更新于：2024-11-01

SMAD4

更新于：2024-11-01

基本信息

别名

Deletion target in pancreatic carcinoma 4、DPC4、hSMAD4

+ [7]

简介

In muscle physiology, plays a central role in the balance between atrophy and hypertrophy. When recruited by MSTN, promotes atrophy response via phosphorylated SMAD2/4. MSTN decrease causes SMAD4 release and subsequent recruitment by the BMP pathway to promote hypertrophy via phosphorylated SMAD1/5/8. Acts synergistically with SMAD1 and YY1 in bone morphogenetic protein (BMP)-mediated cardiac-specific gene expression. Binds to SMAD binding elements (SBEs) (5'-GTCT/AGAC-3') within BMP response element (BMPRE) of cardiac activating regions (By similarity). Common SMAD (co-SMAD) is the coactivator and mediator of signal transduction by TGF-beta (transforming growth factor). Component of the heterotrimeric SMAD2/SMAD3-SMAD4 complex that forms in the nucleus and is required for the TGF-mediated signaling (PubMed:25514493). Promotes binding of the SMAD2/SMAD4/FAST-1 complex to DNA and provides an activation function required for SMAD1 or SMAD2 to stimulate transcription. Component of the multimeric SMAD3/SMAD4/JUN/FOS complex which forms at the AP1 promoter site; required for synergistic transcriptional activity in response to TGF-beta. May act as a tumor suppressor. Positively regulates PDPK1 kinase activity by stimulating its dissociation from the 14-3-3 protein YWHAQ which acts as a negative regulator.

关联

项与 SMAD4 相关的药物

CD55-Smad4

靶点

SMAD4

作用机制

SMAD4调节剂

在研机构

浙江理工大学

原研机构

浙江理工大学

在研适应症

结直肠癌

非在研适应症-

最高研发阶段临床前

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

100 项与 SMAD4 相关的临床结果

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100 项与 SMAD4 相关的转化医学

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0 项与 SMAD4 相关的专利（医药）

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5,782

项与 SMAD4 相关的文献（医药）

2025-01-01·Journal of Ethnopharmacology

Diterpene glycosides from Fructus Rubi ameliorates benign prostatic hyperplasia in rats through the androgen and TGF-β/Smad signaling pathway

Article

作者: Li, Yiming ; Yang, Binrui ; Cheng, Kaixian ; Wang, Jing ; Yu, Jundong ; Du, Jun ; Zhang, Xue ; Chen, Liang ; Wu, Yingchun

ETHNOPHARMACOLOGICAL RELEVANCEFructus Rubi (FR), a food material with medicinal value, is used in traditional Chinese medicine (TCM) for treatment of various kidney-related problems, such as impotence, spermatorrhea, and frequent urination. It is also frequently used to produce diverse functional foods in China.AIM OF STUDYThe purpose of this research was to assess the therapeutic effects of FR diterpene glycosides on RWPE-1 epithelial cell (RWPE-1), a human normal prostatic epithelial cell, and benign prostate hyperplasia (BPH) rats, both of which had been exposed to dihydrotestosterone (DHT) and testosterone propionate (TP), respectively, and to investigate the mechanism of action.METHODSTarget proteins that could stably bind to certain diterpene glycosides were screened through drug affinity responsive target stability combined with mass spectrometry (DARTS/MS). DHT-induced RWPE-1 cells were used to detect drug activity. TP was subcutaneously injected to induce BPH in rats. The extract of diterpene glycosides from FR (FDS) was orally administered for 28 days. The DHT levels in the serum and prostate tissue of the rats were measured through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and to analyze cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition (EMT), the protein expression of prostate-specific antigen (PSA), androgen receptor (AR), steroid 5α-reductase type 2 (SRD5A2), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), S100 calcium-binding protein A2 (S100A2), transforming growth factor-β1 (TGF-β1), E-cadherin, vimentin, and Smad4 was determined through western blotting (WB), immunohistochemistry (IHC), or immunofluorescence (IF).RESULTSFDS reduced the proliferation of DHT-induced RWPE-1 cells. It also significantly inhibited rat prostate enlargement; decreased DHT levels in the serum and prostate tissue; inhibited the protein expression of AR, PSA, PCNA, S100A2, TGF-β1, E-cadherin, and Smad4; and increased the protein expression of E-cadherin.CONCLUSIONThe present study is the first to report that diterpene glycosides isolated from FR inhibited BPH at the cellular level, regulated the proliferation of prostate cells through the androgen signaling pathway, and prevented EMT in the prostate through the S100A2-mediated TGF-β/Smad signaling pathway. These results indicate that FDS is a promising multitarget therapy for BPH.

2024-12-01·Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research

SRSF3 suppresses RCC tumorigenesis and progression via regulating SP4 alternative splicing

Article

作者: Zheng, Junfang ; Zhang, Liuxu ; Dai, Chenyun ; Zhang, Hongning ; Tang, Yuangui

Abnormal alternative splicing (AS) caused by dysregulated expression of splicing factors plays a crucial role in tumorigenesis and progression. The serine/arginine-rich (SR) RNA-binding protein family is a major class of splicing factors regulating AS. However, their roles and mechanisms in renal cell carcinoma (RCC) development and progression are not fully understood. Here, we found that SR splicing factor 3 (SRSF3) was an important splicing factor affecting RCC progression. SRSF3 was downregulated in RCC tissues and its low level was associated with decreased overall survival time of RCC patients. SRSF3 overexpression suppressed RCC cell malignancy. Mechanistically, the binding of SRSF3 to SP4 exon 3 led to the inclusion of SP4 exon 3 and the increase of long SP4 isoform (L-SP4) level in RCC cells. L-SP4, but not S-SP4 overexpression suppressed RCC cell malignancy. Meanwhile, L-SP4 participated in SRSF3-mediated anti-proliferation by transcriptionally promoting SMAD4 expression. Taken together, our findings provide new insights into the anticancer mechanism of SRSF3, suggesting that SRSF3 may serve as a novel potential therapeutic target for RCC.

2024-12-01·Molecular Biology Reports

Silymarin and MSC-exosomes ameliorate thioacetamide-evoked renal fibrosis by inhibiting TGF-β/SMAD pathway in rats

Article

作者: Mekawy, Dina Mohamed ; Sabry, Rania Mohamed ; Abozeid, Naglaa F ; Sabry, Dina

AbstractBackgroundTGF-β1 and SMAD3 are particularly pathogenic in the progression of renal fibrosis.AimThis study aimed to evaluate the kidney protective potentials of silymarin (SM) and exosomes of mesenchymal stem cells against the nephrotoxin thioacetamide (TAA) in rats.Methods32 female rats were randomly assigned into four groups: the control group, the TAA group, the TAA + SM group, and the TAA + Exosomes group. The kidney homogenates from all groups were examined for expression levels of TGF-β receptors I and II using real-time PCR, expression levels of collagen type I and CTGF proteins using ELISA, and the expression levels of nuclear SMAD2/3/4, cytoplasmic SMAD2/3, and cytoplasmic SMAD4 proteins using the western blot technique.ResultsCompared to the control group, the injection of TAA resulted in a significant increase in serum levels of urea and creatinine, gene expression levels of TβRI and TβRII, protein expression levels of both collagen I and CTGF proteins, cytoplasmic SMAD2/3 complex, and nuclear SMAD2/3/4 (p-value < 0.0001), with significantly decreased levels of the co-SMAD partner, SMAD4 (p-value < 0.0001). Those effects were reversed considerably in both treatment groups, with the superiority of the exosomal treatment regarding the SMAD proteins and the expression levels of the TβRI gene, collagen I, and CTGF proteins returning to near-control values (p-value > 0.05).ConclusionUsing in vitro and in vivo experimental approaches, the research discovered a reno-protective role of silymarin and exosomes of BM-MSCs after thioacetamide-induced renal fibrosis in rats, with the advantage of exosomes.

项与 SMAD4 相关的新闻（医药）

2024-09-23

·药渡Daily

不怕贴秋膘！ ALK7 siRNA 脂肪递送、精准减脂，鼎泰 KBI 打造影像学小蛮腰

首先，引用 CDE 于 2021 年发布的《体重控制药物临床试验技术指导原则》中几个“人人自危”且“难以言说”的术语和指标吧！超重和肥胖的判定标准体重指数（BMI） BMI = 体重（kg）/ 身高²（m²），用于判定超重和肥胖的标准中国标准：24 kg/m² ≤ BMI ＜ 28 kg/m²为超重，BMI ≥ 28 kg/m²为肥胖当 BMI ≥ 24 kg/m²且有合并症或 BMI ≥ 28 kg/m²不论是否有合并症，经过 3-6 个月调整仍不能减重 5%，可考虑药物治疗腰围（WC）中心型肥胖是指脂肪主要在腹壁和腹腔内沉积过多中国标准：男性腰围≥90 cm，女性腰围≥85 cm为中心型肥胖腰围与内脏脂肪含量相关，是代谢异常风险的独立预测因素在前期文章（《减脂保肌，INHBE有态度，KBI有招数》点击查看原文）中，鼎泰团队具体介绍了 INHBE siRNA 的独特优势、INHBE 的生物学背景和种属同源性、鼎泰集团旗下子公司昆明科灵（KBI）非人灵长类肥胖模型和药效学研究平台。本期文章将聚焦与肥胖相关的另一个潜力靶点 —— ALK7（Activin receptor-like kinase 7）的相关生物学信息，并学习以 ALK7 为靶点、脂肪组织递送的 siRNA ARO-ALK7 的临床前概念验证数据、未来的临床研究规划及 TRiMTM 肝外递送技术平台（实现骨骼肌、脂肪等组织的靶向递送）。期待为助力该类药物更高效地实现临床转化和推动产品上市提供借鉴和启示。肥胖，是个问题根据 WHO 公开资料，2022 年有 25 亿 18 岁及以上的成年人超重，其中超过 8.9 亿成年人患有肥胖症。 2021 年 CDE 发布的《体重控制药物临床试验技术指导原则》中指出，超重和肥胖是由多因素引起的慢性代谢性疾病，特征为体内脂肪过度蓄积。超重和肥胖显著增加心脑血管、呼吸、内分泌等多种系统疾病的风险，严重影响生活质量。生活方式的改善是体重管理的首要手段，但对于无法通过这种方式获得满意效果的患者，药物治疗也是一种选择。我国肥胖患者数量显著增加，成年居民中超重或肥胖的比例超过 50%，6-17 岁和 6 岁以下儿童的超重/肥胖率分别达到 19% 和 10.4%。本指南的主要内容包括：早期探索性研究（药代动力学、药物相互作用、探索性研究），确证性临床试验及安全性和特殊人群考虑等。 GLP-1 激动剂在减重方面表现出色，曾一度被认为是体重管理的救命稻草。这类药物存在停药反弹、肌肉流失等问题（点击查看《减脂保肌，INHBE 有态度，KBI 有招数》）。因此，众多药企纷纷布局新机制药物，寻求减脂不减肌、不反弹的减肥药物。 2024 年 8 月14 日 Arrowhead Pharmaceuticals 于美国东部时间下午 2:00 举办了肥胖/代谢研发网络研讨会，会议议程包括： ◆ 介绍两款基于 RNAi 用于治疗肥胖和代谢疾病的候选药物 —— ARO-INHBE（点击查看《减脂保肌，INHBE 有态度，KBI 有招数》）和ARO-ALK7 ◆ 初步非临床研究结果：ARO-INHBE 和 ARO-ALK7 可通过新的机制改善对肌肉质量的影响，有望克服 GLP-1 激动剂的不足 ◆ 介绍 ARO-ALK7 的初步临床研究计划 ◆ 介绍 Arrowhead 的 TRiMTM 脂肪组织递送平台 PASADENA, Calif.–(BUSINESS WIRE)–Aug. 14, 2024–Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. (NASDAQ: ARWR) today presented preclinical data and detailed its plans to advance two next generation RNAi-based candidates, ARO-INHBE and ARO-ALK7, into upcoming clinical studies for the treatment of obesity and metabolic diseases. In preclinical studies to date, these candidates demonstrated the potential to reduce body weight and fat mass with a novel mechanism of action that may lead to improved preservation of lean muscle mass compared to currently approved obesity therapies. Arrowhead plans to submit clinical trial applications with regulatory authorities for both programs by the end of 2024 with the goal of initiating clinical studies in volunteers with obesity in early 2025. 全文共：13996 字 54 图预计阅读时长：35 分钟 ★ 目录 ★ 1 肥胖是怎样产生的？—— 脂肪代谢障碍 2 肥胖症治疗现状—— GLP-1 激动剂的局限性 3 脂肪代谢管家 ALK7—— ALK7 的生物学背景和种属同源性 4 肥胖治疗，夜空中最亮的星—— ARO-ALK7 临床前概念验证数据 5 未来展望 —— ARO-ALK7 临床概念验证计划 6 TRiMTM Platform—— 脂肪组织递送系统 7 影像学小蛮腰 —— 鼎泰 KBI 非人灵长类肥胖动物模型和药效学平台 1 肥胖是怎样产生的？脂肪代谢障碍脂肪组织（adipose tissue）是身体重要的内分泌器官，能够产生和分泌多种脂肪因子（adipokines），调节众多生理功能。脂肪组织功能障碍（adipose dysfunction），可能导致脂肪因子的失衡，从而引发脂质代谢异常，并与多种代谢性疾病密切相关，包括：肥胖、II型糖尿病、脂质代谢异常、炎症性疾病、心血管疾病和癌症等。在肥胖状态下，脂肪组织的扩张（expansion）和功能改变可能导致炎症反应和胰岛素抵抗，进一步加剧了脂质代谢的失调。因此，脂质代谢异常不仅是肥胖的结果，也是其发展的重要因素。通过对脂肪组织生物学和基础功能的研究，可以为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供新的思路和策略。 ■ 脂肪组织（AT）细胞有三种主要类型 ● 位于白色脂肪组织（WAT）中的白色脂肪细胞，占脂肪质量 >95%。白色脂肪细胞具有大的单目脂滴（unilocular lipid droplets），是肥胖患者 AT 扩张的主要原因 ● 棕色脂肪组织（BAT）内的棕色脂肪细胞，占脂肪的 1-2% ● 米色脂肪细胞，散布在 WAT 内，可在寒冷暴露或肾上腺素刺激下转化为棕色样脂肪细胞 ■ 热量过剩和代谢应激可导致 AT 不健康扩张 ● 脂肪生成减少、脂肪细胞肥大增加、免疫细胞浸润增加、慢性轻度炎症和胰岛素敏感性降低 ● 脂肪细胞功能障碍导致脂肪因子分泌失衡（图1），促炎性促糖尿病脂肪因子（红点）分泌增加，抗炎性抗糖尿病脂肪因子（绿点）分泌减少 ● 干扰 AT 与脂肪因子效应器官（如胰腺β细胞、肝脏和心脏）的生理信号传递（physiological communication）图 1. 肥胖状态下的脂肪组织功能障碍[1] 通过对脂肪组织功能的深入研究，可以为肥胖及相关代谢疾病的治疗提供新的思路和策略。 2 肥胖症治疗现状 GLP-1 激动剂的局限性肥胖症的治疗方式包括生活方式干预、药物治疗、手术治疗、心理支持以及新兴技术应用等多种方法，目的是通过综合手段实现长期有效的体重管理。 ■ GLP-1 激动剂仍需要长期用药 FDA 已批准了多种 GLP-1 激动剂用于肥胖治疗（表1）。根据文献报道，患者在停用 Semaglutide（皮下注射，2.4 mg/week）以及采取生活方式干预治疗 1 年后体重会快速反弹（图2）。该研究结果提示，肥胖症长期性治疗面临的挑战。表 1. 美国食品和药物管理局批准的抗肥胖药物[4] 图 2. Semaglutide 停药后体重迅速反弹[2] ■ 急需新的作用机制的治疗药物 GLP-1 激动剂依从性也存在挑战，在治疗的第一年，依从率为 27.2%。同时，依从性也因产品而异，每周注射产品的依从性最高，每日注射和口服的依从性最低（图3）。因此，急需新的作用机制的治疗药物。未来的肥胖治疗应该更加关注改善整体健康状况，而不仅仅是体重的减轻。同时，需要针对不同亚型的肥胖采取个体化的治疗方案，以取得更好的疗效。图 3. GLP-1 激动剂用药 1 年 Kaplan-Meier 疗效分析（n=4066）[3] 3 脂肪代谢管家 ALK7 ALK7 的生物学背景和种属同源性 ■ ALK7（ACVR1C）的基本信息[5][10] 激活素受体样激酶 7（ALK7），又名 ACVR1C，是一种Ⅰ型转化生长因子 β（TGF-β）受体，在维持代谢平衡中发挥重要作用。 ● TGF-β 超家族 TGF-β 超家族由超过 35 个配体和 12 个受体组成。TGF-β 配体包括 TGF-β 1~3，激活素（activins）A、B 和抑制素（inhibins），十几种生长/分化因子（growth/differentiation factors，GDF）、骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）和 Nodal 蛋白。 ● TGF-β 受体类型分为两类，即 I 型和 II 型受体，均为跨膜激酶。在没有配体的情况下，可以单体、同源二聚体或/和异二聚体的形式存在于细胞表面。在哺乳动物中，已知 7 种 I 型受体（ACVRL1/ALK1、ACVR1/ALK2、BMPR1A/ALK3、ACVR1B/ALK4、TGFBR1/ALK5、BMPR1B/ALK6 和 ACVR1C/ALK7），在C 末端具有 Ser-Thr 激酶部分、柔性近膜结构域（flexible juxtamembrane domain）和相对较短的细胞外结构域。和 5 种 II 型受体（TGFBR2、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2 和 AMHR2）。 ● TGF-β 受体复合物 TGF-β 超家族配体的受体是四聚体复合物，分别由 I 型和 II 型亚基的两个同型二聚体组成，一些 I 型亚基也可以形成异源二聚体。大多数 I 型受体对配体只有中等亲和力，需要与更大的 II 型亚基结合才能实现有效的配体结合和信号传导。 ● ALK7（ACVR1C）受体复合物及其配体 ALK7 与 II 型受体 ActRIIB（ACVR2B）一起发挥作用，可被激活的 ALK4 的相同配体激活，特别是激活素B、GDF1、GDF3 和Nodal。然而，尽管GDF11和GDF8（Myostatin，MSTN；肌肉生长抑制素）也能与 ALK7 相互作用，但它们更倾向于与 ALK5 结合。此外，文献报道 GDF15 通过 ALK7 激活 SMAD2 和 SMAD3 信号通路，改善炎症诱导的胰岛素抵抗[6]。其他研究表明，ActE（INHBE 编码）是一种 ALK7 特异性配体[7]。图 4. TGFβ 家族受体和配体[10] ■ ALK7（ACVR1C）的结构和表达 ALK7（ACVR1C）在结构上属于单次跨膜蛋白，不同组织中表达水平变化较大，但在白色和棕色脂肪组织中表达水平最高。图 5. ALK7 在脂肪细胞中高表达（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ■ ALK7（ACVR1C）基因变异和腰臀比的关系根据文献，研究人员对超过 400,000 人的基因变异（genetic variants）进行分析，以鉴别与较低的经身体质量指数（BMI）调整后的腰围/臀围比例（waist-to-hip ratio adjusted for BMI，WHRadjBMI）相关的变异，并进一步验证这些变异是否也与 II 型糖尿病的风险相关。结果表明，预测导致 ACVR1C 基因功能丧失的变异会影响体脂分布并降低 II 型糖尿病的风险。ACVR1C 中的四个变异与较低的 WHRadjBMI 相关，并且这些变异携带者患II型糖尿病的风险降低了 30%。 ACVR1C 基因中的四个特定变异体（Asn150His, Ile195Thr, Ile482Val 和 rs72927479）对腹部脂肪分布和腰臀比（WHRadjBMI）有显著影响。图6展示了 UK Biobank 中 4,215 名参与者进行 DEXA 扫描后，腹部脂肪百分比（腹部脂肪占总身体脂肪的比例）与 ACVR1C 基因四个变异体之间的关系。结果表明，携带更多 ACVR1C 变异体的人群具有较低的腹部脂肪百分比。图7表明这四个变异与较低的 WHRadjBMI 相关。图 6. ACVR1C 基因四个变异体与腹部脂肪百分比图 7. ACVR1C 基因中的四个变异与腰臀比（WHRadjBMI）的关系[8] ■ ALK7 调节脂肪组织脂肪分解分子机制当 ALK7 与其配体结合后，通过激活 Smad 蛋白 2、3、4 来传递信号。Smad3 和 Smad4 能够与 CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族成员相互作用，抑制其转录激活功能。C/EBP 蛋白是脂肪生成和脂肪细胞分化的重要调控因子，主要通过调控 PPARγ 的表达来实现。同时，C/EBPα 和 PPARγ 共同控制脂肪分解关键酶（如 ATGL 和 HSL）的表达。此外，PPARγ 还能上调 ALK7 的表达。另一方面， ALK7 与配体结合后，可通过 β3-肾上腺素能受体（β3-AR）调节儿茶酚胺敏感性：通过抑制 β3-AR 表达和信号传导，使脂肪细胞对儿茶酚胺产生抵抗性。图 8. BAT 中 ALK7 在与脂肪分解代谢调节有关的信号通路中的作用[10] 注：ATGL-adipose triglyceride lipase；HSL-hormone sensitive lipase；PPARγ-Peroxisome proliferator-activated receptor γ ■ ALK7 mAb 对 ALK7 受体信号通路的干扰根据文献[7]，在遗传性肥胖小鼠（TSOD）和高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，ALK7 mAb 治疗能显著减少肥胖，并改善葡萄糖耐量异常和胰岛素抵抗；此外，ALK7 mAb 通过抑制脂肪细胞中 S100A8/A9 和下游脂肪组织巨噬细胞（ATM）中 IL-1β 的产生来下调 ATM 中的 GDF3（图9）。这些发现支持以 ALK7 为潜在靶点治疗肥胖和糖尿病的可行性。图 9. ALK7 mAb 作用于 ALK7 受体信号通路[9] （ATM 释放的 GDF3 结合 ALK7 并诱导脂肪细胞产生 S100A8/A9 蛋白，进而激活 NLRP3 并促进成熟 IL-1β 从 ATM 中释放，细胞自主增加 ATM 中 GDF3 的表达和释放，并进一步激活脂肪细胞中 ALK7 介导的通路以促进肥胖。） ■ 不同种属间 ALK7 的同源性根据 NCBI BLAST 氨基酸序列比对，人和小鼠、大鼠、犬、食蟹猴和恒河猴 ALK7 的同源性（Identities）分别为 95%、95%、92%、99% 和 99%，与人的同源性最高的是猴。以上信息有助于了解靶向 ALK7 的 siRNA 的相关种属。图 10. ALK7 蛋白结构 4 肥胖治疗，夜空中最亮的星 ARO-ALK7 临床前概念验证数据 ■ 脂肪组织递送如前文所述，ALK7 主要在脂肪组织中表达，可借助 TRiMTM 递送技术（详见 06 TRiMTM Platform）实现向脂肪组织的靶向递送和对脂肪组织中靶基因的敲降。图 11. 实现组织靶向递送的 TRiM™ 平台及技术特点（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ■ 基于脂肪组织递送的 ARO-ALK7 的临床前概念验证在临床前研究中，ALK7 siRNA 显示出显著的体重减轻和代谢指标改善的效果。在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中，ALK7 siRNA 治疗组的体重（BW）增加显著低于对照组；脂肪质量（fat mass）减少，瘦体重（lean mass）保持稳定（图12）。体重：与高脂肪饮食组相比，以 SC 给药（3 mg/kg）后小鼠 BW 增加减少 39%（图13） ARO-ALK7 基因沉默效率：在DIO模型中，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中 ALK7 mRNA 的沉默效率达 80%，性腺周围白色脂肪组织（pgWAT）中约为 40%（图13） ARO-ALK7 基因沉默持久性：NHP 模型中，可有效、持久、剂量依赖性地沉默 Lean NHP 中脂肪组织中 ALK7 mRNA（图18）图 12. 脂肪组织 ALK7 敲除后小鼠体重增加和脂肪质量减少、瘦体重不变（Arrowhead R&D Webinar）图 13. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可减少体重增加（Arrowhead R&D Webinar）图 14. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可降低脂肪质量并保留瘦体重（Arrowhead R&D Webinar）图 15. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织中 ALK7 可增强对儿茶酚胺的敏感性并增加脂肪动员和氧化（Arrowhead R&D Webinar）图 16. DIO 小鼠模型中沉默脂肪组织在 ALK7 可增强脂肪动员并减少肝脏脂肪（Arrowhead R&D Webinar）图 17. 小鼠 DIO 模型中 ALK7 siRNA 联合替尔泊肽可提高减重效果并提高瘦体重组成（Arrowhead R&D Webinar）图 18. ARO-ALK7 可有效、持久、剂量依赖性地沉默Lean NHP脂肪组织中 ALK7 mRNA（Arrowhead R&D Webinar）左右滑动查看注：DIO- Diet Induced Obesity；iWAT- Inguinal White adipose tissue；pgWAT- Inguinal white adipose tissue 5 未来展望 ARO-ALK7 临床概念验证计划 Arrowhead 研发日活动资料显示，计划于 2024 年底提交 ARO-ALK7 的临床试验申请（IND），2025 年初在肥胖志愿者中启动临床试验。拟开展的首次人体试验为在肥胖与 2 型糖尿病患者、非 2 型糖尿病志愿者开展 ARO-ALK7 的 I/IIa 期临床试验（clinictrial.gov 暂未检索到相关信息）。根据研发日活动资料，主要研究计划如下： Part 1：随机、双盲、安慰剂对照、在肥胖志愿者中开展 ARO-ALK7 的单次给药和多次给药剂量递增试验（共给药 2 次，间隔 28 天）图 19. ARO-ALK7 I/IIa 期临床研究计划（1）（Arrowhead R&D Webinar） Part 2：随机、双盲、安慰剂对照、评价 ARO-ALK7 单用或与 GLP-1/GIP 激动剂（Tirzepatide）联合应用的疗效三个队列：Cohort 5A（肥胖），单用；Cohort 5B（肥胖），单用；Cohort 5C（肥胖且 T2DM），联用 Trizepatide 脂肪检测：给药前 2 次，给药后 D57、D169 各一次 ARO-ALK7 给药频率：共给药 2 次（Day1、Day29），间隔 28 天肥胖和超重患者常常合并有其他疾病并接受相应的药物治疗（例如，与抗高血压药、降糖药、降脂药、降尿酸药等），故建议考虑与 DDI 相关的体外和/或体内试验的必要性。后续将继续关注与支持 ARO-ALK7 临床联合用药合理性相关的体内或体外试验的开展情况和研究结果，为同类产品的非临床研究提供参考。图 20. ARO-ALK7 I/IIa 期临床研究计划（2）（Arrowhead R&D Webinar） ■ 关键终点 ▶ 安全性 ▶ 药代动力学 ▶ 探索性研究脂肪组织中 ALK7 的表达体重变化（千克/%）腰围体脂肪、脂肪分布、脂肪质量与瘦体重（MRI）肝脏脂肪含量（MRI-PDFF）禁食血脂和脂肪代谢参数血糖控制参数 6 TRiMTM Platform 脂肪组织递送系统 Arrowhead 的 TRiM™ 平台利用配体介导 siRNA 的组织特异性递送。根据官方数据，TRiM™ 可实现对脂肪组织等非肝脏组织中靶基因明显的敲降（图26），对肝脏靶点（FXII）和肺靶点（RAGE）未显著敲降（图31）；此外，组织中的 siRNA 的浓度和敲降效果非正相关（图30）。图 21. TRiM™ 平台 ■ TRiMTM 递送平台简介根据对 Arrowhead 等公司已公开的专利信息的调研，TriMTM 递送平台可对 4 个组件进行优化：具有序列特异性和稳定化学性质的高效 RNAi trigger 高亲和力靶向配体各种接头和化学成分增强药代动力学的结构 ■ TRiMTM 递送平台可能相关的专利专利 CN 116348150 A/WO 2022/056273 A1 公开了一种包含 PK/PD 调节剂的化合物，该化合物根据式（I）（图23）进行设计，旨在将基于寡核苷酸的活性分子（如双链 RNAi）有效递送至某些特定细胞（如骨骼肌细胞、脂肪细胞）。该化合物具有特定的结构特征，包括：连接基团 L1 和 L2 脂质 X 和 Y 基于寡核苷酸的活性分子 R 其中，L1 和 L2 中包含一定数量的 PEG 单元，X 和 Y 可以是不同类型的脂质，包括不饱和脂质、饱和脂质等。此外，专利中还提供了多种具体化合物的结构及其在药学上可接受的盐形式。图 22. 可能相关的发明专利：用于肝外递送的脂质 -siRNA 缀合物（CN 116348150 A，WO 2022/056273 A1）图 23. 可能的代表性结构示例（CN 116348150 A）左右滑动查看图 24. 用于脂肪组织递送的脂质结构组成（部分示例）（CN 116348150 A） ■ TRiMTM 递送平台非临床研究信 ● ARO-Adiponectin：脂肪细胞分布的概念验证小鼠给予以 3 mpk (SC) 给药后第 15 天，采用组织染色技术确认 siRNA 在脂肪细胞中的递送及目标 mRNA 的表达情况。通过 miRNAscope 确认 ARO-Adiponectin 可悲递送至脂肪细胞；通过 RNAscope 证实脂肪细胞中 Adiponectin mRNA 水平明显降低（图25）。图 25. 确认 TRiMTM 可实现向小鼠脂肪细胞的靶向递送和靶 mRNA 降低（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● ARO-Adiponectin（lipid-siRNA）：对组织中靶基因的敲降 Adiponectin-siRNA 能够有效敲降小鼠脂肪组织中靶 mRNA 水平。 lipid-siRNA 以 1 mpk（SC）给药后第 15 天，目标基因的表达量降低了 35%；对照组（Saline）和未使用 Lipid 递送的 siRNA 组则未观察到表达量下降。以上结果提示，lipid-siRNA 可实现对脂肪组织中目标基因的敲降（图26）。图 26. Lipid-siRNA 降低脂肪细胞特异性靶点的表达（Arrowhead TIDES 2024 Adipose）在小鼠中以 SC 或 IV 单次注射 2 mpk，可实现持久的 Adipoq 蛋白敲降： ◆ 皮下注射约 90% 的血清 Adipoq 蛋白敲降，效果持续到第 6 周至少 75% 的敲降效果持续到第 10 周 ◆ 静脉注射约 90% 的血清Adipoq 蛋白敲降，效果持续到第 10 周至少 75% 的敲降效果持续到第 16 周图 27. 小鼠单次给药（SC or IV）后可维持血清中Adipoq蛋白持久敲降（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 双脂肪递送通过血清 Adipoq 蛋白表达、iWAT 中 Adipoq mRNA 表达检测表明：双脂质平台优于单脂质平台，双脂质平台在小鼠体内具有更高的敲除效率。图 28. 双脂肪递送平台在小鼠体内具有更高的敲除效率（Arrowhead TIDES 2024 Adipose）通过检测小鼠脂肪组织中 siRNA 相对浓度，评价双脂质平台在小鼠脂肪组织中的递送效果。与单脂质平台相比，双脂质平台实现了在 iWAT、pgWAT 中 2 倍的 siRNA 递送效果。图 29. 双脂肪递送平台可提高对小鼠不同部位脂肪组织的递送（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 组织分布情况小鼠以 2 mpk（IV）给药后第8天，检测组织中 siRNA 浓度。siRNA 具有广泛的全身分布的特点，肝脏中蓄积最多；进一步研究显示，较高的 siRNA 分布未造成更高的靶 mRNA 敲降（图30）。图 30. 主要组织中的相对分布情况（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 对肝细胞和肺泡细胞中基因表达未见影响尽管可见分布，但在其他组织中未见对靶基因的影响。在针对肝细胞特异性基因 FXII 的研究中，miRNAscope 显示大部分 siRNA 分布在非肝细胞中；在1.5 和 3 mpk 剂量下未见对 FXII 基因的敲降效果；在针对肺特异性基因 RAGE 的研究中，在 3 和 6 mpk 剂量下未见对 RAGE 基因的敲降效果（图31）。图 31. 啮齿类动物肝细胞和肺泡细胞中未见明显的靶点敲除（Arrowhead TIDES 2024 Adipose）尽管在外周组织中有 siRNA 分布，对脂肪组织中靶 mRNA 的敲降作用最为显著（图32）。图32. TRiM™ 可特异性敲降脂肪组织中靶 SOD1 mRNA 表达水平（Arrowhead TIDES 2024 Adipose）通过对血清 Adipoq 蛋白表达水平进行检测，评估在 NHP 中的敲降效果。结果显示，单次给药皮下（SC）与静脉（IV）注射对比，两者均能有效降低 Adipoq 蛋白表达并呈现剂量相关性（图33）。图33. NHP 单次给药（SC或 IV），维持长时间敲降（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 代谢和清除特点脂质可在 24 h内被分解，预计以给药间隔 3-4 个月给药后，所有组织中约 95% 被清除。肝脏中 95% 清除时间为 9-10 周（约 2.5 个月）、肾脏中 95% 清除时间为 8-9 周（约 2 个月）、心脏中 95% 清除时间为 15-16 周（4 个月）。图34. 双脂质 siRNA 以 3-4 个月间隔给药预计可使所有组织的清除率达到 95%（Arrowhead TIDES 2024 Adipose） ● 安全性试验设计（大鼠）第 1 天第 15 天 SC 给药，剂量最高可达 120mpk 第 16 天和第 29 天解剖主要结果未见死亡未见明显临床观察或体重改变血清生化、血常规和凝血功能检查结果未见显著异常第 16 天和第 29 天，组织病理学检查未见给药相关不良影响小结 TRiM™一种新的肝外送到脂肪组织的技术平台，在小鼠和 NHP 中实现持久的靶基因敲除大鼠体内安全性良好经对比分析，虽然 ALK7 和 INHBE 在调节肥胖方面的机制相似，都是通过影响脂肪细胞的代谢来实现，但它们在信号传导的起点和具体作用机制有所不同。ALK7 表达于脂肪组织的脂肪细胞，是一个重要的调节脂质代谢的分子，通过抑制其功能，可以改善肥胖相关病症。目前的研究主要集中在动物模型上，未来可能会有更多关于 ALK7 siRNA 在人类疾病治疗中的应用探索。ALK7 siRNA 在临床前研究中的发现表明，沉默 ALK7 表达能够有效减轻肥胖、改善代谢指标，并可能通过调节脂肪代谢机制发挥作用。这些结果为 ALK7 作为治疗肥胖和相关代谢疾病的靶点提供了有力的支持，为后续的临床研究奠定了基础。 INHBE 与 ALK7 的相互作用为肥胖的治疗提供了新的靶点和研究方向。未来的研究将继续探索这两者在肥胖及其相关代谢疾病中的具体作用机制，以便开发更有效的治疗策略。 7 影像学小蛮腰鼎泰 KBI 非人灵长类肥胖动物模型和药效学平台众所周知，肥胖动物模型种类繁多，其中非人类灵长类动物（NHP）模型展示了与人类肥胖相似的疾病特征。这些模型在结构（解剖）和功能（生理）上与人类肥胖患者基本一致，且 NHP 肥胖与类似于人类代谢综合征的代谢变化密切相关，如腹内脂肪增加、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性受损，以及血清甘油三酯和胆固醇升高。此外，NHP 模型还具备便于血液连续采样、临床观察、组织取材（如肝、肾穿刺）、内窥镜检查、腹腔镜活检和影像学评估等优势，这些特性使其在相关肥胖疾病药效学研究中表现出色。自 2006 年成立以来，鼎泰集团旗下子公司昆明科灵（下称“鼎泰 KBI”）始终专注于代谢性疾病等领域的前沿研究。凭借丰富的NHP疾病动物资源，结合经验丰富的技术团队和先进的设施设备，鼎泰 KBI 成功建立了全球知名的 NHP 肥胖、糖尿病及其相关并发症等代谢性疾病模型和研究平台。该研究平台已经通过多个国际知名药企的审计，并与其建立了长期稳固的合作关系。在代谢项目方面，鼎泰 KBI 积累了丰富的经验，涵盖多种药物类型和多个靶点。这些项目的广泛性和多样性反映了鼎泰 KBI 在代谢性疾病领域深厚的专业知识和技术能力，为多个 INHBE-siRNA 的相关研究提供了可靠、稳定的体内脂肪含量变化评估服务。随着研发理念的不断演进，传统的检测指标（如摄食量、体重变化）已无法满足药效学和作用机制评价的需求。相对而言，腰围（WC）、腰臀比（WHR）和体重指数（BMI）则成为更具临床转化意义的终点指标。为应对这一研发趋势，KBI 布局了相关影像学平台，通过 iDEXA、MRI、PET-CT 等不同影像设备，结合专业的分析软件和技术团队，对非人类灵长类动物的身体成分进行数据采集和分析。这为研发者提供了快捷、高效的减肥药效评价手段，使药物研发人员不仅能够从外表观察到“小蛮腰”，更能借助影像设备深入分析药物用于代谢性疾病治疗的内在机制。从“常规”到“升级”，从“表面”到“内在”，鼎泰 KBI 正基于自身模型和影像学优势，全方位帮助药物研发者深入理解产品，做出更加精准的开发决策，是助力寡核苷酸用于代谢性疾病转化研究的“小蛮腰”。 KBI内脏脂肪和瘦体重的影像学技术： iDEXA 测定身体组分和分布：iDEXA 通过双能X射线吸收技术，能够快速、精确地测量整体和局部的脂肪组织、肌肉组织、全身组分、体脂率等指标 iDEXA 扫描进行身体组分分析已经在减肥类相关 NHP 研究中广泛使用。由于 iDEXA 扫描的结果是二维图像，不能区分腹部皮下脂肪、内脏脂肪，以及肝脏脂肪含量，在实验结果的评估和解读上存在一定的局限性。图35. iDEXA 技术 MRI：MRI 扫描可评估特定药物治疗对腹部皮下脂肪和内脏脂肪，以及肝脏脂肪含量的影响，进而揭示其与疾病发展之间的关联。相比 iDEXA，MRI 的图像是三维图像，对于动物身体局部进行扫描后，对扫描结果数据的可视化、处理和分析，能够更加清晰地帮助研究团队进行影像结果诊断。图36. 鼎泰资源 KBI 非人灵长类药效学 MRI 技术展示参考资料： [1] Ankit Gilani, Lisa Stoll, Edwin A. Homan, James C. Lo; Adipose Signals Regulating Distal Organ Health and Disease. Diabetes 19 January 2024; 73 (2): 169–177. https://doi.org/10.2337/dbi23-0005 [2] Wilding JPH, et al. Weight regain and cardiometabolic effects after withdrawal of semaglutide: The STEP 1 trial extension. Diabetes Obes Metab. 2022 Aug;24（8）:1553-1564. doi: 10.1111/dom.14725. Epub 2022 May 19. PMID: 35441470; PMCID: PMC9542252. [3] Patrick P. Gleason, et al.Journal of Managed Care & Specialty Pharmacy Volume 30, Number 8.Real-world persistence and adherence to glucagon-like peptide-1 receptor agonists among obese commercially insured adults without diabetes. 2024 May 8. https://doi.org/10.18553/jmcp.2024.23332 [4] Henderson K, Lewis, Sloan CE, Bessesen DH, Arterburn D. Effectiveness and safety of drugs for obesity. BMJ. 2024 Mar 25;384:e072686. doi: 10.1136/bmj-2022-072686. PMID: 38527759. 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siRNA临床申请临床研究

2024-08-08

·生物制品圈

用于癌症模型构建的类器官培养

摘要：来自成人干细胞（ASCs）和多能干细胞（PSCs）的类器官是研究癌症和开发治疗方法的重要临床前模型。在这里，我们回顾了来自原始组织的和PSC衍生的癌症类器官模型，并详细说明了它们如何在不同的器官环境中有潜力为个性化医疗方法提供信息，并有助于理解早期癌变步骤、癌症基因组和生物学。我们还比较了基于ASC和基于PSC的癌症类器官系统之间的差异，讨论了它们的局限性，并强调了最近对类器官培养方法的改进，这些改进使它们成为人类肿瘤的更好代表。 1.引言全球癌症负担每年导致近1000万人死亡，并且预计这一数字还会增加。遗憾的是，有效的癌症治疗数量未能跟上这一趋势。其中的一个原因是缺乏能够准确模拟人类肿瘤、它们多样化的形态、分子特征和微环境的体外临床前模型。数十年来，由于相对容易使用、可扩展性和低成本，2D细胞培养已成为研究癌细胞生物学和药物发现的基石。它们使我们能够在分子机制上取得开创性的工作，这些机制是肿瘤发生的，帮助确定生物标志物和药物靶点以指导患者的治疗。然而，它们的功能有限，只代表一小部分癌症——其中只有少数来自早期或癌前阶段。2D培养通常不需要与原代细胞培养相同的生存利基因子，这意味着它们已经由于基因组中的异常和畸变以及表观遗传学上的修饰而失去了对利基的内在依赖。此外，2D癌细胞系，由于长期在体外传代，会发生快速的基因漂移，导致药物反应的显著差异。此外，匹配的正常细胞系并不总是存在，使得对癌症早期阶段的研究大多依赖于基因工程小鼠。在某些情况下，基因工程小鼠和患者衍生的异种移植（PDX）模型弥补了2D细胞系的不足，但高昂的成本、技术难度和缺乏可扩展性仍然是它们的限制。最近，3D类器官培养的出现为癌症研究提供了一种替代方法，可以弥合体外2D细胞系和体内小鼠模型之间的差距。类器官可以从两种类型的干细胞中建立：成人干细胞（ASCs）来自成人组织，具有组织特异性，或者多能干细胞（PSCs）可以是诱导多能干细胞（iPSCs）或胚胎干细胞。在这篇综述中，我们特别关注这些类器官模型在癌症研究中的使用，描述并比较代表肿瘤形成不同阶段的各种基于类器官的癌症模型，并讨论它们对癌症研究的贡献以及它们的局限性。 2.类器官类型 ASC和PSC类器官的衍生协议基本上不同。ASC类器官由培养基中的生长因子混合物支持，这些生长因子模仿正常干细胞稳态期间存在的因素。PSC类器官建立涉及通过逐步添加生长因子的方式进行分化，这种方式模仿胚胎发育期间的细胞信号。产生的癌症模型也具有不同的优缺点（表1），在选择适当的研究模型时应考虑这些因素。尽管如此，ASC和PSC类器官是互补的方法，它们共同提供了研究几乎所有人类癌症整个肿瘤进展过程的机会（图1）。图 1. 用于癌症模型的类器官由成人干细胞（ASC）和多能干细胞（PSC）衍生的各种类型的癌症类器官模型及其应用。CTC，循环肿瘤细胞；CAF，与癌症相关的成纤维细胞。 3.ASC衍生的类器官和生物银行 2009年，一项开创性研究表明，可以从小鼠Lgr5+肠道ASCs中建立3D肠道类器官。细胞在Matrigel中生长，并在长期培养中维持，补充干细胞利基调节因子（noggin、R-spondin1和表皮生长因子[EGF]）。从本质上讲，这个系统旨在模拟肠道干细胞（ISCs）通常所在的利基的各个方面。在体内，肠道上皮组织被组织成数百万的隐窝绒毛结构，其中ISCs位于隐窝的基部。Wnt信号和R-spondin1作为Wnt激动剂，在支持隐窝增殖方面的重要性已经得到了很好的确立。此外，EGF通过激活Ras信号通路增强隐窝增殖。noggin抑制绒毛中的骨形态发生蛋白（BMP）信号，导致形成许多异位隐窝单元。引人注目的是，为了在培养中复制这一点，只需要添加R-spondin1、EGF和noggin就可以成功形成类器官。后续研究表明，位于Lgr5+干细胞之间的Paneth细胞提供了Wnt来源。Matrigel提供了形成3D类器官的基质成分，因为它类似于富含层粘连蛋白的肠道隐窝基部。这些类器官展示了肠道隐窝绒毛结构，包含所有肠道细胞类型，重现了来源组织的生理肠道结构。同时，另一组开发了一种替代方法来培养肠道类器官：空气-液体界面（ALI）模型，涉及在部分空气暴露的胶原蛋白基质中培养包含上皮细胞和间充质细胞的小鼠肠道组织片段。自这两项突破性研究以来，已经成功地适应了从一系列正常组织及其相应的癌症中培养人类ASC衍生的类器官。对协议的改进提高了类器官形成的效率，使得从小活检、尿液、宫颈涂片甚至循环肿瘤细胞（CTCs）中建立肿瘤类器官成为可能。结果，成为可能建立大型的人类肿瘤类器官活体生物银行（图2A，在表2中详细总结）。近年来，类器官生物银行的数量激增，作为基础研究和临床设置中宝贵的资源。类器官模型也已通过各种途径商业化，如人类癌症模型倡议、美国典型培养物收集或MilliporeSigma。这些生物银行涵盖了广泛的肿瘤模型，重现了患者肿瘤的形态和分子异质性。相比之下，许多分子亚型没有代表性2D癌细胞系。图 2. 现有的人类癌症和癌前类器官模型 (A 和 B) 文献中描述的(A) 癌症和(B) 癌前ASC衍生类器官的类型。ALC，酒精性肝硬化；NASH，非酒精性脂肪性肝炎；PSC，原发性硬化性胆管炎；PanIN，胰腺上皮内瘤变；UC，溃疡性结肠炎；TSA，传统锯齿状腺瘤；SSA，静止性锯齿状腺瘤；HP，增生性息肉。此外，已建立了来自这些器官的癌前病变，如肠道增生性息肉、静止性锯齿状腺瘤（SSAs）/息肉、管状绒毛腺瘤、常规管状腺瘤癌前子宫内膜异位症、子宫内膜增生17 宫颈鳞状上皮化生胃肠上皮化生胃萎缩 Barrett上皮胰腺上皮内瘤变（PanIN）和一系列癌前肝病（图2B）。从携带杂合性胚系癌症易感性基因突变的个体中还生成了额外的ASC类器官（图2B；表3）。通过基于多组学的分析比较肿瘤衍生类器官和原始肿瘤组织，证实类器官在长期培养中稳定保持了亲本肿瘤的分子谱。 4.衍生ASC类器官的挑战建立癌症类器官的当前协议已在其他地方详细总结。每个协议都是根据对器官/癌症类型的深入生物学知识以及广泛的试错研究来提高效率而开发的。图3总结了正常和肿瘤类器官培养的条件。每种癌症类型都进行了特定的修改，以帮助避免正常细胞污染，同时增强癌症干细胞的活力（在表2中总结）。尽管如此，原始混合中的正常类器官可以胜过肿瘤类器官，最终在培养中占主导地位，特别是当培养条件不能特别有利于肿瘤细胞时。前列腺胃肺结肠和胰腺癌症类器官的研究都报告了这一有问题的现象。因此，通过全外显子组测序（WES）或目标捕获面板测序验证肿瘤纯度至关重要，因为癌症类器官的形态常常与正常类器官无法区分。减轻正常细胞污染和提高协议效率的策略包括撤回一些癌症中不再需要的利基因子，因为普遍存在的致癌突变。例如，撤回Wnt3a和R-spondin1大大改善了结直肠癌（CRC）类器官的形成，而撤回EGF在创建胰腺导管腺癌（PDAC）类器官时有效，因为>80%的CRCs和>90% PDACs分别携带APC和KRAS突变。在胃癌（GC）中，添加nutlin3a，同时从培养基中去除Y-27632、A8301、EGF和FGF10也提高了成功率，样品获取方式的调整也可以产生影响。例如，沿着胃肠道的浆膜侧取样增加了肿瘤纯度，并在传代过程中手动挑选肿瘤类器官可以帮助消除正常细胞污染。提高肿瘤类器官活力的其他方法包括在培养横纹瘤类器官时添加Y-27632以及在培养子宫内膜癌类器官时去除p38抑制剂。使用无血清、Afamin稳定的Wnt3a可以稳定培养PDAC类器官，因为标准Wnt3a条件培养基中的血清会触发胰腺类器官的细胞衰老。图3. 热图显示了各种正常和肿瘤类器官培养的条件每一列代表之前针对特定类器官类型报告的培养条件协议。彩色框表示在类器官扩增协议中使用指定的生长因子成分。大多数类器官类型都在包含AdDMEM/F12、HEPES、GlutaMAX和青霉素/链霉素的基础培养基中培养，但也有一些例外。星号表示使用肝细胞培养基、GlutaMAX和Primocin，而^表示使用DMEM/F12培养基、神经基础培养基、GlutaMAX和低谷氨酸非必需氨基酸混合物。#Jung等人69在培养正常结肠类器官时添加了前列腺素E2，其中使用LY2157229代替A8301来抑制TGF-b信号。LGG，低级别胶质瘤；BLCA，膀胱尿路上皮癌；KIRC，肾透明细胞癌；MRTK，肾脏恶性横纹肌样瘤；HNSC，头颈鳞状细胞癌；MEC，小细胞癌；ACC，腺样囊性癌；AciCC，腺泡细胞癌；SDC，唾液腺导管癌；ESAD，食管腺癌；STAD，胃腺癌；CRC，结直肠癌；PDAC，胰腺导管腺癌；HCC，肝细胞癌；CC，胆管癌；NSCLC，非小细胞肺癌；GEP-NENs，胃肠胰神经内分泌肿瘤；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌；UCC，子宫体子宫内膜癌；OVC，卵巢浆液性癌；PRAD，前列腺腺癌。即使有了这些协议修改，一些常见的癌症类型仍然难以用类器官来模拟，这表明需要进一步优化协议。有趣的是，一种称为条件重编程的替代方法，涉及辐照的小鼠成纤维细胞饲养层细胞与消化后的原代健康或癌细胞在rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）存在的条件下共同培养，允许几乎所有细胞类型来源的原代上皮细胞长期培养长达一百天，而无需遗传操作。这项技术已成功用于从非小细胞肺癌（NSCLCs）、前列腺癌和腺样囊性癌（ACC）细胞培养物生成患者衍生的细胞培养。条件重编程的前列腺和ACC癌细胞在异种移植的小鼠中产生了肿瘤，表明这可能是形成类器官率低的癌症类型的潜在替代方法。 5.ASC衍生的癌症类器官与2D癌细胞系的独特特征 5.1.利基因素和细胞-细胞/细胞-基质依赖性 ASC癌症类器官与2D癌细胞系之间的一个主要区别是，类器官仍然依赖于利基因素和细胞-细胞/细胞-基质相互作用来生存。因此，可以通过系统地撤回基本的利基因素、添加/撤回抑制剂或在无基质条件下培养，在肿瘤类器官上进行深入的功能表征。在此过程中，揭示了在癌变过程中发生的基因型-表型关联。几项关于没有WNT下游基因突变的ASC衍生癌症类器官的研究，例如APC或CTNNB1，已经揭示了赋予Wnt/R-spondin独立的机制。这些研究为Wnt信号在塑造肿瘤内细胞状态形态多样性和异质性方面的贡献提供了见解。在正常胃类器官中双敲除CDH1/TP53导致与R-spondin独立相关的弥漫性GC表型。同样，撤回试验鉴定了PDAC类器官中独立于Wnt和R-spondin的亚群。还评估了撤回ROCK抑制剂和/或无Matrigel生长条件。一项关于GC类器官的研究表明，细胞-细胞/细胞-基质独立性与浸润性肿瘤边缘、晚期肿瘤分期和转移相关，并且与公共GC患者数据集中的总体和无病生存时间较短的转录组特征相关。从早期GC的深层黏膜中分离的肿瘤类器官比来自浅表黏膜的配对肿瘤类器官更不依赖于细胞-细胞粘附，表明同一患者的肿瘤的不同部分可能表现不同。 5.2.谱系多样性、细胞可塑性和细胞状态转换类器官保留了来源组织的谱系多样性和细胞可塑性。例如，健康的前列腺和乳腺类器官包含能产生基底和腔系谱系的腔系和基底祖细胞。有趣的是，来自BRCA1突变携带者的乳腺上皮类器官显示出更高比例的腔系祖细胞，重现了在BRCA1突变携带者中作为癌症起始人群的腔系祖细胞的增加。单细胞RNA测序揭示了Wilms瘤衍生的类器官由三种不同的细胞类型（上皮、基质和胚细胞）组成，并且带有RSPO融合的APC野生型结肠癌细胞在Wnt撤回后仍保持其分化潜力，类似于健康的结肠类器官。撤回或补充外源性Wnt3a和R-spondin能够调节弥漫型GC或CDH1/TP53双敲除的正常胃类器官的组织学亚型规范和细胞可塑性，允许它们分别适应签戒细胞或非签戒细胞形态。这些观察结果与人类GC中的体内情况非常相似，签戒细胞在RSPO3低表达的区域中可见，非签戒环细胞弥漫形态与基质中RSPO3的表达相关。同样，PDACs在转录上可以分为两种细胞状态，更具侵略性的基底样状态和经典状态。通过单细胞RNA测序，一项研究确定了癌细胞在从经典状态过渡到基底样状态时可能经历的中间细胞状态。引人注目的是，使用患者活检和匹配的类器官的研究报告称，类器官在体外倾向于失去基底状态，这可以通过撤回培养基中的基本利基因素来恢复。用TGF-b处理的类器官被推向更具侵略性的基底样状态，而撤回TGF-b导致类器官恢复到经典状态。这些发现表明，生长条件或微环境可以调节细胞可塑性和细胞状态。不同的细胞状态随后导致不同的抗癌药物敏感性。这些结果与另一项谱系追踪研究一致，该研究将表达多色荧光蛋白的PDAC类器官移植到小鼠中，证明经典和基底样表型可以来自单个植入的细胞。因此，肿瘤的亚型受微环境的影响大于遗传学。这项工作清楚地表明，类器官对于未来研究人类癌症中肿瘤可塑性和细胞状态转换的机制具有巨大的前景，这两个过程由于它们有限的异质性而无法在细胞系中研究。结合CRISPR-Cas9编辑将报告基因、谱系追踪和消融盒敲入癌症类器官，然后进行小鼠异种移植，可以进一步利用类器官技术评估肿瘤细胞亚群，包括癌症干细胞和癌症启动、转移和药物耐受性。例如，在患者衍生的CRC类器官中敲入EGFP和谱系追踪盒到LGR5位点证实了EGFP-LGR5+癌细胞干细胞以高效率启动肿瘤异种移植，并且肿瘤细胞采用类似于正常结肠上皮的层次结构。另外两项研究将CRISPR工程化的LGR5特异性消融盒的CRC类器官异种移植，观察杀死LGR5+癌细胞干细胞在肿瘤中的效果。在这两项研究中，LGR5+细胞的消除最初阻止了肿瘤生长，但当LGR5特异性消融关闭后，由分化谱系中再生Lgr5+细胞的人群推动了肿瘤的再生。异种移植的类器官携带可诱导的Lgr5-EGFP-Confetti报告基因，证明肝脏转移是由Lgr5细胞播种的，但转移性生长取决于Lgr5+细胞的重新出现。在异种移植的人类CRC类器官中进行的活体遗传谱系追踪系统鉴定了休眠的LGR5+p27+细胞，这些细胞赋予了可逆的药物耐受状态，该状态依赖于细胞基质界面上COL17A1的粘附。类似地，另一项谱系追踪研究表明，一种独特的CRC干细胞群体，潜伏的Lgr5+细胞，表达高水平的Mex3a，可以下调Wnt/干细胞基因程序以保护自己免受化疗，并成为治疗后的主要残留肿瘤群体。然而，另一项研究发现，负责CRC复发的残留肿瘤细胞特征是高EMP1表达，CRISPR工程化的EMP1+细胞消融防止了异种移植小鼠中转移的复发。 5.3.保留异质性和病毒基因组癌症类器官保留原发性肿瘤的肿瘤内异质性和亚克隆结构是其另一个独特特征。在胃类器官队列中，几个案例显示了具有和不具有ERBB2或FGFR2的致癌性扩增的细胞亚群，模仿了体内肿瘤组织中观察到的区域异质性。引人注目的是，这种异质性在长期培养中得以维持。癌症类器官还显示出在长期培养中维持病毒基因组，使得能够研究与感染相关的癌症。从与Epstein-Barr病毒（EBV）相关的胃癌或鼻咽癌（NPCs）中建立的类器官能够保留EBV病毒基因组和病毒潜伏期，与大多数2D NPC细胞系已经失去了它们的EBV基因组形成对比。因此，与2D细胞系相比，癌症类器官更密切地重现了原发性肿瘤，为研究信号通路、肿瘤内异质性和与感染相关的肿瘤发生提供了强大的工具。 6.ASC衍生的类器官用于研究癌症发病机制能够从多种器官中培养出健康的上皮细胞，为研究癌症逐步发展和理解环境致癌物暴露的影响提供了激动人心的机会。图4总结了使用正常结肠ASC类器官或癌前/早期肿瘤类器官来模拟早期肿瘤转化和肿瘤进展的研究报告示例。上皮器官的癌症是与老龄化人群相关的最常见的恶性肿瘤，但导致ASCs中体细胞突变积累的因素以及它们如何促进恶性转化尚不清楚。肠道隐窝提供了一个独特的模型，用于研究体细胞突变和克隆扩展。从肠道粘膜中建立的混合类器官培养通常是多克隆的，来源于许多腺体的集合，每个隐窝都有由亚克隆体细胞突变特征的，主要是乘客突变（图4A和4B）。ISCs在个别隐窝内竞争，最终走向单克隆性。因此，来自单个正常细胞的克隆类器官可以进行功能研究，对于理解癌症相关过程可能非常有价值。例如，从患有溃疡性结肠炎的患者中分离的克隆类器官显示出经常是双等位基因的截断突变，涉及IL-17-NF-kB途径，这与在溃疡性结肠炎组织中观察到的克隆扩展一致（图4D）。尽管这些突变在癌症中没有富集，但它们赋予了克隆类器官对IL-17A诱导的凋亡的抗性，提高了炎症环境中的细胞存活率。图4. 结肠类器官的类型，从正常到癌前病变及其应用 (A) 正常结肠上皮包含不同异质性克隆的混合物。(B) 正常结肠类器官的长期培养导致克隆优势。克隆类器官可以长期培养，有或没有CRISPR工程化的肿瘤驱动基因突变，或暴露于细菌/药物。亚克隆培养，随后进行测序是一种可以用来询问基因组景观随时间或添加剂变化的方法，这一点通过在LS正常结肠上皮中确认基因组稳定性和在各种类器官模型中识别几种突变特征的原因得到了证明。(C) 在正常结肠类器官中重新创建特定组合的癌症驱动基因突变或进行全基因组CRISPR筛选，产生了各种癌前和肿瘤类器官模型，以及识别赋予Wnt激活和TGF-b抗性的目标。(D) 溃疡性结肠炎(UC)上皮展示了克隆扩展的概念，炎症微环境推动了抵抗IL-17途径的突变克隆的扩展。(E) 不同腺瘤类器官模型在研究癌症发病机制中的多种用途。正常类器官工程化了5个肿瘤驱动基因突变发展了微小转移，而CIN腺瘤但不是GS腺瘤类器官工程化了3个肿瘤驱动基因突变在异种移植小鼠模型中发展了巨大转移。UC，溃疡性结肠炎；LS，Lynch综合征；SSA，静止性锯齿状腺瘤；TSA，传统锯齿状腺瘤；CRC，结直肠癌；FAP，家族性腺瘤性息肉病；GS，基因组稳定；CIN，染色体不稳定性。克隆健康类器官也可以在有无药物、感染因子的情况下进行长期培养，或使用CRISPR-Cas9基因编辑来识别固有的遗传不稳定性、表征突变特征，并识别致突变剂（图4B）。在培养的终点，可以进行最终的克隆步骤，以扩展单个克隆细胞进行测序。随后，从亲本克隆中筛选出突变，以揭示体外获得的突变。一项研究使用CRISPR-Cas9删除DNA修复基因，MLH1和NTHL1，然后进行亚克隆和WGS。他们发现，MLH1缺陷的类器官具有与错配修复缺陷的CRC一致的突变特征，而NTHL1缺陷的类器官具有与突变特征30相关的特征，这之前在一名携带NTHL1胚系无义突变的乳腺癌患者中被识别出来。此外，将肠道类器官暴露于两种药物的组合，更昔洛韦（GCV）和莫昔芬（MMF），重新创建了在之前接受这两种药物治疗巨细胞病毒感染和移植物抗宿主病的CRC患者中观察到的突变特征，表明类器官中的突变特征是由GCV诱导的，并且被MMF进一步增加。相比之下，来自携带杂合性胚系突变的Lynch综合征患者的正常胃或肠道类器官没有显示出增加的突变率，表明在第二个失活突变建立之前不存在单倍体不足。 6.1.与正常和癌前类器官共培养的微生物通过感染微生物可以在类器官中重现突变特征。经过5个月反复腔内注射基因毒性pks+大肠杆菌的肠道类器官，这种病原体已知会在培养细胞中诱导双链DNA断裂，显示出在一部分人类CRC患者中观察到的突变特征，但在其他癌症类型中没有。这一发现暗示了过去暴露于pks+ E. coli可能是那些患者的潜在致癌因素。健康的人类类器官也被其他类型的微生物感染，包括已知与癌症发展相关的细菌和病毒。例如，人类胃类器官被幽门螺杆菌感染，这种病原体会导致胃溃疡和胃癌，导致通常在体内观察到的炎症反应和上皮增殖增加。另一项研究从正常人类口腔粘膜组织中生成类器官，并将它们分别暴露于HSV和HPV感染。这两种类器官系都显示出病毒DNA的增加，即使在传代后也得以维持，暗示持久感染。此外，iPSC和ASC模型突出了人类肝脏类器官模型在体外研究乙型肝炎病毒（HBV）感染和复制方面的潜力，未来可能用于研究与HBV相关的HCC进展。这些研究为解决微生物组在肿瘤发生中的参与提供了方法，由于缺乏适当的体外和动物模型，这一点以前探索得很少。 6.2.ASC衍生的小鼠类器官模型用于研究癌症发病机制直接从患者样本中建立肿瘤类器官仍然是一个挑战。或者，可以从基因工程小鼠模型（GEMMs）中衍生ASC类器官，并在体外快速扩展以建立生物银行。来自人类或GEMMs的正常或早期肿瘤类器官作为研究癌症早期演变途径的良好工具（图4E）。一项共培养研究表明，小鼠Apc突变类器官分泌Notum。当这些Apc突变类器官与野生型小鼠肠道类器官共培养时，Notum通过推动野生型ISCs分化并导致Apc突变ISCs的克隆固定，抑制了野生型类器官的生长（图4E）。与这些发现一致，在小鼠中诱导Apc突变之前用Notum抑制剂处理减少了腺瘤的形成。这些研究突出了遗传小鼠模型和类器官如何协同工作并被利用，从而显著加速研究发现。小鼠类器官易于基因组编辑以诱导驱动突变，并且可以植入同种型和免疫能力的小鼠中以模拟肿瘤发生和转移。例如，为了模拟CRC的发展，携带不同组合驱动突变的小鼠类器官，无论是来自GEMMs的肿瘤/转移还是通过体外基因编辑，都被移植到同种型小鼠的盲肠壁上，用于原位肿瘤形成和转移发展。这些模型证实了TGF-b信号在肿瘤微环境中的作用，促进免疫逃逸并介导癌症转移。另一项研究生成了一种人类化的微卫星稳定的CRC小鼠模型，并确定EMP1+细胞是转移复发的起源细胞。类似地，乳腺肿瘤类器官可以从GEMM肿瘤中衍生出来，在2-3周内并原位移植形成肿瘤，重现原始肿瘤的上皮形态和药物反应。也已经开发了免疫能力的基于类器官的小鼠模型用于卵巢癌和肺腺癌。它们可能代表了与GEMMs相比，模拟癌症发病机制的更强大的平台，GEMMs可能开发起来耗时且技术上具有挑战性。 7.CRISPR-Cas9编辑ASC衍生的类器官 CRISPR-Cas9被用来在健康类器官中工程化组合驱动突变，以重新创建癌症（图4C；表4）。两项开创性研究同时证明，工程化APC、TP53、KRAS或PIK3CA和SMAD4突变的组合结果是人类肠道类器官，这些类器官在所有干细胞利基因素的独立下生长，并能够在小鼠中形成具有侵袭性癌症特征的肿瘤移植物。这些四重突变类器官的原位移植到小鼠盲肠引起了宏观的肺和肝转移。在三重敲除（APC-/-，TP53-/-和KRASG12D）人类类器官中过表达Noggin，当Noggin没有过表达时，在体内具有有限的生长潜力，导致与四重突变类器官相似的肝脏转移。由于这些类器官能够独立于所有利基因素生长，这些发现提出了利基独立可能介导转移的可能性。然而，不能排除其他未知因素。例如，患者衍生的原发性CRC和配对的转移性类器官总是显示出一致的利基因素依赖性，一些患者衍生的肝转移类器官仍然高度依赖于利基因素。染色体不稳定性也可能是一个贡献因素，如下文更详细讨论。已经发表了几种CRC的锯齿状肿瘤途径模型。一项研究通过工程化大染色体重排来生成RSPO融合基因，以及在人类结肠类器官中的BRAFV600E和TP53突变（图4C）。将这些人类结肠类器官异种移植到小鼠结肠中产生了锯齿状病变，重现了人类的SSAs。在类器官中除了BRAFV600E、TP53敲除和RSPO融合外，过度表达GREM1，结果在小鼠中形成了息肉状肿瘤，其组织学特征类似于传统的锯齿状腺瘤。有趣的是，与正常结肠类器官相比，RNF43-/-人类SSA类器官对RSPO的依赖性较小，为RNF43突变在锯齿状肿瘤途径中的致病作用提供了功能支持。另一项研究将正常结肠类器官与BRAFV600E突变工程化后，用TGF-b处理。TGF-b在正常类器官中触发了凋亡，但在BRAFV600E突变类器官中没有，而是诱导了上皮-间充质转化（EMT）和转录特征，模仿了在人类锯齿状肿瘤病变中观察到的特征。除了由癌症驱动基因突变引起的遗传损伤外，使用类器官还可以探索肿瘤进展过程中染色体不稳定性的作用。具体来说，工程化了五种肿瘤驱动突变（APC、SMAD4、TP53、KRASG12V和PIK3CAE545K）的正常结肠类器官能够在注射到小鼠脾脏后在肝脏形成微小转移灶（图4E）。相比之下，染色体不稳定而不是染色体稳定的腺瘤类器官，工程化了三种驱动因素（SMAD4、TP53、KRASG12V或PIK3CAE545K），在肝脏中形成了大的转移肿瘤，显示出组织学恶性。随着越来越多的癌前或早期肿瘤类器官模型的可用性，这些模型捕获了不同形式的遗传或表观遗传异常，研究人员现在有了前所未有的机会进行精细的调查，以确定有助于肿瘤发生的因子。使用CRISPR-Cas9基因编辑在各种组织的正常类器官中成功模拟其他癌症类型的示例总结在表4中。这些包括在人类胃类器官中工程化ARID1A和TP53突变以模拟胃肿瘤；在胰腺类器官中KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4突变以模拟PDAC38；在乳腺类器官中TP53、PTEN、RB1和NR1突变以模拟管腔肿瘤；在人类导管类器官中TP53、SMAD4、NF1、PTEN和BAP1突变以模拟胆管癌；在小鼠食管类器官中Sox2过表达和p53和p16突变以模拟食管鳞状细胞癌。全基因组CRISPR筛选也已在正常类器官中使用，以确定肿瘤发生的目标。两项研究在人类肠道类器官中进行了CRISPR-Cas9筛选，并确定了赋予对TGF-b介导的生长抑制的抗性的基本目标，这对于CRC发展至关重要。在培养中对小鼠胃类器官进行Wnt3a撤回，进行了类似的筛选，以确定以前未被重视的赋予Wnt激活的因素。总的来说，这些在正常或早期肿瘤类器官中的研究表明，多个癌症驱动基因的基因组编辑，无论是顺序还是组合，都可以模拟体内癌症发病机制。它们为这些基因在癌症进展中的基本功能提供了宝贵的见解。此外，将全基因组CRISPR筛选应用于正常类器官的成功，为将来在肿瘤类器官中识别治疗反应或抗性的遗传脆弱性提供了概念验证。 8.PSC衍生的类器官类器官也可以从PSCs，无论是胚胎的还是诱导的，生成。人类胚胎干细胞受到伦理规定的限制，这阻碍了它们的广泛使用。相比之下，iPSCs涉及将体细胞重新编程回到多能性。第一步是将iPSCs定向分化为三个胚层（内胚层、外胚层和中胚层）。然后，细胞在3D基质中培养，使用特定的生长和信号因子引导它们朝着所需器官的细胞系发展。这一模型的主要挑战是在体外忠实地模拟所有体内生化线索，这些线索在正确的时间、位置和浓度下推动细胞分化和3D组织形成，就像在胚胎发育过程中发生的那样。最初通过使用活化素A处理人类PSCs来建立PSC衍生的类器官，以驱动内胚层身份，随后与FGF4和Wnt3a共同孵化以促进后肠分化。这一协议最终产生了表达特定肠道标记物的肠道类器官，如CDX2和KLF5。自那时以来，PSC类器官技术已广泛用于疾病建模。到目前为止，已经成功创建了许多PSC衍生的类器官，包括用于大脑、胃、肺、胰腺、食管、肾脏、肝脏、等等。所有这些模型都为干细胞生物学和器官发育提供了重要的见解。然而，使用PSC衍生的类器官进行癌症研究的一个重要警告是，它们缺乏直接从肿瘤组织中衍生的ASC类器官在培养中保留的获得性癌症基因突变。为了绕过这个问题，人们尝试将癌细胞直接重新编程为PSCs以了解肿瘤过程。然而，成功的结果相对较少，其中大部分主要涉及血液癌症，包括从急性髓性白血病、慢性髓性白血病、和幼年型单核细胞白血病。有趣的是，尽管携带相同的遗传异常，从白血病细胞衍生的iPSCs通常缺乏白血病潜力。然而，当它们被诱导分化为造血干细胞时，它们的白血病表型重新出现。尽管如此，这种方法为存储白血病样本和研究患者特定突变与疾病表型之间的相互作用提供了机会。或者，将致癌突变工程化到PSC细胞中，然后诱导分化为特定器官以模拟来自胰腺、肺、胃、视网膜和大脑的癌症是另一种策略（表4）。这种方法在从PSCs生成大脑类器官方面特别成功，使用CRISPR-Cas9编辑用于工程化大脑类器官，这些类器官具有在脑肿瘤中观察到的最频繁的单次和组合突变。产生的肿瘤性脑类器官代表了不同的脑肿瘤类型，包括中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤和胶质母细胞瘤。此外，分化的PSC衍生的脑类器官被用作健康大脑替代品，以研究肿瘤-胶质细胞相互作用。通过与胶质瘤干细胞或传统的肺癌细胞系共培养，可以模拟大脑环境并分析细胞迁移和细胞-细胞相互作用，模仿胶质母细胞瘤侵袭或上皮性恶性肿瘤转移到大脑。最后，从患有癌症易感性综合征的患者的体细胞中重新编程为PSCs被用来模拟来自具有胚系APC、GNAS或BRCA1突变的患者的癌症类型（表3）。 9.使用类器官研究药物反应体外模型相对于动物模型的一个优势是它们对高通量药物敏感性筛选的适应性。具体来说，癌细胞系几十年来一直被用于在应用到体内模型之前评估药物效力。这由癌症细胞系百科全书（CCLE）和癌症药物敏感基因组学（GDSC）进行的研究证实。这些项目的目标是构建一个有用的数据库，以识别药物反应和癌症基因组之间的相关关联，并反过来指导个性化治疗。同样，癌症患者衍生的类器官可以适应大规模机器人药物筛选。使用患者衍生的CRC类器官的概念验证研究说明了西妥昔单抗和Nutlin-3a对KRAS和TP53野生型癌症类器官生长抑制的有效性。在癌症类器官中还进行了其他药物筛选测定，包括乳腺癌、膀胱、头颈鳞状、肝脏、NPC、卵巢、胰腺、前列腺、和胃癌症类器官。其中一些体外药物反应进一步使用体内异种移植进行了验证。进行药物筛选的详细协议，从细胞分离到数据分析，已在其他地方总结。最近对协议的改进使得可以在正常、前体和肿瘤类器官中进行筛选；提高了可扩展性；并将读数从细胞活性测定扩展到基于图像的高含量表型分析。在HER2过表达的乳腺癌类器官中也描述了有利的基因-药物相关性，这些类器官对阿法替尼敏感，在ARID1A突变的胃类器官中对共济失调毛细血管扩张和Rad3相关激酶（ATR）抑制剂敏感，在MTAP突变的胰腺癌类器官中对PRMT5抑制剂有反应，40 在CHFR表观遗传学沉默的结肠癌类器官中对紫杉醇有反应。除了使用癌症类器官来确认已知的基因-药物关联外，类器官模型预测标准疗法的临床反应的能力也经过了严格的测试。一个转移性CRC和食管胃类器官的生物银行证明了患者和癌症类器官对标准治疗药物紫杉醇和5-氟尿嘧啶之间的一致反应。其他癌症类器官类型的研究也证明了它们在预测患者治疗反应方面的稳健性。此外，从同一个体建立的纵向PDAC类器官反映了逐渐获得对化疗治疗的抗性。除了预测药物反应外，几个先进的直肠癌症类器官模型在体外以及在通过内窥镜注射到小鼠直肠后显示出预测对化疗放疗的反应的潜力。值得注意的是，这些研究大多数只涉及少数患者，需要进行更大规模的相关研究和更长时间的患者随访，以验证这些患者衍生的类器官的真正预测潜力。类器官药物筛选的另一个目标是确定新的治疗靶点。不同类器官队列的初步药物筛选研究已经取得了令人鼓舞的数据，为癌症患者提出了几种治疗策略，尽管需要在更大的癌症类器官队列中进一步验证。例如，一部分原发性肝癌类器官在接受细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂（SCH772984）治疗后显示出生长抑制，但它们对其他大多数临床相关化合物都具有抗性，这些结果在异种移植的小鼠中得到了验证。另外，儿童Rhabdoid癌症类器官模型和相应的PDX模型已经确定Neddylation作为一个有吸引力的治疗靶点。更重要的是，这项研究评估了Neddylation抑制剂MLN4924对健康组织（包括肾脏、肝细胞和小肠类器官）的毒性，强调了使用正常类器官进行毒性测试的可行性。另一项研究产生了一大型针对癌症干细胞的双靶点双特异性抗体库，并使用患者来源的CRC类器官生物库进行功能性筛选。作者还使用了配对的健康类器官来评估治疗抗体在药物筛选管道的最早阶段的毒性。该研究成功鉴定了一种针对几种表达LGR5的上皮癌症类型的潜在治疗性双特异性抗体，MCLA-158，具有EGFR和LGR5臂。尽管ASC癌症类器官是探索药物-基因相互作用的探索性模型，但具有CRISPR工程化致癌突变的ASC或PSC衍生类器官，具有低体细胞突变背景，可以精确地确定合成致死伙伴或药物（单一或组合）以针对特定基因或途径。最近，在ARID1a/TP53敲除胃类器官中对>2,000种小分子进行了高通量筛选，确定了ARID1a突变细胞对组蛋白去乙酰化酶和Survivin抑制剂的敏感性。类似地，在携带Trp53、Rb1和Pten突变以及Kras和c-Myc过表达的小鼠来源的膀胱癌类器官上进行了表观遗传药物的小分子筛选，确定了Sirt1作为治疗靶点。此外，在PSC衍生的肿瘤性脑类器官上成功进行了一小组EGFR抑制剂的药物筛选。尽管需要长达40天的治疗期，但这项研究证明了Afatinib对EGFR过度激活的GBM类器官亚群的生长抑制作用。与正常视网膜类器官相比，用卡铂、雷帕霉素或两种脾酪氨酸激酶（SYK）抑制剂处理PSC衍生的RB1缺陷类器官模型的视网膜母细胞瘤，提供了除人类视网膜母细胞瘤细胞系之外的替代模型，以进一步验证它们的有效性。最后，来自经过验证的转基因小鼠模型的ASC衍生类器官允许快速表征药物反应及其细胞、机制、功能和药理效应。来自代表不同GC亚型的转基因小鼠模型的肿瘤样本的胃类器官在体外显示出不同的药物治疗效果。另一项研究表明，表达RhoAY42C/+与Cdh1缺失的弥漫性GC细胞系以及来自弥漫型GCs转基因小鼠模型的胃类器官都对焦点粘附激酶（FAK）抑制剂敏感，支持FAK作为这种癌症类型的治疗靶点的相关性。这些配对的类器官-小鼠模型允许高效、无偏见、并行地测试由一组定义的基因组异常引起的药物反应。 10.使用类器官衍生的异种移植作为临床前模型尽管PDX模型被认为是体内肿瘤的良好代表，但它们成本高，移植成功率低，需要长时间的培养。患者衍生的类器官异种移植模型可能为这一未满足的需求提供解决方案，并在表2中进行了总结。最简单的方法涉及将健康、癌症或基因修饰的类器官与Matrigel共注射到小鼠侧腹，这不需要高级的外科技术来执行，并给出一个容易观察的读数。然而，皮下类器官移植的植入率可能很低，并且不能重现自然的肿瘤微环境，因为缺乏血管系统阻碍了为肿瘤生长提供必要的利基因素。为了解决这个问题，几个小组将癌症/工程化类器官注射到裸鼠的肾下囊或脾脏中，这两个都是高度血管化的环境，确保了丰富的营养、激素、生长因子和氧气供应给移植的类器官，大大增强了植入率。移植的细胞可以直接进入血液并转移到肝脏，在那里它们增殖形成次级病变，这使得它成为研究人类肿瘤肝转移的理想平台。然而，这个模型仍然不能复制癌症的自然肿瘤微环境。这个限制由一个研究所说明，在该研究中，依赖Wnt和R-spondin的GC类器官未能在肾下囊植入，除非它们与产生Wnt和R-spondin的、来自肠道类器官的成纤维细胞共注射。已经开发了几种原位异种移植模型，为异种移植形成提供了更具生理学相关性的微环境。然而，它们涉及复杂和侵入性的外科手术。与肾囊或皮下空间相比，原始组织环境提供了支持类器官植入的生长因子，这一点通过在结肠环境中弥漫型GC类器官的异种移植效率增加得到了证明，最有可能是由于该位置的Wnt和R-spondin的可用性。到目前为止，癌症类器官已经被直接注射到胰腺尾部、胃浆膜和卵巢囊的NGS小鼠中，这些研究都证明了类器官重现肿瘤过程的能力。几项研究还成功地进行了小鼠类器官的原位移植到盲肠粘膜壁，这不需要外科切口。这种方法随后被改编为将患者来源的CRC类器官和正常人类结肠类器官移植到小鼠结肠中。这些方法允许对异种移植形成进行内窥镜监测，并可以应用于正常人类类器官进行体内谱系追踪。另一项研究报告说，体外药物敏感性可以在其体内原位模型中重现。总的来说，这些报告强调了基于类器官的原位异种移植模型在促进我们对相关生理环境中肿瘤发生的了解方面的高价值，为它们在转化研究和个性化治疗中的使用铺平了道路。 11.局限性与未来展望尽管类器官技术已经彻底改变了癌症研究，并具有广泛的潜在应用，但它仍然面临技术限制。尽管来自ASC的肿瘤类器官在基因组上通常是稳定的，但也有例外。如上所述，来自肠道腺体的普通类器官在长期培养中可能会倾向于克隆优势，这影响了用于全基因组CRISPR筛选的普通类器官的使用。类器官在长期培养中也可能获得新的突变，尽管这些突变通常是亚克隆的、随机的，并且主要影响非编码区域。具有固有基因组不稳定性的类器官可能会更快地获得突变，正如一项研究所示，该研究使用了一个微卫星不稳定的肿瘤类器官。有趣的是，这种固有的不稳定性已被用来模拟肿瘤演化的早期阶段。例如，一项研究追踪了经TP53突变工程化的胃类器官中染色体拷贝数的变化，并注意到在2年的时间里逐渐出现的非整倍性。即使类器官基因组和突变谱是稳定的，表型不稳定性也可能由生长条件的变化引起。一个亚群的尿路上皮癌类器官在亲本肿瘤中显示了腔系亚型，但随后作为类器官转变为基底亚型，尽管亚克隆突变的频率没有可检测的变化。这些基底类器官在异种移植中生长时又恢复了腔系表型，表明类器官培养条件与异种移植环境是这种表型可塑性的原因。显然，对调节表型的因子的更好理解将导致类器官模型的改进。已经改良生长因子，以提高肠道类器官中的分泌系规范和肝脏类器官中的肝细胞规范。在低氧或无锚定条件下培养也可能为肿瘤类器官相对于普通类器官提供选择优势。目前，使用类器官的高通量药物筛选大多涉及直接对肿瘤类器官有影响的药物。除非使用更复杂的共培养模型，否则单独的类器官在筛选阻断肿瘤-基质或肿瘤-免疫相互作用的药物时不会提供有用的结果。利基因子的存在可能进一步限制筛选中使用的小分子抑制剂的类型。例如，BMP和TGF-b抑制剂在常规类器官培养中是必需的，这阻止了相关激动剂在药物清单上的使用。只有在肿瘤类器官自分泌Wnt的情况下，Wnt抑制剂筛选才有可能，但它无法模拟来自肿瘤基质的Wnt来源的阻断。类器官培养中增殖性干细胞的主导地位可能会夸大它们对针对细胞周期的药物的反应。最后，培养条件和类器官大小已被证明可以改变细胞可塑性，如在PDAC和CRC类器官中所示，这反过来可能影响药物反应。因此，基于类器官药物筛选的发现将需要通过临床前研究和临床试验进行广泛验证。迄今为止，几种类器官培养方法已经开始将微环境的一些组分，如基质细胞、血管和免疫细胞，纳入它们的类器官中，使它们在生理上更具相关性（图1和4）。与癌症相关成纤维细胞共培养的胰腺肿瘤类器官表明，来自基质的外源性Wnt供应可以增加依赖Wnt的PDAC细胞的肿瘤潜力。此外，将肿瘤类器官和自体T细胞共培养导致患者特异性肿瘤反应性T细胞的扩增，这是采用性T细胞转移的潜在临床策略。另一种方法涉及基于3D生物打印的模型，该模型由组织基质的关键组分组成，包括癌症相关成纤维细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，创建了一个多层的“组装体”。引人注目的是，内皮细胞能够形成功能性的血管网络，支持肿瘤生长。对组装体的分析揭示了一个旁分泌循环，即成纤维细胞分泌的BMP在肿瘤中诱导FOXA1表达，这反过来又推动了增强子重编程，赋予肿瘤亚型可塑性。与传统的膀胱肿瘤类器官相比，组装体对化疗药物的敏感性也较低。此外，还描述了一个“器官-血管网”模型，该模型涉及将人类CRC或正常肠道类器官与修饰形式的内皮细胞共培养，这些细胞过度表达胚胎限制E26转化特异性（ETS）变异转录因子2（ETV2），形成可灌注的血管网络。有趣的是，这种共培养模型表明，与CRC类器官中预后不良和转移相关的基因上调。最后，AL方法已成功适应建立100个ALI肿瘤类器官，来自28种不同的癌症类型。另一种方法从患者肿瘤的针刺活检中生成微器官球体。将肿瘤消化成Matrigel中的悬浮细胞，然后与油混合以生成基于微流体的液滴进行后续培养和药物筛选，可在14天内得出结果。这两种模型都能保留肿瘤微环境，包括肿瘤浸润性淋巴细胞，使未来在免疫肿瘤学研究中具有潜在应用。当然，这些改进和对现有协议的调整是令人兴奋的，但模拟癌前环境又是另一个挑战。癌前细胞与基质组分之间的相互作用无疑在肿瘤发生中起作用。事实上，与L2-IL-1B小鼠的中性粒细胞共培养的小鼠Barrett食管类器官以剂量依赖性方式增加增殖和类器官生长，表明中性粒细胞对BE上皮细胞有直接刺激作用。未来，看到其他方法如何将癌前微环境纳入类器官模型将是有趣的。用于类器官培养的试剂和协议，无论是用于癌前研究还是更普遍的研究，都需要改进和标准化，如果类器官要在临床应用中使用的话。目前，Matrigel是类器官培养协议中最广泛使用的支架，但它是动物来源的，定义不清，批次间变化，并且存在免疫原转移的风险。所有这些限制都阻止了它在临床应用中的使用。也许在低百分比基质条件下的悬浮培养技术或使用下一代设计基质将解决这个问题，并将类器官的应用扩展到临床环境。重要的是，类器官系仍然大多是手动生成的，每个实验室都使用自己的修改协议。最终，类器官衍生/增殖协议将必须标准化和自动化，以增加可重复性和可扩展性。 12.结论鉴于迄今为止已经成功建立的健康和癌症类器官的广泛多样性，发展微流体方法以提高药物筛选的吞吐量，以及将肿瘤微环境纳入这些设备的潜力（在图5中总结），我们可能会在不久的将来看到类器官模型测试作为患者药物处方的补充。此外，类器官模型及其与动物模型的协同作用将为分析复杂的旁分泌相互作用提供手段，加速发现到癌症发展的最早步骤，从而提供发现有效的癌症预防策略的机会。图5. 显示了癌症模型中类器官培养技术进展的时间线。与ASC衍生类器官相关的主要事件以蓝色文本列出，而与PSC衍生类器官和ALI类器官模型相关的事件分别以黄色和绿色文本显示。ASC，成人干细胞；PSC，多能干细胞；ALI，空气-液体界面；PDAC，胰腺导管腺癌。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

ASCO会议

2024-07-30

·今日头条

强效抗肿瘤！华中科技大学夏丽敏团队：发现肝癌联合免疫治疗策略

本文为转化医学网原创，转载请注明出处作者：Jerry 导读：尽管免疫治疗在肝细胞癌(HCC)的治疗中取得了成功，但HCC仍然严重威胁人类健康。 7月29日，华中科技大学夏丽敏研究团队在期刊《Advanced Science》上发表了研究论文，题为“SOX12 Facilitates Hepatocellular Carcinoma Progression and Metastasis through Promoting Regulatory T-Cells Infiltration and Immunosuppression”，本研究揭示了一个关键的转录因子SOX12，它诱导肝脏肿瘤微环境的免疫抑制。在HCC同种移植模型中过表达SOX12会增加肿瘤内调节性T细胞（Treg）的浸润，减少CD8+T细胞的浸润，并加速HCC转移。在DEN/CCl4诱导的HCC进展和转移中，特异性敲除肝脏SOX12可减轻病情，而特异性敲入则会加速这些效应。机制上，SOX12通过转录激活C-C型趋化因子配体22（CCL22）表达，促进Treg的招募和抑制活性。此外，SOX12转录上调CD274表达，抑制CD8+T细胞浸润。敲低CCL22或PD-L1会减弱SOX12介导的HCC转移。通过抑制CC趋化因子受体4（CCR4），即CCL22的受体，或通过抑制特异性敲除Treg的CCR4，可以阻断SOX12介导的HCC转移。在HCC细胞中，SOX12过表达的上游信号被鉴定为转化生长因子β1（TGF-β1）/TGFβR1-Smad2/3/4。将C-021或TGFβR1抑制剂Galunisertib与抗PD-L1结合在两种HCC模型中显示出增强的抗肿瘤作用。总之，这些发现表明，SOX12通过CCL22/CCR4-Treg和PD-L1-CD8+T轴参与HCC的免疫抑制。阻断CCR4或TGFβR1可改善SOX12介导的HCC对抗PD-L1疗法的疗效。 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202310304 背景知识 01 肝细胞癌（HCC）是全球严重的健康负担。长期以来，HCC的治疗选择很少，但近年来免疫检查点阻断（ICB）取得了重大突破。经典的免疫检查点，如程序性死亡1（PD-1）主要表达在免疫细胞中，而其配体程序性死亡配体1（PD-L1）则在肿瘤细胞和其他细胞中频繁表达。在肿瘤免疫微环境中（TIME），免疫细胞通过配对的免疫检查点或其他信号与肿瘤细胞相互作用，形成一个异质性和免疫抑制的生态系统，促进肿瘤进展和转移。到目前为止，ICB的低响应率和免疫毒性严重阻碍了其在HCC患者中的应用，凸显了全面了解HCC细胞与免疫细胞相互作用的必要性。调节性T细胞(Tregs)是一种T细胞类型，其特征是表达CD25和叉头框蛋白3(Foxp3)，通过负向调节免疫反应来维持免疫系统稳态。由于其免疫抑制特性，Tregs通常在形成抑制性TIME中发挥关键作用。相关机制包括抑制效应T细胞或分泌抑制性炎症因子(TGF-β1、IL-10和IL-35)。Tregs广泛浸润于各种肿瘤中，并通过多种机制促进肿瘤进展和转移。其中，CC趋化因子受体4(CCR4)及其配体C-C型趋化因子配体22(CCL22)是负责招募Tregs并促进肿瘤免疫逃逸的主要趋化因子。CCR4在90%以上的人类Tregs中表达，CCL22也在许多人类癌症中过度表达。一些研究强调Tregs在HCC进展和转移中的重要性。然而，Tregs在HCC中的浸润机制和Tregs与HCC细胞之间的相互作用仍不完全清楚。重要研究发现 02 鉴于SOX12-CCL22/CCR4和SOX12-PD-L1轴在TIME重构和HCC进展和转移中的关键作用，研究人员评估了CCR4抑制剂(C-021)联合pd - l1抑制剂在HCC模型中的抗肿瘤效果。肝内原位移植模型显示，与溶剂组相比，给予C-021或抗pd - l1均能减缓肿瘤生长，提高小鼠生存率，并相对控制肺转移。然而，与两个单药组相比，C-021和抗pd - l1联合治疗显著抑制了这些sox12介导的促肿瘤作用。与两个单药治疗组相比，联合治疗也显著提高了CD8+ t细胞的比例。此外，研究人员在DEN/ ccl4处理的Sox12HepOE小鼠模型中评估了C-021联合抗pd - l1的疗效。与两个单药治疗组相比，联合治疗组小鼠肿瘤负荷显著降低，肝功能改善，免疫抑制微环境恢复。 CCR4抑制剂C-021联合抗pd - l1可抑制sox12介导的HCC进展和转移此外，既往研究表明，TGFβR1抑制剂Galunisertib联合抗pd - l1在多种肿瘤中具有良好的抗肿瘤效果。然而，它们对HCC的作用尚不清楚。为此，研究人员使用Galunisertib和抗pd - l1治疗原位HCC模型和DEN/ ccl4治疗的Sox12HepOE模型。联合治疗组在抑制肿瘤进展和转移方面比Galunisertib或抗pd - l1单药治疗更有效，并且生存率更好。在Galunisertib组和联合治疗组中观察到类似的treg抑制。然而，与其他两种单药治疗相比，联合治疗显著增加了效应性CD8+ t细胞的浸润。这些结果表明，C-021或Galunisertib联合抗pd - l1显示出更显著的抑制sox12介导的HCC进展和转移的能力。综上所述，本研究描述了转录因子SOX12对肝癌免疫微环境的一种新的调节机制，并提出了两种潜在的联合免疫治疗策略。研究小结 03 综上，本研究证明了TGF-β1/Smad2/Smad3/Smad4信号诱导肝癌细胞中SOX12的过表达。上调的SOX12通过促进CCL22/ ccr4介导的Treg募集和功能增强，诱导pd - l1介导的免疫逃逸，重塑免疫抑制微环境，促进HCC进展和转移。本研究结果为肝癌细胞、treg细胞和CD8+ T细胞之间的交流提供了新的见解。研究人员还评估了两种联合免疫治疗策略对sox12介导的HCC的良好抗肿瘤效果，为提高HCC的免疫治疗提供了依据。参考资料： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202310304 【关于投稿】转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。热门·直播/活动 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！点击对应文字查看详情

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