CD101

《Cell Metabolism》期刊上发表了一篇研究，探讨了通过二氯乙酸（DCA）调节体外扩增过程中T细胞的葡萄糖代谢，从而改善线粒体代谢，并显著提高T细胞疗法对癌症的疗效。研究表明，DCA调节不仅改变了T细胞的代谢和表观遗传特性，还促进了干细胞特性和存活率。 体外扩增的T细胞与体内扩增的T细胞代谢差异 线粒体质量和功能 ： 在体外扩增的T细胞比体内扩增的T细胞表现出更高的有氧糖酵解水平，而体内扩增的T细胞在线粒体质量和功能方面显著提高。 具体来说，体内扩增的T细胞在第3天显示出显著升高的线粒体质量，线粒体活性氧（指示线粒体功能），并且倾向于具有更高的中性脂质积累。 氧气消耗率与细胞外酸化率 ： 体内扩增的T细胞在氧气消耗率（OCR）与细胞外酸化率（ECAR）的比率上显示出对氧化代谢的依赖。 第7天的细胞外通量分析显示，体内激活的OT-I T细胞具有升高的线粒体特征，但显著地，体内扩增的T细胞很少进行有氧糖酵解，即在常氧条件下将葡萄糖发酵成乳酸。 通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶提升线粒体能力 乳酸和乙酰辅酶A水平 ： 使用二氯乙酸（DCA）处理的T细胞在体外扩增过程中减少了乳酸的产生，增加了线粒体能力和呼吸能力。 DCA处理的T细胞在第7天的扩增过程中，细胞内和细胞外的13C标记乳酸减少，而未标记（M+ 0）总乙酰辅酶A和13C标记乙酰辅酶A增加。 体内实验表现 ： DCA处理的T细胞在体内实验中表现出更好的肿瘤清除能力和生存率。 DCA处理的pmel-1 T细胞在B16-F10黑色素瘤模型中显示出显著改善的肿瘤清除和生存率。 DCA调节的T细胞在肿瘤内的功能优势 移植和存活 ： 尽管DCA处理的T细胞在肿瘤内的效应功能没有显著提升，但它们在移植和存活方面表现出明显的优势。 DCA处理的T细胞在多种组织中的移植水平显著提高，且长期存活率也更高。 多种组织中的移植水平 ： 输注后24小时，DCA处理的T细胞在血液、脾脏、淋巴结和肿瘤中的移植水平显著提高。 长期植入实验显示，DCA处理的Pmel-1 T细胞在初始肿瘤植入后长达300天仍占循环T细胞区室的约5%。 DCA调节的T细胞更易代谢生理碳源 生理碳源利用 ： 研究发现，DCA处理的T细胞更倾向于利用生理碳源（PCSs），如乳酸、丙酮酸、谷氨酰胺和酮体。 这种适应性使用PCSs的能力可能是DCA处理T细胞在体内立即存活优势的部分原因。 代谢基础 ： DCA处理的T细胞在最小Seahorse培养基中氧化单个PCSs的能力更强，并使用14C标记的丙酮酸、谷氨酰胺、乳酸和β-羟基丁酸盐得到确认。 DCA调节导致更多干细胞样的表观遗传表型 转录组分析 ： 转录组分析显示，DCA处理的T细胞在预记忆形成和减少耗竭基因特征方面表现出关键改进。 DCA处理的T细胞在关键干细胞基因上的H3K27Ac修饰显著增加。 流式细胞图 ： 流式细胞图和定量分析显示，DCA处理的T细胞减少了TIM-3、CD39和CD101等终末耗竭标志物的表达，并提高了SLAMF6和TCF-1等干细胞样特征的表达。 最后，通过DCA调节T细胞代谢的新策略，显著提高了T细胞在癌症免疫治疗中的效能。这种方法具有操作简单、成本低、效果显著的优点，但也存在机制复杂性和潜在副作用。如，高浓度DCA（5 mM）在体外实验中有效，但在临床应用中可能存在毒副作用，并且阻止柠檬酸盐离开线粒体以支持脂肪酸合成可能会导致依赖外源性脂肪酸，这可能是免疫抑制性的。 参考文献：Redirecting glucose flux during in vitro expansion generates epigenetically and metabolically superior T cells for cancer immunotherapy. Cell Metab. 2025 Jan 24:S1550-4131(24)00489-3. doi: 10.1016/j.cmet.2024.12.007 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

NDA 代号 216951 （JESDUVROQ (daprodustat) 申请人 GlaxoSmithKline Intellectual Property (No. 2) Limited England 剂型 片剂 规格 1 mg, 2 mg, 4mg, 6 mg, 和 8 mg 途径 口服 每日最大剂量24mg 原研/OTC 原研 拟定适应症 治疗成人透析患者慢性肾病引起的贫血，而不是透析患者。 产品描述 Daprodustat片，1毫克，灰色包衣层，圆形（直径约7毫米），双凸片，一面压印有“GS KF”。 Daprodustat片，2毫克，黄色包衣层，圆形（直径约7毫米），双凸片，一面压印“GS V7”。  Daprodustat片，4毫克，白色包衣层，圆形（直径约7毫米），双凸片，一面压印有“GS 13”。 Daprodustat片，6毫克，粉红色薄膜涂层，圆形（直径约9毫米），双凸片，一面压印有“GS IM”。  Daprodustat片，8毫克，是橙色薄膜涂层，圆形（直径约9毫米），双凸片，一面压印有“GS 5E”。 联合包装产品信息 无 包装信息 无 储存条件 在20°C至30°C（68°F至86°F）下储存。 溶出方法和接受标准 Daprodustat片是一种速释片剂（1mg、2mg、4mg、6mg、8mg），每天给药一次。表4概述了溶解方法的开发。企业提到，在早期临床研究中，溶出方法A和B之前已经为0.5mg至100mg片剂规格范围的开发。在缩小片剂规格后，开发了一种溶出方法C，作为在III期临床试验中测试Daprodustat片剂的优化溶出方法。后来方法D被开发为一种更好的区分力方法。然而方法D仅用于研发目的，拟定的商业方法，方法E，是对方法D的进一步优化。 企业提供了DOE研究，以证明上述每个参数的含义。评估了溶出方法C和方法E的等效性。企业递交了溶出方法开发报告，包括检测关键生物利用度属性变化的区分能力，以及该方法的验证，包括溶出方法参数小幅变化时方法的稳健性。 企业提出了基于ICHQ6A的速释制剂单点溶出接受标准。Daprodustat片的拟定溶出度验收标准为45分钟时Q= XX。企业表示溶出度验收标准是根据临床批次观察的溶出曲线、以及溶出度对生物药剂学的影响、体内/体外生物等效性数据、相对生物利用度研究和f2统计分析设定。 根据对健康志愿者临床1期首次人体研究（PHX11427），企业得出结论，在300mg剂量下，没有观察到饱和药代动力学（Cmax，AUCO-t），表明溶出不是吸收速率的限速步骤。基于BE研究207727（2mg vs 4mg）和体外溶出数据，所有规格都证明了互相间的等效性。4mg规格的溶出数据被认为可以代表所有规格进行溶受限度制定。 相对生物利用度研究213022 A部分包括两批4mg规格Daprodustat片，由批量工艺制得，这些片的生产是为了提供与连续工艺生产的4mg规格Daprodustat片的对照批次进行对比，得到溶出相关的差异化曲线。 BE研究结果表明，所有三个批次都是等效的。因此，45min的时间点不会拒绝掉生物相关批次。值得注意的是，30min的时间点会拒绝生物相关批次。 FDA：根据ICHQ6A，“单点测试通常被认为适合于速释制剂。”因此，拟定的单点溶出是可以接受的。2022年3月29日，我们要求从关键临床和注册批次中获取的批次溶出数据。申请人于2022年4月14日（SN 012）提供了答复。 申请人表示，3.2.R.3章节中中提供了94个批次（BE批次、注册和稳定批次）的单个溶出数据。SN 012提供了关键临床研究中使用的另外30个批次和32个注册/稳定批次（15个批次是批量生产和16个批次是连续过程生产）的溶出数据（见表8和表9）。 根据信息，评估了30个关键临床批次和BE批次的溶出数据，了解与临床相关的溶出情况。45分钟内Q=XX标准在BE批次中也是支持的。因此企业拟定的45min的Q点标准是可以接受的。企业表示，拥有适当的控制策略可以确保在连续生产期间的产品质量。拟定的商业化溶出方法足够敏感，可以检测生产运行期间产品质量的任何变化。通过使用差异化溶出的样品开发的安全空间，为产品质量提供了保证。工艺验证批次的溶出数据都表现出相似性（f2）。因此，考虑到全部信息（例如，安全空间、设计空间和所有规格工艺验证批次的实时数据），拟定的溶出方法接受标准得到了有力的支持。 为了确认通过连续工艺和批量工艺生产Daprodustat片剂的生物等效性，进行了一项关键的BE研究#213002 B。该研究中，对于对照样品（通过连续工艺生产的片剂）和测试产品（通过批量生产）的每个片剂规格，采用了连续生产三个生产规模批次。针对三个批次，对每个工艺生产的每个规格制剂，使用拟定商业化溶出方法（方法E）得到的快速溶出曲线批次进行BE研究。此外，提供了每种片剂规格使用方法E的对比溶出曲线。 根据对比的溶出数据，1mg、2mg和6mg的溶了在XX分钟大于XX，无需计算f2，即可确定相似性。4mg和8mg规格的相似度值（f2）分别为71和66（f2>50）。因此，所有规格都证明了溶解曲线的相似性。 此外，企业对Daprodustat片剂（1mg、2mg、4mg、6mg、8mg）拟定的商业化片剂规格进行了规格间的等效性评估。测试的片剂是使用连续工艺生产的，但结果也适用于批量生产的片剂。体内BE研究#207727，显示2mg和4mg规格之间的等效性。 处方根据处方成分，临床I期和I期样品相似。处方没有显著变化。因此，在临床1期阶段和2期阶段样品之间不需要桥接。临床2期样品和3期样品之间的区别在于原料药的差异。申请人对用使用早期工艺生产的片剂（临床1期和临床2期）生产的片剂和使用后期原料药（临床3期）生产的片剂进行了BE研究。这两种产品都符合BE标准，具有生物等效性。因此，临床Il期和Ill期产品是可比的，它们的溶出对比数据，也没有显著变化。 为了桥接批量批次生产与连续工艺生产批次，企业对所有批次进行了BE研究213002 B部分。该研究符合BE标准，此外，QC介质中的比较溶出曲线，显示所有规格溶解曲线的相似性（f2>50或>XX分钟>XX溶出）。吸收的Cmax（Cmax）并不符合BE标准。企业阐述了基于临床经验，Daprodustat片的临床有效性是被总暴露量（AUC）决定的，而非吸收（Cmax）决定。而且，8mg规格的变异性较高。FDA表示，“daprodustat片的疗效是由AUC驱动的。尽管企业使用剂量反应模型而不是暴露反应模型来指导剂量选择，因为带有PK暴露（AUC）的模型没有提供比单独剂量更好的反应预测因素。” 申请人使用体内BE研究（#207727）以及多介质的溶出研究提供了片剂规格间的相似性。根据体内和体外数据，不同片剂规格是等效的。 【解读】 企业在早期有开发两个溶出方法，在III期有开发另外一个方法，最终商业化的方法在III期的方法基础上进一步优化。企业使用了DOE的方式，充分证明拟商业化方法与III期方法之间的可桥接性。 企业根据药动学人体研究和制剂的溶出曲线数据，表明药物的溶出不是药物吸收的限速步骤，因此使用了4mg规格的溶出曲线数据用于制剂Q点。 所有规格的溶出数据对比，可以支持两种拟商业化生产方式的可行性，批量生产和连续化生产的制剂体外数据等效的，同时企业也使用了BE体内数据，说明两种商业化生产方式得到的制剂是一致等效的。 企业在整个临床研究期间和最后商业化时，开发了多种溶出方法，证明了它们之间的等效性。企业在研发期间没有变更原料药和制剂的厂地，也就不需要这类桥接。 企来提交了5个规格的上市，使用了多次溶出方法数据对比，多次BE数据的对比，来说明不同规格，不同生产方式得到的制剂都是等效的，很重要的一个原因是daprodustat片的疗效是由AUC驱动，溶出仅用于放行质量控制，与体内吸收相关性不大。 作者精彩原创集锦 1、创新药研发中原料药工艺与沟通交流常见难点 2、创新药研发中「制剂工」常见难点 3、创新药研发中「变更」相关难点 4、创新药研发中「质量分析控制」相关难点（1） 5、创新药研发中「质量分析控制」相关难点（2） 6、创新药研发难点分析与CMC研究策略探讨 7、《已上市化学药品药学变更研究技术指导原则（试行）原料药变更的问答》浅析 8、FDA：原料药中亚硝胺风险评估的最新观点 9、亚硝胺「传奇」：5年来监管和制药界的反思 10、【学习笔记】2023年度CDE审评报告 11、FDA审评：吡托布鲁替尼的药学变更桥接(完) 12、CDE：ICH指南在国内的实施概况 13、「解读」FDA审评：repotrectinib胶囊5次CMC会议内容 14、FDA：IND阶段CMC关注点 15、药品注册检验难点与建议 16、最新 FDA 人用药物亚硝胺杂质指南更新的「底层」参考 17、不同国家地区注册检验差异对比 曾文亮 博士   近20年药物研发经验，擅长新药研发与注册申报，近5年积累了近十个小分子新药中美IND申报成功和两个1类抗肿瘤新药上市申报成功经验。先后任职于某大型CRO医药研发公司、USP大中华区研发中心和港资原料药厂等，主导过MNC质量研究项目、USP各论更新和药厂QC实验室通过国家GMP检查和WHO审计。   受中国医药保健品进出口商会邀请在二十二届世界制药原料药中国展（CPHI）主导策划了“小分子创新药质量研究和注册策略”沙龙并发表主题演讲；同时受专业药学论坛邀请发表了《创新药质量研究要点和案例分析》、《中美新药申报沟通交流常见问题和案例分析》、《亚硝胺杂质的FDA和EMA控制策略》、《分析方法开发，验证和转移的统计学评价》和《FDA483中清洁验证的典型案例分析》等十余次主题演讲。   更多精彩内容可关注： ▲ 关注文亮频道，探索未知世界

RAS家族属于小GTP酶蛋白质超家族，是人类癌症中最常发生突变的蛋白质之一，临床上急需治疗手段来抑制其突变后的蛋白的非正常信号转导活性。在多种癌症和Noonan综合征患者中观察到LZTR1基因的失活会导致RAS GTP酶丰度增加，改变MAPK通路激活状态。今年9月，奥地利科学院分子医学研究中心(CeMM) Giulio Superti-Furga课题组发表了“Identification and Characterization of Novel Small-Molecule Enhancers of the CUL3LZTR1 E3 Ligase KRAS Complex”一文，报道了一种新型化学片段，以分子胶的形式增强KRAS - LZTR1复合物的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）来干扰过度活跃的RAS信号。 图1：文章脉络和研究发现 LZTR1蛋白（亮氨酸拉链样转录调节因子1）是CUL3LZTR1（cullin 3 RING E3泛素连接酶）的底物受体，该E3泛素连接酶可以使主要的RAS GTP酶KRAS、NARS、HRAS以及近相关的GTP酶MRAS和RIT1等泛素化，并改变他们的丰度。在结构上，LZTR1属于含BTB/BACK结构域的蛋白质家族，包含一个N端的Kelch结构域和两个BTB/BACK结构域，其中Kelch结构域是底物结合位点，BTB/BACK结构域与CUL3支架相互作用。LZTR1介导的RAS泛素化导致其丰度降低，抑制了MAPK通路的激活和下游信号传导。因此，LZTR1通过控制RAS水平，对RAS - MAPK信号通路起到负调节作用。此外，在不同人类疾病中发现的LZTR1突变会干扰CUL3LZTR1复合物的组装和/或RAS自身的招募。因此，LZTR1的缺失与RAS GTP酶蛋白质水平增加、RAS过度激活以及MAPK信号通路的过度激活有关。 2018年，为了解决慢性髓性白血病（CML）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗存在耐药性问题，Giulio Superti-Furga课题组就通过单倍体基因筛选发现了LZTR1基因可以影响抑制剂抗性。LZTR1可作为CUL3 E3连接酶复合物的底物衔接子影响RAS蛋白的泛素化，其缺失会导致MAPK通路的异常激活，进而引起CML细胞对TKI的耐药性（图2）。 图2：LZTR1可作为CUL3 E3连接酶复合物的底物衔接子影响RAS蛋白的泛素化(Science, 2018; 362(6419): 1171–1177) 因此，本文提出了一个构想——利用分子胶类似方式化学调节LZTR1-KRAS复合物PPI的片段，从而增强E3泛素连接酶-底物复合物的形成，诱导RAS蛋白进行降解，从而抑制下游MAPK通路激活。 为进行高通量筛选，作者首先设计了一种基于分裂荧光素酶的PPI检测方法（图3），来监测活细胞中LZTR1-KRAS的招募。 图3：基于分裂荧光素酶的PPI检测方法 作者测试了NanoBiT系统是否适用于检测KRAS-LZTR1相互作用。该检测方法将小荧光素酶NanoLuc分为两个部分：一个小标签（SmBiT，11个氨基酸）和一个大标签（LgBiT，18kDa）。这两个亚基彼此之间的亲和力较弱（Kd约为190μM），只有当它们融合到两个对彼此有足够亲和力以支持复合物形成（即使是短暂形成）的蛋白质上时，它们才会靠近。这种由蛋白质-蛋白质相互作用引起的接近会导致荧光素酶的互补，从而在加入底物时产生发光信号。 瞬时转染HEK293T细胞后，作者检测了带有LgBiT标签的KRAS4A（LgBiTKRAS4A）与带有SmBiT标签的LZTR1（SmBiTLZTR1）或RAF1（RAF1SmBiT）之间的相互作用。起初，实验尝试了标签在N端和C端的多种组合，但对于RAS蛋白，LgBiT标签只能放在N端，因为其C端的翻译后加工过程能够使其定位到细胞膜上，那是与LZTR1发生相互作用的位置。用表达带有LgBiT标签的mCherry荧光蛋白（LgBiTmCherry）的载体转染的细胞作为阴性对照。LgBiTKRAS4A与SmBiTLZTR1或RAF1SmBiT共转染导致强烈表达，并且与LgBiTmCherry相比发光显著增强，表明成功发生PPI相互作用（图4，左/中）。此外，作者观察到与SmBiTLZTR1共表达时，与LgBiT-mCherry相比，两种KRAS剪接异构体（LgBiTKRAS4A和LgBiTKRAS4B）都能强烈诱导SLA发光（图4，右）。 图4：LgBiTKRAS4A与SmBiTLZTR1或RAF1SmBiT共转染导致强烈荧光 此外，作者经过实验发现该LZTR1-KRAS SLA体系对于LZTR1的突变体如LZTR1 G248R等仍旧适用。 随后，作者以50μM的浓度筛选了一个约450种市售片段的库（图5），并确定了片段C53（PC-C53-N；Z-score=3.20），与DMSO对照组相比，它显示出发光信号的显著增强。 图5：基于LZTR1-KRAS SLA体系对片段库进行筛选得到C53和Z86 由于筛选的初始文库具有很强的多样性，片段之间的结构相似性尽可能小，故作者尝试探索了C53的50种类似物。文中利用Enamine的REALSpace结构-活性关系（SAR）小分子表征和骨架跃迁搜索工具设计了一个按需虚拟文库。所选的类似物在相同的细胞模型配置中进行筛选，作者检测到片段Z86在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）调节倾向方面有适度的改善。对C53和Z86进一步的单孔验证实验证实了从筛选中得到的初步观察结果，即共表达SmBiTLZTR1和LgBiTKRAS4A的细胞信号呈剂量依赖性增加（图6）。该结果同样适用于KRAS G12D突变体。 图6：共表达SmBiTLZTR1和LgBiTKRAS4A的细胞荧光信号对C53和Z86存在剂量依赖 为了测试C53是否能够增强内源性LZTR1的募集，作者使用了细胞邻近生物素化分析（BioID）。作者在CML细胞系K-562中稳定表达了与miniTurboID融合的KRAS4A。转染空载体的细胞以及表达miniTurboID-GFP的细胞作为阴性对照，细胞用C53处理过夜，然后加入生物素标记2小时。正如预期的那样，未用C53处理即观察到内源性LZTR1与融合的miniTurboID-KRAS4A存在关联。如图7所示，用C53处理导致LZTR1的募集和标记增强，有力地支持了C53通过促进LZTR1-KRAS复合物的形成起作用的观点。 图7：C53促进了LZTR1-KRAS复合物的形成 为确定片段是否与目标蛋白结合，作者使用了15N标记的与GDP结合的KRAS G12D，利用二维1H-15N HSQC谱中监测1H和15N化学位移的变化。向结合有GDP的KRAS G12D中加入化合物C53和Z86导致了一组相似的峰的化学位移扰动（CSPs），表明这两种化合物有相同的结合位点（图8）。GDP-KRAS G12D可以看到酰胺主链的化学位移，并且加入片段后的化学位移变化被用于确定结合位点。在二维图谱中没有重叠且可以明确指定的峰中，加入C53后，L56、R73、T74和G75显示出大于平均值两倍标准偏差的化学位移扰动。这些残基与一个被称为Switch I/II口袋的保守RAS表面口袋重合。由Z86引起的化学位移扰动幅度较小；但对于残基S39、T74和G75仍观察到了显著的化学位移扰动。 图8：GDP-KRAS G12D中加入C53和Z86后观察到的化学位移扰动 最后，作者基于化学位移扰动数据，使用AutoDock Vina进行结合位点对接模拟。如图9所示，在两种对接方式中，C53的苯环和氯原子插入由V7、L56和Y71以及K5和T74脂肪侧链部分形成的Switch I/II（SI/II）口袋中。这些配体取向与Maurer等人和Sun等人确定的X射线结构中的配体姿势相似，表明C53的哌啶和丙酮基团可能介导其与LZTR1的相互作用。 图9：分子对接模拟得到的C53与KRAS蛋白的结合方式 综上，作者设计了一种高通量化学筛选方法，在片段库中筛选小分子片段来调节CUL3-LZTR1复合物与RAS家族的GTP酶之间的蛋白质稳态相互作用，并使用BioID、热位移分析以及核磁共振波谱法探究了结合方式和结合位点，以期加强现有的以RAS和MAPK通路为重点的药物干预，从而为RAS驱动的癌症带来更持久的治疗。 原文链接：https://doi.org/10.1021/acschembio.4c00077 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓