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点击上方的 行舟Drug ▲ 添加关注 作者｜周莉婷，罗建辉（CDE） 目前生物制品上市申请药学申报资料普遍存在完整性和规范性的问题，本文结合相关法规、指导原则的要求以及近年的审评经验，梳理了生物制品上市申请药学申报资料的主要问题和审评关注要点，以期帮助申请人提高申报资料质量。 2017 年6 月，原国家食品药品监督管理总局正式加入ICH。为鼓励药品创新，推动药品注册技术标准与国际接轨的进程，加快药品审评审批时效，加强药品全生命周期管理，原国家食品药品监督管理总局于2018 年1 月发布《关于使用国际人用药品注册技术协调会二级指导原则的公告( 2018 年第10 号) 》［1］，明确自2018 月2 月1 日起，治疗用生物制品1 类和预防用生物制品1 类注册申请适用《M4: 人用药物注册申请通用技术文档( CTD) 》，为国内外生物制品上市申请申报资料提出了统一规范并与国际接轨的要求。但由于目前生物制品研发生产企业研发管理水平参差不齐，对法规、技术指导原则和审评要求理解不到位，造成上市申请申报资料的完整性、规范性较差，普遍存在需要多次发补和多轮沟通的情况。本文结合我国2007 年《药品注册管理办法》附件3 生物制品申报资料要求( 简称2007版法规要求) 和ICHM4Q 指导原则要求，以及近年的审评工作经验，梳理了生物制品上市申请药学申报资料的主要问题和审评关注要点，以期帮助申请人提高申报资料质量，进一步提高审评效率，减少不必要的多次发补。 1 总体问题 自2018 年2 月1 日正式实施ICH M4 指导原则之后，国内外治疗类和预防类1 类生物制品均按照CTD 格式进行申报，其他类别大多数申请仍按照2007 版法规要求进行申报。药学申报资料总体上均存在完整性和规范性的问题。 1．1 完整性   完整性问题包括申报资料缺项和研究工作缺项。申报资料缺项是指未提交完整资料，最常见的是缺少某些证明性文件、制造和检定记录不完整、缺少工艺验证报告及关键图谱以及制检规程缺少关键信息等。研究工作缺项包括生物源性材料缺少安全性评估、缺少临床期间变更信息以及可比性研究资料、工艺验证不全面、杂质研究不充分、质量标准拟定缺乏合理性依据、稳定性研究考察条件及考察项目不全面或包材相容性研究不全面等。个别申报资料过于简略，只有总结概述，缺少具体研究方法、研究数据和分析，基本不具备可评价性。 1．2 规范性   规范性问题，一是相关研究资料没有放在该放的位置，格式不规范，资料整体的逻辑性较差; 二是前后表述不一致，主要体现在生产厂或生产地址、术语、缩略词等，特别需要关注在申请表、申报资料的不同章节、制检规程、质量标准、说明书等文件中生产厂和生产地址的表述保持一致; 如果有缩略词，建议在每章前面提供缩略词列表，以方便审评人员理解和查询; 三是翻译不准确、不专业、可读性差，如将“SDS-PAGE”翻译为“SDS-页码”，将“cell bank”翻译为“细胞银行”等。这些错误或不规范会影响审评人员对申请人研发水平和申报资料质量的整体印象和评价。 2 常见突出问题和审评关注要点 2．1 生产用原材料   生物制品生产过程中使用的各种原材料来源复杂，可能引入外源因子或毒性化学材料，应进行严格的质量控制，但申报资料中常见生产用原材料质量控制和安全性风险评估资料不充分或不完善，如未明确生产过程中所用的动物源性材料并评估其安全性风险，包括引入外源因子的风险。另外，对于生产中所用的关键原材料，包括蛋白酶、亲和抗体、化学偶联物等，如果从外部购买，应进行严格的供应商审计，并明确质量标准; 如果是自行制备，在申报资料中还需提供生产工艺、质量研究和稳定性研究等内容。建议按照《中华人民共和国药典》“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”的要求对生产中所用的原材料进行全面风险评估和质量控制［2］。 在上市申请时，还需要在资料中明确临床期间生产用原材料是否发生过变更以及开展了哪些变更研究和评估。 2．2 上游构建和细胞库建立   工程菌或工程细胞是生产生物制品的基础，是最重要的生产起始种子原材料。上市申请时应提供完整的上游构建资料说明目的基因来源、设计、进行了哪些优化，如改构或位点突变，并提供合理性依据，提供测序结果以及与理论序列的对比结果; 提供表达载体的名称、来源、结构、遗传特性; 提供宿细胞或宿主菌名称、来源、培养特性、生物学特性、传代历史( 包括驯化过程) 和检定结果等，如果对宿主细胞或宿主菌有改构，也应该提供相关资料; 种子库和/或细胞库的建立和检定应符合ICHQ5B，Q5D 指导原则和《中华人民共和国药典》的要求，明确种子库传代及建库过程、建库规模、限传代次、保存方法、保存地点以及使用寿命的评估。需要特别关注以下几个问题。 表达载体抗性基因选择: 《中华人民共和国药典》明确要求: 除另有规定外，不得使用β-内酰胺类抗生素［2］，但在审评过程中发现仍有部分原核表达产品选择氨苄抗性并在建库和种子扩增阶段添加氨苄青霉素，为降低使用β-内酰胺类抗生素带来的风险( 包括排放相关的环境污染和制品中残留引起患者过敏的风险) ，在早期构建载体时应尽量避免使用此类抗性基因，如果产品已进入临床阶段，应在关键临床前开展研究替换为非β-内酰胺类抗生素抗性质粒，重新构建工程菌并进行可比性研究。 建库不规范: 审评中发现，部分生产企业没有严格遵从《中华人民共和国药典》及相关指导原则要求，在建库过程中存在划平板、挑克隆、挑取部分菌体以及侧传代等操作。稳定表达克隆或细胞株的筛选及单克隆化操作应在建库之前完成，在制备主细胞库( master cell bank，MCB) 和工作细胞库( working cell bank，WCB) 过程中不得进行单克隆筛选，以避免由于个别基因突变引起WCB 中细胞群体性的遗传特性改变［3］，从原始种子传代和扩增后保存为主种子批，从主种子批传代和扩增后保存的为工作种子批，工作种子批的生物学特性应与原始种子一致［2］。 传代稳定性研究不规范: 传代稳定性研究应模拟实际生产条件( 如扩增和生产阶段加压或不加压，传代周期、培养表达工艺条件等) 、考察细胞水平、基因水平以及蛋白水平的稳定性，明确生产限传代次，特别需要注意的是上市申请时应评估已开展的传代稳定性研究能否满足商业化规模生产需求［3］。 2．3 生产工艺   由于生物制品的制备过程较复杂，大部分类别的生物制品分子结构尚不能完全表征，为保证产品质量的一致性，系统深入的工艺开发和工艺研究、全面的工艺验证显得尤为重要。在上市申请药学申报资料中，生产工艺部分最突出的问题是工艺验证不充分、不规范以及缺少临床期间的变更信息和可比性研究资料。 工艺验证资料不充分、不规范主要体现在:① 验证规模和工艺不具有代表性。② 验证方案中验收标准不明确。③ 仅对工艺操作参数进行验证，缺少对过程控制水平和工艺性能的评估和验证。④ 缺乏全生命周期管理和持续工艺验证的意识。提交上市申请时，应采用商业化规模、代表性工艺和批次( 至少连续3 批) ，尽可能考察工艺最差条件开展工艺验证，以确认拟上市工艺的稳健性。上游培养工艺验证应关注细胞形态、生长特性、密度、活率、代谢情况、目的产物表达情况、体外细胞寿命限度等; 纯化工艺验证应关注纯度、活性、收率、产品相关杂质和工艺相关杂质去除能力等; 对于化学偶联修饰的产品还应关注修饰度、游离修饰基团、未偶联蛋白比例、修饰偶联对蛋白质量的影响、收率等; 制剂工艺验证应关注原液冻融、混合、除菌过滤、无菌灌装、冻干工艺等; 在这部分还应提供中间体暂存、层析介质清洁/储存/再生和循环使用寿命验证、过滤器清洁/储存/寿命验证、一次性细胞培养袋/储液袋相容性评价、过滤器/管道提取物相容性评价、运输验证等［4］。 生产工艺开发或临床期间变更部分，对于阐述拟上市工艺和产品与已通过临床试验验证的产品之间的相关性具有非常重要意义。这部分也是上市申请申报资料中问题最多、最常被发补的内容。从通行的国际管理方式看，在确保产品质量特性没有发生变化的前提下，新药临床试验早期允许发生必要的工艺和规模变更，但在开展关键性临床( Ⅲ期) 研究前应确定拟上市规模和工艺，在Ⅲ期临床研究以后、注册上市申报前，应尽量避免发生变更; 如果确实需要发生变更，应尽早开展变更研究以便将变更后的产品用于关键性临床［5］。在上市申请申报资料中应明确从工艺开发开始至拟定的商业化工艺为止各个阶段的批次信息( 批号、用途、规模或批量、生产设备、工艺路线、工艺参数、制剂处方、辅料、包装容器、生产地点与日期) 以及主要变化，提供合理变更依据以及相关的支持性验证研究资料，包括各阶段生产工艺和产品质量的可比性研究资料，评价变更对产品质量的影响以及拟上市商业化工艺批次与关键临床批次工艺及产品之间的可比性/可代表性［6］。原则上，拟上市产品质量不能低于临床批次产品质量，如果可比性研究观察到差异，应对差异原因及其对产品安全性和有效性的影响进行深入分析，根据差异性程度和风险性大小，必要时需开展进一步的非临床或临床研究证实。 2．4 质量研究   质量研究和质量控制包括采用适宜的方法对产品进行鉴定、生物活性、纯度和杂质等分析，以及采用参比品和经验证的方法评估已知和潜在的产品相关物质和杂质。这部分资料的主要问题有对结构复杂蛋白质及化学偶联蛋白质的结构确证研究不充分; 对杂质和相关物质的研究不充分; 质量标准拟定缺乏合理的拟定依据; 对照品信息不全面等。 结构确证和特性鉴定部分应明确研究批次、批次来源( 如场地、工艺、阶段等) ; 结合多种手段对样品进行全面解析和理化性质研究，包括一级结构、二级结构、高级结构和翻译后修饰等，需特别关注对翻译后修饰的深入研究; 对于化学偶联修饰的制品，还应对修饰位点进行确证，对修饰基团/蛋白比例、修饰度进行分析; 生物学活性研究应包括亲和力、结合活性、基于动物/体外细胞的生物学活性等，生物学活性分析方法最好能反映产品的预期作用机制和作用特点。 产品相关物质或杂质包括分子大小变体、电荷变体、疏水性变体、结构变体、翻译后修饰变体等，应对杂质或相关物质进行定性和定量分析，并评价其对产品安全、有效性的影响。工艺相关杂质包括宿主细胞蛋白、宿主DNA、色谱配基、细菌内毒素、工艺添加物( 包括胰岛素、筛选试剂、抗生素、消泡剂、有机溶剂、蛋白酶、活化试剂、偶联试剂等) ，应分析生产工艺是否可将相关杂质去除或降低至可接受水平，制定限度标准并提供依据。 质量标准方面常见的问题是缺乏质量标准拟定依据，拟定质量标准时应综合考虑原辅料控制、工艺控制、检测方法验证、多批次检测结果、稳定性、统计分析、药典通用标准、相关产品的基本控制要求等因素，并且应与非临床及临床研究批次相关联［7］。还应在资料中明确临床研究期间质量标准变更的情况，包括变更内容、变更原因、变更依据及比对研究资料; 如果分析方法发生变更，应进行变更前后分析方法的桥接研究和比对研究。如果申报产品为药典收载品种，或有已上市同类品种，应与药典标准或已上市产品标准进行比较。 对照品方面，应提供不同开发阶段的参考品或对照品的详细信息，包括批次来源、制备方法或过程、检定项目和结果、标定方法和结果、储存和复验等，应关注对照品的代表性、可溯源性和可及性。 2．5 稳定性研究   稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，稳定性研究是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据，也可以为药品的生产、包装、运输条件等提供科学依据［8］。稳定性研究资料部分较突出的问题有稳定性考察样品不具有代表性、考察条件和项目不全面、对结果的分析不到位等。 研究样品的代表性：在上市申请时，稳定性研究样品应为拟上市商业化规模工艺生产的样品，内包材应与实际贮藏时所用的包材一致。还应关注对临床批次样品进行稳定性考察。在资料中应明确考察批次的批号、生产日期、生产地点、规模/批量、工艺版本、包装等。 考察条件不全面：常见问题为缺少强制条件研究、运输稳定性研究、使用过程中稳定性研究。强制条件或影响因素试验，目的在于了解产品对外界环境的敏感性，理解产品的降解途径和内在稳定性，在产品可比性研究中，采用强制降解可以在较短时间内观察到产品质量的变化，便于分析产品在质量和性质等方面的异同; 运输稳定性研究目的是确认产品在运输过程中处于拟定的保存条件下可以保持产品的稳定性，并评估产品在短暂的脱离拟定保存条件下对产品质量的影响; 对于需要复溶、稀释或配制、混合或多次使用的产品，应开展相应的稳定性研究，以评估实际使用情况下产品的稳定性。考察项目应全面，重点关注产品敏感的且有可能反映产品质量、安全性和/或有效性的项目［8－9］。 对考察结果分析需重点关注稳定性变化趋势和降解途径的分析。如果临床期间发生变更，应提供临床批次与拟上市批次稳定性可比性研究资料。 2．6 包装系统及相容性研究   包装系统也是药品的重要组成部分，特别是直接接触药品的内包材的质量会直接影响药品的质量。申报资料中常见问题是包材相容性研究不规范，缺少原液/原料药与包装系统的相容性研究资料。 在选择包装容器时应关注其对药品的保护性、功能性、安全性和相容性，如包材对蛋白质的吸附、胶塞有可能产生的微粒、玻璃容器产生玻璃脱片等问题，应按照相关指导原则要求开展规范的包材相容性研究。另外，目前生物制品原液常采用一次性储液袋包装储存，但申报资料中常缺少包装容器与产品的相容性研究资料，或仅提供供应商开展的有限相容性研究资料。一般情况下，供应商开展研究时采用的样品无法完全代表特定的申报产品，申请人需采用代表性的自制样品进行规范的包材相容性研究，供应商提供的数据和信息可作为支持性资料。 2．7 外源因子安全性评估   外源因子的安全性是生物制品最需关注的安全性考量之一，它贯穿生物制品的整个生产过程，从生产用原材料、细胞基质、细胞库到生产过程控制和工艺验证。尤其是对于采用人源或动物源性材料制备的制品，除了对原材料进行风险评估和质量控制，对细胞系和细胞库进行全面的外源性因子检定，对于特定啮齿类细胞( 如CHO，BHK21，NS0 和Sp2 /0) ，还应确定其未加工收获液中病毒颗粒的量及其是否具有感染性逆转录病毒; 病毒清除研究中，应关注选择合适的模型病毒，采用缩小规模的工艺模型进行病毒灭活/清除验证，并证明缩小模型可代表商业化规模工艺; 试验样品应具有代表性，并明确能有效去除或灭活病毒的生产步骤; 结合未加工收获液中病毒检测结果和整个工艺的病毒去除/灭活能力，综合评价终产品的安全性［2，10］。 2．8 制检规程和制检记录   申报上市申请时，按照目前注册管理办法的要求，需提交制检规程和商业化规模连续3 批样品的制检记录。由于生物制品的结构和组成较为复杂，生产工艺和过程控制对其质量影响非常大，仅依据质量标准对生物制品进行质量判断和监管存在较大的风险，因此应依据目前的法规要求、参照现行版《中华人民共和国药典》通则、总论、各论相关要求，并结合实际生产工艺和检定要求拟定制检规程，一般分为: 基本要求、制造部分、检定部分、保存及运输和有效期、生产地址。制检规程作为批准文件的一部分，具有技术性标准的法规效力，也是现场检查的重要依据，并且在生物制品上市后监管中发挥重要作用。 3 结语 申报资料作为药品研发、生产、质量控制及生命周期管理不可或缺的重要文件载体，它的质量对审评效率和审评质量也有非常大的影响。随着CTD和eCTD 在我国的推进和实施，申报资料的要求也会更加科学化、规范化，希望监管机构和业界共同努力，不断促进和提高我国生物制品的研发和申报水平，使有临床价值的药品尽快上市，以最大限度满足患者用药需求。 参考文献：略 文章信息源于公众号天咨医药，登载该文章目的为更广泛的传递行业信息，不代表赞同其观点或对其真实性负责。文章版权归原作者及原出处所有，文章内容仅供参考。本网拥有对此声明的最终解释权，若无意侵犯版权，请联系小编删除。 学如逆水行舟，不进则退； 心似平原走马，易放难收。 行舟Drug 每日更新 欢迎订阅+ 医药大数据|行业动态|政策解读

——背景—— 蛋白质与核酸、小分子、多肽以及金属等配体的相互作用对生物功能至关重要，但原子级别建模这些相互作用并预测其构象系综仍然面临较大挑战。已有的基于深度学习的结构预测工具通常针对特定类别的相互作用进行建模，这限制了对不同功能蛋白质的通用建模，同时这些方法对分子的输入特征因输入分子的类型而异，一定程度上限制了网络学习一般物理化学原理的能力。 为解决上述挑战，David Baker课题组开发了用于蛋白质-配体相互作用的全原子级建模网络ChemNet [1]。作者认为，要实现对蛋白质与各种类型配体结合构象的通用预测方法，需要实现对配体与蛋白质口袋原子的统一建模，这样有希望捕捉到本质的物理化学信息，实现在不同的结合状态，都能准确描述构象系综。这样的统一建模必须在全原子级别上进行。在原子级别上，在以往的以蛋白质为主的模型如AlphaFold系列、RoseTTAFold等中使用的进化信息与结构的相关性较小，因此，作者认为从蛋白序列生成构象系综不合适，应以结合位点或催化口袋周围的蛋白质主链的坐标，以及小分子、侧链的键连几何结构为起点。与蛋白质相互作用的小分子和氨基酸侧链的键合几何的原子级描述。这样的模型虽然无法从序列预测结构，但对于模拟小分子或结合肽的构象以及蛋白质结合位点和相互作用侧链的构象非常有用。 对整个复合物进行全原子级建模势必会导致体系过大而难以计算，作者认为，由于蛋白质的结构可以从PDB获取，或者用AF2或RF生成，可靠的蛋白质主链结构是较容易获得的。在已知结合位点（或相互作用区域）的情况下，此时的任务就是将配体对接到结合位点，调整蛋白质侧链和配体分子本身的构象。ChemNet将学习问题框定为结构去噪任务，在已知系统的所有化学（原子、成键）信息的前提下，从打乱的原子坐标重新生成结合构象。比如，在蛋白质-小分子对接的体系中，网络的输入包括蛋白质主链坐标、氨基酸序列和其侧链坐标（这些侧链的原子坐标会在Cα原子周围随机初始化），以及小分子的化学结构（原子坐标在分子中随机原子周围随机初始化），通过去噪过程生成预测的结合构象，并通过多次构象生成构象系综。作者将ChemNet应用在酶活性中心设计中，取得了较好的效果。 ——模型架构—— 如图1所示，在模型输入中，所有类型的分子都用图来表示化学结构，节点代表重原子，边代表化学键。节点特征包含原子类型、初始3D坐标等信息。同时传入手性中心的信息，用一个4维向量描述3个原子绕手性中心顺时针排列的顺序。对于sp2碳，则用另一个feature描述sp2平面中心和相邻的三个原子。 ChemNet的网络架构借鉴了RoseTTAFold，使用了1D、2D、3D的三轨架构（图1D）。在将输入映射到1D、2D、3D嵌入（embedding）后，这3个嵌入被输入到迭代去噪模块，在对坐标去噪，输出3D构象以及构象的置信区间。 图1. ChemNet的网络架构 在迭代模块（图2）中，首先对每个原子，基于空间距离选32个邻居构建原子邻接图，由图中的原子成对信息通过一个前馈层计算bias，来对2D嵌入计算attention，更新2D嵌入。然后使用一个SE3-Transformer网络，输出3D构象和1D嵌入。 图2. 迭代模块的架构 输入包含5部分（图3）：1. 3D构象，即各原子坐标；2. 键分离邻接图，包含每个原子最近的16个成键邻居（图距离最近）和16个非成键邻居（空间最近）的信息；3. 1D嵌入；4. 2D嵌入；5. 键长、手性中心张角和sp2平面角的几何损失函数对原子坐标的梯度。根据更新的结构，重新计算原子邻接图并更新2D嵌入。之后在1D和2D轨分别接有原子和原子对（距离矩阵）的置信度预测头。最后对1D和2D嵌入进行残差连接。整个网络进行8次迭代，共享权重。 图3. 结构更新模块 模型训练的loss是由坐标预测偏差和置信度预测偏差组合而成的（图4）。坐标偏差包含键长、键角、手性中心张角、sp2平面角几项的偏差，和3个全原子FAPE loss。FAPE loss最初是在Alphafold2模型中用于蛋白质结构预测的，在这里修改为了对全原子体系计算坐标偏差。计算方法是：对成键的3原子组ijk，构建一个三维坐标系(如图5，基矢方向是平面法向量、三角形的一条边和其高,原点是高穿过的顶点)，称为一个frame，在此坐标系下计算各个原子在预测构象和参考构象中的坐标偏差，对原子取平均值;再对每个frame计算平均偏差，对frame平均，得到FAPE。Interaction和small molecule FAPE则分别指对每个蛋白侧链的frame计算小分子的原子偏差以及只对小分子计算FAPE，使得训练过程更关注于配体构象的准确。 图4. 损失函数 图5. FAPE loss计算的示意图 置信度偏差中，plDDT即Alphafold2的plDDT函数，由对蛋白残基计算修改为对每个重原子计算；pRMSD为全原子RMSD的预测值；pDE是原子距离矩阵的预测偏差。 ——模型训练—— 为了验证网络架构能够处理各种化学结构，作者用剑桥结构数据库（Cambridge Structural Database, CSD），对模型在小分子构象预测任务上进行训练。训练任务是基于其化学结构和随机初始化的起始坐标，预测小分子的构象。在CSD结构上训练ChemNet分为两个阶段：第一阶段在模型中串联了四个迭代模块，并且仅采用全原子 FAPE 作为损失项；第二阶段将迭代次数增加到八个，并增加了成键原子几何损失项（键长、键角、手性中心张角、平面角）以提升预测结构的局部质量（如图2B和C中红色与紫色所示）。对照实验表明（图6），将迭代次数减少到2次或用坐标和距离RMSD损失的组合替代FAPE，都会导致预测质量显著下降（如图2B和C中橙色和蓝色所示）。此外，当2D输入不包含键分离特征（一个整数，计算化学结构图中任意两个原子之间间隔的共价键的数量）而用一个0-1的特征表征两个原子是否属于同一个分子（即：能通过共价键构成的路径从原子A找到原子B）时，性能也会降低。训练完的ChemNet成功地准确生成了含有50多个原子的复杂大环化合物的三维结构。 图6. 模块必要性验证 而后，作者使用PDB（Protein Data Bank）中的蛋白质小分子复合物，对模型在复合物构象预测任务上进行训练。作者对PDB中的蛋白质小分子复合物进行了一定的筛选，去除了分辨率低（>2.5Å）、未解出原子多（>10%）、非标准残基多（>20%）以及所含小分子与设定的测试集中小分子过于相似（Tanimoto similarity > 80%）的结构，留下了近12万个结构作为训练和验证集。为了让模型学习分子在界面上的物理化学信息，这些结构中，只有水被移除，其他的如小分子、共价修饰、金属离子、核酸等都被保留。测试集为复合物结构预测任务是，在骨架原子位置不动的情况下，预测侧链原子和小分子的原子坐标。因为ChemNet用去噪过程来生成坐标，需要一个打乱的初始坐标，这里它的初始坐标是这样设置的：首先在结合位点附近随机选定一个原子截断中心，这个中心选定为小分子原子、蛋白原子、核酸原子、金属离子的概率比例为5:1:1:1，在截断中心空间距离最近（根据PDB结构算）的600个原子被选定，其他原子不动。选定的600原子，对骨架（蛋白质主链、核酸的磷酸-核糖链）原子，仅加σ为0.1Å的高斯噪声；对侧链原子，先坍缩到其相连的主链原子，然后加一个σ=1.5Å的高斯噪声；对小分子，会随机选其中一个原子，给坐标加一个σ=1.5Å的高斯噪声，然后所有其他原子坍缩到新坐标，也加同样噪声。由此获得一个骨架和小分子整体位置基本不动，但侧链和小分子的具体原子坐标打乱的结构。 图7. 模型在复合物构象预测任务的结果 由于大部分原子坐标被打乱，ChemNet的坐标生成不太依赖于初始构象（骨架坐标受影响较大）；在结构生成的案例中，如图7的B、C、D、E（上下分别是heme和cortisol与蛋白质的复合物），从降维图（图7D）中看到，生成模型的采样基本能覆盖结合位点的构象空间；图7E展示了RMSD预测的结果，作者任务在生成较好的构象中，模型预测的RMSD是可以给构象RMSD较好地排序。不过，似乎pRMSD区分预测准确和不准确（RMSD特别大）构象的能力不是那么强。作者使用的测试集包含65个药物靶标蛋白的非天然药物结合构象，每个靶标都有一个天然小分子共晶结构，和若干非天然小分子共晶结构，数据集共含有1112个非天然结构。作者希望用从非天然结构预测来说明模型对不同小分子复合物构象预测的泛化性。测试结果展示在图7F和图7G。在图7F中，灰色虚线表示在不同的构象采样数量下，采样到的构象中RMSD的最小值<2Å的体系比例；橙色线表示用pRMSD值排序，排名最高构象RMSD<2Å的体系比例。可以看到用pRMSD排序，能找到大约75%预测准确的构象。图7G展示的是对接成功率，亮条是以RMSD<1Å为对接成功的标准，灰暗条是以RMSD<2Å为标准。可以看到，pRMSD的对接能力比其他置信度指标强；而与当前表现最好的RoseTTA GALigandDock相比，ChemNet在RMSD<2Å标准下表现稍好，但RMSD<1Å下表现较差。使用通用Rosetta力场对网络生成的对接构象进行最小化，并估算结合自由能来挑选构象，在<2 Å时没有显著变化，在<1 Å时对接成功率提高了7.3%，接近于GALigandDock。作者认为，虽然ChemNet在对接能力上没有超越GALigandDock，这仍是一个值得注意的表现，因为ChemNet对蛋白复合物体系统一建模，包含了复合物中除水外的所有分子，没有专门对非天然复合物的对接任务进行训练；且ChemNet直接从噪声生成构象，其他方法的结果受到初始构象的影响。 ——应用—— 作者将ChemNet在复合物构象系综预测上的能力，利用在酶设计领域，取得了较好的效果。 在从头设计酶中，除了靶标的主链结构，关键催化侧链和反应底物的结合构象也至关重要。关键侧链的官能团与底物或过渡态之间的氢键和静电相互作用，对催化至关重要，由于氢键对距离和键角非常敏感，距离的0.5Å偏差和键角的30°偏差就可对氢键解离能产生很大影响，因此对构象预测精度的要求相当高。预组织（preorganization）是天然酶活性位点的重要特征，它指即便底物不存在，催化口袋中残基侧链也应保持形成氢键、静电作用等相互作用时的位置，这样酶结合底物时的熵损失小，并且催化残基位置能确保与底物或过渡态以正确的姿势结合。因此在酶设计时，需要评估活性位点的预组织性。过去的方法如Rosetta Rotamer Bolzmann，对侧链使用了转子（rotamer）近似，且对蛋白和小分子分别采样构象，无法考虑侧链移动与小分子运动的耦合。作者希望用ChemNet克服这一限制，达到在远小于MD模拟的运行时间下，获得比Rotamer Boltzmann更准确考虑侧链与小分子运动耦合的预组织性预测。RA95系列的逆羟醛缩合酶（retro-aldolase），含有一系列天然版本和定向进化改造的版本（图8B，这些版本的酶都有高分辨率的晶体结构），其催化羟醛缩合逆反应的机理如图8A，核心催化残基是活性位点的Lys。作者分析，中间体1和2涉及的基元反应活化能较高，是反应决速步，如果酶能稳定这些中间体，则可提高反应速率。作者用ChemNet预测了不同版本的RA95酶的催化口袋与中间体1、2的结合构象（图8C），考察模型给出的pRMSD，pRMSD越小，说明侧链位置预组织性越高。结果中，活性低的版本pRMSD都较大，越小的酶活性越高，这表明预组织性低是早期酶设计工作的一个主要缺点，MD模拟给出了类似的结果。由此说明，ChemNet可以快速评估酶活性位点的预组织性，指导酶设计工作。 图8. 逆羟醛缩合酶的预组织性预测、活性及设计 此外，作者还前瞻性地测试了ChemNet在指导蛋白质设计中的使用，以深度学习生成的NTF2样折叠为骨架进行了一轮全新的逆醛缩酶设计。NTF2样折叠此前成功地生成出高活性的新型荧光素酶。设计的步骤包括：NTF2样折叠骨架生成；识别潜在催化活性位点；理论酶（theozyme）安装；打分筛选酶设计；实验验证。全新的酶设计首先需要确定理论酶（theozyme），即过渡态（或中间体）被酶活性位点的官能团通过相互作用稳定的结构。作者使用活性最高的RA95逆醛缩酶的活性中心，作为理论酶（如图S3）进行后续设计。作者推测ChemNet可能能通过对预组织性的预测，辅助挑选酶设计（设计出的酶）。 图9. 理论酶设计 首先作者使用RoseTTAFold joint inpainting（RFjoint2）生成大量NTF2样折叠骨架，接下来需要将理论酶“安装”到骨架的合适位置。作者使用修改过的XML-Matcher确定骨架中的哪些位置能在几何形状上容纳与中间体相互作用的4个残基，得到一系列用于匹配理论酶与骨架位置的约束文件。然后将频繁出现在不同骨架中的理论酶与骨架位置的组合应用到10000个NTF2样骨架中，用LigandMPNN在有底物的条件下生成剩余的骨架序列。用Alphafold2验证序列结构，选出iDDT值高的序列进入下一步。接下来需要评估这些设计序列是否有高催化活性，作者使用一组理论酶中侧链极性原子之间的距离“nuc(NZ)” - “brd(OE1)”、“sup(OH)” - “brd(NE2)”、“nuc(NZ)” - “sht(OH)”来衡量氢键网络的形成，在能形成氢键网络的酶设计中，评估酶的预组织性来筛选酶设计。作者提出了两个策略：（1）naive策略：计算在“由AlphaFold2预测的结构”与“LigandMPNN设计的结构中”理论酶侧链重原子的RMSD。选取侧链极性原子间距在2.0-3.3Å的酶设计，按照侧链重原子RMSD排序，筛选出RMSD最小的90个酶，对这些设计用体外转录翻译系统（IVTT）测试活性。（2）ChemNet策略：以AlphaFold2预测的酶蛋白构象作为骨架结构，使用ChemNet生成50个复合物构象，并预测置信度；选取理论酶侧链的极性原子平均间距在2.0-3.3Å的酶设计，根据侧链极性原子pRMSD筛选设计，用IVTT测试活性。 由IVTT结果（图10，列出的设计为分别为两种策略筛选出的top 12设计，control组为已知的酶）可以看出，ChemNet策略筛选出来的酶设计活性显著高于naive策略。其中活性最高的酶，kcat/Km = 11,249.4 M-1min-1，活性与近期使用RFdiffusion 加 proteinMPNN设计的酶相当，远高于定向进化前早期的酶设计，该酶被命名为cnRA-50（图8D）。作者用ChemNet预测cnRA-50与其他设计的step1与step2结合构象的预组织性（图8E, F），发现活性最高的酶活性中心的侧链pRMSD显著小于无活性蛋白（图8G）。 图10. 两种评估策略筛选结果的活性对比 ——总结—— ChemNet用统一的全原子建模，实现了在给定蛋白质序列和主链原子位置的情况下，生成任意分子的构象集合，包括单独的分子和蛋白质复合物。在主链基本固定的场景下，它相比与Alphafold3、RoseTTAFold All-Atom等其他蛋白质结构预测方法，计算速度大大加快，从而能生成构象系综。统一的全原子建模，适用于所有类型分子的相互作用，便于扩展到生物分子之外的其他复杂的小分子。ChemNet快速生成蛋白质-小分子复合物构象系综的能力，对于计算酶设计和小分子结合位点设计工作具有相当的实用性：可以轻松评估活性位点的结构精度，以及关键催化/相互作用侧链基团的预组织程度。作者在全新逆醛缩酶的设计中使用ChemNet生成构象系综进行筛选，其活性远高于此前的设计。作者预计，基于ChemNet的构象系综生成将广泛用于预测复杂非蛋白质分子及其蛋白质复合物结构，并普遍地应用于评估酶和蛋白质-小分子结合位点设计。 参考文献： [1] Ivan Anishchenko, Yakov Kipnis, Indrek Kalvet, Guangfeng Zhou, Rohith Krishna, Samuel J Pellock, Anna Lauko, Gyu Rie Lee, Linna An, Justas Dauparas, Frank DiMaio, David Baker, Modeling protein-small molecule conformational ensembles with ChemNet, bioRxiv, 2024, DOI:10.1101/2024.09.25.614868. 作者：凌心辽 审稿：王宇哲 编辑：王宇哲 版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。 免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。 往期推荐 乐威医药（欧洲）分公司正式成立 乐威医药沧州GMP生产基地高活生产线启用 乐威医药亮相意大利CPHI Milan 2024

——背景—— 蛋白质与核酸、小分子、多肽以及金属等配体的相互作用对生物功能至关重要，但原子级别建模这些相互作用并预测其构象系综仍然面临较大挑战。已有的基于深度学习的结构预测工具通常针对特定类别的相互作用进行建模，这限制了对不同功能蛋白质的通用建模，同时这些方法对分子的输入特征因输入分子的类型而异，一定程度上限制了网络学习一般物理化学原理的能力。 为解决上述挑战，David Baker课题组开发了用于蛋白质-配体相互作用的全原子级建模网络ChemNet [1]。作者认为，要实现对蛋白质与各种类型配体结合构象的通用预测方法，需要实现对配体与蛋白质口袋原子的统一建模，这样有希望捕捉到本质的物理化学信息，实现在不同的结合状态，都能准确描述构象系综。这样的统一建模必须在全原子级别上进行。在原子级别上，在以往的以蛋白质为主的模型如AlphaFold系列、RoseTTAFold等中使用的进化信息与结构的相关性较小，因此，作者认为从蛋白序列生成构象系综不合适，应以结合位点或催化口袋周围的蛋白质主链的坐标，以及小分子、侧链的键连几何结构为起点。与蛋白质相互作用的小分子和氨基酸侧链的键合几何的原子级描述。这样的模型虽然无法从序列预测结构，但对于模拟小分子或结合肽的构象以及蛋白质结合位点和相互作用侧链的构象非常有用。 对整个复合物进行全原子级建模势必会导致体系过大而难以计算，作者认为，由于蛋白质的结构可以从PDB获取，或者用AF2或RF生成，可靠的蛋白质主链结构是较容易获得的。在已知结合位点（或相互作用区域）的情况下，此时的任务就是将配体对接到结合位点，调整蛋白质侧链和配体分子本身的构象。ChemNet将学习问题框定为结构去噪任务，在已知系统的所有化学（原子、成键）信息的前提下，从打乱的原子坐标重新生成结合构象。比如，在蛋白质-小分子对接的体系中，网络的输入包括蛋白质主链坐标、氨基酸序列和其侧链坐标（这些侧链的原子坐标会在Cα原子周围随机初始化），以及小分子的化学结构（原子坐标在分子中随机原子周围随机初始化），通过去噪过程生成预测的结合构象，并通过多次构象生成构象系综。作者将ChemNet应用在酶活性中心设计中，取得了较好的效果。 ——模型架构—— 如图1所示，在模型输入中，所有类型的分子都用图来表示化学结构，节点代表重原子，边代表化学键。节点特征包含原子类型、初始3D坐标等信息。同时传入手性中心的信息，用一个4维向量描述3个原子绕手性中心顺时针排列的顺序。对于sp2碳，则用另一个feature描述sp2平面中心和相邻的三个原子。 ChemNet的网络架构借鉴了RoseTTAFold，使用了1D、2D、3D的三轨架构（图1D）。在将输入映射到1D、2D、3D嵌入（embedding）后，这3个嵌入被输入到迭代去噪模块，在对坐标去噪，输出3D构象以及构象的置信区间。 图1. ChemNet的网络架构 在迭代模块（图2）中，首先对每个原子，基于空间距离选32个邻居构建原子邻接图，由图中的原子成对信息通过一个前馈层计算bias，来对2D嵌入计算attention，更新2D嵌入。然后使用一个SE3-Transformer网络，输出3D构象和1D嵌入。 图2. 迭代模块的架构 输入包含5部分（图3）：1. 3D构象，即各原子坐标；2. 键分离邻接图，包含每个原子最近的16个成键邻居（图距离最近）和16个非成键邻居（空间最近）的信息；3. 1D嵌入；4. 2D嵌入；5. 键长、手性中心张角和sp2平面角的几何损失函数对原子坐标的梯度。根据更新的结构，重新计算原子邻接图并更新2D嵌入。之后在1D和2D轨分别接有原子和原子对（距离矩阵）的置信度预测头。最后对1D和2D嵌入进行残差连接。整个网络进行8次迭代，共享权重。 图3. 结构更新模块 模型训练的loss是由坐标预测偏差和置信度预测偏差组合而成的（图4）。坐标偏差包含键长、键角、手性中心张角、sp2平面角几项的偏差，和3个全原子FAPE loss。FAPE loss最初是在Alphafold2模型中用于蛋白质结构预测的，在这里修改为了对全原子体系计算坐标偏差。计算方法是：对成键的3原子组ijk，构建一个三维坐标系(如图5，基矢方向是平面法向量、三角形的一条边和其高,原点是高穿过的顶点)，称为一个frame，在此坐标系下计算各个原子在预测构象和参考构象中的坐标偏差，对原子取平均值;再对每个frame计算平均偏差，对frame平均，得到FAPE。Interaction和small molecule FAPE则分别指对每个蛋白侧链的frame计算小分子的原子偏差以及只对小分子计算FAPE，使得训练过程更关注于配体构象的准确。 图4. 损失函数 图5. FAPE loss计算的示意图 置信度偏差中，plDDT即Alphafold2的plDDT函数，由对蛋白残基计算修改为对每个重原子计算；pRMSD为全原子RMSD的预测值；pDE是原子距离矩阵的预测偏差。 ——模型训练—— 为了验证网络架构能够处理各种化学结构，作者用剑桥结构数据库（Cambridge Structural Database, CSD），对模型在小分子构象预测任务上进行训练。训练任务是基于其化学结构和随机初始化的起始坐标，预测小分子的构象。在CSD结构上训练ChemNet分为两个阶段：第一阶段在模型中串联了四个迭代模块，并且仅采用全原子 FAPE 作为损失项；第二阶段将迭代次数增加到八个，并增加了成键原子几何损失项（键长、键角、手性中心张角、平面角）以提升预测结构的局部质量（如图2B和C中红色与紫色所示）。对照实验表明（图6），将迭代次数减少到2次或用坐标和距离RMSD损失的组合替代FAPE，都会导致预测质量显著下降（如图2B和C中橙色和蓝色所示）。此外，当2D输入不包含键分离特征（一个整数，计算化学结构图中任意两个原子之间间隔的共价键的数量）而用一个0-1的特征表征两个原子是否属于同一个分子（即：能通过共价键构成的路径从原子A找到原子B）时，性能也会降低。训练完的ChemNet成功地准确生成了含有50多个原子的复杂大环化合物的三维结构。 图6. 模块必要性验证 而后，作者使用PDB（Protein Data Bank）中的蛋白质小分子复合物，对模型在复合物构象预测任务上进行训练。作者对PDB中的蛋白质小分子复合物进行了一定的筛选，去除了分辨率低（>2.5Å）、未解出原子多（>10%）、非标准残基多（>20%）以及所含小分子与设定的测试集中小分子过于相似（Tanimoto similarity > 80%）的结构，留下了近12万个结构作为训练和验证集。为了让模型学习分子在界面上的物理化学信息，这些结构中，只有水被移除，其他的如小分子、共价修饰、金属离子、核酸等都被保留。测试集为复合物结构预测任务是，在骨架原子位置不动的情况下，预测侧链原子和小分子的原子坐标。因为ChemNet用去噪过程来生成坐标，需要一个打乱的初始坐标，这里它的初始坐标是这样设置的：首先在结合位点附近随机选定一个原子截断中心，这个中心选定为小分子原子、蛋白原子、核酸原子、金属离子的概率比例为5:1:1:1，在截断中心空间距离最近（根据PDB结构算）的600个原子被选定，其他原子不动。选定的600原子，对骨架（蛋白质主链、核酸的磷酸-核糖链）原子，仅加σ为0.1Å的高斯噪声；对侧链原子，先坍缩到其相连的主链原子，然后加一个σ=1.5Å的高斯噪声；对小分子，会随机选其中一个原子，给坐标加一个σ=1.5Å的高斯噪声，然后所有其他原子坍缩到新坐标，也加同样噪声。由此获得一个骨架和小分子整体位置基本不动，但侧链和小分子的具体原子坐标打乱的结构。 图7. 模型在复合物构象预测任务的结果 由于大部分原子坐标被打乱，ChemNet的坐标生成不太依赖于初始构象（骨架坐标受影响较大）；在结构生成的案例中，如图7的B、C、D、E（上下分别是heme和cortisol与蛋白质的复合物），从降维图（图7D）中看到，生成模型的采样基本能覆盖结合位点的构象空间；图7E展示了RMSD预测的结果，作者任务在生成较好的构象中，模型预测的RMSD是可以给构象RMSD较好地排序。不过，似乎pRMSD区分预测准确和不准确（RMSD特别大）构象的能力不是那么强。作者使用的测试集包含65个药物靶标蛋白的非天然药物结合构象，每个靶标都有一个天然小分子共晶结构，和若干非天然小分子共晶结构，数据集共含有1112个非天然结构。作者希望用从非天然结构预测来说明模型对不同小分子复合物构象预测的泛化性。测试结果展示在图7F和图7G。在图7F中，灰色虚线表示在不同的构象采样数量下，采样到的构象中RMSD的最小值<2Å的体系比例；橙色线表示用pRMSD值排序，排名最高构象RMSD<2Å的体系比例。可以看到用pRMSD排序，能找到大约75%预测准确的构象。图7G展示的是对接成功率，亮条是以RMSD<1Å为对接成功的标准，灰暗条是以RMSD<2Å为标准。可以看到，pRMSD的对接能力比其他置信度指标强；而与当前表现最好的RoseTTA GALigandDock相比，ChemNet在RMSD<2Å标准下表现稍好，但RMSD<1Å下表现较差。使用通用Rosetta力场对网络生成的对接构象进行最小化，并估算结合自由能来挑选构象，在<2 Å时没有显著变化，在<1 Å时对接成功率提高了7.3%，接近于GALigandDock。作者认为，虽然ChemNet在对接能力上没有超越GALigandDock，这仍是一个值得注意的表现，因为ChemNet对蛋白复合物体系统一建模，包含了复合物中除水外的所有分子，没有专门对非天然复合物的对接任务进行训练；且ChemNet直接从噪声生成构象，其他方法的结果受到初始构象的影响。 ——应用—— 作者将ChemNet在复合物构象系综预测上的能力，利用在酶设计领域，取得了较好的效果。 在从头设计酶中，除了靶标的主链结构，关键催化侧链和反应底物的结合构象也至关重要。关键侧链的官能团与底物或过渡态之间的氢键和静电相互作用，对催化至关重要，由于氢键对距离和键角非常敏感，距离的0.5Å偏差和键角的30°偏差就可对氢键解离能产生很大影响，因此对构象预测精度的要求相当高。预组织（preorganization）是天然酶活性位点的重要特征，它指即便底物不存在，催化口袋中残基侧链也应保持形成氢键、静电作用等相互作用时的位置，这样酶结合底物时的熵损失小，并且催化残基位置能确保与底物或过渡态以正确的姿势结合。因此在酶设计时，需要评估活性位点的预组织性。过去的方法如Rosetta Rotamer Bolzmann，对侧链使用了转子（rotamer）近似，且对蛋白和小分子分别采样构象，无法考虑侧链移动与小分子运动的耦合。作者希望用ChemNet克服这一限制，达到在远小于MD模拟的运行时间下，获得比Rotamer Boltzmann更准确考虑侧链与小分子运动耦合的预组织性预测。RA95系列的逆羟醛缩合酶（retro-aldolase），含有一系列天然版本和定向进化改造的版本（图8B，这些版本的酶都有高分辨率的晶体结构），其催化羟醛缩合逆反应的机理如图8A，核心催化残基是活性位点的Lys。作者分析，中间体1和2涉及的基元反应活化能较高，是反应决速步，如果酶能稳定这些中间体，则可提高反应速率。作者用ChemNet预测了不同版本的RA95酶的催化口袋与中间体1、2的结合构象（图8C），考察模型给出的pRMSD，pRMSD越小，说明侧链位置预组织性越高。结果中，活性低的版本pRMSD都较大，越小的酶活性越高，这表明预组织性低是早期酶设计工作的一个主要缺点，MD模拟给出了类似的结果。由此说明，ChemNet可以快速评估酶活性位点的预组织性，指导酶设计工作。 图8. 逆羟醛缩合酶的预组织性预测、活性及设计 此外，作者还前瞻性地测试了ChemNet在指导蛋白质设计中的使用，以深度学习生成的NTF2样折叠为骨架进行了一轮全新的逆醛缩酶设计。NTF2样折叠此前成功地生成出高活性的新型荧光素酶。设计的步骤包括：NTF2样折叠骨架生成；识别潜在催化活性位点；理论酶（theozyme）安装；打分筛选酶设计；实验验证。全新的酶设计首先需要确定理论酶（theozyme），即过渡态（或中间体）被酶活性位点的官能团通过相互作用稳定的结构。作者使用活性最高的RA95逆醛缩酶的活性中心，作为理论酶（如图S3）进行后续设计。作者推测ChemNet可能能通过对预组织性的预测，辅助挑选酶设计（设计出的酶）。 图9. 理论酶设计 首先作者使用RoseTTAFold joint inpainting（RFjoint2）生成大量NTF2样折叠骨架，接下来需要将理论酶“安装”到骨架的合适位置。作者使用修改过的XML-Matcher确定骨架中的哪些位置能在几何形状上容纳与中间体相互作用的4个残基，得到一系列用于匹配理论酶与骨架位置的约束文件。然后将频繁出现在不同骨架中的理论酶与骨架位置的组合应用到10000个NTF2样骨架中，用LigandMPNN在有底物的条件下生成剩余的骨架序列。用Alphafold2验证序列结构，选出iDDT值高的序列进入下一步。接下来需要评估这些设计序列是否有高催化活性，作者使用一组理论酶中侧链极性原子之间的距离“nuc(NZ)” - “brd(OE1)”、“sup(OH)” - “brd(NE2)”、“nuc(NZ)” - “sht(OH)”来衡量氢键网络的形成，在能形成氢键网络的酶设计中，评估酶的预组织性来筛选酶设计。作者提出了两个策略：（1）naive策略：计算在“由AlphaFold2预测的结构”与“LigandMPNN设计的结构中”理论酶侧链重原子的RMSD。选取侧链极性原子间距在2.0-3.3Å的酶设计，按照侧链重原子RMSD排序，筛选出RMSD最小的90个酶，对这些设计用体外转录翻译系统（IVTT）测试活性。（2）ChemNet策略：以AlphaFold2预测的酶蛋白构象作为骨架结构，使用ChemNet生成50个复合物构象，并预测置信度；选取理论酶侧链的极性原子平均间距在2.0-3.3Å的酶设计，根据侧链极性原子pRMSD筛选设计，用IVTT测试活性。 由IVTT结果（图10，列出的设计为分别为两种策略筛选出的top 12设计，control组为已知的酶）可以看出，ChemNet策略筛选出来的酶设计活性显著高于naive策略。其中活性最高的酶，kcat/Km = 11,249.4 M-1min-1，活性与近期使用RFdiffusion 加 proteinMPNN设计的酶相当，远高于定向进化前早期的酶设计，该酶被命名为cnRA-50（图8D）。作者用ChemNet预测cnRA-50与其他设计的step1与step2结合构象的预组织性（图8E, F），发现活性最高的酶活性中心的侧链pRMSD显著小于无活性蛋白（图8G）。 图10. 两种评估策略筛选结果的活性对比 ——总结—— ChemNet用统一的全原子建模，实现了在给定蛋白质序列和主链原子位置的情况下，生成任意分子的构象集合，包括单独的分子和蛋白质复合物。在主链基本固定的场景下，它相比与Alphafold3、RoseTTAFold All-Atom等其他蛋白质结构预测方法，计算速度大大加快，从而能生成构象系综。统一的全原子建模，适用于所有类型分子的相互作用，便于扩展到生物分子之外的其他复杂的小分子。ChemNet快速生成蛋白质-小分子复合物构象系综的能力，对于计算酶设计和小分子结合位点设计工作具有相当的实用性：可以轻松评估活性位点的结构精度，以及关键催化/相互作用侧链基团的预组织程度。作者在全新逆醛缩酶的设计中使用ChemNet生成构象系综进行筛选，其活性远高于此前的设计。作者预计，基于ChemNet的构象系综生成将广泛用于预测复杂非蛋白质分子及其蛋白质复合物结构，并普遍地应用于评估酶和蛋白质-小分子结合位点设计。 参考文献： [1] Ivan Anishchenko, Yakov Kipnis, Indrek Kalvet, Guangfeng Zhou, Rohith Krishna, Samuel J Pellock, Anna Lauko, Gyu Rie Lee, Linna An, Justas Dauparas, Frank DiMaio, David Baker, Modeling protein-small molecule conformational ensembles with ChemNet, bioRxiv, 2024, DOI:10.1101/2024.09.25.614868. 作者：凌心辽 审稿：王宇哲 编辑：王宇哲 GoDesign ID：Molecular_Design_Lab （ 扫描下方二维码可以订阅哦！）