β-actin

01. 文献概述 近期，北大的团队在Nature Catalysis期刊发表了一篇名为《In situ lysosomal proteomics enabled by bioorthogonal photocatalytic proximity labelling》的文章，主要描述了其开发了一种新的溶酶体邻近标记技术。 图1. CAT-Lyso系统用于活细胞中溶酶体蛋白质组分析的示意图。 溶酶体是细胞内的一个重要细胞器，参与多种细胞过程。溶酶体功能异常与多种疾病相关。 传统的亚细胞蛋白质组学方法，需要细胞裂解处理，会改变细胞和细胞器的原始状态，且存在材料需求大、时空分辨率低、易受污染等问题。而生物催化邻近标记方法需要基因工程改造细胞以引入外源酶，限制了其在原代样本中的应用。 而北大团队开发的这项技术将能够突破这些壁垒，特异性的靶向活细胞溶酶体中的蛋白质并进行标记。 02. 研究方法 1. 伊红在吗啉基团的加入下，LysoCat（伊红光催化剂）就形成啦，这是一种能够靶向溶酶体的伊红衍生物，它可以用于对活细胞中溶酶体蛋白质组的原位分析。注意： 没有引物吗啉基团的伊红可是没有特定靶向的哦，它是在细胞质内均匀分布的。 2. LysoCat在被活细胞摄取后，细胞内的酯酶会将其去乙酰化，释放出高活性的伊红会定向到细胞的溶酶体，在那里，如果用绿色发光二极管（LED；波长520 nm，功率15 mW/cm²)照射的话，被保护的探针就会被催化，脱离保护被暴露出来，从而被激活。这些被激活的，与生物素偶联探针，就会标记附近的溶酶体内蛋白质啦。 3. 利用链霉素对生物素的亲和作用，这些被生物素偶联的蛋白质就会被富集到一起，然后就可以通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）进行富集和蛋白质组分析，鉴定出溶酶体内蛋白质或跨膜蛋白质啦。 03. 基础实验小课堂 问：为什么要测试不同的细胞类型？ 答：为了测试并验证该技术平台对于各类细胞的普适性。 那么要如何测试呢？让我们一起来看一下吧 不同细胞类型的溶酶体光催化邻近标记（CAT-Lyso） 图2. 免疫印记分析前细胞处理的示意图 流程： 1. 将Hela细胞接种到12孔板中培养，待汇合度>90%时，移除培养基 2. 将细胞与LysoCat（10 µM，1 ml DMEM）在37°C、5% CO₂下孵育30分钟 3. 用DMEM洗涤三次，用PBS洗涤一次 4. 加入SF2（50 µM，1 ml DMEM），细胞在37°C、5% CO₂下孵育30分钟 5. 在室温下用绿色LED照射15分钟，并在黑暗中放置15分钟 6. 用PBS（每孔1 ml）洗涤一次 7. 用100 µl RIPA强裂解缓冲液重悬 8. 在冰上孵育10分钟 9. 加入25 µl 5× SDS-PAGE还原上样缓冲液（上样缓冲液的最终浓度为1×） 10. 在95°C下加热15分钟 11. 4-15%梯度SDS-PAGE和0.2-µm PVDF膜进行免疫印迹分析 12. 使用小鼠抗生物素单克隆抗体（mAb）和β-肌动蛋白mAb作为一抗（1:1,000稀释），辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗小鼠免疫球蛋白G（作为二抗（1:5,000稀释） 结果解读： 图3. 经LysoCat处理的Hela细胞的免疫印迹结果 阴性对照（左一泳道）为没有经过临近标记技术处理的Hela细胞组，接着（中间泳道和右一泳道）是经过不同浓度的LysoCat处理后的实验组，通过免疫印迹法检测到强烈的生物素标记信号，证实了光催化标记的发生，更高的LysoCat浓度会导致更强的标记信号。 图4. 经LysoCat处理的不同细胞的免疫印迹结果 在其他对多种类型的细胞（HEK293T、RAW264.7、iBMDM、Raji、K562和Jurkat）进行了相同的标记程序，这些细胞类型从上皮样细胞到巨噬细胞和白血病细胞都有涉及。在所有测试的细胞系中都检测到了明显的光催化标记信号，这表明该策略对广泛的细胞类型都有效。 实验中用到的主要试剂： 图片来源：生产商：康为世纪（CWBIO) 知识点敲黑板： A. 免疫印记是什么？ 这是一种用于检测样本中特异性蛋白的实验技术。它是将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 B. Actin是什么？ 肌动蛋白（Actin） 是一种广泛存在于真核细胞中的蛋白质，具有多种重要的生物学功能在分子生物学实验中，肌动蛋白（Actin）常被用作内参（内参照）基因或蛋白。 C. 为什么选择actin作为内参? 原因主要基于其以下特性： 1.高度保守性 • 序列保守：肌动蛋白基因在不同物种之间高度保守，这意味着其序列在进化过程中变化很小。例如，不同哺乳动物的β-actin基因序列高度相似。 • 结构保守：肌动蛋白的蛋白质结构在不同物种中也高度保守，这使得针对肌动蛋白的抗体可以广泛应用于多种物种的实验。 2.表达稳定且丰富 • 广泛表达：肌动蛋白在几乎所有真核细胞中都有表达，且在不同组织和细胞类型中的表达量相对稳定。 • 表达量适中：肌动蛋白的表达量既不过高也不过低，适合用作内参来标准化实验中的信号。 3.功能重要性 • 细胞骨架成分：作为细胞骨架的重要组成部分，肌动蛋白参与细胞形态维持、细胞运动、细胞分裂等多种生物学过程。 • 实验中的可靠性：由于其在细胞中的重要性，肌动蛋白的表达水平通常不会因实验处理而发生显著变化，这使得它成为可靠的内参。 4.其他优势 • 易于检测：肌动蛋白的分子量适中（约42-43 kDa），且有多种特异性抗体可供选择，便于在Western Blot等实验中检测。 • 适用范围广：适用于多种实验条件和组织类型，但在某些特殊情况下（如肌肉组织）可能需要选择其他内参。 D. 免疫印记中内参的作用? 1.校正蛋白上样量 • 确保上样量一致：在Western Blot实验中，不同样本的蛋白质上样量可能存在差异，这会影响实验结果的准确性。通过检测内参蛋白的表达水平，可以确保各泳道之间的蛋白上样量一致，从而更准确地比较目标蛋白的表达差异。 2.检测转膜效率 • 评估转膜效果：在电泳分离后的蛋白质转移到膜上的过程中，不同泳道的转膜效率可能不同。内参蛋白的转印效率可以帮助确定目的蛋白是否被有效转印到膜上。 3.排除实验误差 • 监测实验体系：内参可以作为实验体系的空白对照，帮助检测整个实验过程中的误差，包括蛋白提取、转膜、显色或发光体系等是否正常。 4.提供定量标准 • 用于定量分析：在半定量或定量分析目标蛋白表达水平时，内参蛋白的表达水平可以作为标准化的参考。通过计算目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值，可以更准确地反映目标蛋白的相对表达量。 04. 研究意义 技术优势：CAT-lyso系统作为一种无基因改造的亚细胞蛋白质组学技术，具有广泛的适用性，能够对难以转染的细胞、原代细胞以及临床样本进行原位亚细胞蛋白质组分析。 疾病研究与治疗：该技术为深入研究溶酶体相关疾病的发生机制、发现新的疾病标志物和治疗靶点提供了有力支持，有助于推动相关疾病的研究和治疗进展。 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

引言 在生命的微观剧场中，RNA分子如同精准的时空指挥官，通过动态的定位与运输调控基因表达、蛋白质合成乃至细胞命运。然而，研究人员长久以来只能通过"静态快照"（如固定细胞成像）或"人工标记"（如插入荧光标记序列）来推测这些分子的行为，就像通过化石拼凑恐龙的运动轨迹——直到2月18日加州大学伯克利分校的研究团队在《Nature Biotechnology》发布的突破性成果“Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm”。他们开发的smLiveFISH技术（single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization），首次实现了对活细胞中天然RNA分子的实时单分子追踪，其精度足以捕捉单个mRNA在细胞质中的纳米级位移（位移分辨率达325 nm），将我们对生命基本过程的观测推向了全新维度。 这项技术巧妙改造了CRISPR-Csm系统，使其从基因编辑工具变身为分子显微镜：通过设计24-48个靶向RNA的crRNA探针阵列，配合多荧光标记的Csm蛋白复合体（每个复合体携带≥3个GFP标签），成功突破传统成像技术信噪比不足的瓶颈。研究团队不仅验证了NOTCH2 mRNA通过共翻译转运（cotranslational translocation）锚定在内质网的经典理论，更首次捕捉到MAP1B mRNA以1.3 μm/s的速度沿微管定向运输的震撼画面——这相当于每分钟跨越半个细胞长度的"分子特快专列"。当用嘌呤霉素（puromycin）抑制翻译时，NOTCH2 mRNA的静态群体比例从71%骤降至34%，而MAP1B mRNA竟加速至1.5 μm/s，并聚集成与P小体（P-body）共定位的应激颗粒，揭示了RNA运输与细胞应激反应的深度关联。 这项突破不仅解开了困扰学界20年的活体RNA观测难题，更为神经退行性疾病、癌症转移等重大疾病的研究提供了革命性工具。想象未来研究人员能像观看实时交通监控那样，追踪渐冻症（ALS）患者神经元中TDP43蛋白异常导致的mRNA运输瘫痪，或可视化癌细胞转移时β-肌动蛋白（β-actin）mRNA的前沿集结——smLiveFISH正在打开生命科学的"暗物质"宇宙，让我们得以亲眼见证那些曾只存在于教科书示意图中的分子奇迹。 这项由加州大学伯克利分校Jennifer A. Doudna团队开发的技术，首次实现了对活细胞中天然RNA分子的单分子级实时追踪——就像在细胞内部安装了纳米级GPS定位系统，研究人员终于能亲眼目睹mRNA在细胞内的动态旅程。 研究团队利用改良的CRISPR-Csm系统，成功观测到NOTCH2和MAP1B两种关键mRNA的运输机制：前者像被"锚定"在内质网附近进行共翻译转运，后者则如同微型货车沿着微管轨道向细胞边缘疾驰。 这项技术突破解决了困扰生物学界20年的难题。自1998年首次实现活细胞RNA成像以来，研究人员始终面临两大困境：要么需要人工改造RNA序列（可能改变其天然行为），要么成像分辨率不足（只能观察RNA团块）。smLiveFISH的诞生，标志着人类首次具备在天然状态下解析RNA时空规律的能力。 RNA的时空之旅：为何重要？ 在传统认知中，RNA只是DNA与蛋白质之间的"传令兵"。但现代生物学发现，RNA分子自身就是精密的时空管理者： 定位决定命运：β-肌动蛋白mRNA会被精准运输到细胞运动前沿，其定位误差会导致细胞迁移异常（Ross et al., 1997） 时间就是生命：神经元中的mRNA必须在特定发育阶段抵达树突，错时到达可能引发神经退行性疾病（Buxbaum et al., 2015） 空间调控疾病：在渐冻症（ALS）患者中，TDP43蛋白异常会导致MAP1B mRNA运输紊乱，与神经元死亡直接相关（Coyne et al., 2014） 然而这些发现多来自固定细胞或人工标记系统，就像通过静态照片推测车辆行驶路线。smLiveFISH提供的实时动态影像，将彻底改变我们对生命基本过程的理解方式。 CRISPR-Csm系统：新一代RNA成像技术 技术原理：分子探针的协同作战 smLiveFISH的核心创新在于将CRISPR-Csm系统改造为"分子探针阵列"。传统CRISPR成像（如Cas13系统）如同单兵作战，每个RNA分子只能结合1个探针，信噪比难以突破。该技术则部署了24-48个Csm探针，通过以下机制实现突破： 多重锁定：针对目标RNA的3'非翻译区（3'UTR）设计crRNA阵列，形成"探针包围网" 信号放大：每个Csm复合体携带≥3个GFP荧光标记，多探针协同产生可检测信号 精准处理：利用Cas6酶切割超长pre-crRNA，确保探针在细胞质正确定位 实验数据显示，当使用24个crRNA探针时，85%的Csm信号点与smFISH（单分子荧光原位杂交）标记共定位，信噪比较传统方法提升30倍。即使在神经元等难转染的原始细胞中，也能保持78%的标记效率。 示意图（Credit: Nature Biotechnology） 技术优势：天然RNA的无创观测 与传统方法相比，smLiveFISH展现出三大革命性优势： 非侵入性：无需插入MS2茎环等人工序列，避免改变RNA稳定性（Garcia & Parker, 2016） 普适性强：成功在HEK293T、HeLa、IMR-90等多种细胞系验证 动态追踪：时间分辨率达100毫秒，可捕捉mRNA的瞬时停滞 更重要的是，Western blot和qPCR验证表明，该技术不会影响目标mRNA的丰度、降解速率或翻译效率，真正实现了"观测而不干扰"的科学理想。 解码NOTCH2 mRNA的运输密码 双模式运输：锚定与游离的辩证法 作为细胞膜受体的编码者，NOTCH2 mRNA展现出独特的双相运动特征： 静态群体（占71%）：扩散系数D₁=0.007 μm²/s，几乎固定在内质网表面 动态群体（占29%）：扩散系数D₂=0.094 μm²/s，在细胞质中自由扩散 这种分化源于其生物学使命——NOTCH2蛋白需要在内质网进行共翻译转运。当使用嘌呤霉素抑制翻译后，静态群体比例骤降至34%，动态群体扩散系数提升至0.189 μm²/s。这证实了经典理论：mRNA通过新生肽链"锚定"在内质网，实现蛋白质的精准投递（Reid & Nicchitta, 2015）。 空间经济学：定位优化的生存智慧 研究团队通过计算每个mRNA与细胞核的距离，发现NOTCH2 mRNA集中分布在距核10-20μm的"黄金地带"。这种空间布局可能实现三重优化： 翻译效率：靠近核糖体富集区，缩短氨基酸运输距离 质量控制：毗邻内质网相关降解（ERAD）系统，及时清除错误折叠蛋白 信号响应：在Wnt/Notch信号通路激活时快速启动翻译 这种精妙的定位策略，或许解释了为何NOTCH2缺陷会导致发育异常和癌症——mRNA的"居住区位"错误，可能比序列变异更具破坏性。 MAP1B mRNA的定向运输之谜 微管高速公路上的RNA货运 与NOTCH2形成鲜明对比，MAP1B mRNA展现出完全不同的运输图景： 定向运输：平均速度1.3 μm/s，最快可达2.5 μm/s（相当于每分钟移动150μm） 间歇性停顿：运输过程中出现2-5秒的停滞，可能与微管结合蛋白的"换轨"有关 纠错机制：约12%的mRNA会在错误方向行驶后折返，最终抵达细胞边缘 这种精准的运输机制依赖kinesin-1马达蛋白（Dictenberg et al., 2008）。当研究人员抑制翻译时，运输速度反而提升至1.5 μm/s，提示翻译复合体可能充当"分子刹车"。 空间布局的生物学意义 作为微管相关蛋白的编码者，MAP1B mRNA的定位展现出精妙的空间逻辑： 边缘富集：72%的mRNA分布在距细胞边缘<5μm区域 即时可用：在细胞迁移或轴突生长时，可就地翻译结构蛋白 疾病关联：在脆性X综合征中，FMRP蛋白缺陷会导致MAP1B mRNA运输异常（Guo et al., 2023） 这种"哪里需要哪里造"的策略，可能代表了一类重要mRNA的通用运输范式。研究团队推测，阿尔茨海默病中的tau蛋白异常聚集，或许正始于其mRNA的定位紊乱。 药物干预下的RNA行为剧变 应激反应：RNA的紧急集合令 当使用嘌呤霉素抑制翻译时，MAP1B mRNA展现出惊人的重组能力： 颗粒形成：15%的mRNA在30分钟内聚集形成直径0.5-2μm的颗粒 P小体归巢：这些颗粒与DCP1A标记的P小体（mRNA降解工厂）高度共定位 动态融合：捕捉到两个RNA颗粒接触后融合的完整过程 这揭示了细胞应对翻译危机的应急机制：通过隔离非必需mRNA来维持核心生命活动。值得注意的是，NOTCH2 mRNA却很少进入P小体，暗示管家基因mRNA具有特殊的保护机制。 药物研发新思路 这些发现为疾病治疗提供新视角： 神经退行性疾病：调节RNA运输速度可能延缓病理蛋白聚集 癌症转移：干扰ACTB等mRNA的定位可能抑制细胞迁移 病毒防御：某些病毒劫持宿主mRNA运输系统，新技术助力抗病毒靶点发现 研究团队正在构建"RNA运输图谱数据库"，未来或可根据mRNA的动态特征开发新型生物标志物。 生物医学研究的革命性工具 技术拓展：从观察到操控 smLiveFISH的应用远不止于基础研究： 多色成像：利用不同Csm系统实现多RNA共定位分析 药物筛选：建立基于RNA运输速度的高通量平台 基因治疗：指导mRNA疫苗的细胞定位优化 团队已在小鼠模型中成功追踪亨廷顿病相关mRNA的异常运输，预计3年内进入临床前研究。 伦理与挑战 随着技术发展，新的科学伦理问题浮现： 隐私边界：是否允许观测受精卵等敏感细胞的RNA动态？ 技术滥用：精准操控mRNA定位可能被用于生物武器开发 数据过载：单细胞RNA动态数据集可能达PB级，需要AI辅助解析 科学界正在建立RNA动态研究的伦理框架，确保技术造福人类。 打开生命运作的黑箱 smLiveFISH的诞生，标志着我们进入了RNA动态研究的新纪元。就像17世纪的显微镜揭示细胞存在，21世纪这项技术将让我们真正理解生命的时空密码。当研究人员能实时观测单个RNA分子的生灭旅程，那些困扰我们百年的疾病机理、进化谜题，或许正隐藏在这些纳米级的生命舞步中。 未来已来——在活细胞的微观宇宙里，每一段RNA都在演绎着自己的星际穿越。而我们，正站在解码生命史诗的起点。 参考文献 Xia, C., Colognori, D., Jiang, X.S. et al. Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm. Nat Biotechnol (2025). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02540-5 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 声明：本文仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ End 往期精选 围观 Science | T细胞为何会“疲惫不堪”？代谢与表观遗传的答案 热文 Nature Biotechnology | 免疫治疗新突破：如何精准锁定病变细胞？ 热文 Cell | 突破传统认知：电突触如何动态调控神经网络行为 热文 Nature Biotechnology | 如何解码非编码区的“基因组暗物质”？ 热文 Nature Methods | 如何利用温度精准操控细胞？细胞命运调控的新思路

扫码报名2024肝病新药联盟年会暨减重新药论坛！ 胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是成人中最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤,其治疗方法主要包括手术、放疗，靶向治疗，免疫治疗和干细胞治疗等。由于GBM存在高度的异质性，通常有低的突变负担，并且其肿瘤微环境固有的免疫抑制性，使得传统的化疗和免疫疗法难以发挥预期效果。mTOR是雷帕霉素靶蛋白，其通过PI3K-AKT-mTOR信号通路或通过影响胶质母细胞瘤微环境在胶质母细胞瘤的发展中起着至关重要的作用。GSPT1作为调控蛋白翻译终止的关键蛋白，在胶质母细胞瘤中高度表达，并通过特定机制促进胶质母细胞瘤的进展。有研究表明，mTOR抑制剂耐药原因之一可能是由于GSK3β表达量降低引起，而GSPT1的降解会促使GSK3β的表达上调，有望克服其耐药。与此同时，mTOR的抑制能有效增强GSPT1降解剂活性，并且mTOR抑制和GSPT1降解在细胞翻译的始末具有协同作用。基于此，研究人员提出了一种利用分子胶技术将小分子抑制剂和分子胶降解剂特性整合到单一分子中的新策略。 首先，通过结合多种mTOR抑制剂和E3泛素连接酶配体，结合分子胶的特点，研究人员选择刚性短的连接体构建双功能化合物库，通过多轮筛选，筛选出YB-2-43，它对胶质母细胞瘤细胞的增殖具有抑制作用。通过进一步的结构优化，最终获得mTOR抑制和GSPT1降解活性更好的双功能化合物YB-3-17。同时使用MLN0128（mTOR抑制剂）和SJ6986（GSPT1降解剂）治疗U87细胞，发现其抗肿瘤活性虽有提高，但仍逊于YB-3-17，这表明YB-3-17在同时干扰两个靶点时存在显著协同作用。 基于torkinib与mTOR的共晶结构(PDB:4JT5)，研究人员使用mTOR对YB-3−17和MLN0128进行了分子动力学模拟，对接结果表明YB-3-17能够有效适应mTOR的激酶口袋，其琥珀酰亚胺环中的羰基基团与mTOR的LYS2306形成了强烈的氢键相互作用，这可能增强了其抑制活性。MMGBSA分析显示，YB-3-17与mTOR的亲和力较低，表明与MLN0128相比，YB-3−17是一个更稳定的配合物。此外，使用CRBN-CC885GSPT1的共晶结构(PDB:SHXB)，预测了YB-3-17的分子胶结合模式。 将YB-3-17中的谷氨酰胺进行乙基化以得到YB-3-17-NEG，作为阴性对照组；其丧失了与CRBN的结合，并且降低对GSPT1的降解活性，但保留了较强的对下游mTOR磷酸化的抑制。经免疫共沉淀实验显示，在YB-3-17处理下，Flag-CRBN HeLa细胞中的GSPT1蛋白与mTOR相比显著富集，而MLN0128和阴性对照分子YB-3-17-NEG则没有达到这种效果，这些结果突出表明YB-3−17独特的作用机制，其选择性地增强GSPT1在目标细胞环境中的积累，并诱导CRBN和GSPT1之间形成紧密的次级复合体。 研究人员对YB-3-17进行了进一步的生物学活性评估以及机制验证。YB-3-17以浓度和时间依赖性的方式显著抑制了U87细胞中S6K，4EBP1以及AKT蛋白的磷酸化水平，表明其抑制mTORC1/2复合物活性的能力。YB-3−17处理细胞6h可以观察到GSPT1明显降解。随后，研究发现，YB-3-17诱导的GSPT1降解可以被蛋白酶体抑制剂(卡非佐米、硼替佐米)、类泛素化抑制剂(MLN4924、MLN7243)和泊马度胺阻断，但不会被MLN0128阻断，这表明GSPT1的降解依赖于蛋白酶体系统而不是与mTOR的结合。 这表明了YB-3-17通过蛋白酶体途径作用于GSPT1的特异性。激酶活性测定表明，YB-3-17的ICs0为0.22nM，优于mTOR抑制剂MLN0128。在生物学活性评估中，YB-3-17还展现出了对多种神经肿瘤细胞的增殖抑制作用，显著优于单靶点mTOR抑制剂、GSPT1降解剂以及它们的联合治疗。这一结果充分展示了YB-3-17通过双靶点协同作用所带来的治疗优势。相比单一靶点药物，YB-3-17能够同时作用于mTOR和GSPT1，可以更有效的抑制肿瘤细胞增殖。 进一步，通过蛋白质组学和激酶谱实验评估YB-3-17的降解选择性和激酶抑制选择性，以此来评估其安全性。蛋白质组学分析显示，YB-3−17处理后GSPT1，GSPT2和SNUPN均有下调，但通过western blotting验证表明，YB-3−17并没有诱导GSPT2和SNUPN这两种蛋白的降解，这表明YB-3−17只显著降解GSPT1，而不影响其他细胞内蛋白，展现极好的降解选择性。同时，激酶谱实验显示，不同于MLN0128，YB-3−17不抑制对细胞生长至关重要的FGR、CSF1R （FMS）、LCK和LYNa等脱靶蛋白，进一步证实，YB-3-17在抑制mTOR活性时具有显著的选择性，未对多种常见的细胞生长相关激酶产生抑制作用。同时，在对小鼠进行的为期三天的连续给药研究中，MLN0128单次30 mg/kg剂量会导致小鼠死亡，而接受等量YB-3−17治疗的小鼠在整个研究期间保持良好的健康状况。这些数据表明，YB-3−17降低了脱靶效应的毒性，同时通过降解GSPT1和抑制mTOR增强了疗效。 通过RNA测序分析，作者进一步探索YB-3-17的作用机制。KEGG分析显示，YB-3−17显著富集了与多种途径相关的基因，包括氨基酸合成、内质网蛋白质加工和胰岛素抵抗信号。这种广泛的活性表明YB-3-17对细胞过程的多方面影响。且通过火山图分析，YB-3-17处理后SENS2、DDIT4和CHAC1在mRNA水平上的显著上调，这些基因能够显著增强对mTOR的抑制活性。同时，YB-3−17还显示出大量富集与细胞凋亡（DDIT3）和p53信号通路（GADD45A）相关的基因。以上数据表明，YB-3-17通过影响更广泛的信号通路发挥抗肿瘤效应。 在体内实验中，通过将U87细胞接种到雄裸鼠中建立了异种移植模型，随后，通过腹腔注射对小鼠进行治疗。与对照组相比，MLN0128和YB-3−17均能显著抑制肿瘤生长。然而，在相同剂量下，YB-3−17表现出更好的疗效。在10/20 mg/kg剂量下，YB-3−17几乎完全停止肿瘤生长，导致肿瘤消退，表明其体内抗肿瘤能力更强。并且，相比于MLN0128，不同剂量的YB-3-17处理小鼠后，小鼠状态良好。进一步在体内验证了YB-3−17抑制mTOR和降解GSPT1的能力。通过免疫印迹法分析腹腔注射指定剂量的YB-3−17,MLN0128后，裸鼠肿瘤细胞中GSPT1、cyclin D1、pS6K、pAKT和β-actin的变化，进一步证实了YB-3-17显著抑制mTOR下游蛋白的磷酸化，并以剂量依赖性方式降解GSPT1。 综上，本研究提出了在一个小分子中同时实现mTOR抑制和GSPT1降解的双靶双机制小分子设计策略，通过多轮筛选以及结构优化，设计开发出小分子YB-3-17，其表现出优于mTOR抑制剂MLN0128的肿瘤抑制活性、选择性和安全性。该化合物验证了双靶点、双机制策略的可行性，为抗肿瘤药物开发提供了新的治疗思路。 参考文献 Yongbo Liu, Xiuyun Sun, Qianlong Liu, Chi Han, Yu Rao. A Dual-Target and Dual-Mechanism Design Strategy by Combining Inhibition and Degradation Together. J Am Chem Soc. 2024 Dec 2. doi: 10.1021/jacs.4c11930 封面图来源：pixabay 《生物安全法案》再遇挫，药明系周一开盘大涨！ 2024-12-09 Acta Pharmacol Sin| 上海药物所评测AlphaFold3的GPCR-配体复合物预测表现能力显示实验结构的必要性 2024-12-08 里程碑！乙肝治愈率首次突破30%大关 2024-12-07 版权声明/免责声明 本文为授权转载文章。 本文仅作信息交流之目的，不提供任何商用、医用、投资用建议。 文中图片、视频、字体、音乐等素材或为药时代购买的授权正版作品，或来自微信公共图片库，或取自公司官网/网络，部分素材根据CC0协议使用，版权归拥有者，药时代尽力注明来源。 如有任何问题，请与我们联系。 衷心感谢! 药时代官方网站:www.drugtimes.cn 联系方式: 电话:13651980212 微信:27674131 邮箱:contact@drugtimes.cn 点击，报名参加肝病会议!