BLM

编辑丨王多鱼 排版丨水成文 利用合成致死（Synthetic Lethality）特异性杀伤肿瘤细胞，是近年来肿瘤临床治疗的一项重要尝试。特别是靶向 BRCA1/BRCA2 突变的 PARP 抑制剂（PARPi），自问世以来便展现出显著的临床疗效，为基于合成致死原理的靶向药物开发提供了积极的实践验证。 然而，PARPi 的应用有其局限性，即便在 BRCA1/2 突变的肿瘤细胞中，也并非所有病例均能对其产生敏感应答。究其原因，除了耐药机制的存在，还在于 BRCA1/2 所参与的生物学过程比以前学术界所知的更为复杂。近年来，BRCA1/2 被发现在复制叉稳定性维持中发挥关键作用，然而细胞进行复制叉稳定性维持的分子机制还未得到清晰揭示。 2025年1月14日18时，浙江大学刘婷教授团队、方东教授团队及黄俊教授团队（博士生谢海华、宋礼志为共同第一作者）合作，在 Nature 子刊 Nature Chemical Biology 上发表了题为：Synergistic protection of nascent DNA at stalled forks by MSANTD4 and BRCA1/2-RAD51 的研究论文。该研究揭示了一条与 BRCA1/2 合成致死的新通路。 在这项最新研究中，研究团队发现了一个具有与端粒结合蛋白 TRF1/TRF2 类似的 Myb/SANT-like DNA 结合结构域的新蛋白——MSANTD4（Myb/SANT-like DNA-binding domain-containing protein 4），能结合于停滞复制叉翻转臂的 3'-ssDNA 末端，特异性阻碍 RPA-WRN/BLM-DNA2 复合物对翻转臂上新生 DNA 的过度切割，从而维持停滞复制叉的稳定性。该通路完全独立于传统已知的由 BRCA1/2-RAD51 介导的停滞复制叉保护机制，因此与 BRCA1/2 合成致死。 该研究首次报道了 MSANTD4 在复制叉稳定性维持中的功能及分子机制，为深入理解复制叉稳定性维持的分子机制以及肿瘤治疗提供了全新视角。 在高等真核生物中，复制叉翻转（Fork reversal） 是细胞应对复制压力的一种进化上高度保守的机制。在此过程中，“三叉”结构的复制叉在转位酶（例如 SMARCAL1、ZRANB3、HLTF 和 PICH），以及 DNA 拓扑异构酶 TOP2A 和 SUMO E3 连接酶 ZATT 等因子的协作下，被重塑为更稳定的“四叉”结构，从而维持复制叉的动态平衡。然而，复制叉翻转臂末端由于其结构类似于单一末端的 DNA 双链断裂（One-ended DSB），极易受到核酸酶攻击，从而引发新生DNA链的降解，导致基因组不稳定性。 已有研究表明，BRCA1/2 介导的 RAD51-DNA 核纤丝（RAD51 filament） 能够保护停滞复制叉的翻转臂，起到维持复制叉稳定性的作用。然而，现有证据显示，BRCA1/2-RAD51 轴并不能完全抵御多种核酸酶的攻击，这表明可能存在独立于 BRCA1/2-RAD51 的其它保护机制，有待进一步研究和揭示。 在解旋酶 WRN/BLM 等的协助下，核酸酶 DNA2 可修剪翻转复制叉的末端，产生带有  3'-单链DNA突出末端（3'-overhanged DNA）的结构。这一结构是复制压力缓解后，复制叉通过同源重组（Homologous recombination，HR）实现重启的关键。然而，若这一切割过程失控，将导致复制叉的降解，并显著增加基因组不稳定性的风险。因此，如何精确调控这些复合物的活性，成为实现停滞复制叉精准调控和有效保护的关键科学问题。 研究团队发现，MSANTD4 蛋白在复制压力下能够被招募至停滞复制叉，并特异性结合 3'-overhanged DNA。该蛋白通过拮抗 BLM 或 WRN 对复制叉翻转臂双链 DNA 的解旋活性，有效阻止了 DNA2 对新生 DNA 的降解。与这一作用一致，MSANTD4 的缺失会导致细胞内新生 DNA 降解显著增加，同时提升细胞对复制压力的敏感性。此外，由于 MSANTD4 保护翻转复制叉末端的机制与传统的 BRCA1/2-RAD51 轴完全不同，研究者还发现，MSANTD4 的缺陷能够进一步加剧 BRCA 缺陷细胞中新生 DNA 的降解现象，并显著提高这些细胞对复制压力的敏感性，展现出“合成致死”的效应。 综上所述，该研究首次报道了 MSANTD4 在复制叉稳定性调控中的关键功能与作用机制；系统阐明了 MSANTD4 保护停滞复制叉新生 DNA 链的分子生物学过程；同时揭示了一种 MSANTD4 与 BRCA1/2-RAD51 协作的新型复制叉保护模式。该协同机制能够有效防止核酸酶对停滞复制叉翻转臂中新生 DNA 的过度降解，为 BRCA1/2 突变相关肿瘤的“合成致死”疗法开发提供了潜在的全新靶点。 论文链接： https://www.nature.com/articles/s41589-024-01833-9 设置星标，不错过精彩推文 开放转载 欢迎转发到朋友圈和微信群  微信加群  为促进前沿研究的传播和交流，我们组建了多个专业交流群，长按下方二维码，即可添加小编微信进群，由于申请人数较多，添加微信时请备注：学校/专业/姓名，如果是PI/教授，还请注明。 点在看，传递你的品味

“ 点击蓝字 关注我们 北京大学高宁课题组揭示真核DNA复制中冈崎片段引物去除过程的新分子机制 PPS  2024年11月22日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、核糖核酸北京研究中心高宁课题组在The EMBO Journal发表了题为Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2的研究论文，对含有PCNA的内源相关复合物进行结构研究，获得了两组PCNA复合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的结构，为理解冈崎片段成熟的后期步骤提供了一系列的结构快照。 真核生物DNA复制在复杂的染色质环境下进行，与多种分子生物学过程互相协调，例如DNA复制与修复的偶联以及DNA复制与新生核小体组装的偶联等。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作为DNA复制体不可缺少的辅助蛋白，在DNA复制中结合各种DNA聚合酶以赋予其持续合成的能力，也可以将多种因子募集到DNA复制、修复等DNA代谢事件发生的位点，并促进相应的生物学反应，是DNA代谢的中心枢纽之一。与PCNA相互作用的蛋白超过两百多种，包括DNA复制相关蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修复蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表观遗传因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及参与细胞周期调控、凋亡等过程的一些蛋白分子，它们都是通过自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like 基序结合PCNA。 真核生物PCNA是环绕双链DNA的同源三聚体，每个单体都包含一个PIP box结合位点，因此一个PCNA环可以至多结合三个含有PIP box的蛋白因子。领域内认为PCNA的协调功能是通过“工具带，toolbelt”的形式实现，即PCNA同时结合处于上下游过程的不同的酶，以提高DNA代谢相关事件的整体效率。一个具有代表性的例子是DNA复制过程中的滞后链冈崎片段的加工成熟，参与这一过程的所有具有催化活性的酶都与PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1。参与引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作为RNA核酸酶去除由Pol α与引物酶复合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滞后链上的新生DNA链的延伸之后，会进行链置换反应，继续向前合成将临近冈崎片段中的引物顶起，形成5'-flap DNA结构；FEN1作为结构特异性的DNA核酸内切酶结合并切割5'-flap DNA；通过这一系列步骤，保真度较差的DNA引物及RNA引物得以去除。领域前期通过体外重组的方式，已经获得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1复合物，对它们的结构和功能进行了表征，部分地验证了PCNA作为工具带的分子角色。然而很多重要的机制性的问题还未得到解答，例如PCNA如何特异性地选择并协调参与同一DNA代谢事件的不同蛋白因子；同时结合在PCNA上的蛋白因子之间是否进行相互的变构调节等。 课题组以PCNA作为诱饵蛋白，首先建立了一套从染色质中快速纯化PCNA内源复合物的方法，得到了一系列含有PCNA且参与DNA复制、核小体组装、DNA修复等过程的内源复合物。 结合冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了两套复合物PCNA-FEN1与PCNA-FEN1-RNaseH2不同状态的三维结构。其中PCNA-FEN1复合物中FEN1处于催化后状态，5'-flap DNA被切割但尚未离开FEN1的酶活中心，表明FEN1的5'-flap DNA产物释放在细胞内是限速步骤。 在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中，发现FEN1与RNaseH2分别结合PCNA的不同亚基，证实了PCNA工具带的功能。对不同状态的PCNA-FEN1-RNaseH2复合物进行结构分析，发现RNaseH2始终结合在FEN1催化位点上游固定的双链DNA区域，并且此区域不包含任何未去除的RNA残基，这表明同时结合PCNA的FEN1与RNaseH2存在一种未被认识到的功能上的耦合。因为5'-flap DNA是聚合酶Pol δ继续向前合成进行链置换的产物，其核苷酸序列与其上游双链DNA序列一致，所以在细胞中5'-flap DNA很可能侵入上游的双链DNA，产生3'-flap DNA，一旦3'-flap长度大于1 nt，FEN1将无法切割5'-flap DNA。然而，当RNaseH2结合在5'-flap DNA上游双链DNA时，由于空间位阻的存在，5'-flap DNA无法进行链入侵，大幅降低了5'-flap DNA转化形成3'-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通过维持DNA底物的特定构象以促进FEN1 5'-flap DNA的酶切效率。 此外，结构分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中RNaseH2蛋白通过RNaseH2A亚基结合PCNA，而不是之前报道的RNaseH2B PIP box结合PCNA，序列分析鉴定到RNaseH2A亚基中一个新的PIP box，通过体外生化实验验证了RNaseH2A及RNaseH2B亚基的PIP box都可以结合PCNA。结合免疫荧光电镜的成像实验，表明RNaseH2A PIP box与RNaseH2B PIP box在不同的生理学过程中发挥功能。 该研究表明PCNA在细胞内可以作为工具带同时结合多个蛋白因子。之前的模型认为同时结合PCNA的蛋白是按照顺序发挥功能，一个酶发挥完功能后与DNA解离，释放出DNA底物以供另一个酶结合；与之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物结构中，FEN1与RNaseH2稳定结合同一个DNA底物，RNaseH2可能通过对底物DNA的构象调控来促进FEN1的酶切效率。这表明细胞内同时结合PCNA的不同蛋白因子间可能会对它们酶促反应动力学进行互相调控。RNaseH2除了作为RNA核酸酶参与冈崎片段引物RNA的去除外，该研究发现了RNaseH2的另一个可能的新功能，即以不依赖于核酸酶活性的形式作为双链DNA结合蛋白来调节FEN1的5'-flap DNA酶切功能。 高宁教授为该论文的通讯作者。生命科学学院2020级博士研究生田宇辉为该论文第一作者。生命科学学院研究员李宁宁在实验方法探究及结构计算方面提供了帮助。生命科学学院李晴教授为该论文提供了支持与帮助。该研究得到了国家自然科学基金和昌平实验室的支持。北京大学冷冻电镜平台、昌平实验室冷冻电镜平台、北京大学高性能计算平台、生命科学学院仪器中心及国家蛋白质基础设施（北大分平台）对该项目提供了重要的技术支持。 参考文献: 1. Bellush, J. M. & Whitehouse, I. DNA replication through a chromatin environment.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci372(2017). 2. Li, N.et al.Parental histone transfer caught at the replication fork.Nature627, 890-897 (2024). 3. Slade, D. Maneuvers on PCNA Rings during DNA Replication and Repair.Genes9, 416 (2018). 4. Boehm, E. M., Gildenberg, M. S. & Washington, M. T. The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication.Enzymes39, 231-254 (2016). 5. Sun, H.et al.Okazaki fragment maturation: DNA flap dynamics for cell proliferation and survival.Trends in Cell Biology(2022). 6. Levikova, M. & Cejka, P. The Saccharomyces cerevisiae Dna2 can function as a sole nuclease in the processing of Okazaki fragments in DNA replication.Nucleic Acids Res43, 7888-7897 (2015). 7. Blair, K.et al.Mechanism of human Lig1 regulation by PCNA in Okazaki fragment sealing.Nat Commun13, 7833 (2022). 8. Lancey, C.et al.Structure of the processive human Pol δ holoenzyme.Nature Communications11(2020). 文章来源：北京大学生命科学学院 美编排版：朱玲欣 文章审核：周碧远 朱玲欣 罗琪 【免责声明】以上内容来源于互联网，不代表本平台立场或观点；如有侵犯作者著作权，请及时与我们联系（Tel：025-83271227，或直接在微信平台留言），我们将及时更正或删除。 《药学进展》杂志由国家教育部主管、中国药科大学和中国药学会共同主办，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.216，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 聚焦“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟

引言 DNA双链断裂（DSB）是细胞分裂过程中最严重的DNA损伤类型之一，如果不及时修复，会导致基因突变和癌症。同源重组（HR）是DSB修复的主要途径之一，HR依赖于同源染色体之间的序列匹配，以修复DSB【1】。HR的启动需要先对DSB末端进行DNA端重组，生成单链DNA模板，以便RAD51重组酶等蛋白组装并执行修复。BRCA1-BARD1复合体是重要的肿瘤抑制因子，在HR中发挥关键作用【2】。它参与多个HR阶段，包括DNA端重组，并已被证明与RAD51重组酶相互作用并增强其活性【3】。尽管BRCA1-BARD1在HR中至关重要，但其直接调节DNA端重组活性的机制尚不清楚。 近日，来自美国德克萨斯大学健康科学中心的Patrick Sung，Sandeep Burma研究团队和哥伦比亚大学的Eric C. Greene研究团队合作在Nature杂志上发表题为Promotion of DNA end resection by BRCA1-BARD1 in homologous recombination的研究论文，该研究发现BRCA1-BARD1通过增强关键重组酶的活性，以及与DNA端重组机器的协同作用，在DSB修复中发挥至关重要的作用。 首先研究人员利用体外酶促反应，将纯化的BRCA1-BARD1、BLM和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。结果发现BRCA1-BARD1显著增强BLM的解旋酶活性和DNA2的DNA端切割酶活性，并提高BLM-DNA2复合物的进程性和效率。接着通过亲和层析实验，研究人员验证BRCA1-BARD1与BLM和DNA2的相互作用。研究结果表明，BRCA1-BARD1与BLM和DNA2直接相互作用，这导致BLM-DNA2途径的DNA解旋和DNA端重组效率显著提高。BRCA1-BARD1的加入还促进了BLM-DNA2复合物的组装进程和效率，使其在DNA端重组过程中发挥更积极的作用。 与BRCA1-BARD1增强BLM-DNA2途径的实验类似，研究人员使用纯化的BRCA1-BARD1、WRN和DNA2与32P标记的DNA底物混合，并观察DNA解旋和DNA端重组的效率。通过亲和层析实验，验证BRCA1-BARD1与WRN的相互作用。结果发现BRCA1-BARD1显著增强WRN的解旋酶活性，并提高WRN-DNA2复合物的进程性和效率。与BLM-DNA2途径类似，BRCA1-BARD1的加入并没有改变WRN-DNA2复合物的组成，而是通过增强其活性来提高端重组的效率。 研究还发现，BRCA1-BARD1与EXO1直接相互作用，并显著增强EXO1的5’→3’外切酶活性。这意味着BRCA1-BARD1不仅作用于解旋酶和DNA切割酶，也作用于外切酶，进一步增强了DNA端重组的整体效率。机制解析发现BRCA1-BARD1通过与EXO1的特定结构域相互作用，提供辅助作用，促进DNA端的切割，并提高EXO1在DNA端重组过程中的稳定性和效率。例如，BRCA1-BARD1可能通过稳定EXO1的结构，或通过改变其活性位点的电荷状态，来增强其切割能力。 最后，研究发现，BRCA1和BLM1都含有独立的DNA结合模块，它们协同作用以增强DNA端重组的效率。此外，BARD1的DNA结合域对于BRCA1-BARD1促进DNA端重组的能力至关重要。这表明BRCA1-BARD1通过与DNA端的结合，更有效地引导和协调重组酶的活性。 同期在Nature杂志上，来自瑞士提契诺大学（USI）生物医学院的Petr Cejka研究团队发表题为Mechanism of BRCA1-BARD1 function in DNA end resection and DNA protection的研究论文，该研究也发现了BRCA1-BARD1在DNA端重组中的重要作用，并阐明了其保护DNA的功能。 总之，这两项工作都深入探讨了BRCA1-BARD1在DNA双链断裂修复中的关键作用，特别是它在同源重组过程中的DNA端重组阶段。这些研究不仅加深了我们对BRCA1-BARD1功能和癌症发生的理解，还可能为开发针对BRCA1-BARD1缺陷的癌症治疗方法提供新思路。 参考文献 1. Tarsounas, M. & Sung, P. The antitumorigenic roles of BRCA1-BARD1 in DNA repair and replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 284-299 (2020). 2. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W. & Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a016600 (2015). 3. Zhao, W. et al. BRCA1-BARD1 promotes RAD51-mediated homologous DNA pairing. Nature 550, 360-365 (2017). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07910-2 https://doi.org/10.1038/s41586-024-07909-9 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述