PPIL4

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。今年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。 ——背景—— 分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？ ——CRBN靶蛋白空间探索—— 计算挖掘：作者以CK1α的β-hairpin G-loop为查询模板（该模板由I35到E42八个氨基酸组成，包含5个上游残基（G-5）和2个下游残基（G+2）），在蛋白质结构数据库（PDB）和AlphaFold2（AF2）预测的人类蛋白质中进行搜索，选择与查询模板的均方根偏差（RMSD）小于0.75Å且与CRBN无空间位阻基序，并去除其中主要定位于细胞外的蛋白质，最终确定了1424种含有CRBN兼容β-hairpin G-loop的蛋白质，其中成功召回了含有已知β-hairpin G-loop底物（图1）。 图1.A.G-loop模板C.可能与CRBN兼容的G-loop蛋白 实验验证：作者在CAL51细胞中表达TurboID-CRBN，并提前加入CELMoDs，使与CRBN邻近的蛋白质发生生物素化，亲和纯化后进行质谱分析。以DMSO处理的对照细胞为参考，作者检测了化合物处理后蛋白质的富集情况，发现多种蛋白质在化合物存在下发生富集，包括已知的G-loop蛋白（CK1α,WEE1，GSPT1）和新发现的G-loop蛋白（NEK7、MNAT1、PPIL4和CHD7）（图2）。 图2.TurboID实验结果 NanoBRET和TR-FRET实验验证：之后作者将关注点置于蛋白激酶上，这些激酶的N-lobe具备与CK1α同源的G-loop。作者选取了在TurboID实验中呈阳性的激酶（CK1α、WEE1、NEK7、SCYL1）以及其他一些激酶（CAMK2D、CK1δ、LIMK1、PLK3、STK4、TRIB1、TRIB3），通过NanoBRET和TR-FRET实验，最终确定了9种激酶（CK1α、WEE1、NEK7、SCYL1、CK1δ、LIMK1、PLK3、TRIB1、TRIB3）能够在CELMoDs存在下与CRBN形成三元复合物。此外，当把G-loop上的甘氨酸突变为天冬酰胺后，NanoBRET信号消失，这充分表明了G-loop在三元复合物形成过程中的关键作用。 接着，作者进一步将研究范围拓展至先前未曾探索的结构域（RRM、WW、BRK、LIM-ZF、RINGZF、kinesin和HUP结构域），从中挑选出部分蛋白进行NanoBRET实验，以验证其与CRBN/CELMoD三元复合物的形成状况，确定了8种非激酶蛋白（如PPIL4、MNAT1、WBP4、LIMD1、CHD7、ASS1、HNRNPD、KIFC3等）能够与CRBN形成三元复合物（图3）。 图3.NanoBRET实验结果 小结：作者借助计算手段在人类蛋白质组中挖掘出与CRBN结合相关的β-hairpin G-loop，确定了1424种含有CRBN兼容β-hairpin G-loop的蛋白质，它们分布于多种蛋白质类别和结构域类型之中，其中一大类是已知的C₂H₂锌指蛋白。 通过邻近连接实验（Turbo-ID）、NanoBRET和TR-FRET等实验，验证了多种新型β-hairpin G-loop蛋白与CRBN的相互作用，证实了G-loop基序的序列多样性，明确了不同的G环靶标需要不同的化学物质来与CRBN结合。 ——helical G-loop motifs的发现—— 通过对CK1α-Lenalidomide-CRBN三元复合物进行分析，作者确定G-loop参与蛋白-蛋白相互作用贡献最大的5个残基（G-3、G-2、G-1、G和G+1），以此为依据重新定义G-loop并进行挖掘，采用RMSD截止值为0.5Å，排除与CRBN空间位阻不兼容以及位于细胞外结构域的基序，从而得到1633种预测的G-loop蛋白，其中包含184种含有helical G-loop的蛋白质（图4）。 图4.helicalG-loop蛋白 NanoBRET实验：作者针对预测含有helical G-loop的mTOR-FRB结构域开展NanoBRET实验，验证了其与CRBN和化合物Cpd.1的三元复合物形成情况。在突变甘氨酸残基G2092后检测信号变化，证实了mTOR-FRB helical G-loop作为CRBN识别基序的作用；对预测含有helical G-loop的酪氨酸激酶LCK、HCK和LYN（其helical G-loop位于激酶C-lobe的αEF螺旋远端）进行NanoBRET实验，观察到这三种激酶可被不同的小分子诱导，与CRBN形成三元复合物，并且突变G-loop甘氨酸残基能够消除三元复合物的形成，从而验证了预测结果（图5）。 图5.激酶与CRBN的邻近 晶体结构测定：作者解析了DDB1ΔB-CRBNΔ1-40、Cpd.1和mTOR-FRB2022-2114三元复合物的晶体结构（2.95Å），揭示了helical G-loop在复合物中的作用机制，即helical G-loop在mTOR-FRB的四螺旋束顶端通过其C末端CULT结构域与CRBN相互作用，形成与β-hairpin G-loop相似的主链相互作用，且由于螺旋折叠的变化，其G-4残基的主链几何形状与β-hairpin G-loop不同，导致化合物界面更紧凑。 小结：作者发现了一种新的helical G-loop基序，存在于184种蛋白质中，扩展了CRBN-neosubstrate的范围，超越了β-hairpin G-loop。通过生物信息学预测和实验验证，确定了1633种蛋白质原则上可通过G-loop基序被分子胶降解剂（MGD）诱导招募至CRBN，其中1424种含有β-hairpin G-loop，184种含有helical G-loop。mTOR-FRB结构域中的helical G-loop通过C末端CULT结构域与CRBN/CELMoD相互作用形成三元复合物，其招募依赖于甘氨酸残基G2092；酪氨酸激酶LCK、HCK和LYN也可与CRBN/CELMoD相互作用。 参考文献： [1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933. 作者：任宇浩 审稿：郭   政   编辑：郭   政 GoDesign ID：Molecular_Design_Lab （ 扫描下方二维码可以订阅哦！） 点击阅读原文即可查看文献链接 Andy M. Lau et al.

今年9月17日，来自Dana–Farber Cancer Institute和Harvard Medical School的Katherine A. Donovan和Eric S. Fischer合作，在预印本上online了一篇文章，全面揭示了分子胶诱导的CRBN的互作蛋白组。 1.在裂解液中无偏识别降解剂诱导的互作蛋白 作者建立了一种简化的IP-MS方法，通过在细胞裂解液中使用重组蛋白作为诱饵，创建了一个可控的环境，以减少生物学变异性。通过简化的IP-MS方法，作者在细胞裂解液中使用FLAG- CRBN和DDB1蛋白复合物作为诱饵，用flag抗体富集了与小分子降解剂形成的复合物。在MOLT4和Kelly细胞系中，使用pomalidomide和SB1-G-187（一种激酶双功能降解剂），鉴定出11个蛋白(9 in MOLT4 and 4 in Kelly cells)，其中有三个未被报道的新靶点ASS1, ZBED3 and ZNF219。这三个新靶点经过了TR-FRET的验证。 2.映射IMiD分子胶降解剂的互作组 为了优化和解决对灵敏度和高通量的关键需求，作者自动化了富集和样品制备程序，显著提高了实验的灵敏度和通量。在对20种不同的IMiD类似物进行筛选后，结合MOLT4和Kelly细胞系的数据，共鉴定出298个蛋白，排名前五的是PATZ1, ZBED3, WIZ, IKZF2和ASS1，其中.ZBED3和ASS1是非降解型互作靶点。 在这鉴定出的298个靶点中，270个均为发现的新靶点。作者根据超家族和结构域的特征对这些靶点进行了分类，计算了相应的占比。 3.鉴定CRBN招募的锌指蛋白新底物 在298个被鉴定的蛋白质靶标中，作者发现C2H2型锌指超家族是最大的靶标类别，占所有靶标的14%以上。这一发现与之前的研究结果相一致，即CRBN分子胶倾向于招募含有C2H2型锌指结构域的转录因子。 作者通过比较不同细胞系中鉴定的锌指蛋白，发现了一批在MOLT4和Kelly细胞系中均被富集的锌指蛋白。这一结果表明，这些锌指蛋白可能代表了CRBN分子胶的常见靶标。 为了进一步验证这些锌指蛋白与CRBN的相互作用，作者利用AlphaFold2（AF2）数据库中的结构信息，对这些锌指蛋白进行了结构比对。通过计算模型，作者评估了这些锌指蛋白与已知CRBN-IMiD复合物的结合潜力。 作者特别关注了锌指蛋白中的G-loop结构，这是CRBN分子胶招募的关键结构特征。通过分析，作者发现多数被鉴定的锌指蛋白含有与已知CRBN结合的IMiD分子相似的G-loop结构。除了已知的锌指蛋白靶标，作者还鉴定了一批新的锌指蛋白靶标，包括ASS1、ZBED3、ZNF219、ZMYND8和RNF166。  4.鉴定CRBN招募的新非锌指蛋白 在298个靶标中，作者发现251个非ZF蛋白被富集，这些非ZF蛋白包括蛋白激酶、RNA识别基序蛋白、代谢酶、翻译蛋白等，涵盖了不同的生物途径。通过TR-FRET实验验证了这些新靶标的直接招募，并使用结构G-loop对齐来辅助确定这些新靶标。其中，通过cryo-EM结构分析，作者揭示了PPIL4和PDE6D与CRBN-DDB1DB-FPFT-2216复合物的结构。晶体结构显示，PPIL4的RRM结构域三元复合物的形成中发挥重要作用。因此，具有RRM结构域的蛋白可能是一种分子胶诱导下的CRBN的新底物。 5.鉴定PPIL4的新型选择性分子胶 作者通过生化筛选约6000种IMiD类似物，针对PPIL4进行了TR-FRET筛选，鉴定了一种新型先导化合物Z6466608628，其对PPIL4的招募效果优于FPFT-2216。 本文作者：ZZY 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓