准确选择合适的模型仍然具有挑战性。目前还不可能找到一种完全复制人类生物学所有方面的小鼠模型，而且一些SCID小鼠随着年龄的增长会出现“免疫泄漏”。这些“泄漏”导致小鼠产生少量功能性T细胞和B细胞，以及免疫球蛋白。SCID小鼠免疫泄漏背后的分子机制尚不清楚，目前还没有确定的诊断标准。非人灵长类动物(NHPs)在系统发育上与人类高度相关，在生理上有许多相似之处，包括免疫系统特征NHPs与人类在遗传和生理上的相似之处使它们成为生物医学研究的优秀模型。因此，建立免疫缺陷猴模型势在必行。碱基编辑猴的生成过程示意图（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy）虽然CRISPR/Cas9有望用于治疗和生物学研究，但由于它依赖DNA双链断裂(DSBs)来促进基因编辑，因此引起了人们的担忧。CRISPR/Cas9诱导的DSBs可导致数千个碱基对的缺失，从而导致可能对有丝分裂活性细胞产生有害影响的基因型的产生。例如，当应用于人类多能干细胞时，CRISPR/Cas9可以诱导p53突变，限制了细胞替代疗法的可行性。此外，基因编辑的效率受到插入缺失突变的高频率的阻碍，在HEK293T细胞中，CRISPR介导的同源定向修复率仅达到38%。然而，大多数已知的遗传疾病主要是由单核苷酸多态性(SNPs)引起的。因此，需要能够在不引入DSBs的情况下特异性地修改目标位点上的单个碱基对的方法。碱基编辑器提供了可编程性和灵活性，消除了对DSBs的需求，克服了传统Cas9核酸酶在基因编辑中的局限性。胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)具有胞嘧啶脱氨酶活性，已被有效地用于在包括人类、小鼠和作物在内的各种生物体的基因组中引入精确的单碱基突变。与CBE4相比，CBE4max系统是C-G到T-A转化的增强工具，已在小鼠模型中开发和验证，随后对哺乳动物物种进行了优化。该研究利用CBE4max系统在IL2RG和RAG1基因中引入特异性单核苷酸替代，成功实现了非人灵长类动物免疫缺陷模型的生成。碱基编辑过程导致被编辑猴子的免疫系统明显受损，表现为淋巴细胞减少、淋巴样器官萎缩和缺乏成熟T细胞。此外，研究人员观察到人类乳腺癌细胞在碱基编辑的猴子体内存活和增殖的显著能力。这些有免疫缺陷的猴子是临床前研究的宝贵工具，并弥合了小动物模型与人类之间的差距。它们的利用可以显著提高临床前研究的有效性，为抗癌药物的开发和再生医学领域的异源细胞或器官移植提供依据。文章来源“iNture”责编|文竞择校对|文竞择End往期精选围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎热文富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老热文世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝热文为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者热文首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元点击“阅读原文”，了解更多~

细胞疗法临床研究

2023-08-09

·生物制品圈

推荐学习 | 抗体的前世今生

1890年，日本科学家北里柴三郎发现，感染白喉杆菌的动物康复后，血浆中存在一种能缓解白喉毒性的物质。他将这种物质命名为抗体（antibody）。本文将从抗体定义，抗体分类，抗体-抗原结合，单克隆抗体的生产，应用和生物功能来介绍抗体的前世。一、抗体定义抗体，又称免疫球蛋白（immunoglobulin），由B淋巴细胞产生，是一种Y字型分子，由两条轻链和两条重链组成，分子量约为150kD，其中轻链分子量约25kD，重链分子量约50kD。按照功能划分抗体分子可分为抗原结合区Fab和可结晶区Fc。Fab区域具有高度可变性，能高亲和力结合特异抗原，Fc区域较为保守，主要招募相关细胞引发免疫反应，如吞噬等。Fab与Fc结合处称为铰链区。两条重链和轻链以二硫键相连。在抗体Fc区域还存在大量N-糖基化修饰，这些糖类对于抗体发挥功能有着重要作用。IgG2a结构。Harris et al. 1997二、抗体分类根据抗体重链Fc区域的不同，可将抗体分成五类，即IgA, IgG，IgM, IgD, IgE，对应α, γ, μ, δ，ε五种不同类型重链；轻链有两种类型，分别是κ链和λ链，两者在功能上没有区别，在人体内κ链和λ链的数量比为2:1。五种不同抗体的结构如上图所示，IgG, IgD, IgE在体内均为单体形式存在，IgM被J chain固定在Fc区，形成五聚体IgA既有单体，也有J chain固定的二聚体形式（与J chain形成二硫键）。单体IgA主要分布于骨髓、淋巴结、脾脏，二聚IgA主要位于粘膜表面，如皮肤、肠道，也存在于乳汁、眼泪、汗液等分泌物中。不同抗体分子量、血浆浓度和半衰期IgG是血浆内含量最高的抗体，根据铰链区结构不同可以进一步细分为4个亚型，即IgG1-4.。铰链区可以增加抗体Fab片段的弹性，使其更容易结合抗原表面两个表位，也更容易激活补体。但铰链区越长，越容易被蛋白酶降解，因此寿命越短（IgG3）。四种亚型，IgG4最特殊，它的含量最低，不能激活补体，但却有一项额外技能（由CH3区域赋予）：可以与另一分子IgG4交换半边轻重链，形成杂合抗体（除IgG4外，所有抗体的两个Fab区域都是一样的）。IgG亚型结构。黑色连线代表二硫键根据抗体氨基酸序列保守程度，可以将轻重链分成可变区(V domain)和保守区(C domain)。轻链的C区与V区均由β-sheet方式折叠成两团，对可变区氨基酸进行测序发现，其中某些区域的氨基酸基团可变程度远远高于周围，将这些区域称为超变区（hypervariable region, HV）三维结构上，这些超变区位于β-sheet的连接环(loop)处，由于它们与抗原结合，故被命名为互补决定区域（complementarity-determining region, CDR）。同一条轻链的V区共有3个CDR，这些区域的氨基酸序列决定了抗体能否与抗原特异、紧密结合。为了对抗体不同区域进行研究，可以用蛋白酶切割的方式将抗体从铰链区切断。常用的有木瓜蛋白酶（papain）和胃蛋白酶（pepsin）。在一定条件控制下，Papain较为温和，切断铰链区后产生两分子Fab和一分子Fc；Pepsin则能将Fc切碎，保留铰链区域的二硫键，形成一分子F(ab')2，通过加入还原剂也能得到单分子Fab三、抗体-抗原结合抗体具有高度特异性，主要是通过结合抗原表面某一特定分子结构而产生的，这种抗原表面的特定结构被成为表位（epitope）。抗原可以是任何分子，最主要为蛋白质以及糖类（包括糖蛋白、糖脂）等大分子。对于分子量比较小的，我们称之为半抗原（hapten）。这些小分子需要共价结合在蛋白等大分子上才能被抗体识别。有时候，抗体结合的表位是序列上连续的氨基酸，这种表位称为线性表位（linear epitope）；有时，表位是空间上临近，但蛋白序列上不相邻的氨基酸，这种表位称为不连续表位(discontinuous epitope)。含有多个表位的抗原称为多价抗原（multivalent antigen），可以被不同抗体识别。关于抗体-抗原相互作用强弱的表征，有两个重要概念，分别是affintiy和avidity。两者中文都是“亲和力”的意思，但affinity指单个Fab区域结合抗原表位的强弱，而avidity指整个抗体分子（甚至是抗体的二聚体、五聚体）结合抗原能力的强弱。例如，IgM以五聚体形式存在，虽然Fab区域affinity较低，但由于整个分子存在10个Fab区域，可以结合具有重复表位的抗原，总体avidity还是比较高的。解离常数Kd可以表征Fab与抗原作用强弱，一般IgG抗体的Kd都在nM量级。测量抗体Fab的affinity的主要表征手段为表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance， SPR），其原理如下图所示：抗原分子附着在金属表面，抗体Fab与其结合，使得光路发生改变。测量达到平衡时有多少表面分子结合即可算出解离常数。由于抗体-抗原的结合具有特异性和高亲和性，化学上可以利用抗体制造反应催化剂，这种抗体被称为催化抗体（catalytic antibody）。催化抗体的作用机理是结合并稳定反应过渡态分子，降低反应活化能。通过选择、设计合适的半抗原，可以生产出具有高度选择型的催化抗体。抗体具有高度可变性和庞大的数量，远远大于编码蛋白的基因数（2万）。那么，人体是如何产生种类繁多的不同抗体呢？为了产生尽可能多种类的抗体，有两个主要的过程：遇到抗原以前，B细胞通过V(D)J重组（recombination）产生不同抗体；遇到抗原以后，主要通过体细胞超突变（somatic hypermutation，SHM）产生高亲和力抗体（这一过程被称为affinity maturation）。这里主要介绍V(D)J重组过程，SHM将在后一章介绍。编码免疫球蛋白的基因并不是一个基因，而是由许许多多基因片段组成，依次排列在染色体上。在人体，B细胞通过“洗牌”的方式抽取不同基因片段连成完整的重链、轻链基因。免疫球蛋白重链基因座位于14号染色体上，分为V(variable)、D(diversity)、J(joining)三个区域，每个区域分别有约40、23、6种不同的基因片段。轻链的可变区只有V和J两个区域，其中λ链基因座位于22号染色体，对应区域分别有约30、4个片段，κ链基因座位于2号染色体，对应区域分别有约35、5个不同片段。每个B细胞需要从V、D、J区域各随机抽取一个片段组成重链，再从λ或κ链中的一个选择一个V区+一个J区片段组合成轻链，最终形成完整的抗体。这样计算一下抗体可能的总数便有40×23×6×(35×5+30×4)=1.6×10^6种。免疫球蛋白基因座结构B细胞内催化V(D)J重组的酶主要是Rag1和Rag2，在重组过程中一些DNA修复酶也会参与其中。重组信号序列（RSS）是RAG的识别位点，由保守的7mer(5'-CACAGTG-3')，12/23 spacer和保守的9mer(5'-ACAAAAACC-3')组成。RSS位于V片段3'端，D片段两侧和J片段5'端。12spacer RSS和23spacer RSS分别位于同一间隔片段的两端，这样才能保证RAG酶正确切割（称为12/23规则）。RAG复合物从7mer上游切断DNA形成双链断裂切口，并将切口处相邻的核苷酸连在一起。接着，Artemis复合物与DNA结合，切断其中一条链，打开hairpin结构，形成回文核苷酸（Palindromic, P-nucleotide）【注：回文DNA的互补链和正义链序列正好反过来】。这样，切口两端的DNA双链均有一条向外延伸的粘性末端（3' overhang）。TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)会继续在P-nucleotide末端随机插入碱基，进一步增加抗体的多样性。这些插入的碱基称为N-nucleotide。最后，通过非同源末端连接（NHEJ）将两条DNA片段连接到一起，完成一次重组。连接过程使得抗体获得额外多样性，增加的倍数多达3×10^7。四、单克隆抗体的生产单克隆抗体（monoclonal antibody）是指单一种类的抗体。杂交瘤（hybridoma）技术是目前最常用的单克隆抗体生产技术，可以满足目前大量生产抗体的需要。为了获得针对某种抗原的抗体，首先需要将抗原注射到小鼠（或者兔、山羊等动物）体内，待其产生免疫反应后分离其脾脏中的B细胞，同时与永生化的淋巴瘤细胞融合。使用含有HAT的培养基筛选细胞，只有融合成功的B细胞可以存活并扩增。这种细胞既能像成熟B细胞一样产生抗体，又具有淋巴瘤细胞无限分裂和永生的能力。未融合的淋巴瘤细胞会被HAT杀死，而天然B细胞的寿命很短最终也会死去。最后只剩下融合的杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞稀释到极低浓度分装于96孔板中，使得每个孔中只有一个细胞，这样孔中的扩增出来的细胞就都是单克隆细胞了。通过ELISA法筛选，可以选出结合特定抗原的单克隆抗体。将该细胞扩增，收集上清液，就能纯化出抗体。纯化抗体使用的是从金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）中分离出的Protein A，这是一种能特异结合IgG等抗体Fc区域的蛋白。同样来源于链球菌，Protein G也能结合抗体Fab和Fc保守区，被用于提纯抗体。但Protein G对于血清蛋白albumin也有一定结合能力，需要删去结合域。Protein L来源于Peptostreptococcus magnus，可以结合抗体轻链部分。五、应用1.ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）中文名称酶联免疫吸收法，是一种最常见的利用抗体特异性分析物质浓度的方法，其基本原理如下图所示：待分析物（抗原）吸附在固定相表面，加入抗体孵育，抗体与抗原结合，洗涤去除非特异性吸附。抗体表面连有酶，可以催化某些化学反应发生，产生荧光物质。最常用的是辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢-鲁米诺体系，该反应十分灵敏，可以检测到nmol量级甚至更低的蛋白。Luminol化学发光反应机理2. Western blot（免疫印迹法）该方法的基本原理和ELISA类似，是将蛋白样品通过凝胶电泳分离（SDS-PAGE）、转膜后，分别孵育一抗和二抗，最后荧光法显色。该方法广泛应用于生化分析，是生物学实验的必备技能之一。3. 抗体共价药物（antibody-drug conjugates，ADC）利用抗体结合抗原的特异性，可以将抗体作为载体定点释放药物，从而减少药物的毒副作用、增强药效。抗体共价药物，顾名思义就是通过化学反应在抗体分子上共价连接小分子药物。目前获FDA批准上市的抗体共价药物包括Adcetris®（anti-CD30，治疗霍奇金淋巴瘤），Kadcyla®等，均用于癌症治疗。这些抗体药物首先结合肿瘤细胞表面特异靶蛋白，被细胞内吞后分解释放出具有细胞毒性的小分子药物，从而有效杀死肿瘤细胞。六、生物功能抗体主要通过中和（neutralizing）、调理（opsonization）、和抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）三种方式清除病原体。中和：直接与细菌、病毒以及毒素结合，防止其进入细胞内。调理：抗体结合病原体后，被巨噬细胞、粒细胞等吞噬细胞（phagocyte）表面的Fc受体识别、内吞并消化。此外抗体也能激活补体系统，增加病原体被吞噬的概率。ADCC：NK细胞表面Fc受体能识别被抗体标记的细胞（如肿瘤细胞和被病毒感染的细胞），并分泌毒素杀死异常细胞。抗体参与的中和、调理过程，最右为补体参与的调理过程。不同类型的抗体的Fc区域有很大差异，因此发挥的功能也不一样，下表是抗体功能的总结：可以看到，IgG家族蛋白功能最为广泛，几乎囊括了中和、调理、补体激活和ADCC的全部功能。IgE比较特殊，只能激活肥大细胞，是过敏反应的元凶。小结：抗体是体液免疫的重要组成。本章介绍了抗体的基本结构、分类以及生物功能，同时也涉及到抗体在生物实验和医药方面的重要应用。抗体-抗原相互作用的特异性和高亲和性是抗体发挥免疫功能的基础。抗体的多样性来源于VDJ重组和SHM，本章对前者的机理做了详细解释。参考文献：【1】 Murphy, Ken, and Casey Weaver.Janeway's immunobiology. Garland Science, 2016.【2】Parham, Peter.The immune system. Garland Science, 2014.【3】Sievers, Eric L., and Peter D. Senter. "Antibody-drug conjugates in cancer therapy."Annual review of medicine64 (2013).【4】Pandey, Shivanand. "Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies."Hybridoma1.2 (2010): 017.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。