RNF4

研究背景由与E3泛素连接酶配体连接蛋白质靶向配体形成的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的靶向蛋白质降解已成为一种通过蛋白酶体介导的降解致病蛋白质的强大治疗方式。虽然有超过600个E3连接酶，但是大多数PROTAC只利用了Cullin-RING E3泛素连接酶的底物受体——cereblon和VHL。近年来，还发现了许多其他针对其他E3连接酶的募集蛋白，包括cIAP、MDM2、DCAF16、DCAF11、RNF114、RNF4、FEM1B、KEAP1和DCAF1。并不是所有的E3连接酶都对癌细胞活力至关重要，因此，癌细胞中可能会出现耐药机制，从而损害E3连接酶募集并使PROTAC无效。开发针对泛素-蛋白酶体机制核心成分的募集剂，例如针对对细胞活力至关重要的CUL1-CUL7 E3连接酶中的Cullin-RING E3连接酶复合接头蛋白（如DDB1、SKP1 或ELOB/ELOC）的募集剂，可以避免PROTAC可能产生的潜在未来耐药机制。加州大学伯克利分校Nomura课题组研究了CUL1-RING E3连接酶接头蛋白SKP1是否可以被募集用于PROTAC介导的新底物降解。研究内容该课题组在基于凝胶的基于活性的蛋白质分析（ABPP）中筛选了1284个半胱氨酸反应性共价配体，筛选了针对人SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物（图1）。该筛选产生的性能最良好的化合物是EN884（图2）。EN884显示了SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物中人SKP1蛋白的半胱氨酸反应性探针的剂量反应置换（图3）。   图1.半胱氨酸反应性共价配体库筛选结果（针对SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物）图2.EN884结构图3.EN884与半胱氨酸探针反应该课题组对与 EN884 一起孵育的SKP1-FBXO7-CUL1-RBX1复合物进行了串联质谱（MS/MS）分析，以确定修饰位点（图4），发现了一个被修饰的位点——SKP1上的C160（图5），该位点由于特定的F-Box结构域，表现出独特的构象。因此，该课题组假设EN884可能会利用SKP1和CUL1底物受体之间的集体界面并结合。图4.串联质谱分析图5.结合位点位置 接下来，该课题组合成了两个基于EN884的炔烃功能化探针SJH1-37-m、SJH1-37-p（图6）。基于凝胶的ABPP评估这些探针与SKP1复合物的结合，与对位相比，间位结合能力更佳（图7）。    图6.探针结构图7.探针结合能力值得注意的是，由于C160位置特殊，EN884和SJH1-37m不与单体SKP1结合（图8）。这表明，CUL1复合物的其余部分，或至少是底物受体，是配体与SKP1结合所必需的。图8.探针与单体SKP1结合       该课题组进一步证明，SJH1-37m通过SKP1的下拉在细胞中结合SKP1，而不是不相关的蛋白质，如GAPDH（图9）。   图9.SJH1-37m探针的SKP1下拉接下来，该课题组进行了基于质谱的ABPP，以使用先前建立的同位素脱硫生物素-ABPP（isoDTB-ABPP）鉴定HEK293T细胞中EN884参与SKP1的半胱氨酸。该课题组发现EN884在SKP1上与C160有7%的最小参与（图10）。这种最小参与与已应用在PROTAC（包括DCAF16、DCAF11和RNF114）中的其他共价E3连接酶募集剂观察到的最小参与一致。图10.HEK293T细胞中EN884的isoDTB-ABPP分析为了证明共价SKP1配体可用于PROTAC应用，该课题组合成了四种不同的PROTAC，通过C2、C4、C5或PEG3连接子将EN884的衍生物与BET家族抑制剂JQ1连接起来，分别生成SJH1-51A、SJH1-51B、SJH1-51C和SJH1-51D（图11）。所有四种PROTAC都降解了HEK293T细胞中BRD4的短亚型（图12），其中使用C4烷基接头的SJH1-51B观察到的降解最强。   图11.四种PROTAC结构图12.四种PROTAC降解效果并且，基于串联质量标记（TMT）的MDA-MB-231细胞中SJH1-51B的定量蛋白质组学分析显示BRD4中等选择性降解，其中16种蛋白质的水平显着降低>50%（图13）。   图13.SJH1-51B的定量蛋白质组学与蛋白酶体介导的降解一致，SJH1-51B介导的BRD4降解通过用蛋白酶体抑制剂硼替佐米预处理而减弱（图14）。它还显示出对活性Cullin RING E3连接酶所需的NEDD化的依赖性，NEDD化抑制剂MLN4924可减弱BRD4的降解（图15）。最重要的是，该课题组证明SKP1敲低完全减弱了SJH1-51B在HEK293T细胞中对BRD4的降解（图16）。图14.硼替佐米预处理结果图15.MLN4924预处理结果图16.SKP1敲低细胞结果BRD4是一种相对容易被PROTAC降解的蛋白质。因此，该课题组接下来测试了共价SKP1募集剂是否可用于降解另一种新底物蛋白——雄激素受体（AR）。该课题组合成了4种AR PROTAC，将共价SKP1募集剂与来自ARV-110的Arvinas AR PROTAC靶向配体连接起来，没有连接子或C4、C6或C7烷基连接子，分别产生SJH1-63、SJH1-62C、SJH1-62D和SJH1-62B（图17）。该课题组观察到所有4种PROTAC的AR降解，其中带有C7烷基接头的SJH1-62B在LNCaP前列腺癌细胞中显示出最有效和最强大的AR降解（图17）。 图17.四种AR PROTAC结构与降解效果该课题组进一步证明，SJH1-62B介导的AR降解在蛋白酶体抑制剂预处理后减弱（图18）。定量蛋白质组学分析还表明，AR与其他11种蛋白质的选择性降解在5000多种定量蛋白质中也显著降低（图19）。图18.SJH1-62B的硼替佐米预处理结果图19.SJH1-62B的定量蛋白质组学研究总结 该课题组发现了一种SKP1募集物，它共价靶向位于SKP1和CUL1 F-box底物受体界面的SKP1的固有无序C160。这一观察结果为发现仅在含有IDR的蛋白质与其相互作用的蛋白质形成复合物时出现的可连接位点提供了概念证明。他们进一步证明，这种共价SKP1配体可用于PROTAC应用，以降解细胞中的新底物，如BRD4和AR。鉴于SKP1的重要性，SKP1的共价募集可能潜在地克服在癌症治疗中利用非本质E3连接酶的PROTAC的耐药性机制。虽然该课题组证明了在PROTAC中使用Cullin RING E3连接酶衔接蛋白的概念，但SKP1配体仍处于早期阶段，需要进行重大的药物化学优化，以提高效力、选择性和类药物特性。   该课题组的研究结果还强调了使用共价化学蛋白质组学方法来识别泛素-蛋白酶体系统中蛋白质的补充物的实用性，该系统可用于靶向蛋白质降解应用。作者：潘相奕校审：周金明编辑：郑一榕时间：2024年3月29日参考文献Exploiting the Cullin E3 Ligase Adaptor Protein SKP1 for Targeted Protein Degradation ACS Chemical Biology 2024 19 (2), 442-450. DOI: 10.1021/acschembio.3c00642    声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

该研究揭示了骨髓微环境中ID1通过促进ANGPTL7的表达调控白血病的发生发展，揭示了AML细胞通过分泌BMP6促进骨髓微环境中ID1的表达。这条骨髓微环境和AML细胞相互影响的环路或对临床AML治疗 中国科学院上海营养与健康研究所王兰研究组在Blood上，在线发表了题为The cell non-autonomous function of ID1 promotes AML progression via ANGPTL7 from the microenvironment的研究成果。该研究揭示了骨髓微环境中转录调控因子ID1对急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）起始与进展的关键作用，为急性髓系白血病（AML）治疗提供了新的思路和策略。 AML是起源于造血干/祖细胞的恶性疾病。它的特征是髓系前体细胞恶性克隆性增殖和分化为成熟血细胞的能力受阻。AML是常见的成人白血病，高度的异质性影响疾病预后与转归。目前，AML的诊疗随着药物和方法的更新已取得较大进步，但亟需提高对AML发生机制的认识，并开发新的治疗方法。 AML的发生发展往往伴随基因的异常表达。前期研究显示，ID1是致病融合蛋白AML1-ETO的直接靶基因，在白血病细胞中显著高表达。白血病细胞中ID1与AKT1发生直接相互作用促进AKT1的磷酸化，进而加速AML1-ETO驱动白血病的起始与进展。ID1在模拟儿童白血病的MLL-AF9驱动的白血病胎肝移植小鼠模型与模拟成人白血病的MLL-AF9驱动的白血病骨髓移植小鼠模型中具有相反功能。ID1促进儿童MLL-AF9驱动白血病干细胞的自我更新，抑制成人MLL-AF9驱动白血病的发生。 研究发现，ID1在AML患者来源的骨髓间充质干细胞中高表达。这种高表达在AML1-ETO和MLL-AF9融合蛋白相关的白血病中更为显著。为了探讨AML骨髓微环境中ID1表达升高的原因，研究分析ChIP-seq发现，致病融合蛋白AML1-ETO和MLL-AF9直接结合于BMP6的启动子区域。科研人员在AML细胞中敲低BMP6，随后将这些细胞与基质细胞共培养。结果显示，AML细胞中BMP6的低表达显著降低了与之共培养的基质细胞中ID1的表达，表明AML细胞通过分泌BMP6促进基质细胞中ID1的表达。研究通过小鼠移植实验发现，在Id1缺失受体中，AML1-ETO9a和MLL-AF9诱导的AML起始与进展显著延缓，白血病干细胞的自我更新能力出现显著抑制。研究通过体外共培养实验发现，骨髓基质细胞中ID1缺失可显著抑制与之共培养的AML细胞的增殖并引起周期阻滞。 机制上，研究利用定量蛋白组学分析了AML受体小鼠的骨髓液发现，骨髓微环境中Id1调控分泌型糖蛋白Angptl7表达加速了白血病的发生发展。研究表明，ANGPTL7可促进白血病干细胞的自我更新。科研人员向体外共培养系统中添加ANGPTL7重组蛋白发现，ID1缺失引起的AML细胞增殖抑制和周期阻滞现象得到明显逆转；通过向AML受体骨髓腔输注Angptl7重组蛋白发现，Id1缺失引起的AML受体白血病干细胞减少和生存期延缓现象得到明显逆转。 为了进一步探究ID1如何调控ANGPTL7的表达，研究通过质谱分析与免疫共沉淀等实验发现，ID1羧基端与RNF4氨基端的SIM结构域发生直接相互作用。RNF4是SP1的E3泛素连接酶，ID1与RNF4相互作用显著抑制RNF4对SP1的泛素化修饰，从而维持了SP1蛋白水平。SP1是ANGPTL7的转录因子，因此AML骨髓微环境中ID1通过抑制RNF4-SP1相互作用促进了ANGPTL7的表达，从而影响AML的发生发展。 该研究揭示了骨髓微环境中ID1通过促进ANGPTL7的表达调控白血病的发生发展，揭示了AML细胞通过分泌BMP6促进骨髓微环境中ID1的表达。这条骨髓微环境和AML细胞相互影响的环路或对临床AML治疗具有指导意义。 研究工作获得国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科技创新行动计划和营养与健康所公共技术平台等的支持。上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海交通大学附属第六人民医院、上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心、大连医科大学附属第二医院和复旦大学附属肿瘤医院的科研人员参与研究。   骨髓微环境中ID1调控AML的分子机制示意图

综上所述，该研究揭示了骨髓微环境中ID1通过促进ANGPTL7的表达调控白血病的发生发展，也揭示了AML细胞通过分泌BMP6促进骨髓微环境中ID1的表达。 急性髓系白血病（AML）是一种起源于造血干/祖细胞的恶性疾病，其特征是髓系前体细胞恶性克隆性增殖和分化为成熟血细胞的能力受阻。AML作为最常见的成人白血病，其高度的异质性影响疾病预后与转归。 目前，AML的诊疗随着药物和方法的不断更新已取得很大进步，但仍有50%的AML患者总生存时间不超过4年，AML细胞的异质性也导致50%的患者出现复发，因此我们急需提高对AML发生机制的认识并开发新的治疗方法。 2023年6月15日，中国科学院上海营养与健康研究所王兰研究组在 Blood 期刊发表了题为：The cell non-autonomous function of ID1 promotes AML progression via ANGPTL7 from the microenvironment 的研究论文。 该研究揭示了骨髓微环境中转录调控因子ID1对急性髓系白血病（AML）起始与进展的关键作用，为急性髓系白血病（AML）治疗提供新的思路和策略。 AML的发生发展往往伴随基因的异常表达，该研究团队前期的成果显示ID1是致病融合蛋白AML1-ETO的直接靶基因，在白血病细胞中显著高表达。白血病细胞中ID1与AKT1发生直接相互作用促进AKT1的磷酸化，进而加速AML1-ETO驱动白血病的起始与进展。ID1在模拟儿童白血病的MLL-AF9驱动的白血病胎肝移植小鼠模型和模拟成人白血病的MLL-AF9驱动的白血病骨髓移植小鼠模型中具有相反功能。ID1促进儿童MLL-AF9驱动白血病干细胞的自我更新，而抑制成人MLL-AF9驱动白血病的发生。 在这项研究中，研究团队发现ID1在AML患者来源的骨髓间充质干细胞中高表达，这种高表达在AML1-ETO和MLL-AF9融合蛋白相关的白血病中更为显著。 为了研究AML骨髓微环境中ID1表达升高的原因，研究团队进行ChIP-seq分析发现，致病融合蛋白AML1-ETO和MLL-AF9直接结合于BMP6的启动子区域。研究人员在AML细胞中敲低BMP6，随后将这些细胞与基质细胞进行共培养，实验结果表明AML细胞中BMP6的低表达显著降低与之共培养的基质细胞中ID1的表达，这提示AML细胞通过分泌BMP6促进基质细胞中ID1的表达。研究团队通过小鼠移植实验发现，在Id1缺失受体中，AML1-ETO9a和MLL-AF9诱导的AML起始与进展显著延缓，白血病干细胞的自我更新能力显著抑制。研究人员通过体外共培养实验发现，骨髓基质细胞中ID1缺失能显著抑制与之共培养的AML细胞的增殖并引起周期阻滞。 机制上，研究团队通过对AML受体小鼠的骨髓液进行定量蛋白组学分析发现，骨髓微环境中Id1调控分泌型糖蛋白Angptl7表达加速白血病的发生发展。研究团队发现ANGPTL7能促进白血病干细胞的自我更新。通过向体外共培养系统中添加ANGPTL7重组蛋白，研究团队发现ID1缺失所引起的AML细胞增殖抑制和周期阻滞现象得到明显逆转。通过向AML受体骨髓腔输注Angptl7重组蛋白，研究团队发现Id1缺失所引起的AML受体白血病干细胞减少和生存期延缓现象明显逆转。 为了进一步研究ID1如何调控ANGPTL7的表达，研究团队通过质谱分析与免疫共沉淀等实验发现ID1羧基端与RNF4氨基端的SIM结构域发生直接相互作用。RNF4是SP1的E3泛素连接酶，ID1与RNF4相互作用显著抑制RNF4对SP1的泛素化修饰从而维持了SP1蛋白水平。SP1是ANGPTL7的转录因子，因此AML骨髓微环境中ID1通过抑制RNF4-SP1相互作用促进了ANGPTL7的表达，从而影响AML的发生发展。 骨髓微环境中ID1调控AML的分子机制示意图 综上所述，该研究揭示了骨髓微环境中ID1通过促进ANGPTL7的表达调控白血病的发生发展，也揭示了AML细胞通过分泌BMP6促进骨髓微环境中ID1的表达。这条骨髓微环境和AML细胞相互影响的环路可能对临床AML治疗具有指导意义。