导读：接种疫苗不能预防病毒的感染，而感染也不能阻止病毒的再次感染，新冠病毒的波谲云诡，由此可见一斑。尽管如此，仍有部分人群在多次暴露新冠病毒后却从不感染从不发病。现有的新冠疫苗为什么仅能防重症，不能防感染？为什么在一波一波的疫情中，有些人频频中招，有些人却能多次与病毒擦肩而过？下一代新冠疫苗该如何设计才能应对病毒突变的问题以及不能预防感染的问题？面对这样一种或者一类正在出现的新的病毒，我们首先是要了解机体在自然感染过程中的免疫应答规律，揭示突破感染、再次感染以及从不感染背后的原因，然后才能切中要害，设计出一款有效的预防或治疗性疫苗。去年11月，奥密克戎变异株横空出世。紧接着，国内外疫苗企业又对新的变异株纷纷布局。今年4月，中国生物、科兴生物、康希诺、石药集团、斯微生物等针对奥密克戎变异株的重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、灭活疫苗，相继获批临床¼¼速度之快，种类之全，不能不让人惊叹。但细心研究之后，发现这些疫苗的抗原还是基本沿用了原始株的设计路线，只是将原始株换成了新的VOC变异株，或者更多地采用了mRNA的技术路线，但还是以Spike蛋白或者Spike蛋白上的RBD或其他结构域作为疫苗靶点（除了灭活疫苗），目的仍然是诱导抗病毒的中和抗体应答。1.疫苗有没有效力，最终是要由它诱导的免疫应答来决定人类免疫系统包括固有免疫和获得性免疫，而获得性免疫系统主要包括三种细胞：B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。B细胞主要负责产生抗体以清除细胞外的病毒，CD8+ T细胞主要负责杀伤病毒感染细胞，而CD4+ T细胞具有广泛的辅助和效应功能（图1）。图1.抗病毒免疫中获得性免疫的主要组成部分关于疫苗的免疫原性，有三个概念需要把握：一是除了我们熟知的中和抗体，免疫应答还包括T细胞免疫应答；二是免疫应答要达到一定的强度和广度才能起保护作用，强度是指抗体的滴度、T细胞的频率等，而广度则是指抗体或者T细胞识别的表位数量等；三是疫苗的效力还与抗体和T细胞的种类及其功能有关，抗体有中和抗体、非中和抗体之分，一般来讲非中和抗体不具有抗病毒作用，而T细胞的分类则更为复杂，但只有那些多功能（分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子）的T细胞免疫应答才具有保护作用。2.疫苗有没有效力，还要看病毒自身就病毒感染来说，我们大部分人可能从来没有听说过一款预防性疫苗能诱导产生高水平的中和抗体却不能起到预防感染的作用，但新冠疫苗就是这样（其实还有带状疱疹疫苗也是这样，仅有中和抗体不足以达到预防的目的）。第一代新冠疫苗的抗原设计不可谓不精湛，尤其是重组蛋白疫苗、mRNA疫苗诱导的中和抗体滴度不可谓不高，但就是不能预防病毒的感染，尽管这些疫苗在预防重症方面效果显著。究其原因，病毒突变介导的抗体免疫逃逸是一个重要的因素，但决不是其根本的原因。在2021年疫苗大规模接种期间，在世界范围内流行的主要是Delta及Beta变异株。比对过新冠病毒的氨基酸序列之后我们就会发现，Delta及之前的变异株在Spike蛋白上的突变数量有限，不足以让所有克隆的中和抗体失效。事实上，据文献报道辉瑞的BNT162b2疫苗接种者血清对Delta变异株的中和活性不低于1:40，曾一度被认为是有望结束新冠在全球大流行的候选疫苗。况且在受到病毒攻击时，记忆性B细胞还会很快活化、分化为浆细胞并分泌新的抗体。然而，接种2剂甚至3剂疫苗后仍有大量的“突破感染者”感染新冠病毒。因此，尽管我们已经习惯了用位于病毒颗粒最外层的糖蛋白Spike作为疫苗的靶点，但我们是时候该停下来想一想了：是不是传统的抗原靶点设计使其诱导产生的免疫应答的种类和水平不足以给新冠疫苗提供足够的保护效力？3.要设计出一款有效的预防或治疗性疫苗，首先是要了解机体在自然感染过程中的抗病毒免疫应答规律对此，世界各国的免疫学家们已进行了深入的研究，成绩卓著，迄今已有数千篇论文发表。毋容置疑，协同的中和抗体、T细胞免疫应答更有利于病毒的清除和疾病的痊愈。而且，一般情况下中和抗体与T细胞应答水平成正相关。但两者之间并不完全一致，孰轻孰重，对于疫苗的设计来说就是一个至关重要的策略问题。相对于人们检测了几十年的中和抗体，T细胞应答的检测方法比较复杂。每个人都会做ELISA，但T细胞应答的检测，相比之下则要困难得多。现有疫苗的设计正是基于我们一直以来对中和抗体的熟悉和重视，但新冠病毒很可能是一个例外。尽管我们一直认为：中和抗体是机体抵御外来病原体的中流砥柱，但越来越多的研究表明，与中和抗体相比，细胞免疫在机体对新冠病毒的免疫防御中占有更为重要的地位。例如，新冠病毒感染者的病情从重症到轻型/无症状，表现多样，甚至一些医务工作者和家庭密接者在过度暴露病毒后并不发病甚至体内检测不到病毒和抗体的存在，这些PCR阴性抗体阴性的病毒暴露者往往具有强烈的多功能的T细胞应答，从而将病毒扼杀在亚临床感染阶段；大流行期间的健康对照者，Spike/RBD IgG抗体阴性，但近半人数存在较高水平的、与恢复期个体频率相当的、Spike蛋白特异的T细胞应答，提示这些“健康对照者”在感染病毒后通过T细胞应答很快地清除了病毒，而没来得及产生抗体应答；新冠发病后2周内，仅有轻型患者出现T细胞应答，重型患者往往检测不到T细胞应答，而中和抗体的应答则参差不一，提示延迟的T细胞应答与重症有关。图2模拟了新冠病毒感染后机体的免疫应答与病情的关系。图2.新冠病毒的免疫应答与病情的模型图凡此种种，不胜枚举。不仅如此，免疫学家们还对T细胞应答的种类、靶向的病毒蛋白等进行了大量的、系统的研究。这些研究为疫苗的设计奠定了坚实的基础。但是，T细胞免疫应答从来就不在疫苗设计者的传统思路中。现有疫苗的靶点无一例外都是Spike蛋白或Spike蛋白上的RBD结构域或者其他结构域（除了灭活疫苗是全病毒），目的是诱导抗病毒的中和抗体应答，因为超过90%以上的中和抗体的靶点在Spike蛋白上。尽管Spike蛋白上还具有部分T细胞表位，可诱导产生T细胞免疫应答，但T细胞应答的水平普遍不高。研究表明，在SARS-CoV-2感染过程中，Spike蛋白特异的CD4+、CD8+ T细胞应答仅占10%–27%；接种2剂疫苗（BNT162b2, mRNA-1273, 或Ad26.COV2.S）者，Spike蛋白特异性T细胞应答的强度仅有恢复期个体的三分之一（43 Vs. 152 SFU/106 PBMC），而恢复期个体还有强烈的针对N/M/E/ORF3a蛋白的T细胞免疫应答。4.疫苗能诱导什么样的应答，是由其中的抗原成分决定的，确切地说是由抗原上的中和抗体、T细胞表位决定的作为疫苗组分之一的抗原首先得有这些供中和抗体、T细胞识别的表位，靶点的选择就至关重要，当然抗原的结构也不容忽视。中和抗体有线性表位和构象表位两种，要诱导高水平的中和抗体，作为疫苗成分的抗原就得维持一定的空间构象，因此才有了二聚体/三聚体的构象设计。但T细胞则不同，它不能识别整个的病毒或病毒蛋白，只能识别蛋白质中的某一或某些小段的15肽（CD4+ T细胞）或者8–11肽（CD8+ T细胞），而病毒或病毒蛋白需经过APC（抗原提呈细胞，如树突状细胞DC）中蛋白酶体的降解、加工，然后才能把这种“表位肽”以“抗原肽-MHC复合物”的形式提呈给T细胞，供T细胞识别。在蛋白酶体降解、加工的过程中，越复杂的结构可能越不易于在精准的位点得到酶解并把一段段的表位肽正确地加工出来，就越不利于诱导T细胞应答（此结论从体外试验推测而来，还没有得到体内试验的验证）。灭活疫苗就是一个很好的例子。灭活疫苗的抗原成分中尽管包含了整个病毒的所有蛋白，即理论上所有的T细胞表位，但目前已上市的几乎所有病毒的灭活疫苗都不能诱导机体产生T细胞应答或者诱导的T细胞应答极弱。新冠病毒的灭活疫苗也不能例外。5.奥密克戎变异株疫苗可能还面临着新的挑战回到本文开头，这些新近进入临床试验的以诱导中和抗体为主要目标的候选疫苗，在半年后将陆续上市。但是，最近Science和Nature上发表的两项研究发现，接种3剂BNT162b2或CoronaVac疫苗者感染奥密克戎变异株时唤回的主要是针对原始株或其他VOC变异株的中和抗体及S1特异性T细胞应答，但对奥密克戎自身的免疫力却极弱，而因感染奥密克戎BA.1产生的BA.1特异性中和抗体又可被BA.4、BA.5逃逸。这些以奥密克戎灭活病毒或Spike蛋白为靶点的候选疫苗，能否在接种过原始株疫苗、感染过原始株或其他VOC变异株的人群中建立起针对奥密克戎众多子变体的有效免疫保护还有待观察。而且，如果到那个时候，新冠病毒还没有像SARS病毒那样突然销声匿迹，按照目前的变异速度，那时候在全球流行的很可能是另一个变异株。那时候的我们很可能将会发现自己仍然处在今天这样的两难之中：尽管完成了史上最大规模的疫苗接种，但疫情仍如星星之火，稍不留神就可形成燎原之态。鉴于当今世界西方各国“与病毒共存”的抗疫政策，“动态清零”虽然效果显著，但也面临着不小的压力和挑战。疫苗仍是我们最终战胜疫情最有力的武器。为今之计，唯有打破固有思维，遵循病毒感染过程中的免疫应答规律，设计出既能诱导保护性免疫应答又能应对病毒突变问题的疫苗，才能让我们摆脱被动挨打的局面。这就要求我们从新的视角，以新冠病毒自然感染过程中的免疫应答规律为出发点，寻找可诱导机体产生更加强烈的保护性免疫应答的抗原组成策略。6.新冠疫苗抗原的选择和设计仍是重中之重在第一代疫苗中，Spike蛋白诱导中和抗体的免疫原性已得到了充分的体现，但仍没有能够阻断病毒的传播。除了病毒突变，Spike蛋白诱导的免疫应答的种类和水平不足，恐怕才是最根本的原因。新冠病毒基因组可表达近30种蛋白质，除了Spike蛋白，T细胞还可识别M、N、ORF3a、ORF8等蛋白，而且新冠患者体内存在着高频率的针对这些非Spike蛋白的T细胞应答，这些病毒蛋白可做为潜在的疫苗靶点。更重要的是，相比Spike蛋白，其他结构/非结构蛋白更为保守。新冠病毒SARS-CoV-2与同一亚属的SARS病毒SARS-CoV-1相比，Spike蛋白的保守性只有76%，但M、N蛋白的保守性却高达91%，某些蛋白序列甚至与不同亚属的MERS-CoV高度保守。因此，适当地将其他非Spike蛋白纳入到疫苗抗原组分中，既可能诱导产生强烈的、针对多靶点多表位的T细胞应答，又可能应对病毒突变的问题。迄今为止，引起人类呼吸综合征的b冠状病毒属病毒主要有Sarbecovirus亚属的SARS-CoV-1和SARS-CoV-2，以及Merbecovirus亚属的MERS-CoV。前两者我们都很熟悉，它们分别引起了2003年的SARS和这次的新冠，后者则引起了2012年的中东呼吸综合征（MERS）。此外，Embecovirus亚属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1还可引起人类的普通感冒。通过对新冠病毒免疫应答规律的分析，我们发现在新冠病毒蛋白质序列中存在着一些中和抗体、T细胞的免疫优势表位富集的“热点区域”。碰巧的是，大部分热点区域还处在新冠病毒的保守区，不仅在新冠病毒现有变异株之间完全一致，还与SARS病毒高度保守，甚至还有一些热点区域与MERS-CoV以及引起普通感冒的HCoV-OC43、HCoV-HKU1等高度保守。这些高度保守的“热点区域”堪称理想的疫苗靶点，弥足珍贵。利用这些优势表位的“热点区域”，由此而设计的候选疫苗，就有可能诱导出高水平的中和抗体及高频率的T细胞免疫应答，有效地预防新冠病毒SARS-CoV-2所有变异株的感染，并有可能预防未来可能出现的Sarbecovirus亚属病毒甚至b冠状病毒属病毒的感染，从而制备出真正的广谱疫苗。“广谱”绝不是简单的乘法或除法，将中和抗体的滴度提高到一定程度就能起到广谱的预防作用，而是抗原靶点的重新选择和设计，才能在免疫应答水平上引起质的飞跃。事实上，国际上已有一些团队在尝试将Spike蛋白以外的其他病毒蛋白纳入疫苗的抗原成分之中，以拓展细胞免疫应答的广度和强度。例如，以Spike、N蛋白为靶点的多款候选疫苗已完成1期临床试验，且能够诱导产生较强的T细胞免疫应答及中和抗体应答。但是，由于新冠病毒特异性T细胞的靶点相对比较分散，N蛋白只是其中的一个靶点，并不是其主要靶点，这些候选疫苗诱导的T细胞应答似乎还不够理想。下一代新冠疫苗的设计，是时候换个思路了！然而，尽管目前几乎整个疫苗行业都在关注新冠疫苗，并对新冠疫苗进行了大量的研究，但主要侧重于抗原的表现形式（譬如，是mRNA还是重组蛋白，是全长的Spike蛋白还是RBD，是单聚体还是三聚体），而很少有人关心疫苗靶点这类最基本的问题。谨以此文，抛砖引玉，希望能引起业界对新冠疫苗的再审视和再讨论。作者：mlwang，免疫学博士，从事抗病毒细胞免疫研究近20年，现从事疫苗研发工作。欢迎大家发邮件mlwang2020@163.com与作者沟通。参考文献：1. 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