CD32A

*仅供医学专业人士阅读参考感觉流感季终于快过去了！过年前那段时间可真是你方唱罢我登场，身边朋友轮流发烧咳嗽，只要还出门见人，谁也逃不过病毒。不过都是生病，严重的人发高烧遭大罪，有的人可能擤了两天鼻涕没事儿了，人和人之间免疫系统亦有差距啊。上周，来自法国的科学团队在《自然》杂志发表论文，研究者们分析了1000名健康人的血液样本，试图找到个体免疫差异的关键决定因素。有趣的是，分析了大量与社会人口统计学、饮食/生活方式有关的因素之后，研究者们发现，对免疫功能影响最大的三个因素竟然是吸烟、巨细胞病毒（CMV）感染和体重指数（BMI）。其中吸烟尤其值得关注，因为吸烟可以通过改变表观遗传对适应性免疫产生影响，且在戒烟后还能持续多年。论文题图个体之间免疫功能差距极大，过去的三年我们已经亲身体会过这一点。免疫能力到底受什么影响？为了搞清楚这个问题，研究者们开展了此次试验。试验采用多种免疫激动剂分别刺激参与者全血样本22小时，并随后检测其中13种在病生理状态下比较受关注的细胞因子，CXCL5、CSF2、IFNγ、IL-1β、TNF、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17 和IL-23的水平。免疫激动剂包括微生物和病毒类制剂，如卡介苗（BCG）、大肠杆菌、脂多糖（LPS）、poly I：C等等，这些刺激物主要诱导先天免疫；金黄色葡萄球菌肠菌素B（SEB）、抗CD3+CD18抗体等T细胞激活剂可以诱导适应性免疫；此外还有TNF、IL-1β、IFNγ等细胞因子。另一方面，研究者从电子病历中总结出了136个潜在的影响因素，将它们分别与不同刺激物诱导的细胞因子变化进行相关性检验。最终得出的分析结果显示，BMI、CMV潜伏感染和吸烟相关性最强。不同刺激物对细胞因子水平的影响及与不同因素的相关性吸烟影响的主要是SEB刺激和抗CD3+CD28抗体刺激后的IL-2和IL-3水平，以及先天免疫刺激后的CXCL5水平。这与之前的研究结果是一致的，吸烟会促进炎症并削弱对细菌感染的免疫力。CMV潜伏感染影响的主要是适应性免疫刺激后的CSF2、IFNγ和TNF，这表明CMV血清阳性与效应T细胞记忆亚群数量增加之间存在关联。BMI则主要影响BCG刺激后的CXCL5和SEB刺激后的IL-2水平，这与肥胖中CXCL5和IL-2失衡表现也是一致的。针对吸烟，研究者进一步分析了烟龄、戒烟年限等相关因素的影响。值得注意的是，吸烟对先天免疫的影响是短暂的，对适应性免疫的影响却非常长远。戒烟后对适应性免疫的影响仍然存在为了寻找背后的机制，研究者确定了2416个与吸烟直接相关的CpG位点，并在参与者中进行了相应位点的甲基化水平分析。这些位点中，有129个与SEB刺激后的IL-2水平显著相关，将其中11个作为协变量加入模型之后，吸烟与IL-2和IL-3的关联消失了，也就是说这11个CpG的甲基化就是吸烟影响适应性免疫的中介。这11个位点中，有3个与芳烃受体阻遏蛋白（AHRR）基因有关，其他还包括视黄酸受体（RARA）、丝氨酸蛋白酶（PRSS23）、G蛋白偶联受体（GPR15）等基因。在这些位点上，吸烟者的甲基化水平明显较低，戒烟者则略有回升。研究者还测试了5699237个单核苷酸多态性（SNP）与刺激诱导细胞因子的关联，并报告了多个反应蛋白数量性状位点（pQTL），包括与多种自身免疫性疾病有关的FCGR2A附近的反式pQTL和与年龄相关黄斑变性有关的TLR3外显子上的反式pQTL。这表明吸烟参与调节不同基因型个体对免疫刺激的反应差异。最后，研究者计算了吸烟的影响程度。量化其对细胞因子水平的影响，研究者得出结论，吸烟可以解释个体差异的4%到9%，这一幅度与年龄、性别和遗传效应相当。看来吸烟对免疫的影响是真的很大。参考资料：[1]https://www.nature.com/articles/s41586-023-06968-8[2]https://www.nature.com/articles/d41586-024-00412-1[3]https://www.nature.com/articles/d41586-024-00232-3本文作者丨代丝雨

本文整理初衷源于自身对于免疫学及抗体工程等领域的陌生，有非常多的疑问待解决，遂溯源基础，只有基础打牢了，才能谈其他，本身也想分享出来，以飨读者。抗体药物的研发历史已经很久了，也成为当下的研究热点，竞争趋于白热化。如何在万军之中杀出来，是一众Biotech企业和大药企最为关心的。以抗PD-1单抗为例，启示单抗药物核心竞争要素如下：临床疗效优势，获得医生和患者的认可，优先使用拓宽适应症范围，增大患者基数学术推广能力强，迅速放量规模化生产与成本控制，保证产品供应，应对价格战本文就抗体药物的生产演化历程及盲点进行梳理。天然抗体结构示意图天然抗体的结构免疫球蛋白（Ig）又称抗体（Ab），是用来标记抗原的蛋白。抗体共有5类：lgM 、 lgD 、 lgG 、 lgA 和 lgE 。天然抗体的基本结构是一“Y”型的四肽链，由两条重链（H）和两条轻链（L）组成，之间由二硫键相连。重链和轻链近N端氨基酸序列变化较大，称可变区（V），其他氨基酸序列相对恒定，称为恒定区（C）。IgG经木瓜蛋白酶酶切后裂解为2个完全相同的Fab段和1个Fc段,每个Fab段都为单价,可与抗原结合但不会再发生凝集反应；经胃蛋白酶酶切后裂解为1个完整F(ab)2片段和碎片化的Fc片段,F(ab’)2片段为双价,可同时结合两个抗原表位。Fab段为抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab），相当于抗体分子的两个臂，由一个完整的轻链和重链的VH和CH1结构域组成。Fc段为可结晶段（fragmentcrystallizable，Fc）相当于Ig的CH2和CH3结构域，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。Fab段包含完整的可变区，以及恒定区的CH1区域。Fc段仅指Ig恒定区CH2和CH3的区域，相当于Y字结构下面那一部分。Fab可变区可以用来识别和连接抗原。Fc段可结合巨噬细胞、NK细胞、补体等，通过ADCP效应、ADCC效应和CDC效应杀伤靶细胞。可变区：抗体分子的N端存在一段氨基酸序列变化较大的区域，该区域称为可变区。可变区中存在可以与抗原特结合的部位，即抗原结合位点。一个抗体有两个抗原结合位点，可以同时结合两个抗原分子。在可变区中有三个区域的序列高度变化，成为高变区（hypervariable region，HVR）又称为抗原互补决定区（complementarity determining region，CDR）。CDR决定了抗体的独特型（抗独特型抗体表达）。可变区主要通过其3个CHR区形成3个环状结构与抗原特异性结合。可变区中非CDR部分，氨基酸组合和排列相对比较保守，称为骨架区（framework region，FR），其氨基酸组成和排列变化相对CDR较少。可变区中CDR与FR的组成方式为“FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4”。CDR自己可以分为V、D、J三种片段，它们的组合给了CDR超级丰富的变化，我们把这叫做VDJ重组。其中CDR3超变程度更高，抗体的特异性和亲和力成熟主要涉及到该区域的改造。当被抗原激活，生产抗体的B细胞开始迅速增殖，它们编码可变区的基因将会以远超其他细胞的速度开始突变，这种名为体细胞超突变（SHM）的过程使得B细胞每一次分裂产生的后代都微妙地有所不同。随后，辅助T细胞则会对B细胞进行进一步选择，只有那些产生高亲和力抗体的B细胞才能获得资源存活下来，这个过程叫亲和力成熟。恒定区：恒定区可以与细胞表面受体或补体系统蛋白相互作用，从而触发宿主效应功能（effector function)，比如裂解入侵细胞或吞噬外来病原。抗体恒定区域位于H链靠近C端的3/4或4/5(约从119位氨基酸至C末端) 和L链靠近C端的1/2(约含105个氨基酸残基)区域。抗体重链恒定区分为CH1，CH2和CH3，其中CH3区域涉及到细胞膜表面受体结合，CH2涉及补体激活途径，是补体结合位点。简单来说，可变区负责识别抗原，恒定区帮助宿主决定如何处置抗原。抗体药物技术方案: 鼠源到人源单抗名字最末尾的mab代表的是单抗，mab前面的1-2个字母里面藏着单抗命名的法则：如果是o，那它就是鼠源抗体；如果是xi，那它就是人鼠嵌合抗体；如果是zu，说明是人源化抗体；如果只有一个u，那就是全人源抗体。各种类型抗体的结构示意图鼠源性抗体与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术，大多数杂交瘤细胞从BALB/c小鼠中产生，可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。但缺点也非常明确：操作步骤繁琐、利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别、产生人抗鼠抗体( HAMA）反应、鼠源性抗体半衰期短，需要反复大量使用，又加剧了HAMA反应的产生、在人体循环系统中很快被清除等。杂交瘤技术制备单克隆抗体动物体内产生单抗的方法鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物首选BALB/c小鼠（或LOU/c大鼠）。将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。该法操作简便、经济且抗体浓度很高。但是，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此得到的腹水抗体要提纯后才能使用。体外培养法体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。细胞体外培养一定时间后，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆。抗体相较于免疫动物生产单克隆抗体的方法，体外培养不需要对得到的抗体进行纯化，但该法的产量较低且费用昂贵。基因工程重组将单抗进行人源化改造人鼠嵌合抗体（human-mouse chimeric antibody）人源Ig恒定区+鼠源Ig可变区。代表药物：利妥昔单抗。人源化抗体（humanized antibody）将鼠源单抗可变区的CDR置换成人Ig的CDR，或者以人抗体为参照，改造替换鼠源单抗表面氨基酸残基，得到镶面抗体。代表药物：曲妥珠单抗。全人源抗体（fully human antibody）将人的B细胞与骨髓瘤细胞融合，以生产全人源的单抗药物的设想由来已久，但一直难有突破，不能将二者融合起来。随着技术的进步，可以采用噬菌体展示抗体库或转基因小鼠产生全人源抗体。代表药物：阿达木单抗。噬菌体展示其原理为将B淋巴细胞的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）采用PCR方法进行扩增，将扩增的片段插入到噬菌体载体中，抗体分子Fab片段或者单链抗体（scFv）与单链噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，再将噬菌体转染至宿主细胞中进行增殖，待成熟后释放出来，最后利用抗原筛选的方法经过亲和吸附-洗脱-扩增等步骤后即可获得靶抗原特异性的单克隆噬菌体抗体。噬菌体展示技术噬菌体展示技术对抗体蛋白的修饰和折叠，与人体细胞差别非常大。一定程度上影响了抗体可变区与抗原的亲和力。有研究表明，对癌症的治疗而言，治疗效果是随抗体的亲和力增加而增加的。而由噬菌体展示技术获得的抗体可变区，其亲和力通常不足以有效治疗肿瘤。因此，噬菌体展示技术获得的抗体往往还需人工优化需要多次提纯才能弥补这个缺陷。为了解决噬菌体展示平台面临的问题，基于真核生物酵母菌的酵母展示平台就出现了。酵母表面展示技术酵母表面展示技术原理为将外源蛋白基因与特定的载体基因融合后导入酵母细胞，融合蛋白含有可锚定在酵母细胞壁上的结构，经转录翻译后可将外源蛋白固定化表达在酵母细胞表面。在抗体工程中，利用酵母真核表达系统的特性，将抗体文库蛋白表达于酵母细胞表面，利用磁珠和流式细胞分选技术进行筛选，获得高亲和力或高稳定性的抗体序列。此项技术在各种骨架形式的抗体工程，如单链可变区scFv、抗体结合区片段Fab、全长IgG、骆驼科单域抗体可变区VHH，以及抗体亲和力成熟、抗体稳定性提升、pH稳定性等方面均有广泛应用。对于酵母文库筛选，我们通常经验是采用流式细胞分选法或磁珠筛选结合流式分选的方法。免疫文库通常仅需1轮磁珠筛选结合1-2轮流式细胞分选，通过NGS测序就可获得多株多样性丰富且亲和力高的抗体序列，进一步对多个克隆进行鉴定，之后还可按要求进行多轮亲和力成熟提高性能。Yeast display 原理与流程酵母展示平台实现了从原核表达系统到真核表达系统的进步，不过酵母的蛋白质修饰系统与人体依然有不小的差距，这对抗体功能也存在一定的影响。也正是这种差别在一定程度上限制了酵母展示平台的应用。转基因小鼠转基因小鼠平台生产抗体的方式，是先破坏小鼠的免疫系统，采用基因编辑技术将人体编码抗体的IgG基因转入小鼠体内，并在小鼠体内最大程度再现人体抗体生产系统，再经杂交瘤技术即可大量生产人源的IgG抗体。另一方面，为了保持抗原可变区的多样性，噬菌体展示和酵母展示依赖于人工引入突变，而转基因小鼠则利用的是B细胞天然自主的体细胞超突变。理论上讲，小鼠作为历经数百万年的进化的生命体产物，其引入突变的方式更优于人工。转基因小鼠制备全人源抗体示意图下一篇会介绍部分概念，方便大家理解当下的各种热词。包括单域抗体、纳米抗体、双特异性单克隆抗体等。注释：杂交瘤技术又称为单克隆抗体技术：将免疫动物的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，可以得到既能产生抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，利用杂交瘤细胞可以大量的生产单克隆抗体。Balb/C（巴比赛）是广泛使用的实验小鼠。这个品系具有白化、免疫缺陷的特征，是一个近交品系。Balb/C是一种极为温顺的品种，有着易于繁殖和雌雄体重差异小的特点。值得注意的是Balb/C对致癌物极其敏感，常用于肺癌、肾癌等实验动物模型的建立。另外，对BALB/c品系注射矿物油可迅速引发浆细胞瘤，该品系被广泛应用于杂交瘤和单克隆抗体的生产。BALB/c小鼠在癌症治疗和免疫学研究中有着广泛应用。Fab段免疫球蛋白酶解（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）片段免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶Fab段 2个 抗原结合片段（fragment with antigen binding）Fc段   1个 可结晶片段（fragment crystallized）胃蛋白酶F(ab’)2 段 1个 Fc'段 1个免疫球蛋白的功能区及主要功能免疫球蛋白的基本结构及功能区示意图免疫球蛋白分子的每条重链和轻链均可经链内二硫键形成球形的结构域（domain），发挥其相应的功能，故又称为功能区。重链和轻链V 区各形成一个结构域，分别以VH 和VL 表示；重链和轻链C 区形成数量不等的结构域（CH1、CH2、CH3、CH4）免疫球蛋白轻链可变区、恒区及高度可变区立体构象；黑条表示二硫键（摘自Edmundson AB：1975）免疫球蛋白分子每个结构域约由110 个氨基酸残基构成。各结构域虽然功能不同，但却具有相似的结构，即各结构域均形成“β 三明治”样二级结构，也称为“β 桶状”（β barrel）结构。该结构由多肽链折叠形成两个反向平行的β 片层（anti-parallel β sheet），片层间由一个链内二硫键垂直连接，以稳定其结构。免疫球蛋白多肽链分子的这种折叠方式称为免疫球蛋白折叠（immunoglobulin fold）。功能区的作用VL和VH：结合抗原决定簇（FV区）CL和CH：具有同种异型的遗传标记CH2：结合补体CH3：结合Fc受体 单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞铰链区（hinge region）免疫球蛋白铰链区位于CH1 与CH2 功能区之间。该区富含脯氨酸，因此易伸展弯曲，能改变“Y”形两臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个相同的抗原表位。也有利于免疫球蛋白分子补体结合位点的暴露，与补体C1q 结合而激活补体。铰链区对木瓜蛋白酶和胃蛋白酶敏感，经酶水解处理后，可使免疫球蛋白从该部位断裂为数个不同的片段。Fab相关的作用机制识别游离的靶点的单抗游离存在于血液循环中的细胞因子、促血管生成因子、生物毒素等都可以作为单抗的作用的靶点。中和抗体的作用机制就是通过结合抗原进行中和，使抗原丧失结合受体的能力，进而丧失生物学功能。常见的针对游离靶点的抗体有血管内皮生长因子（VEGF）抗体，肿瘤坏死因子（TNF）抗体，炭疽毒素中和抗体等。识别细胞表面受体的单抗靶点抗原表达在特定细胞表面，具有特定的功能，例如细胞激活、生长或迁移。根据抗体的Fab活性，可以分为结合、拮抗和激活。结合型抗体只是结合在靶蛋白表面但并不影响其功能。因此，靶蛋白受体的配体仍然可以与其结合，从而传递信号。结合型抗体可以用于标记靶细胞，从而让其Fc产生效应功能或通过搭载毒素从而杀灭靶细胞。拮抗型抗体封阻受体上的与配体相互作用所需的表位，阻止配体结合产生的信号传导。激活型抗体模拟配体的功能，识别结合靶受体并传导信号至细胞内部。基于被激活的细胞内信号强弱，激活型抗体可能在治疗时使得靶细胞被激活并释放细胞因子，进而产生副作用。Fc相关的作用机制单克隆抗体通过其Fc部位结合各种FcγRs,进而发挥其效应功能，包括ADCC, ADCP和CDC（图2）. 以最常见的IgG1为例，其Fc区域通过结合FcγRIII（CD16A）激活NK细胞诱导ADCC；与巨噬细胞上FcγRIII（CD16A），FcγRII（CD32A）和FcγRI（CD64）结合，引发ADCP；与补体的C1q结合激活补体引发CDC。Fc 还能够以pH依赖的方式结合新生的Fc受体（FcRn），避免被核内体降解，从而延长单克隆抗体的半衰期。抗体Fc段介导的效应功能（摘自Hilma J ：2020）ADCCADCC作用是一种细胞介导的免疫防御机制，在靶细胞膜表面抗原结合了特异性的抗体的情况下，激活免疫系统的效应细胞进而裂解靶细胞的作用。因其对已存在的抗体的依赖性，ADCC作用是适应性免疫反应的一部分，也是体液免疫反应的一部分，用于限制和消除感染。经典的ADCC作用由NK细胞介导，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用。比如嗜酸性粒细胞能通过ADCC作用杀死某些特定的寄生虫。ADCP抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ADCP）是治疗性抗体对抗病毒感染或者肿瘤疾病的一种重要作用机制。在体内，ADCP 作用由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及树突细胞通过其细胞表面表达的 FcγRIIa、 FcγRI、FcγRIIIa 介导，其中 FcγRIIa 被认为是 ADCP 作用过程中最主要的 Fcγ 受体。ADCP 作用过程为抗体与疾病细胞表面的抗原特异性结合，随后抗体 Fc 片段与效应细胞（如巨噬细胞）表面 Fcγ 受体结合，诱导巨噬细胞吞噬疾病细胞。CDC补体是存在于人或脊椎动物血清于组织液中一组不耐热的，经活化后具有酶活性的蛋白质，共包括30余种可溶性蛋白和膜结合型蛋白。抗体的Fc片段能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）清除目的细胞。单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）是由抗体重链的可变区与轻链的可变区在一段肽链的连接下构成的小分子，是具有抗体活性的最小功能结构单位。单链抗体可以由表达系统进行表达，也可以用噬菌体展示技术进行制备。透过人工改造，只表达可变区，通过人工合成的连接肽（Linker）基因将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）连接成重组基因，由该重组基因表达的抗体就称为单链抗体（scFv）。在结构上，可以将重链的N 端与轻链的C 端相连，也可以将轻链的N 端与重链的C 端相连。Linker 长度通常为15~25 个氨基酸，通常由甘氨酸（Gly）和丝氨酸（Ser）构成，具有一定弹性及蛋白酶抗性，Linker 的作用是连接VH，VL，并保持一定的弹性，使VH，VL 的功能区折叠后仍可配对，构成单价抗原结合位点。由于其分子质量小，穿透力强，半衰期短，免疫原性低等特点，在疾病临床诊断、治疗、预防等方面具有重要作用和广阔的应用前景。单域抗体即为VH，约为完整分子的1/2。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。纳米抗体（nanobody, Nb）即重链单域抗体VHH (variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody) ，该类抗体只包含一个重链可变区（VHH）和CH2，CH3区，相比于其他抗体，轻链天然缺失，其重链可变区VHH的CDR3区较长。纳米抗体晶体直径2.5nm，长4nm，是自然存在的可以和抗原结合的最小片段。最早从骆驼血液中发现的，后来又有科学家从鲨鱼血液中发现了这种小型抗体，到目前为止也就这两类动物能自然产生这种小型抗体。纳米抗体一般通过免疫羊驼然后构建噬菌体文库，并使用噬菌体筛选技术筛选制备。VHH的CDR3区较长，人和小鼠抗体VH的CDR3区平均长度为9-12个氨基酸，VHH的CDR3区为16-18个氨基酸。可变区的扩大能够形成更丰富的抗原结合构想，在一定程度上弥补了轻链缺失导致结合力下降的不足，从而使得纳米抗体本身具有较强的抗原结合能力。纳米抗体的CDR3区可形成一个特殊的凸环，凸环大部分折叠在FR2上，这里疏水残基受到保护，可避免与外界水环境接触。凸环中的半胱氨酸与CDR1（或FR2）区的半胱氨酸形成二硫键从而使其结构稳定。该凸环结构能够结合酶的裂隙或是凹穴，因此能够很好地成为酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂。抗体融合蛋白在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白（fusion protein，FP）抗体融合蛋白（Ig融合蛋白）是指在基因水平上将目的基因同免疫球蛋白部分片段基因相连，并在真核或原核表达系统中表达的重组蛋白。抗体融合蛋白具有抗体的特性及融合功能蛋白的活性，可广泛应用于免疫诊断、免疫治疗、抗体纯化及抗体和抗原的定量分析等，特别可用于免疫导向药物的制备。根据结合的Ig片段的不同，可以将抗体融合蛋白分为Fab融合蛋白、Fc融合蛋白与单链抗体（scFv）融合蛋白。Fab（Fv）融合蛋白、单链抗体融合蛋白Fab(Fv)融合蛋白主要是将Fab(Fv)段与其他生物活性蛋白结合，利用抗体对抗原的特异性识别功能将活性蛋白导向特定部位。使活性蛋白在特定部位发挥生物作用。常见的与Fab融合的蛋白有毒素、细胞因子、受体、酶等。研究表明，抗体可变区的N端空间结构上与互补决定区（CDR）形成的抗原结合部位十分接近，有的抗体可变区N端残基甚至直接参与抗原结合部位的形成，如果将效应蛋白与抗体片段的N端结合，可能对抗体可变区的空间构型造成较大影响，从而降低抗体与抗原的结合能力。因此，通常将蛋白与抗体片段的C端进行结合，形成抗体融合蛋白。Fc融合蛋白Fc 融合蛋白是指利用基因工程技术将免疫球蛋白（IgG、IgA 等）的 Fc 段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。具有生物学活性的功能蛋白可以是细胞因子、毒素、受体、酶、抗原肽等。Fc 融合蛋白不仅可发挥所融合蛋白的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如可引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（ CDC）与抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）等。蛋白类药物在血浆内半衰期较短，为了达到治疗效果需要大剂量给药，这样会造成严重的副作用，给患者造成巨大的负担。将功能蛋白与免疫球蛋白的 Fc 段融合，可以延长药物在血浆内的半衰期，降低药物的免疫原性，在疾病的诊断与治疗方面有重要的意义。Fc融合蛋白的常见结构单克隆抗体与抗体融合蛋白的区别           单克隆抗体           抗体融合蛋白   结构               Y型           具有多种结构制备方法   杂交瘤技术/基因重组              基因重组表达系统     真核系统/原核系统         真核系统/原核系统作用原理特异性识别抗原Fc段引起ADCC、ADCP、CDC等作用功能蛋白与靶分子间的受体-配体的相互作用抗体融合蛋白与双特异性抗体抗体融合蛋白是将抗体的部分片段与目的蛋白进行融合表达得到的重组蛋白，若将两个具有不同抗原特异性的抗体片段连接至同一蛋白，即可得到双特异性抗体。 双抗发展历程（中文翻译）[1]双特异性抗体和多价抗体双特异性抗体是针对两个明确的特异位点产生的人工分子，通常在自然状态下是不能发生的。这就意味着需要借助生物化学，分子以及遗传学方面的知识，经过改造才能实现。自概念首次被提出，双抗技术至今已发展了60年。早期的bsAbs技术依赖于杂交瘤技术和化学重组方法，但是重链错配和非人类相关免疫原性限制其广泛的临床应用。基因工程技术的出现和快速发展带来了第二次bsAbs生产浪潮，之后伴随该技术的进步以及诸如噬菌体展示，蛋白质工程和转基因小鼠等众多方法的出现，双抗迎来研发热潮。三类研发阶段汇总如下：化学交联BsAb分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。细胞工程BsAb将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤（quadroma）。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应（HAMA），因此不适用于临床。基因工程BsAb多采用抗体分子片段，如Fab，Fv或scFv，经基因操作修饰后，或体外组装为BsAb，或直接表达分泌型的BsAb。根据双抗的结构，可以分为以下两大类IgG样BsAbs（具有Fc区）具有Fc介导的效应功能，如ADCC、CDC、ADCP，可以进一步加强双抗的肿瘤杀伤能力，具有较高免疫原性。IgG 样双抗由于具有较大分子量以及能够通过结合 FcRn参与循环利用，因此具有较长的血清半衰期。工艺较为成熟，并且 Fc部分有助于提高抗体纯化的溶解度和稳定性，生产相对便利。非IgG样BsAbs（缺乏Fc区）仅通过抗原结合力发挥治疗作用，免疫原性较低，安全性相对较高。由于其相对分子质量较小可渗透到肿瘤组织，因此具有更强的治疗效果。非 IgG 样双抗的血清半衰期非常短，已上市的Blincyto半衰期仅为2小时，而单抗药物的半衰期通常超过 100 小时。非 IgG 样双抗CMC 工艺较为复杂。国内外布局双抗的企业较多，研发平台也有多种形式，基于有Fc片段的IgG样双抗技术平台汇总如下：有Fc片段的IgG样双抗技术平台研发平台展示企业实力，目前，众多企业布局IgG 样双抗，以AntibodyTherapeutics 上于2020年发表的一篇双抗综述为例，在中国临床阶段的21个项目中，17种双抗的结构已经公开了，这些结构可分为如下四类：不对称型IgG类双抗（7个）对称型IgG类双抗（6个）双特异性片段（1个）抗体-受体融合双抗（3个）中国药公企开发的BsAb结构 [2]总体而言，分子设计时利用整个IgG结构作为骨架，构建一个具有双特异性或者多特异性的二价或多价抗体，由于具有跟天然抗体一样的结构，CMC工艺更成熟，且体内分布行为更好预测。从结构来看，IgG-like双抗又可以进一步被分为对称模式和不对称模式。对称IgG样双抗具备和天然IgG相似的结构和较高的稳定性，不存在错配问题，因此CMC相对简单且易于生产；而不对称IgG样双抗具有桥接功能，并且可以通过调节两个抗体的效价进一步调节双抗对两个靶点的亲和力，有望提高双抗的安全性和特异性，但其生产相对复杂，需要解决重链和轻重链的错配问题。双特异性抗体免疫疗法的新型作用机制[3-4]综上所述，不存在最佳的双特异性抗体结构，也不存在某个结构形式普遍适用于任何双特异性抗体分子。相反，双特异性抗体结构形式的多样性才是宝贵的资源，才有可能成就治疗性双特异性抗体的百花齐放。参考文献[1] https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1.[2] AntibodyTherapeutics, 2020, Vol. 3, No. 2 126–145.[3] Kontermann. PEGS  Boston, 2019.    [4] Labrijn et al. Nat. Rev. Drug Discov.2019,18:585-608.声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

01双特异性抗体研究现状早在1960年，Nisonoff等人首次描述了一种具有两个不同抗原结合位点的人造抗体分子，即双特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb）。随着抗体工程里程碑式进展，双特异性抗体的概念和技术创新也日渐发展。1980年代中期，T细胞重定向和接合（T cell redirection and engagement）的概念被首次提出来，直至2009年，运用该概念的首个双特异性抗体卡妥索单抗（Catumaxomab, CD3 × EpCAM）于欧盟批准上市，用于腹腔内恶性腹水的治疗。由于Fc介导的脱靶效应，卡妥索单抗产生了严重的细胞因子释放综合征和剂量依赖性肝毒性，加上生产成本高、市场表现不佳等原因，出于商业考虑最终于2017年退市。2014年，博纳吐单抗（Blinatumumab, CD3 × CD19）作为全球第二个双特异性抗体，获FDA批准，用于治疗急性B细胞淋巴细胞白血病，获得良好的临床效果，促使双特异性抗体的迅速发展。目前已有8个双特异性抗体药物获FDA批准上市。国内公司也深度参与双抗药物研发。截至2022年底，国内双抗在研药物共145个，处于临床Ⅰ期及临床前研究阶段药物占比80%以上。目前国内仅康方生物AK104卡度尼利单抗（Cadonilimab，CTLA4 × PD-1）作为全球首款肿瘤免疫双抗，于2022年6月获NMPA批准上市，用于治疗既往接受含铂化疗治疗失败的复发或转移性宫颈癌患者。2022年11月，国家药监局药审中心发布《双特异性抗体类抗肿瘤药物临床研发技术指导原则》，其中指出，BsAb的开发，应该体现以解决单抗不能解决的问题为主要目标，以临床需求为导向的设计思路。BsAb能够介导免疫细胞对肿瘤的杀伤、增强对免疫细胞的激活、能够通过双靶点信号阻断防止耐药、具备更强肿瘤特异性、靶向性和降低毒性和能够介导更强的内吞作用，在治疗方面，双特异性抗体具有比单抗拥有更大的潜在优势。02双特异性抗体结构类型结构决定功能。不同的空间结构、抗体-受体结合的发生顺序（同时或者依特定顺序结合）、靶点结合强度会产生不同的生物学效应。需要根据靶点、作用机制及预期发挥的生物学效应，合理地设计BsAb。根据有无含Fc片段，可以将双抗分为IgG-like双特异性抗体（含Fc片段）和Non-IgG-like双特异性抗体（不含Fc片段）。IgG-like双抗包括：Quadromas、Knobs-into-holes/CrossMab、Dual-variable domains Ig（DVD-Ig）、Half-molecule exchange、κλ-bodies等类型。Non-IgG-like双抗主要基于scFv结构：Tandem scFvs（BiTE）、Dual-affinity retargeting molecules（DARTs）、Tandem diabodies（TandAbs）、也包括bi-Nanobody、Dock-and-lock（DNL）等类型。03双特异性抗体生物学作用机制虽然结构类型有所不同，双特异性抗体的生物学作用机制大致可归类如下。目前，普遍认为BsAb的作用机制主要包括桥联细胞、桥联受体及桥联因子三类。3.1 桥联细胞BsAb可以实现细胞毒活性效应细胞的重定向功能。BsAb的一个抗原结合部位与肿瘤细胞上表达的特异性抗原结合，而另一个抗原结合部位桥联并激活效应细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞等。目前在研的其中一个靶点为T细胞表面CD3靶点的双抗数量较多，主要应用于急性髓/淋巴细胞白血病（Acute Myeloid/Lymphoblastic Leukemia, AML/ALL）和淋巴瘤血液系统疾病的治疗（CD19, CD20, CD123, CD33, CD38, BCMA）。但靶外肿瘤毒性（on-target/off-tumor toxicities）、肿瘤微环境中效应细胞数量有限以及T细胞激活能力下降是目前CD3双特异性抗体在实体瘤治疗中存在的问题。卡妥索单抗与博纳吐单抗是较为典型的利用该机制的药物，其作用机制如下：1)卡妥索单抗（Catumaxomab, CD3 / EpCAM）：Triomab结构，属于三功能抗体，一个臂与肿瘤相关抗原EpCAM结合，另一个臂与T细胞上的CD3结合，Fc区优先识别辅助细胞如巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞上的CD64、CD32a、CD16受体。2)博纳吐单抗（Blinatumomab, CD3/CD19）：BiTEs（Bispecific T cell Engagers）结构，anti-CD3 scFv与anti-CD19 scFv通过一个柔性肽连接。3.2 桥联受体BsAb可以同时特异性阻断多条信号通路、蛋白或新生血管的生成，或通过桥联受体加强信号通路从而增强抗肿瘤效果，也可通过靶向介导增加抗肿瘤的特异性和安全性。主要有以下四种作用类型。1)Dual inhibitory checkpoint bsAbs，靶向双抑制性免疫检查点双抗：通过结合两个免疫抑制检查点分子，同时阻断多条抑制性信号通路。2)Co-stimulatory and inhibitory checkpoint bsAbs靶向共刺激和抑制免疫检查点双抗：通过结合激活性和抑制性的免疫检查点分子，阻断抑制性信号通路的同时，激活免疫细胞。3)Growth factors/cytokines and immunomodulatory checkpoint bsAbs，靶向生长因子/细胞因子和免疫检查点双抗：通过中和肿瘤微环境中的相关生长因子/细胞因子（如TGF-β、VEGF等），阻断生长因子/细胞因子对肿瘤的发展，并结合免疫检查点，调节免疫细胞。4)TAA and immunomodulatory checkpoint bsAbs，靶向肿瘤相关抗原和免疫检查点双抗：其中一个靶点位于肿瘤细胞表面，另一个靶点建立在刺激肿瘤浸润的、预先激活的免疫细胞，如肿瘤特异性效应T细胞。识别肿瘤细胞，并调节免疫细胞。3.3 桥联因子BsAb可以用于促进蛋白复合物和膜受体蛋白复合物的形成，提高抗体药物偶联物或激动剂抗体的活性。艾美赛珠单抗（Emicizumab，IXa/X）被设计成可以靶向桥连凝血因子IXa和凝血因子X，通过模拟替代凝血因子VIII，促进凝血酶的产生，降低血友病患者的出血率。04双特异性抗体体外活性检测在体外生物学活性检测中，可以根据具体项目的作用机制，采用合适的检测方法进行。最为基础地，可以使用ELISA或SPR法进行单靶点或双靶点的结合活性实验，结合活性方法适用于基于抗体技术的任何药物。另外，可以根据双抗的作用机制，如T细胞的活化、靶细胞的杀伤、受体激活或阻断后的细胞活性变化（如增殖、凋亡、下游信号通路磷酸化、细胞因子释放）等，设计基于细胞的生物活性实验（如报告基因法、流式细胞术等）。如果涉及Fc效应功能，可使用ADCC、ADCP、CDC等相关实验进行检测。以下以4种双特异性抗体的体外活性检测方法进行举例。1) Tebentafusp（Kimmtrak，CD3/IMCgp100）Tebentafusp(ImmTAC, Immune-mobilising monoclonal TCRs against cancer)Tebentafusp的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性两种方法进行。结合活性通过ELISA夹心法同时检测检测gp100和CD3双靶点的结合活性。细胞活性通过T细胞激活后释放的IL-2进行检测。2) 格罗菲妥单抗（Glofitamab, CD3/CD20）GlofitamabGlofitamab的生物学活性检测采用细胞生物学活性方法（报告基因法）进行。Glofitamab结合表达CD20的Z-138细胞或WIL2-S靶细胞后，激活表达CD3的Jurkat T/NFAT-RE-luc2P细胞，导致转录因子NFAT的激活，诱导荧光素酶报告基因的表达，两者呈成剂量依赖关系。3) 卡度尼利单抗（Cadonilimab，CTLA-4/PD-1）CadonilimabCadonilimab的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性（报告基因法）两种方法进行。结合活性通过ELISA或FACS分别检测各靶点结合或竞争结合活性。细胞活性使用荧光素酶报告基因法进行检测。4) 埃万妥单抗（Amivantamab，EGFR/c-MET)AmivantamabAmivantamab的生物学活性检测采用结合活性和细胞生物学活性两种方法进行。结合活性通过竞争法时间分辨荧光能量共振转移（TR-FRET）分别检测EGFR和c-MET靶点的结合活性。因为该分子设计为低岩藻糖化的IgG1双抗，具有ADCC效应，细胞活性采用ADCC报告基因法进行，Amivantamab与靶细胞表面的抗原结合后，Fc区与表达FcγRIIIa受体的Jurkat细胞结合，导致转录因子NFAT的激活，诱导荧光素酶报告基因的表达，两者呈成剂量依赖关系。05结语抗体药物的快速发展促进了双特异性抗体的发展。截至目前，已有200多个BsAb处于临床和临床前研究阶段，用于肿瘤和其他疾病的治疗。由于BsAb分子结构的复杂性，建立可重复的、反映双抗药物作用机制的生物测定方法用于双抗药物的效价测定和生物学特性表征仍具有一定的挑战性。对于双靶点药物的生物学活性检测，单靶点试验不能评价潜在的相互作用（如协同效应），双靶点生物测定更能反映作用机制，且省时高效。开发稳健高效的生物学活性检测方法对BsAb生产过程进行质量控制极为重要。虽然在BsAbs的研究和发展过程中，仍然面临着许多问题，但随着科学家们对BsAbs作用机制的研究深入及双特异性分子结构的不断优化，相信未来会有越来越多的BsAbs应用于临床治疗，惠及更多的患者。12月2日（周六） 13：30-17：00，诺唯赞联合生物制品圈将共同组织了一场以“抗体药关键质量属性分析及活性检测要点”为主题的线下沙龙活动，共同探讨抗体药关键质量研究基础和活性检测研究相关的内容。希望带给大家一些启发和帮助，共同助力抗体药行业的长久发展。1活动信息1、时间：2023年12月2日（周六）13:30-17:002、地点：上海（具体地点待定）3、参与人员：生物医药研发企业、科研院校和监管机构从业人员4、报名方式：扫描二维码或点击“阅读原文”,填报个人信息，仅限生物制药行业人员，规模在20人以内，本活动采用审核制，名额有限，最后以邮件确认为准。5、报名费用：50-100元（具体待定，含场地费用、茶歇等，报名缴费后若无法按时到场参与，报名费不予退还）2讨论话题一、抗体药关键质量研究基础1.关于抗体药质量研究，国内外有哪些重要的技术指南或规范？2.高产细胞株的筛选、细胞的检定有哪些关键考虑？3.抗体药质量分析技术主要有哪些？二、抗体药活性检测研究1、抗体药活性检测主要包含哪些？2、抗体药CMC阶段对高产细胞株的筛选要求都哪些？3、高产细胞株的筛选现常用的方法一般如何选择？测定方法的选择依据是怎样的？解决高通量的痛点，HTRF方法学是不是可以完全替换常规ELISA方法学？5、报告基因细胞株活性检测方法有何优点？有哪些应用场景？6、细胞株筛选和活性检测的方法学要求？eg特异性、稳定性、精密度、准确度；参考的标准是？7、抗体药的抗原结合活性测定一般在什么阶段？测定方法的选择依据是怎样的？HTRF方法的是否可以作为放行标准？8、关于ADCC活性分析，原代细胞方式和报告基因方式选择依据是什么？9、不同的药物类型eg：双抗、单抗、ADC、CAR-T对细胞因子检测的要求差异是怎样的？10、细胞因子不同测试阶段有哪些检测方法？常用方法CBA、MSD、ELISA、HTRF等选择的依据是什么？测试不同因子的选择依据是什么？是否会作为质控放行检项？3沙龙宗旨生物蜂：“蜂”有勤劳，传播，奉献之意。作为生物制品圈线下平台这一延伸，生物蜂旨在打造一个近距离的，高效的，中立的交流平台，为生物制品圈的技术达人创造交流空间！参考文献[1]Labrijn, A. 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A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges.[J].Pharmacology&Therapeutics, 2019.[6]Seimetz D, Lindhofer H, Bokemeyer C. Development and approval of the trifunctional antibody catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) as a targeted cancer immunotherapy.[J].Cancer Treatment Reviews, 2010.[7]Zhang T , Lin Y , Gao Q .Bispecific antibodies targeting immunomodulatory checkpoints for cancer therapy.[J].Cancer Biology and Medicine, 2023. [8]Damato, B. E., Dukes, J., Goodall, H., and Carvajal, R. D. Tebentafusp: T cell redirection for the treatment of metastatic uveal melanoma.[J]. Cancers, 2019.[9]Dickinson M J, Carlo-Stella C, Morschhauser F, Bachy E, Corradini P, Iacoboni G, et al. Glofitamab for relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.[J].New England Journal of Medicine, 2022.[10]Pang X, Huang Z, Zhong T, Zhang P, Wang ZM, Xia M, et al. 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