CD3 x CD8 x GPC3 x TCRs

嵌合抗原受体（CAR）工程化免疫细胞疗法是癌症治疗领域的一项重要进展。然而，复杂的体外细胞制备工艺和严格的患者筛选标准限制了其广泛应用。体内CAR工程化疗法正逐渐成为一种极具前景的即用型疗法，具有生产流程简化、无需患者特异性制备、成本降低和物流便捷等优势。大量的临床前研究成果激发了人们对难治性疾病（如实体瘤）治疗方法的进一步探索，并促进了先进产品的开发，以提高体内CAR工程化的疗效、细胞治疗的持久性和安全性。当前的体内CAR工程化策略，包括基于纳米颗粒和病毒的递送系统以及生物指导性植入支架，同时系统地比较体内和传统的体外CAR工程化方法，并探讨体内CAR工程化面临的挑战和未来发展前景。 嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞（CAR-T细胞）疗法是癌症免疫治疗领域的一项重大进展，目前已有七种获得FDA批准的CAR-T细胞产品在治疗复发或难治性急性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤方面取得了临床成功。目前，所有FDA批准的CAR-T细胞产品均基于自体T细胞的体外工程化。该过程包括分离患者的T细胞，利用慢病毒或逆转录病毒将CAR基因工程化导入这些细胞，并进行淋巴清除预处理，以赋予工程化细胞稳态优势（通过减少与自身免疫细胞的竞争并清除可能抑制CAR-T细胞功能的调节性T细胞，从而增强其存活、扩增和抗肿瘤疗效）。之后，将工程化细胞重新输注回同一患者体内（图 1a）。为每位患者定制 T 细胞产品，而不是制备标准化的大宗药物，其复杂性和高昂成本带来了重大挑战。 图 1：体外自体和异体 CAR-T 细胞疗法与体内 CAR-T 细胞疗法的比较概述。 图a展示了体外自体嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法的流程。该方法包括从患者体内分离T细胞，利用慢病毒或逆转录病毒递送系统对其进行CAR基因修饰，然后将改造后的细胞重新输注回患者体内。淋巴清除对于赋予改造后的CAR-T细胞稳态优势至关重要，它能减少CAR-T细胞与自身免疫细胞的竞争，并清除可能抑制CAR-T细胞功能的调节性T细胞，从而增强CAR-T细胞的存活、扩增和抗肿瘤疗效。这种自体CAR-T细胞疗法已获得FDA批准。 图b展示了体外异体CAR-T细胞疗法的一种方法。该方法利用健康供体来源的T细胞生成异体CAR-T细胞。利用CRISPR-Cas9进行多重基因编辑，通过慢病毒载体将CRISPR-Cas9导入细胞，靶向TRAC和/或TRBC位点，破坏天然αβ T细胞受体（TCR），从而预防由HLA不相容引起的移植物抗宿主病。此外，HLA I类和/或II类分子被清除以减少宿主免疫系统的排斥反应，CD52表达被破坏以赋予对淋巴清除剂（如阿仑单抗）的耐药性。这些同种异体CAR-T细胞疗法已在临床试验中进行评估，但尚未获得FDA批准。 图c 体内CAR-T细胞治疗过程示意图。已开发出多种策略，包括脂质纳米颗粒（LNP ）包裹的核酸、包裹核酸的聚合物纳米颗粒、基于慢病毒或腺相关病毒（AAV）的递送系统以及生物指导性植入支架。KO，基因敲除； PBMC，外周血单核细胞；scFv，单链可变片段。 针对自体CAR-T细胞疗法相关的生产问题，已开发出多种策略。其中一种很有前景的方法是使用源自健康供体的“现成”异体CAR工程细胞产品（图 1b）。这种方法具有多项优势，包括可立即获得冷冻保存的产品、生产标准化、有充足的时间进行细胞修饰以及通过工业化流程降低成本。然而，异体CAR-T细胞存在发生危及生命的移植物抗宿主病（GvHD）的风险。尽管降低这些风险的策略正在研发中，但异体CAR-T细胞的给药仍然需要进行淋巴清除以防止宿主免疫排斥，而这一过程通常伴有长期血细胞减少症、中性粒细胞减少症以及频繁的感染并发症。因此，需要开发新的方法来设计 CAR-T 细胞，使其能够有效杀死癌细胞，同时降低其制造成本和复杂性。 体内直接生成CAR-T细胞是一种很有前景的替代方案，可以解决目前体外生成的自体和异体CAR-T细胞疗法所面临的挑战（表1和图1c ）。一种能够促进CAR工程化免疫细胞生成的现成产品，将简化治疗药物的生产流程，消除患者特异性生产要求，并简化生产物流，从而节省成本并缩短治疗时间。此外，与体外永久基因修饰的CAR-T细胞相比，使用非整合载体的体内方法在避免T细胞耗竭和安全性问题方面可能具有优势。目前也在持续探索其他免疫细胞（包括自然杀伤 (NK) 细胞、单核细胞和巨噬细胞）的体内工程策略（表2）。 表1 临床前模型中T细胞体内CAR工程策略概述 1.AAV，腺相关病毒；Ab，抗体；CAR，嵌合抗原受体；CRS，细胞因子释放综合征；DARPin，设计锚蛋白重复蛋白；LNP，脂质纳米颗粒；NSG，NOD scid gamma；PBAE，聚（β-氨基酯）；PBMC，外周血单核细胞；RNP，核糖核蛋白；ROR1，受体酪氨酸激酶样孤儿受体1；scFv，单链可变片段；shRNA，短发夹RNA；TCR，T细胞受体。 表2 体内CAR工程在其他免疫细胞中的应用 1.ALK，间变性淋巴瘤激酶；CAR，嵌合抗原受体；GPC3，糖蛋白聚糖3；GSC，胶质瘤干细胞；IFNγ，干扰素-γ；ITIM，免疫受体酪氨酸抑制基序；LNP，脂质纳米颗粒；MUC1，粘蛋白1；NA，不适用；NK，自然杀伤细胞；PBAE，聚（β-氨基酯）；scFv，单链可变片段。 体内CAR-T细胞工程策略 目前，多种策略正处于临床前研究阶段，用于在体内生成CAR-T细胞。这些方法包括使用脂质纳米颗粒（LNP）包裹的核酸（mRNA或质粒DNA）、包裹核酸（mRNA或质粒DNA）的聚合物纳米颗粒、慢病毒或腺相关病毒（AAV）递送系统、生物指导性植入支架的混合方法，以及Cas9包装的包膜递送载体（Cas9-EDV）和病毒模拟融合纳米囊泡（FuNV）（表 1）。每种递送平台在细胞特异性靶向性、潜在的全身效应以及是否存在插入突变风险方面都各有优缺点。在这些递送平台中，LNP包裹的mRNA递送技术发展迅速，受益于疫苗技术的最新临床成功，并展现出瞬时但有效的CAR表达潜力。 LNP 制剂核酸 负载mRNA的脂质纳米颗粒（LNP-mRNA）技术利用了成熟的临床生产基础设施，例如已成功大规模生产2019冠状病毒病（COVID-19）疫苗。此外，FDA的批准证实了其安全性，并凸显了其在更广泛的治疗应用方面的潜力，例如体内CAR工程。LNP-mRNA给药后会被多种细胞内吞，尤其是静脉注射后会被肝细胞内吞细胞摄取后，mRNA从内体释放并进入细胞质，在细胞质中进行短暂翻译，然后被降解。与LNP表面偶联的抗体可以促进特定细胞类型对其的摄取。由于mRNA局限于细胞质中，本身不稳定，无法整合到基因组中，并且在细胞分裂过程中会被稀释，因此使用LNP-mRNA的工程方法本质上是短暂的因此，使用LNP-mRNA进行体内CAR工程的治疗方法可能需要频繁的连续给药以维持治疗效果。 临床前研究表明，利用LNP-mRNA技术在体内构建CAR-T细胞在癌症免疫治疗领域具有巨大潜力（图2a ）。这种方法产生的CAR-T细胞具有短暂性，有望降低潜在毒性，并实现精准给药，且注射前无需进行淋巴清除。目前大多数利用LNP在体内构建CAR-T细胞的研究都涉及将靶向CD3、CD4、CD5、CD7和CD8的抗体或单链可变区片段（ scFv ）整合到LNP中。 图 2：T 细胞体内 CAR 工程的当前策略和机制 a，利用封装在脂质纳米颗粒（LNP）或聚合物（例如阳离子可生物降解的聚（β-氨基酯））中的编码嵌合抗原受体（CAR）的mRNA，在体内生成CAR-T细胞的机制。LNP或聚合物经抗体或抗体片段功能化，可通过与T细胞抗原（例如CD3、CD4、CD5和CD8）的相互作用选择性地结合T细胞。这种结合促进内吞作用，其中LNP中阳离子可电离脂质与内体膜阴离子脂质之间的相互作用被认为可促进mRNA释放到细胞质中。然后，mRNA在细胞质中由核糖体翻译，从而表达CAR分子，并瞬时生成功能性CAR-T细胞。 b，利用封装在LNP或聚合物中的编码CAR的DNA，在体内生成CAR-T细胞的机制。同样，LNP或聚合物载体经T细胞靶向抗体功能化后，通过内吞作用进入细胞，从而将DNA货物释放到细胞质中。为了增强细胞内运输和核递送，可以利用微管相关序列和核定位信号来促进DNA货物进入细胞核。进入细胞核后，质粒DNA被转录成mRNA，mRNA被输出到细胞质并翻译成CAR分子。 c，利用慢病毒递送系统在体内生成CAR-T细胞的机制。慢病毒递送载体通常用源自病毒（如尼帕病毒和麻疹病毒）的糖蛋白进行假型化，并与靶向T细胞的分子（如靶向CD3、CD4、CD5或CD8的单链可变区片段（scFv））偶联。慢病毒颗粒与T细胞结合后，通过膜融合或内吞作用进入细胞。在细胞质中，病毒RNA被逆转录为DNA，DNA随后被转运至细胞核并整合到宿主基因组中，从而造成永久性的基因修饰。编码CAR的转基因随后被转录为mRNA，mRNA被转运至细胞质并翻译成CAR蛋白。 d，利用生物指导性可植入支架在体内生成CAR-T细胞。该支架由藻酸盐或胶原蛋白制成，其中嵌入了患者来源的外周血单核细胞（PBMC）或分离的T细胞、病毒载体、与T细胞结合的抗CD3和抗CD28抗体，以及趋化因子和细胞因子等免疫刺激分子。除了直接接种人T细胞外，该支架还可以通过建立趋化因子梯度或局部释放细胞因子在体内募集内源性T细胞。该支架可促进病毒载体介导的基因转移，并作为体内平台生成和释放功能性 CAR-T 细胞。 e，利用Cas9包装包膜递送载体（Cas9-EDVs）在体内生成CAR-T细胞的机制。Cas9-EDVs采用类似逆转录病毒的颗粒组装机制，整合靶向分子，例如共展示的靶向CD3和CD28的scFv，以促进T细胞选择性摄取，主要通过受体介导的内吞作用。内化后，融合性包膜蛋白水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）的突变体促进内体逃逸，从而使封装的货物能够高效地释放到细胞质中。Cas9-EDVs共递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物（以蛋白质形式存在），该复合物包含靶向T细胞受体（TCR）α链恒定区（TRAC）的引导RNA，以及编码CD19特异性CAR转基因的慢病毒载体。慢病毒载体经逆转录和整合酶介导插入宿主基因组，从而实现CAR的稳定表达。这种共递送系统能够有效促进体内T细胞中CAR的表达以及TCR的破坏。 f，利用病毒模拟融合纳米囊泡（FuNVs）在体内生成CAR-T细胞的机制。FuNVs是合成的脂质膜纳米颗粒，其设计旨在模拟包膜病毒的膜融合能力。它们经抗CD3 scFv功能化以靶向T细胞，并整合了源自麻疹病毒或呼肠孤病毒等病毒的T细胞特异性融合蛋白以及CAR蛋白。这使得FuNVs能够在体内有效地与T细胞膜融合，从而将抗原特异性CAR蛋白直接递送至T细胞，使其转化为功能性CAR-T细胞。 抗体标记的脂质纳米颗粒（LNP）（以及下文讨论的聚合物纳米颗粒）具有独特的药代动力学和药效学（PK/PD）特征。静脉注射4小时后，非靶向纳米颗粒主要转运至肝脏，而经CD3或CD8靶向抗体修饰的淋巴细胞靶向纳米载体则主要积聚在富含T淋巴细胞的组织中，例如脾脏、淋巴结和骨髓。纳米载体独特的PK/PD特征反映了它们与靶细胞的特异性相互作用。通过将这些LNP靶向T细胞、NK细胞、巨噬细胞或固有T细胞等免疫细胞，可以增强其摄取，从而改变PK/PD特征并提高治疗效果。然而，与靶向基团的偶联过程会使生产过程复杂化，降低颗粒产量和稳定性，并限制产品在冷冻状态下的长期储存。 在小鼠中开展的临床前研究中，研究人员利用马来酰亚胺功能化的脂质纳米颗粒（LNP）偶联了靶向CD3、CD5或CD7的抗体片段，用于递送编码CD19靶向CAR（CD19 CAR）的mRNA。在该设计中，LNP表面引入马来酰亚胺基团，通过硫醇-马来酰亚胺偶联促进了抗体的结合。这种基于LNP的递送系统实现了肝外转染，并将CAR靶向递送至脾脏中的T细胞，从而成功递送了CAR mRNA，T细胞表达CAR呈剂量依赖性，活化的CAR-T细胞有效释放细胞因子，并实现了高达90%的B细胞清除。该研究还表明，与靶向CD5或CD7的LNP相比，靶向CD3的LNP在体内靶向T细胞方面最为有效。此外，LNP 系统表现出良好的安全性，肝毒性极低。 另一项用于体内CAR-T细胞生成的LNP系统采用了一种表面偶联的CD3靶向抗体，并封装了编码人CD19 CAR和IL-6靶向 短发夹RNA的DNA质粒。在人源化 NOD scid gamma (NSG)小鼠Burkitt淋巴瘤模型中，该系统在注射后21天实现了80%的人T细胞CAR转染率，CAR-T细胞持续存在超过90天，并显著抑制了肿瘤生长。IL-6靶向短发夹RNA的加入降低了细胞因子释放综合征(CRS)的风险 。然而，观察到了脱靶CAR表达，因为一些LNP在体内也转染了巨噬细胞。尽管如此，这些CAR-巨噬细胞无法显著增殖，也不会对其他器官造成实质性损害。 包裹核酸的聚合物纳米颗粒 阳离子型可生物降解聚（β-氨基酯）（PBAE）聚合物制剂可通过静电相互作用与阴离子核酸（DNA或mRNA）自组装，并在内吞作用后发生pH依赖性的内体逃逸。这些聚合物已通过含有微管相关序列和核定位信号的肽进行功能化修饰，以促进其遗传物质通过微管转运机制快速进入细胞核。PBAE聚合物纳米颗粒具有生物降解性，半衰期短（在人源化小鼠体内循环半衰期为1-7小时），并且在动物模型中显示出良好的耐受性，即使高浓度脑内给药也未观察到毒性。这些纳米颗粒可采用纳米沉淀、乳液聚合或溶剂蒸发等技术高效制备成稳定形式。此外，冻干技术能够将聚合物纳米颗粒以干粉形式储存，从而便于储存，提高稳定性并降低相关成本。PBAE 聚合物纳米颗粒已成功用于临床前模型中 T 细胞的体内基因工程（图2b ）和巨噬细胞的体外基因工程。 为了将PBAE聚合物纳米颗粒特异性靶向T细胞，将聚谷氨酸与靶向CD8或CD3的抗体偶联，所得偶联物通过静电吸附作用吸附到PBAE颗粒上。这些靶向纳米颗粒随后可以负载质粒DNA（可设计为整合或不整合到基因组中）、转座子DNA（可促进构建体整合到安全港位点）或编码CAR构建体的mRNA。目前，已使用靶向小鼠CD19的194-1BBz CAR、靶向人CD19的1928z CAR、靶向人受体酪氨酸激酶样孤儿受体1 (ROR1)的CAR以及靶向乙型肝炎病毒的人T细胞受体(TCR)进行了测试。 已成功构建了包封核酸（包括mRNA和DNA）的PBAE聚合物纳米颗粒，这些核酸编码人源或鼠源CAR，用于在白血病、前列腺癌和乙型肝炎诱导的肝细胞癌（HCC）的临床前模型中体内转导T细胞，从而实现肿瘤消退，其疗效与传统的过继性CAR-T细胞疗法相当。然而，由于CAR表达的短暂性，使用包封mRNA的纳米颗粒实现高效的CAR工程和抗肿瘤疗效需要多次给药。重要的是，这些纳米载体的现货供应使得根据需要方便地重复给药成为可能。相比之下，PBAE聚合物纳米颗粒DNA递送方法存在与转座子相关的插入突变风险，其临床可行性仍有待进一步证实。 总之，PBAE聚合物纳米颗粒的制备工艺简便稳定，简化了储存和成本方面的考量。因此，该方法可能是一种可行、灵活且应用广泛的体内诱导CAR-T细胞介导免疫的解决方案。然而，与具有更高包封效率、更强的抗降解保护能力和良好安全性（尤其是在临床mRNA疫苗应用方面）的脂质纳米颗粒（LNP）相比，PBAE纳米颗粒的可扩展性、长期生物相容性和潜在毒性方面仍需进一步研究。 慢病毒递送系统 慢病毒是一类具有球形包膜结构和单链RNA基因组的逆转录病毒，其特点是能够整合到宿主基因组中，从而实现转基因的长期表达。慢病毒载体已被广泛用于将外源基因递送至T细胞。然而，由于慢病毒与靶细胞的亲和力较低以及T细胞通常处于静息状态，其体内感染效率往往受到限制。为了优化这些载体在体内T细胞转导中的效率，研究人员已利用多种病毒包膜对其进行假型化，包括尼帕病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒和cocal融合糖蛋白的包膜。此外，还可以对慢病毒进行基因工程改造，使其表达与包膜蛋白和其他病毒表面蛋白融合的靶向配体，以进一步增强其对T细胞的趋向性。通过将 scFv 或设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins) 基因融合到慢病毒表面表达的糖蛋白复合物上，可以创建专门靶向特定亚型 T 细胞的慢病毒载体（图2c）。 例如，研究人员利用靶向CD8的scFv慢病毒载体在体内生成了靶向CD19的CD8 CAR-T细胞。注射该载体7天后，30-50%的CD8 T细胞表达了CAR，并有效清除了异种移植了人外周血单核细胞（PBMC）和Raji淋巴瘤细胞的人源化NSG小鼠体内的淋巴瘤细胞 。此外，当将该载体注射到移植了人CD34造血干细胞和祖细胞（HSPC）的小鼠体内时，生成的CAR-T细胞减少了CD19 B细胞的数量。然而，它们也增加了人细胞因子（如IL-6、干扰素-γ（IFNγ）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF））的水平，这些细胞因子是细胞因子释放综合征（CRS）的标志。与免疫缺陷的NSG小鼠相比，接受造血干细胞移植的人源化小鼠体内CAR-T细胞的生成量较低，这可能是由于髓系细胞吞噬了外源病毒颗粒，从而降低了T细胞中慢病毒的转导效率。另一项研究在NSG小鼠腹腔注射人外周血单核细胞（PBMC）后，测试了一种融合了CD4特异性DARPin和修饰 血凝素蛋白的慢病毒载体，结果显示腹腔注射7天后， CD4 T细胞的CAR转导率约为40-60% 。与使用CD8特异性DARPin以相同方式生成的CD8 CAR-T细胞相比，CD4 CAR-T细胞表现出更高的增殖率和更有效地清除CD19 B细胞的能力，这可能是因为在高肿瘤负荷的情况下，CD8 T细胞更容易因TCR激活而耗竭。 表达抗CD3 scFv并编码CD19 CAR的慢病毒载体可以转导所有T细胞，这已被证明能够有效生成CAR-T细胞并清除B细胞白血病小鼠模型中的恶性细胞 。用水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）假型化并含有靶向T细胞识别的CD3特异性单链抗体的慢病毒载体， 在腹腔注射和静脉注射后，也显示出在体内生成CAR-T细胞的有效性。这些慢病毒载体的生物分布、脱靶效应和免疫原性尚未得到全面评估。然而，这些研究提供了概念验证，即在体内直接注射靶向T细胞的慢病毒可以成功地将CAR转基因递送到足够数量的宿主T细胞中，从而引发治疗反应。 最近，一种改良的基于慢病毒的递送平台在非人灵长类动物模型中进行了测试。该载体除了包含抗CD3 scFv外，还整合了共刺激配体CD80和CD58，从而显著增强了体内CAR-T细胞的活化和抗肿瘤功能。这些载体在体内产生的靶向CD20的CAR-T细胞占循环T细胞的65%，并导致B细胞完全耗竭长达76天，表明其在治疗B细胞恶性肿瘤和B细胞介导的自身免疫性疾病方面具有显著疗效。 慢病毒已被广泛应用于体外治疗，其临床级生产方案和试剂现已成熟，能够实现CAR转基因的稳定整合和表达。然而，由于病毒的永久性整合，在体内使用这些载体时，安全性问题尤为突出，引发了关于可控整合、意外突变的可能性以及长期后果等疑问。因此，慢病毒载体在体内的应用需要严格控制靶细胞类型，并且只有在经过严格的安全性评估后，才能考虑进行临床试验，并最终获准广泛应用。此外，慢病毒包膜包含一系列宿主膜蛋白，这些蛋白可能触发免疫反应并诱导反应原性。这种免疫反应可能会降低载体在患者血清中的稳定性，阻碍重复给药，并排除已存在针对慢病毒载体抗体的患者。开发不含同种异体抗原的慢病毒载体可能是一种有希望的体内 CAR 工程策略，可最大限度地降低反应原性风险，但插入突变方面的安全问题仍然存在。 基于AAV的递送系统 腺相关病毒（AAV）是一种小型无包膜病毒，具有二十面体衣壳结构和单链DNA基因组，不会整合到宿主基因组中。AAV衣壳可进行基因工程改造，以展示多种蛋白质，包括scFv和DARPins。对衣壳进行修饰对于实现特异性细胞靶向和减少其他细胞的非特异性摄取至关重要。 由于AAV能够实现长期转基因表达和有效纠正疾病表型，且毒性极低，因此已成为治疗性基因递送的关键载体。与慢病毒载体不同，AAV DNA以稳定的游离体形式存在，能够抵抗核酸外切酶的降解，并利用宿主内质网进行脱壳。这种稳定性以及以游离体形式持续存在的能力，使得AAV成为体内基因操作的理想载体，因为它不存在插入突变的风险。 一种基于腺相关病毒（AAV）的体内CAR基因治疗策略已在人源化小鼠模型中针对人CD4 + T细胞白血病进行了测试。在该研究中，AAV载体经过改造，可递送编码靶向人CD4的scFv以及共刺激受体CD28和4-1BB和CD3ζ TCR亚基信号域的线性单链DNA质粒。单次注射该载体即可成功产生能够诱导肿瘤消退的CAR-T细胞 。这种AAV介导的CAR-T细胞疗法也有望用于未来开发治疗HIV和其他损害CD4 + T细胞的传染病的疗法。 表达AAV编码的靶向CD4 CAR构建体的记忆性T细胞的持续存在和产生，可能会加剧临床环境中的CD4 + T细胞再生障碍，这凸显了为该治疗策略开发有效安全开关的必要性。尽管如此，基于AAV的方法代表了推进体内T细胞工程技术的一个有前景的基础，其潜在应用范围已扩展到癌症和传染病以外的领域，例如自身免疫性疾病和器官移植。 生物指导性植入支架 植入式多功能藻酸盐支架，通过接种病毒载体介导体内CAR-T细胞工程和释放，代表了一种介于体内和体外策略之间的混合策略。虽然仍需从患者体内分离T细胞，但处理时间已缩短至一天。与其他体内工程方法不同，藻酸盐支架提供了一个局部且可控的微环境，增强了T细胞、病毒载体、细胞因子和趋化因子之间的相互作用。这种空间限制提高了CAR转导效率，同时最大限度地减少了与全身T细胞工程相关的潜在全身性副作用（图2d）。例如，一种基于藻酸盐的支架包含靶向人CD3和CD28的抗体以及人IL-2，以促进T细胞增殖。该支架在植入前接种自体外周血单核细胞（PBMC）和逆转录病毒。该装置可促进病毒载体介导的基因转移，并支持在体内生成和释放功能性 CAR-T 细胞。在 CD19 +淋巴瘤的人源化小鼠模型中，该方法释放了大量的 CD19 CAR-T 细胞，这些细胞在控制肿瘤生长方面与传统的体外生成的 CAR-T 细胞一样有效，但表现出更优异的扩增和持久性。 另一种生物指导性可植入支架设计以胶原蛋白为基础，将抗人 CD3/CD28 抗体、慢病毒和选定的趋化因子（如 CCL21、CCL3、CCL4 或 CXCL10）偶联到胶原蛋白上。这种支架不是接种 T 细胞，而是旨在募集、改造、扩增和释放肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)，用于治疗实体瘤。 在人源化乳腺癌小鼠模型中，将含有CCL21、抗CD3/CD28抗体和共表达抗ROR1 CAR的慢病毒的支架植入乳腺，此前已腹腔注射了人T细胞。这种局部植入方式增强了T细胞在肿瘤部位的募集和CAR改造。尽管CAR-T细胞具有全身迁移的潜力，但该支架提供了一个浓缩的微环境，促进了CAR-T细胞在肿瘤部位的活化、扩增和滞留，并最终导致显著的长期肿瘤消退。 总体而言，生物指导性植入支架技术为体内CAR工程提供了一种新方法，将CAR-T细胞的制备和递送整合到一个统一的平台中。它为CAR-T细胞的激活、增殖和释放创造了一个局部支持性微环境。虽然生物指导性植入支架可能非常适合治疗血液系统恶性肿瘤和易于治疗的实体瘤，例如黑色素瘤和乳腺癌，但其靶向治疗位于内部或解剖位置较为复杂的实体瘤（例如肝脏、肺部和脑部，如胶质母细胞瘤）的适用性可能更为复杂。 Cas9-EDVs 病毒及其衍生颗粒引起的非靶向效应（即非靶细胞的意外转导）会严重限制体内基因工程。为了解决这个问题，一种利用可预测的抗体-抗原相互作用将基因组编辑机制瞬时特异性地递送至靶细胞的技术应运而生，从而能够在预定义的基因组位置进行精确且永久性的基因编辑，同时最大限度地减少对旁观细胞的脱靶效应。该方法使用基于逆转录病毒样颗粒的Cas9-EDV，通过将其与特异性针对CD3、CD4或CD28的scFv偶联，可以将其靶向T细胞（图 2e）。该方法已用于同时在体内构建CD19 CAR表达和敲除TCRα恒定区（TRAC）基因座，从而构建同种异体工程化T细胞并降低移植物抗宿主病（GvHD）的风险。与其他使用scFv或DARPins偶联递送载体的体内工程策略类似，scFv-抗原相互作用的特异性确保Cas9-EDV将其有效载荷递送至特定细胞类型，而非非特异性摄取颗粒的其他细胞，例如肝细胞。总体而言，与使用病毒载体的体内工程方法相比，该平台能够将分子载荷精确递送至特定细胞类型，从而促进复杂的基因组改造，例如CAR工程和靶向基因敲除。然而，仍需开展进一步研究，以全面评估其在肿瘤根除方面的体内疗效并解决潜在的安全性问题。未来的研究还将着重于将该技术的应用扩展到非免疫细胞靶点。 病毒模拟融合纳米囊泡 预先形成的 CAR 蛋白也可以直接插入体内的 T 细胞膜中。这种方法确保 CAR 蛋白的存在时间有限，从而降低了由持续的 CAR 介导的 T 细胞活化引起的 CRS 的风险，并且没有插入突变的风险。 利用病毒模拟的FuNVs 65实现了工程化蛋白的直接插入，该FuNVs整合了T细胞融合蛋白（具体而言是抗人CD3 scFv）以及CAR（例如CD19 CAR）（图 2f）。静脉注射后，FuNVs与T细胞膜融合，促进CAR整合到T细胞膜中，从而在体内产生CAR-T细胞。在人源化小鼠模型中，通过该方法生成的CD19 CAR-T细胞能够有效清除CD19 + B淋巴瘤细胞，且不诱导细胞因子释放综合征（CRS）。这代表了一种在体内生成CAR-T细胞的创新方法。为了优化FuNVs以用于临床应用，筛选具有更高特异性和融合效率的T细胞融合蛋白可以最大限度地减少与脱靶相互作用相关的潜在副作用。 体内CAR工程改造其他免疫细胞 鉴于体内CAR-T细胞工程方法令人鼓舞的临床前结果，其他免疫细胞（特别是NK细胞、单核细胞和巨噬细胞）的体内工程改造也得到了探索（表2和图 3）。其中，CAR-巨噬细胞因两个主要原因而备受关注。首先，巨噬细胞固有的吞噬特性使其能够高效地内化纳米颗粒，从而增强了其在体内转导中的适用性。其次，巨噬细胞具有浸润肿瘤的天然能力，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中的主要细胞类型。TAMs通过促进血管生成、转移、免疫抑制和耐药性，在肿瘤进展中发挥着至关重要的作用。近年来，越来越多的研究利用合成纳米颗粒对巨噬细胞进行重编程，利用其肿瘤归巢特性。因此，体内CAR-巨噬细胞疗法具有巨大的潜力，可通过释放促炎细胞因子和趋化因子，将靶细胞的促肿瘤M2极化转变为抗肿瘤M1极化，从而增强靶细胞的抗肿瘤活性。 图 3：临床前模型中巨噬细胞体内 CAR 工程的实例 a，利用脂质纳米颗粒（LNP）包裹的mRNA治疗胰腺癌：静脉注射LNP-mRNA纳米载体，通过引入带正电荷的甘露糖基化壳聚糖寡糖-精氨酸（MCA）组分，实现肿瘤内巨噬细胞的嵌合抗原受体（CAR）基因工程，从而靶向递送至巨噬细胞。该策略已被证明能够选择性地增强肿瘤微环境（TME）内巨噬细胞的摄取，进而诱导CAR表达，并在胰腺癌小鼠模型中刺激强效的抗肿瘤免疫反应。 b，利用包裹DNA的聚合物治疗脑癌：瘤内注射合成的通用聚合物包裹的DNA纳米载体，实现肿瘤内巨噬细胞的CAR基因工程。研究表明，这种方法能够引导巨噬细胞的吞噬活性作用于肿瘤细胞，并在胶质瘤小鼠模型中启动局部抗肿瘤免疫反应。 c，纳米载体（NP）-水凝胶超结构用于治疗脑癌：肿瘤切除后瘤内注射NP-水凝胶超结构，能够靶向小鼠脑内术后空腔周围的巨噬细胞，生成肿瘤特异性CAR-巨噬细胞，清除残留肿瘤，从而防止胶质瘤小鼠模型术后脑癌复发。 利用一种可腔注射的纳米载体-水凝胶超结构，研究人员构建了CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞，该结构旨在将胶质瘤干细胞特异性CAR基因递送至巨噬细胞和小胶质细胞中。这项技术采用均一的纳米胶束，其表面包覆有柠檬酸酐修饰的葡聚糖（CA-葡聚糖），以靶向清道夫受体CD206，从而促进体内CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞的生成，这些细胞随后可以靶向并清除胶质瘤干细胞。在人源化小鼠胶质瘤模型中，这些CAR-巨噬细胞和CAR-小胶质细胞能够刺激肿瘤微环境（TME）内的适应性抗肿瘤免疫反应，并通过诱导长期抗肿瘤免疫来预防术后胶质瘤复发。针对脑干胶质瘤，研究人员开发了一种合成的通用DNA纳米载体，用于实现肿瘤内递送，并用针对ERBB2（也称为HER2）的CAR对巨噬细胞进行重编程。该方法利用了基于可生物降解的PBAE聚合物的纳米颗粒，该纳米颗粒经RP-182肽功能化，RP-182肽可结合并激活M2样巨噬细胞上的甘露糖受体CD206。通过靶向巨噬细胞，该策略促进了巨噬细胞从M2极化表型重编程为M1极化表型。这种非整合型CAR基因负载的DNA纳米复合物引入了靶向ERBB2的CAR，使生成的CAR-巨噬细胞能够在原位同源小鼠模型中连续清除侵袭性ERBB2阳性脑干胶质瘤细胞。另一项研究采用甘露糖偶联聚乙烯亚胺（MPEI）靶向巨噬细胞上的甘露糖受体。该研究整合了非病毒piggyBac转座子系统，以确保CAR和IFNγ编码转基因在靶细胞中持续表达。瘤内注射的纳米复合物成功生成了间变性淋巴瘤激酶（ALK）特异性CAR-M1巨噬细胞，这些巨噬细胞能够吞噬癌细胞，促进肿瘤抑制性免疫微环境的形成，并在皮下同源淋巴瘤小鼠模型中抑制神经母细胞瘤的生长。 尽管瘤内基因递送方法对某些局限性实体瘤有效，但静脉基因递送对于全身治疗性细胞分布和转移性癌症的治疗仍然至关重要。一种含有带正电荷的甘露糖基化壳聚糖寡糖-精氨酸（MCA）的脂质体纳米载体已被证实可在静脉注射后靶向瘤内巨噬细胞，并且该纳米载体可以负载编码CAR构建体的DNA。在胰腺癌小鼠模型中，转染CAR的巨噬细胞重新激活了其吞噬活性，从而靶向肿瘤细胞并启动局部抗癌免疫。此外，包裹CAR编码mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）已成功靶向肝脏巨噬细胞。这些LNP吸附特定的血浆蛋白，从而引导其到达肝细胞癌（HCC）相关的巨噬细胞。在肝细胞癌（HCC）小鼠模型中，静脉注射脂质纳米颗粒（LNP）显著增强了巨噬细胞的吞噬功能，降低了肿瘤负荷并延长了生存期，这表明其是一种有前景且灵活的HCC治疗策略。此外，通过高通量体内筛选，研究人员发现氧化脂质纳米颗粒（oLNP）能够将编码CAR的mRNA递送至单核细胞。oLNP制剂C14-O2表现出对单核细胞的天然趋向性，并被用于在体内构建功能性CD19 CAR-单核细胞。静脉注射C14-O2可导致健康小鼠出现明显的B细胞再生障碍，凸显了oLNP作为体内构建CAR-巨噬细胞或CAR-单核细胞平台的潜力。 其他免疫细胞类型，包括NK细胞、 NKT细胞和中性粒细胞，也已被改造用于癌症免疫治疗。尽管尚未实现CAR-NK细胞、CAR-NKT细胞或CAR-中性粒细胞的体内靶向改造，但由于CD19特异性CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞表达CD8α链（工程化慢病毒载体颗粒中单链抗体的靶抗原），因此已在体内意外生成了CD19特异性CAR-NK细胞和CAR-NKT细胞。另一项研究展示了使用负载mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）在体外生成CAR-NK细胞的方法，并指出了其在体内CAR-NK细胞改造方面的潜力。 CAR-NK 细胞疗法目前面临的挑战包括工程化细胞的持久性和体内扩增能力有限、基因工程效率不理想以及需要额外的细胞因子支持（如 IL-15），这些仍然是重要的障碍。 总体而言，利用 T 细胞以外的免疫细胞的固有特性，对免疫细胞进行体内工程改造，为 CAR-T 细胞提供了一种很有前景的替代方案。 体内CAR工程超越癌症 近年来，CAR-T细胞技术已从癌症扩展到传染病、自身免疫性疾病和纤维化等领域。CAR-T细胞技术在非癌症适应症中的应用实例包括：靶向CD19、BCMA、DSG3和CD20的CAR-T细胞，目前已用于治疗系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力和寻常型天疱疮等自身免疫性疾病中的自身反应性B细胞。此外，靶向HIV gp120糖蛋白的CAR-T细胞疗法目前正在两名患者中进行I/II期剂量递增研究。 CAR 疗法的其他潜在适应症包括哮喘、乙型和丙型肝炎病毒感染心脏纤维化、严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2)感染和阿尔茨海默病。 在小鼠心脏纤维化模型中，已获得非癌症适应症的体内CAR工程临床前研究结果。该研究中，T细胞被改造表达一种 靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的CAR，该CAR可与活化的成纤维细胞结合，从而抑制心肌硬化和心脏功能。这是通过使用含有FAP-CAR mRNA的CD5靶向脂质纳米颗粒（LNP）实现的，该颗粒可导致T细胞中FAP-CAR的瞬时表达。心脏切片显示，心脏中超过一半的CD3 T细胞表达FAP-CAR并定位于成纤维细胞所在的区域。经治疗的小鼠表现出纤维化减轻和心脏功能恢复，这已通过超声心动图测量得到证实。 比较体内和体外CAR工程 CAR-T细胞的制备方法多种多样，包括体内策略（使用非整合型或整合型载体）和体外方法（使用自体或异体细胞），每种方法都各有优势，但也面临着独特的挑战。这些挑战涵盖了治疗药物生产的物流、最终治疗药物的疗效以及关键的安全性和毒性考量（表3）。鉴于这些平台的多样性，对它们进行比较有助于深入了解各自的优势和潜在应用。 表3 体内与传统体外自体CAR-T细胞工程的比较 1.CAR，嵌合抗原受体；COVID-19，2019冠状病毒病；CRS，细胞因子释放综合征；ICANS，免疫效应细胞相关神经毒性综合征 商业市场和临床试验对体外工程化自体CAR-T细胞的需求不断增长，暴露出自体工程化T细胞生产能力的巨大局限性。在美国，所有体外生成的自体CAR-T细胞产品目前均在中心化生产设施中生产，周转时间为16至33天，这可能对患者造成危险的延误。由于活细胞产品集中生产涉及复杂的物流，通过扩大生产规模来缩短生产时间是不可行的。因此，必须通过建立更分散、更本地化的生产设施来“扩大规模”，从而提高自体细胞疗法的生产能力。然而，与集中式生产设施相比，本地细胞生产设施由于需要专用设备和昂贵的试剂，成本更高，因此限制了其物流可行性。体外工程化自体 CAR-T 细胞疗法的生产和管理成本也相当高昂，这是由于涉及白细胞分离术、基因工程和细胞扩增的多步骤过程所致 。相比之下，异体 CAR-T 细胞疗法提供了一种更具成本效益的替代方案，具有更高的可扩展性，并且具有现成可用的优势。 由于其“即用型”特性，体内CAR工程策略为自体和异体体外生成的CAR-T细胞提供了一种极具前景的替代方案。这些特性简化了 放行检测，优化了供应链，从而降低了成本并缩短了时间，而且其本身也具有自体来源的优势。利用LNP-mRNA平台进行体内CAR工程方法的临床转化，有望受益于COVID-19疫情期间为生产疫苗而建立的高度商业化的制造基础设施。然而，采用LNP-mRNA递送方法的体内CAR工程方法直到最近才进入临床试验阶段，而其他平台，例如PBAE聚合物纳米颗粒和生物指导性植入支架策略，目前仍处于临床前开发阶段。关于LNP-mRNA、PBAE聚合物-mRNA/DNA和AAV基CAR载体的短期、中期和长期安全性和有效性，以及能否利用现有生产工艺高效大规模生产这些载体，仍存在一些未解之谜。此外，由于成本高昂和复杂的知识产权格局，用于mRNA递送的LNP的开发和生产仍然面临挑战。尽管AAV载体是一种很有前景的基因治疗载体，并且已展现出良好的安全性，但由于其固有的不稳定性、复杂的生物学特性和有限的临床数据，其生物工艺开发耗时且充满挑战。与单克隆抗体等成熟的生物药物平台不同，AAV的生产在优化生物工艺、细胞系和分析工具方面仍缺乏技术成熟度。 尽管体外生成的自体CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得了成功，但其在实体瘤治疗中的疗效仍然有限。新兴的体内CAR工程方法提供了一种很有前景的替代方案，因为该方法能够持续修饰和扩增肿瘤微环境（TME）内的治疗性免疫细胞。这种动态过程克服了体外生成的CAR-T细胞存在的持久性和迁移效率低下等局限性，从而提高了其疗效。此外，体内生成的CAR-T细胞与其他疗法联合使用，可以协同解决免疫抑制性TME和T细胞耗竭等挑战（图4和框 1）。而且，所有体外生成的CAR-T疗法通常都需要进行淋巴细胞清除步骤，以便为输注的CAR-T细胞“创造空间”，这可能导致免疫抑制及相关风险。相比之下，体内CAR工程无需进行淋巴细胞清除，从而保护了患者的免疫系统。这种方法可能增强 表位扩散，并维持免疫系统识别和靶向肿瘤的能力。如果肿瘤细胞通过下调CAR配体逃避免疫检测，内源性免疫反应仍然可以识别它并启动抗肿瘤防御。此外，体外生成的自体CAR-T疗法通常靶向单一抗原，如果肿瘤细胞在靶向表位上获得突变，则该疗法可能容易发生肿瘤逃逸。体内CAR工程利用多重mRNA或病毒载体同时或依次靶向多个抗原，从而降低肿瘤逃逸的风险。 图 4：体内 CAR 工程联合治疗 为了提高嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在肿瘤微环境（TME）中的疗效，目前正在开发多种联合治疗策略。这些策略包括：使用抗PD-1等药物阻断免疫检查点以防止CAR-T细胞耗竭；使用小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA）增强CAR-T细胞的活化和存活；使用小分子药物激活CAR-T细胞、降低调节性T细胞活性或直接靶向肿瘤细胞；使用溶瘤病毒诱导肿瘤细胞裂解；使用酶降解细胞外基质（ECM）成分；使用放射疗法和化疗靶向肿瘤细胞并增强促炎环境；使用基于mRNA的癌症疫苗通过增强对肿瘤细胞的免疫识别与CAR-T细胞产生协同作用；以及使用抗肿瘤单克隆抗体引导免疫反应靶向肿瘤细胞并增强CAR-T细胞的疗效。以及通过基因编辑方法增强 CAR-T 细胞的耐受性，减少其耗竭并提高其在肿瘤微环境 (TME) 中的功能。APC，抗原呈递细胞；BiTE，双特异性 T 细胞衔接器。 非整合型载体用于体内CAR-T细胞生成的一个潜在优势在于，它们允许CAR构建体的暂时表达，并可进行多次给药，每次给药之间有休息期，这可能避免慢性刺激引起的CAR-T细胞耗竭<。其他T细胞特异性免疫治疗方法（例如双特异性分子）的连续给药已被证明可以减少T细胞耗竭。相比之下，体外生成的自体CAR-T细胞在输注前已观察到耗竭现象，这是由于其在体外长时间激活和扩增所致，从而降低了其再次输注时的疗效。 体内CAR工程还能同时递送小干扰RNA（siRNA），从而暂时沉默特定基因或编码细胞因子的mRNA，这些细胞因子能够暂时增强T细胞的活性和持久性，而不会像体外方法那样出现“过度工程”的风险——在体外方法中，引入多个永久性基因修饰可能会损害T细胞的适应性。这种灵活性使得治疗策略更加灵活，同时还能减轻肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用。 尽管体内CAR工程具有这些优势，但在疗效和特异性方面仍面临挑战。与自体CAR-T细胞相比，后者可通过体外可控操作在给药后立即产生大量治疗细胞，而体内CAR工程最初只能产生数量少得多的CAR-T细胞。这些细胞随后必须在患者体内逐渐扩增，这可能会延迟治疗效果。然而，与体外生成自体CAR-T细胞所需的7-22天延迟相比，一旦初始扩增阶段完成，体内方法可以提供更快的治疗反应。体内CAR-T疗法的另一个重要局限性，尤其是在肿瘤治疗领域，是患者免疫系统的受损状态。体外生产可以筛选和扩增最佳T细胞，但这些补偿机制在体内CAR-T工程中无法实现。对于接受淋巴清除的癌症患者而言，适合体内工程的功能性 T 细胞的匮乏可能会限制治疗效果，从而导致临床结果欠佳。 药代动力学参数进一步增加了体内CAR工程的复杂性，因为活细胞、纳米颗粒和载体在体内的分布和迁移差异很大。此外，尽管暂时性CAR表达在避免T细胞耗竭方面具有优势，但对于非整合型载体而言，CAR表达持续时间短可能会影响疗效。能够实现稳定整合的平台，例如使用慢病毒载体的平台，可以绕过这个问题，但存在插入突变的风险，如下文所述。最后，预先存在的和获得的宿主免疫会干扰体内CAR工程中的载体给药，导致病毒载体和颗粒的清除。这给治疗效果带来了巨大挑战，尤其是在需要连续给药的情况下。 方框 1：体内 CAR 工程联合疗法 嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在癌症治疗中，尤其是在实体瘤治疗中，其功能、持久性和总体疗效方面面临着诸多挑战。肿瘤逃逸机制，例如肿瘤抗原的下调和抑制性分子的表达，会导致“冷”肿瘤微环境（TME）的形成，从而削弱免疫识别和肿瘤清除能力。在TME中，癌细胞和其他细胞可以表达PD-L1，PD-L1与免疫细胞上的检查点分子PD-1相互作用，抑制免疫细胞的增殖和细胞因子产生。此外，TGFβ、IL-10和腺苷等免疫抑制分子可以与效应细胞上的抑制性受体结合，抑制其功能。这些分子由肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞（MDSC）和调节性T细胞（Treg细胞）产生，共同促进免疫细胞耗竭并降低效应功能。细胞外基质（ECM）等物理屏障进一步阻碍免疫细胞浸润到肿瘤中，限制了CAR-T疗法的疗效。为了应对这些挑战，人们探索了结合CAR工程的联合疗法，并发现其有望提高治疗效果（图 4）。这些疗法已在体外CAR工程T细胞治疗中得到广泛研究，并在与体内CAR工程细胞联合治疗的临床前模型中也开始展现出潜力。 例如，在胰腺腺癌 (PAAD) 小鼠模型中，将肿瘤内巨噬细胞进行体内 CAR 工程改造并抑制 CD47（一种在肿瘤细胞中过度表达的免疫抑制蛋白，可作为巨噬细胞的“别吃我”信号）显示出良好的疗效。在该研究中，靶向 PAAD 细胞表面黏蛋白 1 (MUC1) 抗原的 CAR 与 CD47 小分子抑制剂 RRx-001 联合使用，两者均通过脂质体纳米载体（一种用于将 DNA 递送至细胞内的脂质体纳米载体）进行瞬时递送。这种联合疗法在免疫细胞激活和肿瘤抑制方面均优于任何单一疗法。 类似地，研究人员开发了脂质纳米颗粒（LNP），可同时递送编码CAR的mRNA和小干扰RNA（siRNA），后者可下调T细胞中PD1的表达，从而拮抗PD1-PDL1免疫抑制轴。该平台实现了人T细胞中CAR的暂时性表达和PD1的持续抑制，持续时间长达1周。尽管目前仅在体外T细胞工程中进行了测试，但这种双重递送方法为共同递送CAR和其他免疫调节剂以克服免疫抑制性肿瘤微环境（TME）提供了一种策略。 其他一些在临床上使用的联合策略，例如体外工程化CAR-T细胞疗法，也显示出增强体内应用的潜力（图 4）。例如，免疫检查点阻断与CAR-T细胞疗法的联合应用已证实具有协同效应，这在乳腺癌和肉瘤的临床前模型以及B细胞急性淋巴细胞白血病的临床试验中均有观察到。目前正在弥漫性大B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验中评估的CAR-T细胞疗法联合放疗，似乎也能通过诱导肿瘤细胞表达NKG2DL等应激配体，以及将肿瘤微环境（TME）重塑为更“热”的炎症状态来增强疗效。化疗也能观察到类似的增强作用，并能进一步提高CAR-T细胞的疗效。另一种临床前策略是利用细胞外基质（ECM）降解酶（例如肝素酶）来分解ECM的关键成分，从而增强CAR-T细胞向肿瘤的浸润。其他策略，例如溶瘤病毒和mRNA疫苗，也具有增强体内生成的CAR-T细胞疗法的潜力，它们可以直接靶向肿瘤并激活免疫系统对抗肿瘤特异性抗原。单克隆抗体，包括双特异性T细胞衔接器（BiTE），也可以与CAR-T细胞协同作用，更好地引导针对肿瘤的免疫反应。目前，这些不同的策略正在与CAR-T细胞疗法联合进行临床试验。基因编辑技术，例如CRISPR修饰，可以进一步提高CAR-T细胞的耐受性并减少其耗竭，从而为增强CAR活性提供了另一种途径。 尽管这些方法在体外CAR工程疗法中已取得成功，但仍需进一步研究以评估其在体内CAR工程中的应用价值。利用脂质纳米颗粒（LNP）等递送系统进行体内CAR工程，可以方便地共递送siRNA和mRNA等药物，从而实现对肿瘤微环境（TME）和免疫检查点分子的同步调控。然而，当包含多种不同的核酸时，转导效率可能会降低，导致CAR表达不稳定。此外，在单一系统中联合使用多种药物会引发安全问题，例如脱靶效应和由于随机整合导致的非预期基因修饰，这些问题在体内比在体外更难控制。尽管如此，联合疗法以及CAR表达和其他修饰的基因递送系统的进步，或许能够克服TME中的免疫抑制屏障，并提高体内CAR免疫疗法的疗效。 与自体CAR-T细胞疗法相比，体内CAR工程在安全性和毒性方面具有多项显著优势。所有体内CAR工程策略的一项重要优势在于，它们无需在治疗前进行淋巴细胞清除化疗，从而避免了相关风险。此外，非整合型载体允许实时调整剂量，这可以显著降低毒性和长期副作用，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。在COVID-19疫苗和多种FDA批准疗法的研发和应用过程中，mRNA和AAV载体的安全性已得到证实，这凸显了体内CAR工程快速商业化的潜力。此外，纳米颗粒和mRNA可以以无细胞方式生产，从而获得明确的理化性质，最大限度地减少产品变异性。这种可控的生产过程确保了质量控制的一致性，这对临床应用至关重要。此外，基于mRNA和AAV的疗法不存在插入突变的风险，因为遗传物质被递送到细胞质并在细胞质中翻译，从而避免整合到宿主基因组。相比之下，体外CAR-T细胞的生产通常依赖于病毒载体（例如慢病毒或逆转录病毒载体）的整合，而这些载体存在插入突变的风险。在一项慢性淋巴细胞白血病的临床试验中，CAR构建体的整合破坏了靶向CD19的CAR-T细胞产品中的TET2基因，导致TET2基因被破坏的CAR-T细胞出现意想不到的过度增殖。如前所述，基于慢病毒的体内疗法仍然存在这种风险（此外还存在生殖系整合的潜在风险），这凸显了谨慎选择载体以确保疗效和安全性平衡的重要性。与同种异体 CAR-T 细胞方法相比，体内 CAR 工程可以规避免疫相容性问题，从而提高整体安全性。 尽管体内CAR工程具有诸多优势，但仍面临一些重要挑战。由于成功到达靶器官或细胞的载体颗粒比例有限，通常需要高剂量载体。全身给药载体可能导致剂量限制性毒性，包括肝损伤。载体引起的炎症反应，例如补体系统介导的超敏反应，也构成重大障碍。然而，这些免疫反应也可能通过激活抗原呈递细胞（APC）、增强细胞因子产生和促进T细胞启动来增强抗肿瘤免疫，从而潜在地增强CAR-T细胞的扩增和功能。在临床前模型中，慢病毒载体在体内生成的CAR-T细胞表现出增强的炎症细胞因子分泌，并引起类似细胞因子释放综合征（CRS）的症状。脱靶递送仍然是一个至关重要的问题，因为它可能导致CAR在非靶细胞中意外表达，从而可能破坏正常的细胞功能并引起不可预见的并发症。尽管与体内工程化CAR相比，慢病毒载体能够提供更稳定、更持久的CAR表达，但其永久整合到宿主基因组中会带来长期脱靶效应的风险（除了插入突变的风险外）。因此，需要谨慎地进行靶向递送以防止脱靶转导，特别是生殖细胞的脱靶转导，因为基因转移可能导致生殖系转化和可遗传的基因修饰。此类事件可能比体外生成的CAR-T细胞产生更多不可预测的副作用。鉴于这些担忧，目前在体内CAR工程中，非整合载体或位点特异性整合载体比慢病毒载体更受青睐，以提高安全性并最大限度地减少基因组破坏。 与目前体外工程化的自体CAR-T细胞相比，体内CAR工程方法在治疗癌症等疾病方面具有经济和制备优势。尤其值得一提的是，它将成为一种现成的产品，既能生成患者特异性的工程化细胞，又无需对患者进行淋巴清除等预处理。凭借简化的生产工艺，它有望为数百万患有各种疾病的患者提供一种实用且可扩展的解决方案。迄今为止，在癌症和心脏损伤模型中进行的临床前概念验证研究表明，体内工程化的治疗细胞与通过传统体外方法生产的治疗细胞具有功能等效性。然而，这些研究迄今为止仅限于同基因或人源化小鼠模型（框 2）。为了确定体内CAR工程在人体中的可行性、有效性和安全性，还需要进行临床试验。 在将体内CAR工程应用于临床之前，必须对各种载体技术进行比较分析，以确定在疗效、免疫原性和安全性之间取得最佳平衡的载体。技术难点包括优化靶细胞特异性、实现可控的基因编辑以及减少脱靶效应以确保安全性。对于基于纳米颗粒的方法，CAR表达的短暂性可能需要多次给药，并且纳米颗粒会被肝脏清除，这会限制其生物利用度。基于慢病毒载体的方法存在严重的安全性问题，例如转基因可能整合到旁观细胞（如生殖细胞、恶性细胞或抑制性免疫细胞）中，这凸显了高特异性递送系统的必要性。非整合型载体（如AAV ）在靶细胞上也表现出CAR的短暂表达，这一特性既可能带来局限性，也可能带来潜在优势，需要在治疗疗效和安全性之间取得平衡。此外，载体成分可诱导免疫反应，导致纳米颗粒、病毒载体或由此产生的 CAR 工程细胞被清除，因此需要重复给药，这也有可能增加不良反应的风险。 体内CAR-T细胞工程治疗的患者选择可能优先考虑免疫系统相对完整的个体，因为内源性T细胞必须对体内基因递送做出反应，并扩增和持续存在才能发挥治疗效果。这可能会排除既往接受过大量治疗、淋巴细胞严重减少或肿瘤微环境（TME）高度免疫抑制的患者。与体外自体CAR-T疗法相比，体内方法可以显著缩短细胞分离、基因修饰和扩增所需的时间，从而有可能快速启动治疗（表 3）。然而，体内生成的CAR-T细胞在给药后仍需要时间扩增，这意味着其临床疗效可能不会立即显现。异体CAR-T细胞提供了一种折衷方案，无需患者特异性生产，即可提供即用型产品，但免疫排斥和移植物抗宿主病（GvHD）仍然是需要关注的问题。从物流角度来看，体内工程可能是最具成本效益和可扩展性的方法，而与自体疗法相比，异体CAR-T细胞可以缩短生产时间（表 3 ）。 此外，必须认真考虑体内CAR疗法在临床试验中的伦理影响，尤其是在已有FDA批准的自体CAR-T细胞疗法作为标准治疗方案的情况下。确保透明度并获得知情同意至关重要，以便充分沟通体内CAR疗法的潜在风险、获益和不确定性。潜在的临床应用可能包括治疗耐药性癌症、治疗选择有限的复发或难治性疾病患者，以及在专业中心开展的严格监管的试点研究。在这些情况下，采用适应性试验设计可以迭代改进安全性、有效性和可行性评估，从而实现更广泛的临床应用。 在各种体内CAR工程方法中，基于LNP-mRNA的CAR有望率先进入临床应用，这得益于COVID-19疫情期间在生产和监管方面取得的进展。其瞬时表达特性可能限制CAR的长期表达，但有利于降低毒性，并允许重复给药而无需担心基因组整合（表 3）。相比之下，慢病毒载体由于存在插入突变和脱靶整合的风险，面临着诸多障碍，除非开发出更安全的靶向整合策略，否则其体内应用更具挑战性（表 3）。Cas9-EDV等新兴技术提供了一种潜在的解决方案，它能够实现精确的基因组编辑和持久的CAR表达，同时避免随机整合的风险。如果能够优化特异性、递送和免疫逃逸能力，Cas9-EDV有望通过平衡疗效和安全性，代表体内CAR工程的未来发展方向。最终，任何平台的临床成功都将取决于能否克服免疫反应、实现有效的体内靶向以及与现有自体 CAR-T 细胞疗法相比，展现出更优越的安全性。 同时，体外CAR工程技术的创新以及不断发展的免疫学见解，可以为体内CAR工程的进步提供信息。近期研究集中于通过缩短制备时间、减轻耗竭以及改善记忆和效应功能来提高体外生成的自体CAR-T细胞的疗效。实现这些改进的策略包括基因修饰，例如：优化CAR构建体，增强其细胞内信号转导结构域；表观遗传修饰，包括使用BET抑制剂或组蛋白去乙酰化酶抑制剂来维持低分化状态；细胞因子调节，例如引入IL - 7、IL-15或IL-21等细胞因子来促进CAR-T细胞的持久性；代谢重编程，例如调节 mTOR 信号通路，可以增强细胞适应性；转录重编程，包括引入 Jun 或 BATF 等转录因子，可以帮助对抗 CAR-T 细胞耗竭并增强其效应功能。一些先进技术，例如 APC 模拟脂质纳米颗粒 (LNP)，已被开发用于快速递送 mRNA，并已证实能够增强体外自体 CAR-T 细胞的活化和功能，这些 APC 模拟 LNP 可轻松应用于体内 CAR 工程。此外，将体内 CAR 工程与其他已建立的治疗策略相结合，可能协同提高该方法的疗效（框 1）。 CAR工程方法的其他重要方面包括CAR的设计，例如铰链区、跨膜区和共刺激区的选择，以及编码CAR的核酸的优化设计。靶向载体，例如脂质纳米颗粒（LNP）、PBAE聚合物和其他递送载体，可以与mRNA、整合型和非整合型质粒DNA、转座子DNA或自扩增RNA（saRNA）形成复合物。saRNA提供了一种替代mRNA的非整合方法，可以延长基因表达时间，并利用细胞内扩增来降低RNA剂量需求。尽管其在体内CAR工程中的潜力尚未得到验证，但saRNA能够以较低的RNA剂量实现持续表达，使其成为疫苗、基因治疗和细胞治疗等领域中一种很有前景的工具，在这些领域中，可控和延长的表达是有益的。此外，确定各种体内载体技术的最佳药代动力学/药效学（PK/PD）特征和给药途径至关重要。 总体而言，体内CAR工程这一新兴领域有望在医疗领域取得重大进展。为了将其确立为一种新的治疗手段，科学家、临床医生和生物技术公司需要通力合作，共同解决悬而未决的问题，并优化载体设计，以提高疗效和安全性。 方框 2：临床前动物模型在体内 CAR 工程研究中的局限性 同源小鼠模型和人源化小鼠模型均已被用于评估体内嵌合抗原受体（CAR）工程改造T细胞的疗效以及CAR-T细胞的抗肿瘤活性。在同源小鼠模型中，CAR递送已通过脂质纳米颗粒（LNP）-mRNA或与核酸复合的聚合物纳米颗粒，以及靶向小鼠T细胞的病毒载体实现。通过将LNP-mRNA和纳米颗粒与靶向CD3、CD5或CD7的小鼠抗体偶联，实现了LNP-mRNA和纳米颗粒的特异性细胞靶向。为了构建人源化小鼠模型，需要将人类淋巴细胞移植到免疫缺陷的NOD scid gamma（NSG）小鼠体内。利用脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物包覆的核酸或病毒载体，通过抗体、单链可变区片段（scFv）或设计的锚蛋白重复序列蛋白（DARPin）构建体与人CD3、CD4或CD8结合，已成功靶向小鼠体内的人类T细胞。这些动物模型是临床前治疗策略测试的重要工具，但它们也存在一些显著的局限性，尤其是在测试免疫反应和递送方法方面。以下列出了主要挑战。人源化小鼠模型旨在模拟人类免疫系统的某些方面，但无法完全捕捉人类免疫学的复杂性。这些小鼠体内的人源免疫细胞在与宿主环境的多种相互作用方面存在缺陷。这可能会限制它们对人类免疫反应的预测价值，尤其是在评估新型疗法的疗效时。很少有动物模型能够准确反映人类对病毒载体或纳米颗粒等递送载体所表现出的特定免疫反应。例如，常用的载体如腺相关病毒和脂质纳米颗粒（LNP）可能会在人体内引发显著的免疫反应，而这些反应在动物模型中却未观察到。这一局限性阻碍了对不良免疫反应的预测。动物与人类在药物代谢方面存在差异，包括清除率、生物利用度和整体药代动力学。尽管非人灵长类动物是药代动力学研究的更接近模型，但它们的药物代谢仍然可能与人类有所不同，这常常导致估计的治疗剂量或作用持续时间出现差异。 联系我们： 西安迈博睿生物科技有限公司致力于一站式的CRO技术开发，包括：抗体定制开发、重组蛋白定制、生物偶联、检测方法开发、科研项目整包等服务。 公司名称(中):  西安迈博睿生物科技有限公司 公司名称(英):  Mabioway Biotech Co., Ltd. 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Glypican-3在肝细胞癌中的作用 1 肝癌的治疗现状 ◆疾病地位与趋势：肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，占病例的75%-85%，2020年全球癌症统计显示其为第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，高死亡率部分源于晚期诊断和缺乏有效系统疗法。 ◆发病与预后特点：HCC多发生于晚期慢性肝病背景下，早期通常无症状，5年生存率早期超70%，晚期不足20%；手术切除是推荐疗法之一，但仅10%-20%的初诊原发性HCC患者适合切除。 ◆ 风险因素：包括乙肝(HBV)、丙肝(HCV)感染、酒精消费、铜/铁过载、原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。 ◆现有治疗局限：晚期HCC治疗手段如射频消融(RFA)、经动脉化疗栓塞(TACE)等，因药物耐药性和高复发率(源于肝内转移、新生癌变等机制)，难以改善患者生存期，且预后极差。抗体或T细胞导向免疫疗法需稳定肿瘤特异性靶点，此为主要障碍。因此迫切需要更可靠、无创的HCC识别和监测策略。 表1 HCC中GPC3过表达的证据 2 GPC-3的基本概述 ◆GPC-3的价值：Glypican-3(GPC3)是一种细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在包括HCC在内的多种肿瘤中过表达，在正常器官中缺失，约70%-80%的HCC患者GPC-3表达升高，且与不良预后相关，但在正常成人肝脏和良性肝脏病变中几乎不存在。其肿瘤限制性分布以及在Wnt/β-连环蛋白、Hedgehog和成纤维细胞生长因子信号等关键致癌通路中的功能作用，使其有望成为HCC早期检测的特异性生物标志物和精准治疗的潜在靶点。 ◆ Glypican(GPC)家族：属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)，目前已发现6个哺乳动物成员(GPC1至GPC6)，果蝇中还有两个额外成员Dally和Dally-like蛋白(DLP)。家族成员在肽链结构上有保守特征，约60-70kDa的蛋白质，N端有分泌信号肽，C端疏水区域可添加糖基磷脂酰肌醇(GPI)以锚定在细胞表面，C端还会发生硫酸乙酰肝素(HS)链修饰，且14个半胱氨酸残基位置保守，推测三维结构相似。 ◆GPC3的结构：GPC-3是由X染色体Xq26上的GPC-3/OCI-5基因编码，分子量为70kDa的前体单链核心蛋白，含580个氨基酸。经弗林蛋白酶在特定位点(Arg358-Cys359)切割，形成40kDa的N端亚基和30kDa的C端亚基，两个亚基通过二硫键连接，其中C端蛋白带有两条硫酸乙酰肝素(HS)糖链。GPC-3基因功能缺失突变会导致Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)，这是一种罕见的过度生长疾病，常伴随面部异常。 图1 GPC3剪接亚型和GPC3结构示意图 图2 GPC3的突变形式示意图 ◆GPC3的分布 ①胚胎发育：胚胎发育阶段，GPC-3在多种组织中以阶段和组织特异性方式表达，参与形态发生过程，其功能缺失突变与SGBS密切相关。 ②成人组织：成年健康组织中GPC-3几乎不表达，但在HCC、黑色素瘤、卵巢癌、肺腺癌和胚胎性肿瘤等多种肿瘤中高表达，提示其可作为癌症早期检测的潜在生物标志物。 图3 GPC3 mRNA在不同肿瘤组织和正常组织中的表达水平 表2 肿瘤组织与正常组织中的GPC3蛋白水平 ◆GPC3的生物学功能 图4 GPC3生理功能机制示意图 表3 GPC3在HCC中的生物学作用及其作用机制 ◆可溶性的GPC3：除了GPI介导的膜结合形式，还有可溶性GPC3，与膜结合的GPC-3竞争结合Wnt和其他生长因子，起显性负性作用。在体外培养细胞的培养基和HCC患者血清中可检测到。 3 HCC中GPC-3表达的表观遗传调控 ◆DNA甲基化：DNA甲基化和组蛋白变化是HCC中基因表达失调的主要表观遗传机制，GPC-3启动子在正常肝组织中通常呈高甲基化状态，基因表达受抑；而在HCC中，该区域呈低甲基化，导致GPC-3异常重新激活表达，进而促进肿瘤发生，这种甲基化状态的转变是多种癌症中癌基因激活的典型特征。 ◆长链非编码RNA(lncRNA) ①lncRNA-AF085935：以反义方向转录，对应GPC-3基因体区域，在HCC组织中显著上调，且与GPC-3-mRNA共表达，其在HCC患者血清中的表达水平高于健康对照，可作为HCC筛查的无创生物标志物。 ②GPC3-AS1：通过与GPC-3基因体区域的PCAF物理相互作用，促进常染色质组蛋白标记的沉积，形成开放染色质状态，从而触发GPC-3的转录，调控GPC-3表达。 ◆调控意义：表观遗传机制是HCC中GPC-3调控的重要因素，不仅为HCC的早期诊断和预后提供了潜在标志物，也为靶向GPC-3表观遗传调控因子的治疗开辟了新途径，但目前对这些调控系统的治疗利用仍需进一步研究。 表4 GPC-3在HCC中的结构见解和翻译后修饰 GPC-3与肝癌发生信号通路 1 Wnt信号通路 Wnt信号通路激活是HCC发生的关键分子事件，约95%的HCC病例存在Wnt/β-连环蛋白失调。GPC-3通过增加受体位点的Wnt浓度，促进自分泌/旁分泌经典Wnt信号，其核心蛋白和HS链均参与Wnt信号，膜结合的GPC-3才能激活Wnt信号，sGPC-3抑制Wnt介导的HCC细胞增殖。此外，GPC-3还作为Wnt信号的共受体，与Frizzled(FZD)受体相互作用触发下游信号，加剧通路失调。GPC-3在HCC中的高表达使其不仅是生物标志物，也是潜在治疗靶点。 图5 GPC3在HCC中影响的信号转导通路示意图 2 FGF信号通路 癌细胞中硫酸酯酶2(SULF2)水平升高，可释放FGF等生长因子，这些因子与GPC-3的HS链结合，激活信号通路，调控细胞增殖和迁移，在HCC发病机制中发挥关键作用，80%以上的HCC病例存在FGF和/或FGFR的过表达。抑制GPC-3表达可增加HCC细胞中TGF-β2的产生，进而抑制细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导复制性衰老。GPC-3过表达还可通过SMAD通路阻碍BMP7活性，促进HCC细胞增殖、迁移，其高表达可作为HCC的新型肿瘤标志物。 3 Hedgehog(Hh)信号通路 Hh信号通路对胚胎发育至关重要，成年后异常激活与癌症发生相关，GPC-3是Hh信号通路的强效抑制剂。GPC-3基因功能缺失突变会导致Hh信号通路过度激活，引发SGBS疾病，GPC-3可直接(不依赖HS链)与Sonic-hedgehog和Indian-hedgehog结合，与Patched竞争结合hedgehog，抑制Hh信号。转化酶对GPC-3阻断Hh信号的能力至关重要，模拟或增强GPC-3阻断Hh信号能力的治疗(如重组GPC-3片段或GPC-3特异性单克隆抗体)可能抑制HCC中Hh驱动的肿瘤发生。 4 IGF信号通路 GPC-3通过N端结构域与IGF-II和IGF-1R相互作用，增强HCC细胞中IGF1R的磷酸化和激活，触发下游ERK级联反应，导致ERK磷酸化和c-Myc表达，促进肿瘤发生，通过与Grb10相互作用，抑制IGF-1R的泛素化和降解，延长其信号，促进肿瘤生长和存活。但Grb10上调可抑制GPC3介导的ERK激活，二者存在复杂相互作用。 图6 GPC-3调控的HCC信号转导途径示意图 5 其他信号通路 ◆ HGF/c-Met信号通路：GPC-3的HS侧链与HGF/c-Met信号通路相互作用，促进HCC细胞迁移，HS20(一种靶向HS的抗体)可有效抑制HCC处理细胞中c-Met的激活，进而抑制HGF介导的迁移和转移。 ◆ERK信号通路：GPC-3上调与E-钙粘蛋白表达呈负相关，可通过激活ERK信号通路诱导上皮-间质转化(EMT)，但GPC-3无胞内信号传导结构域，其在细胞膜上的作用可能与细胞间或细胞与ECM相互作用相关。 ◆YAP信号通路：GPC-3是YAP的靶基因，两者表达呈正相关，下调GPC-3会降低YAP信号，靶向GPC-3的HN3抗体可阻断YAP信号，抑制HCC细胞增殖，YAP在M2巨噬细胞的募集中起作用，GPC-3、YAP和M2巨噬细胞之间可能存在交叉对话。 图7 Glypican-3导致肝细胞癌的不同信号通路 表5 GPC-3对HCC关键信号通路的影响 6 GPC-3调控的肿瘤发生机制 ◆肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的募集：GPC-3过表达通过结合CCL5和CCL3增强HCC组织中TAM募集，TAMs促进侵袭和转移，靶向GPC-3的抗体可减少M2极化TAMs的募集。 ◆葡萄糖代谢：GPC-3通过上调HIF-1α介导的糖酵解酶激活，同时下调PGC-1α介导的线粒体氧化磷酸化，调控Warburg效应，增强葡萄糖摄取和乳酸生成，促进肝癌发生和转移，还与MCT4和GLUT4相互作用帮助癌细胞在缺氧条件下存活。 ◆上皮-间质转化(EMT)：通过ERK信号通路与EMT过程和转移密切相关，GPC-3和Snail作为E-钙粘蛋白的负调节因子，沉默GPC-3可下调Snail和Slug，增加E-钙粘蛋白水平，β-连环蛋白和Wnt信号相关蛋白也参与EMT过程，受GPC-3调控。 ◆调节肿瘤微环境：在晚期胃癌的癌症相关成纤维细胞(CAFs)亚群中上调，与胃癌患者预后不良相关，CAFs分泌的GPC3促进胃癌细胞中免疫检查点基因的表达。 ◆ CXCL12/CXCR4轴：GPC-3通过抑制CD26间接调节该通路，CD26可降解CXCL12，CXCR4与CXCL12结合促进HCC的细胞迁移、血管生成、肿瘤生长和转移，且CXCR4通过与TGF-β2和基质金属蛋白酶相互作用增强癌细胞迁移。 ◆Bax/Bcl-2通路：GPC-3通过破坏该通路增强对凋亡的抵抗，沉默GPC-3可上调Bax/Bcl-2比率，导致细胞死亡。 ◆与SULF-2的相互作用：SULF-2通过上调FGF信号和GPC-3表达，及激活PI3K/Akt信号通路产生致癌作用，GPC-3可能通过增加Bcl-2表达增强其作用，SULF-2通过对GPC-3的HS侧链的6-O-脱硫酶活性释放生长因子，激活相关信号通路。 图8 GPC3参与癌症发展的示意图 表6 Glypican3对HCC肿瘤发生机制的影响 靶向GPC-3的HCC新治疗策略 1 GPC-3作为HCC早期检测的诊断生物标志物 ◆单独作为标志物：传统标志物甲胎蛋白(AFP)为HCC筛查标志物，存在非恶性/遗传性疾病中升高、灵敏度低等局限。而免疫组织化学和基于血清的研究证实，在包括小肿瘤或早期肿瘤在内的大多数HCC病例中可检测到GPC3，GPC-3在AFP阴性HCC患者中表达率达90%。且GPC3的表达与不良预后、侵袭性肿瘤特征以及根治性治疗后较短的无病生存期相关。GPC3在恶性转化早期表达且在非恶性肝脏中低表达的特点，使其成为早期检测策略和风险分层的理想候选标志物。 ◆联合其他标志物：GPC-3作为HCC生物标志物具高特异性，与其他标志物联合使用时，综合灵敏度69%、特异性93%。 ◆分子成像应用：GPC-3可作为分子靶点用于PET、MRI和近红外成像等，如PET成像中，使用结合89Zr放射性核素的GPC3靶向抗体，能有效显示HCC细胞，同时降低健康肝组织信号。 2 GPC3的治疗相关进展 基于GPC3在肿瘤细胞表面的可及性，已开发多种靶向治疗方式，如单克隆抗体(如codrituzumab/GC33)、双特异性抗体、肽和DNA疫苗、免疫毒素以及嵌合抗原受体CAR-T细胞等，其中许多正处于临床前或临床测试阶段。值得注意的是，GPC3靶向CAR-T疗法在异种移植模型和早期试验中显示出有前景的抗肿瘤活性，但仍面临与毒性和肿瘤微环境相关的挑战，如免疫抑制性肿瘤微环境会损害T细胞浸润和持久性，还存在细胞因子释放综合征和靶点相关、非肿瘤毒性等严重免疫相关不良事件的风险。鉴于其限制性表达、生物学相关性和免疫原性，GPC3也成为分子成像和靶向放射性核素治疗的潜在靶点。 图9 目前的GPC-3靶向治疗方法 3 基于分子靶向的治疗 ◆微小RNA(miRNA)：已发现可选择性靶向GPC-3的miRNA，如miR-1271水平降低与HCC中GPC-3表达升高相关，miR-1271可通过GPC3依赖方式抑制HCC细胞增殖并诱导细胞死亡。 ◆长链非编码RNA(lncRNA)：lncRNA在癌症(尤其是HCC)中发挥重要作用，抑制HOXA簇反义RNA2(HOXA-AS2)可降低GPC-3表达，诱导G1期细胞周期阻滞，抑制HCC细胞增殖、刺激凋亡并阻止迁移和侵袭。 4 GPC-3单克隆抗体 ◆靶向GPC-3的C端区域(510-560位残基)：该区域物种间序列一致性低，在小鼠中免疫原性高，包括G12、GC33、YP7等特征明确的抗体，这些抗体对HCC诊断特异性高，且GC33和YP7还用于CAR-T细胞、抗体-药物偶联物(ADCs)和双特异性T细胞疗法。 ◆靶向GPC-3蛋白的N端结构域：以HN3为代表，能有效抑制Wnt信号通路，可用于研究Wnt与GPC-3的相互作用。 4 GPC-3双特异性抗体 抗GPC3/CD3双特异性抗体对GPC-3和T淋巴细胞上的CD3具有高亲和力，可激活T细胞并诱导其对HCC细胞产生细胞毒性，CD3抗体的单链可变片段(ScFv)能特异性结合CD3分子，诱导淋巴细胞释放穿孔素和颗粒酶等炎性和细胞毒性介质，导致癌细胞凋亡。目前已通过工程改造双特异性抗体，延长其体内半衰期，减少细胞因子过度释放等不良反应，但在疗效优化和副作用控制方面仍需进一步研究。 5 GPC-3特异性嵌合抗原受体免疫细胞 ◆GPC-3在CAR-T细胞治疗中的应用：GPC-3因表达稳定、靶向特异性高且脱靶效应小，成为CAR-T细胞治疗的理想候选靶点，多项研究已开发出GPC-3特异性CAR-T疗法，CAR-T细胞与GPC-3结合后激活TCR信号，驱动T细胞增殖和细胞毒性，还可通过颗粒胞吐诱导肿瘤细胞凋亡。 ◆临床研究与疗效：Zhang等人开展的I期剂量递增临床试验评估了靶向GPC3抗原的自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法C-CAR031治疗晚期HCC患者的安全性和初步疗效，24例接受标准淋巴细胞清除后单次静脉输注C-CAR031的晚期、经多线治疗的HCC患者，治疗安全性可控，90.9%的患者肿瘤缩小(包括肝内和肝外病灶)，总客观缓解率为50%(最高剂量组达57.1%)，中位无进展生存期为4.27个月。 ◆CAR-NK细胞相关研究：靶向GPC-3的CAR-NK细胞可增强对HCC细胞的细胞毒性，且安全性和有效性已得到证实，研究人员从外周血细胞和NK-92细胞系等多种来源获取NK细胞，构建表达CAR的细胞系，如Yu等人利用hu9f2抗体制备的CAR-NK细胞系，在体内外对表达GPC-3的HCC细胞均表现出强效抗肿瘤活性。 6 GPC-3疫苗 ◆肽疫苗概述：肽疫苗是HCC免疫治疗的重要策略，GPC3肽疫苗可激活CD8+T淋巴细胞，诱导表达GPC-3的癌细胞凋亡，激活的CD8+T细胞通过释放细胞毒性分子发挥抗肿瘤作用，其产生的IFN-γ还能增强肿瘤微环境中M1巨噬细胞的极化，强化免疫应答；肽疫苗还可激活树突状细胞(DCs)和自然杀伤细胞(NK细胞)，进一步增强免疫应答并监测肿瘤。 ◆临床研究与疗效：I期试验表明GPC-3疫苗耐受性良好，可诱导晚期HCC患者特异性T细胞增殖和功能激活；II期试验显示，HCC患者术后或射频消融(RFA)后接种疫苗，复发率显著低于未接种疫苗的患者，但在晚期HCC整体疗效提升方面仍需更多研究。 7 与免疫检查点抑制剂联合治疗 抗GPC-3抗体与抗PD-1/PD-L1或CTLA-4等免疫检查点抑制剂联合使用，可提升HCC治疗的抗癌效果；I期临床试验中，抗GPC-3抗体与阿替利珠单抗或纳武利尤单抗等检查点抑制剂联合使用，在晚期或复发性HCC患者中显示出良好前景，但目前对GPC-3的生物学功能、个体发生和调控机制仍有诸多未知，需进一步研究以完善基于GPC3的免疫疗法。 表7 治疗方法结果概述 靶向治疗与免疫治疗联合传统疗法成为研究热点，其中免疫毒素(ITs)因兼具抗体的靶向性和毒素的细胞毒性，被视为潜在突破方向。 图10 GPC3结构、抗GPC3抗体及免疫毒素(ITs)在HCC中的作用机制图 表8 GPC3靶向免疫毒素 表9 靶向GPC3治疗HCC的IT的临床前和临床研究总结 8 研究局限性 ◆对GPC-3在复杂信号网络中的相互作用理解尚不完整。 ◆HCC的异质性使肿瘤微环境差异大，可能影响GPC-3的表达和功能，导致细胞系和动物模型的研究结果难以完全转化到临床。 ◆GPC-3靶向免疫疗法的应答率和总体有效性有待优化，耐药性和脱靶效应问题需解决。 ◆sGPC-3在HCC进展中的作用及其对治疗的影响尚未完全明确，其双重性质增加了治疗干预设计的难度。 9 当前和未来展望 ◆GPC-3作为癌胚抗原，在HCC的诊断、治疗和预后方面有潜力，其分泌形式也可作为相关靶点。 ◆未来需深入研究血清GPC-3的生物化学特性，开发促进特定磷脂酶激活以切割细胞表面GPC-3的分子。 ◆GPC-3水平检测有助于与良性病变和肝转移瘤鉴别，其特异性成像方式可辅助评估肿瘤反应。 ◆单独的抗GPC-3治疗不足以解决HCC，需探索与抗癌药物和免疫治疗剂联合使用的策略，并研究如何调节GPC-3表达以避免耐药克隆的出现。 参考文献 Filippi L, Frantellizzi V, Urso L, De Vincentis G, Urbano N. Targeting Glypican-3 in Liver Cancer: Groundbreaking Preclinical and Clinical Insights. Biomedicines. 2025 Jun 26;13(7):1570. Piao Q, Bian X, Zhao Q, Sun L. Unraveling Glypican-3: From Structural to Pathophysiological Roles and Mechanisms-An Integrative Perspective. Cells. 2025 May 15;14(10):726. Rismani E, Hossein-Khannazer N, Hassan M, Shams E, Najimi M, Vosough M. Targeting glypican 3 by immunotoxins: the promise of immunotherapy in hepatocellular carcinoma. Expert Opin Ther Targets. 2025 Jan-Feb;29(1-2):59-73.  Tehrani HA, Zangi M, Fathi M, Vakili K, Hassan M, Rismani E, Hossein-Khannazer N, Vosough M. GPC-3 in hepatocellular carcinoma; A novel biomarker and molecular target. Exp Cell Res. 2025 Jan 15;444(2):114391.  Devan AR, Nair B, Pradeep GK, Alexander R, Vinod BS, Nath LR, Calina D, Sharifi-Rad J. The role of glypican-3 in hepatocellular carcinoma: Insights into diagnosis and therapeutic potential. Eur J Med Res. 2024 Oct 5;29(1):490.  Couzinet A, Suzuki T, Nakatsura T. Progress and challenges in glypican-3 targeting for hepatocellular carcinoma therapy. Expert Opin Ther Targets. 2024 Oct;28(10):895-909. 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Glypican-3在肝细胞癌中的作用 1 肝癌的治疗现状 ◆疾病地位与趋势：肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，占病例的75%-85%，2020年全球癌症统计显示其为第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，高死亡率部分源于晚期诊断和缺乏有效系统疗法。 ◆发病与预后特点：HCC多发生于晚期慢性肝病背景下，早期通常无症状，5年生存率早期超70%，晚期不足20%；手术切除是推荐疗法之一，但仅10%-20%的初诊原发性HCC患者适合切除。 ◆ 风险因素：包括乙肝(HBV)、丙肝(HCV)感染、酒精消费、铜/铁过载、原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等。 ◆现有治疗局限：晚期HCC治疗手段如射频消融(RFA)、经动脉化疗栓塞(TACE)等，因药物耐药性和高复发率(源于肝内转移、新生癌变等机制)，难以改善患者生存期，且预后极差。抗体或T细胞导向免疫疗法需稳定肿瘤特异性靶点，此为主要障碍。因此迫切需要更可靠、无创的HCC识别和监测策略。 表1 HCC中GPC3过表达的证据 2 GPC-3的基本概述 ◆GPC-3的价值：Glypican-3(GPC3)是一种细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在包括HCC在内的多种肿瘤中过表达，在正常器官中缺失，约70%-80%的HCC患者GPC-3表达升高，且与不良预后相关，但在正常成人肝脏和良性肝脏病变中几乎不存在。其肿瘤限制性分布以及在Wnt/β-连环蛋白、Hedgehog和成纤维细胞生长因子信号等关键致癌通路中的功能作用，使其有望成为HCC早期检测的特异性生物标志物和精准治疗的潜在靶点。 ◆ Glypican(GPC)家族：属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)，目前已发现6个哺乳动物成员(GPC1至GPC6)，果蝇中还有两个额外成员Dally和Dally-like蛋白(DLP)。家族成员在肽链结构上有保守特征，约60-70kDa的蛋白质，N端有分泌信号肽，C端疏水区域可添加糖基磷脂酰肌醇(GPI)以锚定在细胞表面，C端还会发生硫酸乙酰肝素(HS)链修饰，且14个半胱氨酸残基位置保守，推测三维结构相似。 ◆GPC3的结构：GPC-3是由X染色体Xq26上的GPC-3/OCI-5基因编码，分子量为70kDa的前体单链核心蛋白，含580个氨基酸。经弗林蛋白酶在特定位点(Arg358-Cys359)切割，形成40kDa的N端亚基和30kDa的C端亚基，两个亚基通过二硫键连接，其中C端蛋白带有两条硫酸乙酰肝素(HS)糖链。GPC-3基因功能缺失突变会导致Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)，这是一种罕见的过度生长疾病，常伴随面部异常。 图1 GPC3剪接亚型和GPC3结构示意图 图2 GPC3的突变形式示意图 ◆GPC3的分布 ①胚胎发育：胚胎发育阶段，GPC-3在多种组织中以阶段和组织特异性方式表达，参与形态发生过程，其功能缺失突变与SGBS密切相关。 ②成人组织：成年健康组织中GPC-3几乎不表达，但在HCC、黑色素瘤、卵巢癌、肺腺癌和胚胎性肿瘤等多种肿瘤中高表达，提示其可作为癌症早期检测的潜在生物标志物。 图3 GPC3 mRNA在不同肿瘤组织和正常组织中的表达水平 表2 肿瘤组织与正常组织中的GPC3蛋白水平 ◆GPC3的生物学功能 图4 GPC3生理功能机制示意图 表3 GPC3在HCC中的生物学作用及其作用机制 ◆可溶性的GPC3：除了GPI介导的膜结合形式，还有可溶性GPC3，与膜结合的GPC-3竞争结合Wnt和其他生长因子，起显性负性作用。在体外培养细胞的培养基和HCC患者血清中可检测到。 3 HCC中GPC-3表达的表观遗传调控 ◆DNA甲基化：DNA甲基化和组蛋白变化是HCC中基因表达失调的主要表观遗传机制，GPC-3启动子在正常肝组织中通常呈高甲基化状态，基因表达受抑；而在HCC中，该区域呈低甲基化，导致GPC-3异常重新激活表达，进而促进肿瘤发生，这种甲基化状态的转变是多种癌症中癌基因激活的典型特征。 ◆长链非编码RNA(lncRNA) ①lncRNA-AF085935：以反义方向转录，对应GPC-3基因体区域，在HCC组织中显著上调，且与GPC-3-mRNA共表达，其在HCC患者血清中的表达水平高于健康对照，可作为HCC筛查的无创生物标志物。 ②GPC3-AS1：通过与GPC-3基因体区域的PCAF物理相互作用，促进常染色质组蛋白标记的沉积，形成开放染色质状态，从而触发GPC-3的转录，调控GPC-3表达。 ◆调控意义：表观遗传机制是HCC中GPC-3调控的重要因素，不仅为HCC的早期诊断和预后提供了潜在标志物，也为靶向GPC-3表观遗传调控因子的治疗开辟了新途径，但目前对这些调控系统的治疗利用仍需进一步研究。 表4 GPC-3在HCC中的结构见解和翻译后修饰 GPC-3与肝癌发生信号通路 1 Wnt信号通路 Wnt信号通路激活是HCC发生的关键分子事件，约95%的HCC病例存在Wnt/β-连环蛋白失调。GPC-3通过增加受体位点的Wnt浓度，促进自分泌/旁分泌经典Wnt信号，其核心蛋白和HS链均参与Wnt信号，膜结合的GPC-3才能激活Wnt信号，sGPC-3抑制Wnt介导的HCC细胞增殖。此外，GPC-3还作为Wnt信号的共受体，与Frizzled(FZD)受体相互作用触发下游信号，加剧通路失调。GPC-3在HCC中的高表达使其不仅是生物标志物，也是潜在治疗靶点。 图5 GPC3在HCC中影响的信号转导通路示意图 2 FGF信号通路 癌细胞中硫酸酯酶2(SULF2)水平升高，可释放FGF等生长因子，这些因子与GPC-3的HS链结合，激活信号通路，调控细胞增殖和迁移，在HCC发病机制中发挥关键作用，80%以上的HCC病例存在FGF和/或FGFR的过表达。抑制GPC-3表达可增加HCC细胞中TGF-β2的产生，进而抑制细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导复制性衰老。GPC-3过表达还可通过SMAD通路阻碍BMP7活性，促进HCC细胞增殖、迁移，其高表达可作为HCC的新型肿瘤标志物。 3 Hedgehog(Hh)信号通路 Hh信号通路对胚胎发育至关重要，成年后异常激活与癌症发生相关，GPC-3是Hh信号通路的强效抑制剂。GPC-3基因功能缺失突变会导致Hh信号通路过度激活，引发SGBS疾病，GPC-3可直接(不依赖HS链)与Sonic-hedgehog和Indian-hedgehog结合，与Patched竞争结合hedgehog，抑制Hh信号。转化酶对GPC-3阻断Hh信号的能力至关重要，模拟或增强GPC-3阻断Hh信号能力的治疗(如重组GPC-3片段或GPC-3特异性单克隆抗体)可能抑制HCC中Hh驱动的肿瘤发生。 4 IGF信号通路 GPC-3通过N端结构域与IGF-II和IGF-1R相互作用，增强HCC细胞中IGF1R的磷酸化和激活，触发下游ERK级联反应，导致ERK磷酸化和c-Myc表达，促进肿瘤发生，通过与Grb10相互作用，抑制IGF-1R的泛素化和降解，延长其信号，促进肿瘤生长和存活。但Grb10上调可抑制GPC3介导的ERK激活，二者存在复杂相互作用。 图6 GPC-3调控的HCC信号转导途径示意图 5 其他信号通路 ◆ HGF/c-Met信号通路：GPC-3的HS侧链与HGF/c-Met信号通路相互作用，促进HCC细胞迁移，HS20(一种靶向HS的抗体)可有效抑制HCC处理细胞中c-Met的激活，进而抑制HGF介导的迁移和转移。 ◆ERK信号通路：GPC-3上调与E-钙粘蛋白表达呈负相关，可通过激活ERK信号通路诱导上皮-间质转化(EMT)，但GPC-3无胞内信号传导结构域，其在细胞膜上的作用可能与细胞间或细胞与ECM相互作用相关。 ◆YAP信号通路：GPC-3是YAP的靶基因，两者表达呈正相关，下调GPC-3会降低YAP信号，靶向GPC-3的HN3抗体可阻断YAP信号，抑制HCC细胞增殖，YAP在M2巨噬细胞的募集中起作用，GPC-3、YAP和M2巨噬细胞之间可能存在交叉对话。 图7 Glypican-3导致肝细胞癌的不同信号通路 表5 GPC-3对HCC关键信号通路的影响 6 GPC-3调控的肿瘤发生机制 ◆肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的募集：GPC-3过表达通过结合CCL5和CCL3增强HCC组织中TAM募集，TAMs促进侵袭和转移，靶向GPC-3的抗体可减少M2极化TAMs的募集。 ◆葡萄糖代谢：GPC-3通过上调HIF-1α介导的糖酵解酶激活，同时下调PGC-1α介导的线粒体氧化磷酸化，调控Warburg效应，增强葡萄糖摄取和乳酸生成，促进肝癌发生和转移，还与MCT4和GLUT4相互作用帮助癌细胞在缺氧条件下存活。 ◆上皮-间质转化(EMT)：通过ERK信号通路与EMT过程和转移密切相关，GPC-3和Snail作为E-钙粘蛋白的负调节因子，沉默GPC-3可下调Snail和Slug，增加E-钙粘蛋白水平，β-连环蛋白和Wnt信号相关蛋白也参与EMT过程，受GPC-3调控。 ◆调节肿瘤微环境：在晚期胃癌的癌症相关成纤维细胞(CAFs)亚群中上调，与胃癌患者预后不良相关，CAFs分泌的GPC3促进胃癌细胞中免疫检查点基因的表达。 ◆ CXCL12/CXCR4轴：GPC-3通过抑制CD26间接调节该通路，CD26可降解CXCL12，CXCR4与CXCL12结合促进HCC的细胞迁移、血管生成、肿瘤生长和转移，且CXCR4通过与TGF-β2和基质金属蛋白酶相互作用增强癌细胞迁移。 ◆Bax/Bcl-2通路：GPC-3通过破坏该通路增强对凋亡的抵抗，沉默GPC-3可上调Bax/Bcl-2比率，导致细胞死亡。 ◆与SULF-2的相互作用：SULF-2通过上调FGF信号和GPC-3表达，及激活PI3K/Akt信号通路产生致癌作用，GPC-3可能通过增加Bcl-2表达增强其作用，SULF-2通过对GPC-3的HS侧链的6-O-脱硫酶活性释放生长因子，激活相关信号通路。 图8 GPC3参与癌症发展的示意图 表6 Glypican3对HCC肿瘤发生机制的影响 靶向GPC-3的HCC新治疗策略 1 GPC-3作为HCC早期检测的诊断生物标志物 ◆单独作为标志物：传统标志物甲胎蛋白(AFP)为HCC筛查标志物，存在非恶性/遗传性疾病中升高、灵敏度低等局限。而免疫组织化学和基于血清的研究证实，在包括小肿瘤或早期肿瘤在内的大多数HCC病例中可检测到GPC3，GPC-3在AFP阴性HCC患者中表达率达90%。且GPC3的表达与不良预后、侵袭性肿瘤特征以及根治性治疗后较短的无病生存期相关。GPC3在恶性转化早期表达且在非恶性肝脏中低表达的特点，使其成为早期检测策略和风险分层的理想候选标志物。 ◆联合其他标志物：GPC-3作为HCC生物标志物具高特异性，与其他标志物联合使用时，综合灵敏度69%、特异性93%。 ◆分子成像应用：GPC-3可作为分子靶点用于PET、MRI和近红外成像等，如PET成像中，使用结合89Zr放射性核素的GPC3靶向抗体，能有效显示HCC细胞，同时降低健康肝组织信号。 2 GPC3的治疗相关进展 基于GPC3在肿瘤细胞表面的可及性，已开发多种靶向治疗方式，如单克隆抗体(如codrituzumab/GC33)、双特异性抗体、肽和DNA疫苗、免疫毒素以及嵌合抗原受体CAR-T细胞等，其中许多正处于临床前或临床测试阶段。值得注意的是，GPC3靶向CAR-T疗法在异种移植模型和早期试验中显示出有前景的抗肿瘤活性，但仍面临与毒性和肿瘤微环境相关的挑战，如免疫抑制性肿瘤微环境会损害T细胞浸润和持久性，还存在细胞因子释放综合征和靶点相关、非肿瘤毒性等严重免疫相关不良事件的风险。鉴于其限制性表达、生物学相关性和免疫原性，GPC3也成为分子成像和靶向放射性核素治疗的潜在靶点。 图9 目前的GPC-3靶向治疗方法 3 基于分子靶向的治疗 ◆微小RNA(miRNA)：已发现可选择性靶向GPC-3的miRNA，如miR-1271水平降低与HCC中GPC-3表达升高相关，miR-1271可通过GPC3依赖方式抑制HCC细胞增殖并诱导细胞死亡。 ◆长链非编码RNA(lncRNA)：lncRNA在癌症(尤其是HCC)中发挥重要作用，抑制HOXA簇反义RNA2(HOXA-AS2)可降低GPC-3表达，诱导G1期细胞周期阻滞，抑制HCC细胞增殖、刺激凋亡并阻止迁移和侵袭。 4 GPC-3单克隆抗体 ◆靶向GPC-3的C端区域(510-560位残基)：该区域物种间序列一致性低，在小鼠中免疫原性高，包括G12、GC33、YP7等特征明确的抗体，这些抗体对HCC诊断特异性高，且GC33和YP7还用于CAR-T细胞、抗体-药物偶联物(ADCs)和双特异性T细胞疗法。 ◆靶向GPC-3蛋白的N端结构域：以HN3为代表，能有效抑制Wnt信号通路，可用于研究Wnt与GPC-3的相互作用。 4 GPC-3双特异性抗体 抗GPC3/CD3双特异性抗体对GPC-3和T淋巴细胞上的CD3具有高亲和力，可激活T细胞并诱导其对HCC细胞产生细胞毒性，CD3抗体的单链可变片段(ScFv)能特异性结合CD3分子，诱导淋巴细胞释放穿孔素和颗粒酶等炎性和细胞毒性介质，导致癌细胞凋亡。目前已通过工程改造双特异性抗体，延长其体内半衰期，减少细胞因子过度释放等不良反应，但在疗效优化和副作用控制方面仍需进一步研究。 5 GPC-3特异性嵌合抗原受体免疫细胞 ◆GPC-3在CAR-T细胞治疗中的应用：GPC-3因表达稳定、靶向特异性高且脱靶效应小，成为CAR-T细胞治疗的理想候选靶点，多项研究已开发出GPC-3特异性CAR-T疗法，CAR-T细胞与GPC-3结合后激活TCR信号，驱动T细胞增殖和细胞毒性，还可通过颗粒胞吐诱导肿瘤细胞凋亡。 ◆临床研究与疗效：Zhang等人开展的I期剂量递增临床试验评估了靶向GPC3抗原的自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法C-CAR031治疗晚期HCC患者的安全性和初步疗效，24例接受标准淋巴细胞清除后单次静脉输注C-CAR031的晚期、经多线治疗的HCC患者，治疗安全性可控，90.9%的患者肿瘤缩小(包括肝内和肝外病灶)，总客观缓解率为50%(最高剂量组达57.1%)，中位无进展生存期为4.27个月。 ◆CAR-NK细胞相关研究：靶向GPC-3的CAR-NK细胞可增强对HCC细胞的细胞毒性，且安全性和有效性已得到证实，研究人员从外周血细胞和NK-92细胞系等多种来源获取NK细胞，构建表达CAR的细胞系，如Yu等人利用hu9f2抗体制备的CAR-NK细胞系，在体内外对表达GPC-3的HCC细胞均表现出强效抗肿瘤活性。 6 GPC-3疫苗 ◆肽疫苗概述：肽疫苗是HCC免疫治疗的重要策略，GPC3肽疫苗可激活CD8+T淋巴细胞，诱导表达GPC-3的癌细胞凋亡，激活的CD8+T细胞通过释放细胞毒性分子发挥抗肿瘤作用，其产生的IFN-γ还能增强肿瘤微环境中M1巨噬细胞的极化，强化免疫应答；肽疫苗还可激活树突状细胞(DCs)和自然杀伤细胞(NK细胞)，进一步增强免疫应答并监测肿瘤。 ◆临床研究与疗效：I期试验表明GPC-3疫苗耐受性良好，可诱导晚期HCC患者特异性T细胞增殖和功能激活；II期试验显示，HCC患者术后或射频消融(RFA)后接种疫苗，复发率显著低于未接种疫苗的患者，但在晚期HCC整体疗效提升方面仍需更多研究。 7 与免疫检查点抑制剂联合治疗 抗GPC-3抗体与抗PD-1/PD-L1或CTLA-4等免疫检查点抑制剂联合使用，可提升HCC治疗的抗癌效果；I期临床试验中，抗GPC-3抗体与阿替利珠单抗或纳武利尤单抗等检查点抑制剂联合使用，在晚期或复发性HCC患者中显示出良好前景，但目前对GPC-3的生物学功能、个体发生和调控机制仍有诸多未知，需进一步研究以完善基于GPC3的免疫疗法。 表7 治疗方法结果概述 靶向治疗与免疫治疗联合传统疗法成为研究热点，其中免疫毒素(ITs)因兼具抗体的靶向性和毒素的细胞毒性，被视为潜在突破方向。 图10 GPC3结构、抗GPC3抗体及免疫毒素(ITs)在HCC中的作用机制图 表8 GPC3靶向免疫毒素 表9 靶向GPC3治疗HCC的IT的临床前和临床研究总结 8 研究局限性 ◆对GPC-3在复杂信号网络中的相互作用理解尚不完整。 ◆HCC的异质性使肿瘤微环境差异大，可能影响GPC-3的表达和功能，导致细胞系和动物模型的研究结果难以完全转化到临床。 ◆GPC-3靶向免疫疗法的应答率和总体有效性有待优化，耐药性和脱靶效应问题需解决。 ◆sGPC-3在HCC进展中的作用及其对治疗的影响尚未完全明确，其双重性质增加了治疗干预设计的难度。 9 当前和未来展望 ◆GPC-3作为癌胚抗原，在HCC的诊断、治疗和预后方面有潜力，其分泌形式也可作为相关靶点。 ◆未来需深入研究血清GPC-3的生物化学特性，开发促进特定磷脂酶激活以切割细胞表面GPC-3的分子。 ◆GPC-3水平检测有助于与良性病变和肝转移瘤鉴别，其特异性成像方式可辅助评估肿瘤反应。 ◆单独的抗GPC-3治疗不足以解决HCC，需探索与抗癌药物和免疫治疗剂联合使用的策略，并研究如何调节GPC-3表达以避免耐药克隆的出现。 抗体发现服务 & 产品 01 羊驼免疫&骆驼免疫—自建现代化养殖农场 02 万亿级天然抗体库产品—轻松DIY科研抗体 关于仁域生物 成都仁域生物成立于2019年1月，是一家专注基因工程抗体技术和天然抗体库开发的公司，拥有优化的噬菌体展示抗体库技术和现代化的骆驼/羊驼养殖免疫基地。 公司主营业务： ◆ 全人源/纳米抗体定制；◆ 噬菌体展示抗体库定制； ◆ 多肽/多肽库定制；◆ 羊驼/骆驼免疫服务； ◆ 文库相关产品经销商。 protocol 获取 / 产品咨询 邮箱｜find@renyubio.com 电话｜19136178673 地址｜成都市经开区科技产业孵化园 关注我们，小编将持续更新相关内容～ 参考文献 Filippi L, Frantellizzi V, Urso L, De Vincentis G, Urbano N. 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