更新于：2024-11-01

RPA1

更新于：2024-11-01

基本信息

别名

HSSB、REPA1、Replication factor A protein 1

+ [10]

简介

As part of the heterotrimeric replication protein A complex (RPA/RP-A), binds and stabilizes single-stranded DNA intermediates, that form during DNA replication or upon DNA stress. It prevents their reannealing and in parallel, recruits and activates different proteins and complexes involved in DNA metabolism (PubMed:27723720, PubMed:27723717). Thereby, it plays an essential role both in DNA replication and the cellular response to DNA damage (PubMed:9430682). In the cellular response to DNA damage, the RPA complex controls DNA repair and DNA damage checkpoint activation. Through recruitment of ATRIP activates the ATR kinase a master regulator of the DNA damage response (PubMed:24332808). It is required for the recruitment of the DNA double-strand break repair factors RAD51 and RAD52 to chromatin in response to DNA damage (PubMed:17765923). Also recruits to sites of DNA damage proteins like XPA and XPG that are involved in nucleotide excision repair and is required for this mechanism of DNA repair (PubMed:7697716). Also plays a role in base excision repair (BER) probably through interaction with UNG (PubMed:9765279). Also recruits SMARCAL1/HARP, which is involved in replication fork restart, to sites of DNA damage. Plays a role in telomere maintenance (PubMed:17959650, PubMed:34767620). As part of the alternative replication protein A complex, aRPA, binds single-stranded DNA and probably plays a role in DNA repair. Compared to the RPA2-containing, canonical RPA complex, may not support chromosomal DNA replication and cell cycle progression through S-phase. The aRPA may not promote efficient priming by DNA polymerase alpha but could support DNA synthesis by polymerase delta in presence of PCNA and replication factor C (RFC), the dual incision/excision reaction of nucleotide excision repair and RAD51-dependent strand exchange (PubMed:19996105).

关联

项与 RPA1 相关的药物

JC-229

靶点

RPA1

作用机制

RPA1 inhibitors

在研机构

Rutgers Biomedical & Health Sciences

原研机构

Rutgers Biomedical & Health Sciences

在研适应症

非洲锥虫病

非在研适应症-

最高研发阶段临床前

首次获批国家/地区-

首次获批日期1800-01-20

100 项与 RPA1 相关的临床结果

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100 项与 RPA1 相关的转化医学

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0 项与 RPA1 相关的专利（医药）

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823

项与 RPA1 相关的文献（医药）

2024-10-28·Nucleic Acids Research

Partial wrapping of single-stranded DNA by replication protein A and modulation through phosphorylation

Article

作者: Holehouse, Alex S ; Chadda, Rahul ; Antony, Edwin ; Cooley, Richard B ; Dastvan, Reza ; Biswas, Gargi ; Sigurdsson, Snorri Th ; Origanti, Sofia ; Holehouse, Alex S ; Ahmad, Iram Munir ; Mehl, Ryan A ; Mehl, Ryan A ; Kaushik, Vikas ; Cooley, Richard B ; Sigurdsson, Snorri Th ; Levy, Yaakov ; Deveryshetty, Jaigeeth ; Bothner, Brian

AbstractSingle-stranded DNA (ssDNA) intermediates which emerge during DNA metabolic processes are shielded by replication protein A (RPA). RPA binds to ssDNA and acts as a gatekeeper to direct the ssDNA towards downstream DNA metabolic pathways with exceptional specificity. Understanding the mechanistic basis for such RPA-dependent functional specificity requires knowledge of the structural conformation of ssDNA when RPA-bound. Previous studies suggested a stretching of ssDNA by RPA. However, structural investigations uncovered a partial wrapping of ssDNA around RPA. Therefore, to reconcile the models, in this study, we measured the end-to-end distances of free ssDNA and RPA–ssDNA complexes using single-molecule FRET and double electron–electron resonance (DEER) spectroscopy and found only a small systematic increase in the end-to-end distance of ssDNA upon RPA binding. This change does not align with a linear stretching model but rather supports partial wrapping of ssDNA around the contour of DNA binding domains of RPA. Furthermore, we reveal how phosphorylation at the key Ser-384 site in the RPA70 subunit provides access to the wrapped ssDNA by remodeling the DNA-binding domains. These findings establish a precise structural model for RPA-bound ssDNA, providing valuable insights into how RPA facilitates the remodeling of ssDNA for subsequent downstream processes.

2024-10-01·Science of The Total Environment

First insight of the intergenerational effects of tri-n-butyl phosphate and polystyrene microplastics to Daphnia magna

Article

作者: Huang, Yumei ; Lin, Mingfu ; Chen, Xiaoli ; Qing, Xian ; Yang, Xinlu ; Gan, Yijing ; Wang, Jun ; Zhong, Lixiang ; Zhang, Menghuan

As an emerging organic pollutant, tributyl phosphate (TnBP) can be easily adsorbed by microplastics, resulting in compound toxic effects. In the present work, the effects of polystyrene microplastics (PS-MPs) and TnBP on the survival, growth, reproduction and oxidative stress of Daphnia magna (D. magna) have been evaluated through multigenerational test. Compared with the alone exposure groups, the somatic growth rate and the expression values of growth related genes rpa1, mre11, rnha, and rfc3_5 in the F₁ generation of the combined exposure groups were significantly lower (p < 0.05), indicating synergistic effect of PS-MPs and TnBP on the growth toxicity and transgenerational effects. In addition, compared with the PS-MPs groups, significantly lower average number of offspring and expression values of reproduction related genes ccnb, mcm2, sgrap, and ptch1 were observed in the combined exposure group and TnBP group (p < 0.05), indicating TnBP might be the major factor causing reproductive toxicity to D. magna. Although PS-MPs and TnBP alone or in combination also had toxic impacts on the growth, survival and reproduction of D. magna in generations F₀ and F₂, the effects were less than F₁ generation. Regarding oxidative stress, the activity of SOD, CAT and GSH-Px and MDA content in the generations F₀ and F₁ of combined exposure groups were higher than the TnBP group but lower than the PS-MPs groups, suggesting that PS-MPs might be the dominant cause of the oxidative damage in D. magna and the presence of TnBP would alleviate oxidative stress by reducing the bioaccumulation of PS-MPs. The present work will provide a theoretical basis for further understanding of the toxic effects and ecological risks of combined TnBP and microplastic pollution on aquatic organisms.

2024-09-01·International Immunopharmacology

Harmine inhibits pulmonary fibrosis through regulating DNA damage repair-related genes and activation of TP53-Gadd45α pathway

Article

作者: Liu, Jiangyun ; Zhang, Haibo ; Hu, Junping ; Yang, Jianhua ; Zhang, Fei ; Zhao, Yicong ; Gong, Yuehong ; Wang, Jie ; Pan, Meichi

BACKGROUNDHarmine has many pharmacological activities and has been found to significantly inhibit the fibrosis of keloid fibroblasts. DNA damage repair (DDR) is essential to prevent fibrosis. This study aimed to investigate the effects of harmine on pulmonary fibrosis and its underlying mechanisms.METHODSBleomycin and TGF-β1 were used to construct pulmonary fibrosis models in vivo and in vitro, then treated with harmine to explore harmine's effects in treating experimental pulmonary fibrosis and its related mechanisms. Then, RNA sequencing was applied to investigate further the crucial DDR-related genes and drug targets of harmine against pulmonary fibrosis. Finally, the expression levels of DDR-related genes were verified by real-time quantitative PCR (RT-qPCR) and western blot.RESULTSOur in vivo experiments showed that harmine treatment could improve weight loss and lung function and reduce tissue fibrosis in mice with pulmonary fibrosis. The results confirmed that harmine could inhibit the viability and migration of TGF-β1-induced MRC-5 cells, induce their apoptosis, and suppress the F-actin expression, suggesting that harmine could suppress the phenotypic transition from lung fibroblasts to lung myoblasts. In addition, RNA sequencing identified 1692 differential expressed genes (DEGs), and 10 DDR-related genes were screened as critical DDR-related genes. RT-qPCR and western blotting showed that harmine could down-regulate the expression of CHEK1, ERCC1, ERCC4, POLD1, RAD51, RPA1, TOP1, and TP53, while up-regulate FEN1, H2AX and GADD45α expression.CONCLUSIONSHarmine may inhibit pulmonary fibrosis by regulating DDR-related genes and activating the TP53-Gadd45α pathway.

项与 RPA1 相关的新闻（医药）

2024-06-10

·生物探索

NAR | 四川大学韩俊宏团队发现KDM6A-SND1相互作用通过保护新生DNA维持基因组稳定性，并有助于癌症化疗耐药

引言基因组的不稳定性是癌症的标志之一。虽然组蛋白去甲基化酶KDM6A的缺失增加了肿瘤发生的风险，但其在维持基因组稳定性方面的具体作用仍然知之甚少。 2024年6月8日，四川大学韩俊宏团队在Nucleic Acids Research 在线发表题为“KDM6A–SND1 interaction maintains genomic stability by protecting the nascent DNA and contributes to cancer chemoresistance ”的研究论文，该研究提出了KDM6A维持基因组稳定性独立于其去甲基化酶活性的机制。这是通过它与SND1的相互作用发生的，导致建立一个保护性的染色质状态，通过招募RPA和Ku70到新生的DNA链来防止复制叉崩溃。值得注意的是，KDM6A SUMOylation上调了KDM6A-SND1相互作用，而KDM6AK90A突变几乎消除了这种相互作用。 KDM6A或SND1的缺失导致H3K9ac和H4K8ac的富集增加，但减弱了新生DNA链上Ku70和H3K4me3的富集。这随后导致细胞对基因毒素和基因组不稳定性的敏感性增强。与这些发现一致，食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞中KDM6A和SND1的敲低会增加基因毒素敏感性。有趣的是，在ESCC患者中发现的KDM6A H101D和P110S、N1156T和D1216N突变通过增加SND1关联促进基因毒素抗性。总之，该研究的发现为KDM6A-SND1在基因组稳定性和化学耐药中的关键作用提供了新的见解，这意味着靶向KDM6A和/或其与SND1的相互作用可能是克服化学耐药的有希望的策略。基因组的稳定性对细胞存活和肿瘤发生的预防至关重要。在整个完整的细胞周期中，诸如DNA复制、染色体分离、常染色质/异染色质转化、转录激活和核小体组装等事件确保了真核染色质的动态性质。真核生物已经进化出复杂而严格的机制来维持基因组的稳定性，确保适当的细胞分裂和精确的DNA复制。基因组稳定性的破坏可触发细胞内DNA损伤反应(DDR)通路，以维持染色质的完整性和功能。该通路受ATM/ATR、BRCA1/2、TP53等多种蛋白和信号调控。新出现的证据表明，多种染色质重塑因子参与基因组稳定性的调节。染色质重塑的失败或抑制会导致DNA损伤。此外，染色质重塑因子也通过组蛋白修饰或蛋白募集直接调节DDR。由于破坏基因组稳定性是肿瘤治疗的重要策略，因此探索其潜在机制至关重要。复制胁迫是引起基因组不稳定的主要内源因素之一。在复制胁迫下，DNA前导链和后导链在Rad51和RPA蛋白的介导下快速翻转，形成末端具有粘性的DNA双链。这种结构可以保护复制分叉的功能，它也被称为Holliday结，并有助于分叉的稳定性。与常规的普通DNA双链类似，核小体组装也可以发生在反向的新生DNA中，有效地防止DNA被核酸酶降解。在这个过程中，组蛋白修饰和染色质重塑因子在保护新生DNA中起着至关重要的作用。例如，组蛋白去甲基化酶KDM5B可以识别双链断裂DNA，并通过招募Ku70和BRCA1蛋白到DNA断裂处启动DNA修复。组蛋白甲基化酶SETD1A可以通过催化新生双链DNA的组蛋白甲基化来保护新合成的DNA不被核酸外切酶降解。然而，其他组蛋白修饰和染色质重塑因子在复制叉重塑中的参与在很大程度上仍然是难以捉摸的。模式图（Credit: Nucleic Acids Research）组蛋白去甲基化酶6A (KDM6A)位于X染色体上，是染色质重塑因子的一员。KDM6A C端Jumonji C (JmjC)结构域特异性催化组蛋白H3第27位赖氨酸的去甲基化。此外，KDM6A N端的四肽重复(TPR)结构域主要介导蛋白-蛋白相互作用(PPI)。此外，其他证据表明KDM6A与胚胎发育和肿瘤发生密切相关。例如，在KDM6A基因敲除小鼠中观察到高肿瘤发生率。然而，KDM6A突变已在多种肿瘤中被发现，促进肿瘤的发生和进展，如膀胱癌、肾细胞癌。有证据表明，KDM6A功能缺失可使多个抑癌基因启动子区域的H3K27me3水平升高，进而促进肿瘤恶性。JmjC或TPR结构域突变诱导的催化失活也可以取消KDM6A的抑瘤功能，这表明KDM6A抑制肿瘤发生不依赖于其组蛋白去甲基化酶的能力。基因组不稳定是癌症的典型特征。基因组稳定性的破坏可能导致染色体断裂、易位和基因突变，这是肿瘤发生的关键。作为一种重要的染色质重塑因子，KDM6A缺乏已被证明会增加肿瘤发生的风险。因此，KDM6A在维持基因组稳定性和防止肿瘤发生和肿瘤进展中发挥关键作用。事实上，有令人信服的证据表明，KDM6A不仅直接通过JmjC结构域催化H3K27去甲基化，而且还分别通过TPR结构域或内在失调区(IDR)介导的PPI和相分离来实现其功能，这表明KDM6A可能以去甲基化酶依赖和/或独立的方式调节基因组稳定性。到目前为止，KDM6A参与复制叉稳定性的调节在很大程度上仍然未知。该研究发现KDM6A与SND1相互作用，SND1是一种染色质结构修饰剂。KDM6A与SND1之间的相互作用通过KDM6A的SUMOylation而增强，而KDM6A的K90A突变几乎消除了这种相互作用。此外，KDM6A敲低通过抑制RAP32磷酸化和降低γH2AX表达而损害基因组稳定性。这种破坏也会影响其与SND1的相互作用，减少新生DNA上Ku70的富集和RPA1的富集，最终导致DNA损伤。此外，在食管鳞状细胞癌(ESCC)患者中发现的KDM6A H101D和P110S、N1156T和D1216N突变与SND1的相互作用增加，对基因毒素的抗性增强。相反，敲低KDM6A和SND1会提高对基因毒素的敏感性。总之，该研究揭示了KDM6A影响ESCC基因组稳定性和耐药性的新机制。原文链接 https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae487/7689923 责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature” End 往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

基因疗法临床1期

2024-02-17

·药渡

药渡Cyber解析拜耳开发的TRPA1拮抗剂BAY-390的设计及优化过程

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖性、配体门控的离子通道，其激活与多种疼痛状况有关。临床前研究已经证明TRPA1受体在急性、炎症和神经性疼痛动物模型中的作用。TRPA1拮抗剂GRC-17536（Glenmark公司）的临床研究已证实其在疼痛性糖尿病神经病变患者上具有疗效。因此，TRPA1是镇痛药物的潜在靶点。采用高通量筛选（HTS）命中在人和啮齿动物TRPA1均具有活性的化合物15，对其芳香片段、连接基团和环己基片段分别进行SAR研究，发现一种新型的血脑屏障通透性TRPA1拮抗剂（化合物18，BAY-390），该拮抗剂目前正作为开源的探针分子使用。本文梳理了BAY-390的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-390的优化过程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖的配体门控通道，可渗透一价和二价阳离子。TRPA1在外周和中央神经系统中均有表达，也在胶质细胞，免疫细胞，血管内皮，屏障组织，肺细胞，关节细胞和癌细胞中表达。RPA1通过直接或间接，内源性或外源性，非反应性配体等多种方式激活，并受pH和/或温度的变化影响。内源性介质，如氧化脂质、前列腺素、代谢物和反应分子（即过氧化氢），可在体外激活TRPA1，从而启动Ca2+信号。TRPA1与多种病理疾病有关，如疼痛性疾病、皮肤病、肺部疾病、泌尿生殖系统疾病和胃肠道疾病。特别是，TRPA1受体在急性痛觉、慢性炎症性和神经性疼痛中的作用被广泛研究。TRPA1基因的功能获得突变被证明是导致家族性发作性疼痛综合征的原因。临床研究证明TRPA1拮抗剂2（GRC-17536）对患有疼痛性糖尿病神经病变患者有疗效。在一项I期研究中，TRPA1拮抗剂GDC-0334能够减少TRPA1激动剂诱导的皮肤血流量、疼痛和瘙痒。近年来，多种化学结构分子被鉴定为TRPA1拮抗剂（图2），这些化合物有些具有显著的物种差异，有些物理化学性质，如溶解性、代谢稳定性和血脑屏障通透性等不足，导致仅有少数化合物进入了临床研究。近日JMC报道了有关TRPA1拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，命中了化合物15，对该分子进行针对不同的位点开展SAR研究，获得双重抑制人及啮齿动物TRPA1的先导化合物18。采用位置突变的方法，发现化合物18的结合位点在TRPA1的位点1a。化合物18不仅具有良好的药理性质，并且在多种疼痛及炎症模型上显示出体内药效活性。设计和优化过程总结如下：图2. 文献中报道的TRPA1拮抗剂Hit发现研究人员用重组表达人TRPA1和遗传编码钙指示剂GCaMP6的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行Ca2+内流检测。针对包含400万个化合物的结构库进行高通量筛选，旨在识别具有可口服等特性的新型TRPA1拮抗剂。其中，化合物15在人类（hTRPA1 IC50=14nM）和啮齿动物（rTRPA1 IC50=1370nM）TRPA1上均具有较高活性（表1）。SAR研究化合物15包含非对映异构体（未知比例），具有合适的亲脂性（log D 4.1），但结构中的硝基结构不利于成药。因此，针对硝基进行修饰（表1）：（1）F原子取代硝基后，分离对映体，只有一种对映体（(rac)-16）与15几乎等效；（2）Cl或氰基的引入导致活性下降；（3）供电子基团，如甲基（24c）、对甲氧基（24d）或酰胺（24e）的引入，导致完全失去活性；（4）间位F（24f）及氰基（24g）取代，邻对位双F（24h）导致活性明显降低。说明苯环上引入取代基的耐受性较差。去除化合物(rac)-16上的偕二甲基，然后分离单一异构体，得到对人类和大鼠TRPA1活性（hTRPA1 IC50＝4.0nM，rTRPA1 IC50＝24nM）均明显提高的17（表2）。化合物17的立体化学性质与16a相反，但log D（3.8）改善不明显。进一步对17进行结构修饰：（1）将苯环变为Cl-噻吩27a，对hTRPA1活性相似，但rTRPA1下降。（2）将苯环变为极性杂环（27b−h），导致TRPA1活性下降，且rTRPA1活性下降更明显；（3）将亚甲基连接基团变为O（31）或NH（18，BAY-390），活性高效且亲脂性（logD分别为3.5和3.0）略低于早期化合物。采用圆二色谱（VCD）测定18的绝对立体构型为R,R-构型，该分子表现出更好的溶解度；（4）对化合物18进一步改构，如N上烷基化（32a和32b）或环化（32e和32f），导致活性降低。结合位点研究目前缺乏TRPA1与小分子结合的结构信息，研究人员对hTRPA1进行突变，比较前期发表的不同结构类型的化合物与突变和野生型hTRPA1蛋白结合的研究。图3显示的是化合物4的冷冻电镜（cryoEM）结构。F909T和T874V突变体被称为结合位点1a；M911A突变接近F909，为结合位点1b；N855S突变和G238K/N249S/K270N突变分别为结合位点2和3。图3. TRPA1拮抗剂的结合位点瞬时转染上述突变体及野生型，采用基于荧光的FLIPR钙离子检测，比较目前报道的活性分子对突变型和野生型的活性。如表3所示，大于3倍的变化被认为是显著的，具体分析如下：（1）化合物BAY-390、3、4、5、10和13对T874V和F909T突变体显示活性的显著变化，表明它们结合在TRPA1的位点1a；（2）化合物6对M911A突变体活性差别较小，可能需要双突变（M911A/M912A）才能看到显著的效果；（3）化合物1和2对N855S突变活性发生显著变化，证实了它们与位点2的结合；（4）测试的化合物均未受到G238K/N249S/K270N突变的影响，说明这些化合物都没有结合在位点3；（5）化合物14和7对任何突变体都没有活性损失，化合物14被推测与蛋白内半胱氨酸共价结合，化合物7的结合未知。所述突变研究的结果与已发表的数据一致，表明BAY-390与1a位点结合。BAY-390药理性质评价化合物BAY-390在大鼠肝细胞中的体外代谢稳定性为中等水平（Clblood 2.4 [L/h/kg]），但其具有高渗透性和低外排（CaCo-2A−B：293nm/s；efflux ratio=0.6），合适的溶解度和口服暴露量。在多种动物模型中表现出了良好的疗效，最低暴露量（fu%rat=0.6）均高于体外IC50。BAY-390药效性质评价BAY-390减弱肉桂醛（CA）诱导的大鼠的伤害行为在大鼠足底注射TRPA1激动剂CA会导致TRPA1介导的伤害性反应，其特征是强烈的退缩和舔舐行为（图4A）。使用这种动物模型可以直接研究TRPA1介导的反应，并评估TRPA1拮抗剂的靶向效应。BAY-390口服剂量分别为3、10和30 mg/kg，显示显著减少退缩的数量和舔爪的时间（图4A），从而证实了BAY-390在体内抑制TRPA1激活的能力。给药1h后的游离血浆浓度（3、10和30mg/kg对应浓度为10、35和115nM）达到了体外IC5016nM)。图4. BAY-390在大鼠体内疼痛模型中的药理疗效。（A）肉桂醛（CA）诱导的伤害行为；（B）完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症性疼痛；（C，D）脊神经结扎（SNL）引起的神经性疼痛BAY-390减少完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠炎症性疼痛在大鼠足底注射CFA可引起炎症性疼痛。这种外周炎症性疼痛模型的特征是产生机械性疼痛，可用于评估化合物的镇痛和抗炎作用。如图4B所示，口服BAY-390，在给药2h及4h后，10和30mg/kg给药组均显著减少机械性疼痛。BAY-390逆转大鼠脊神经结扎（SNL）神经性疼痛模型中机械异常性疼痛从SNL手术后的第15天到第24天，连续10天，给药BAY-390（p.o., b.i.d），2小时后进行疼痛测试（图4C）。口服90mg/kg的BAY-390，6天后开始产生明显影响（p<0.05），10天后能够持续保持（p<0.05）（图4D）。先导化合物进一步优化BAY-390的苯胺类代谢物可能会有遗传毒性（Ames）风险，因此进行进一步SAR优化（表4）：（1）氰基（34b）取代导致了活性的丧失；（2）Cl原子（34a）取代具有很好的耐受性；（3）取代基位置的变化都降低活性，特别是对rTRPA1；（4）34e具有良好的hTRPA1和中等rTRPA1活性，代谢稳定性（Clblood 2.3 [L/h/kg]）也与BAY-390相当，但PK研究显示暴露量（fu%rat=0.36）降低；（5）34f和34g对rTRPA1活性显著下降；（6）吡啶（34d）等杂环的引入耐受性较差（hTRPA1 IC50=440nM，rTRPA1 IC50=6300nM）。结论采用高通量筛选方法，获得Hit化合物15（hTRPA1 IC50=14nM，rTRPA1 IC50=1370nM）。优化活性和理化性质，成功获得先导化合物18（BAY-390），该分子在炎症和神经性疼痛的体内模型中具有良好的药效，适合作为体外和体内探针来研究TRPA1在啮齿类动物临床前模型中发挥的中枢和外周作用。BAY-390已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01830请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就TRPA1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“TRPA1”，选中关联“TRPA1 (Homo sapiens)”搜索TRPA1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于TRPA1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3. 在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到TRPA1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

临床1期临床结果临床终止临床2期

2022-08-28

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CAR-Treg工艺优化是商业化的关键

CAR-T在细胞治疗领域备受瞩目，通过将嵌合抗原受体（CAR）导入T细胞，极大地改善了临床对肿瘤的治疗效果。CAR-T的大获成功的同时也加速了CAR-Treg向临床转化的进展。通过CAR技术，CAR-Treg能够绕过MHC限制性和提高治疗靶向性，在自身免疫性疾病及抑制物抗宿主病（GVHD）中表现出很好的治疗潜力，目前已有多家公司参与开发。‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/然而，尽管CAR-T对肿瘤疗效非常好，但由于生产成本极高，所产生的昂贵治疗费用让普通患者只能望而止步，CAR-Treg自然绕不开这个难题。人们一直在积极寻找CAR-T工艺优化手段，以期改进疗效的同时减少生产成本，进而推动其市场化进程。工艺流程同样，CAR-Treg的生产也大致可以分为以下步骤：获取细胞，分选富集 → 活化 → 基因传递 → 扩增 → 质检、储存、运输、回输Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.工艺优化方向1. 采集，分选富集：CAR-Treg以单采和来自外周血单核细胞（PBMC）为原料，主要也是通过磁珠细胞分选(MACS)，获得维持免疫耐受的主要亚群：CD4+CD25highFoxp3+Treg。目前CAR技术细胞来源均为自体细胞，Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5-10%，部分疾病患者Treg含量更低，甚至在之后表现出无法扩增。原材料无法标准化，细胞活力不可控，以及最主要的个性化定制均为造价昂贵的原因，因此细胞健康人的Treg细胞捐献是未来趋势。以及通过CAR-Foxp3共载体转染可以将CD4或CD3T细胞转化为Treg，这也可以解决外周Treg细胞数量少和内源性TregFoxp3表达不足的。推荐阅读：调节Treg的转录因子：FoxP3/RelA/c-Re/...Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.2. 基因导入：通过慢病毒转染，将CAR基因传递到Treg细胞中是目前最主要基因导入方式。该方法两个词总结：高效，昂贵。病毒载体生产耗时耗力，并且有引起炎症反应和基因插入的致癌风险。电穿孔技术是应用广泛的非病毒转染策略之一通过短的脉冲使细胞产生短暂通透性，允许目的基因DNA或mRNA进入。但是这种方法容易引起细胞应激。"sleeping beauty"转座子系统（SB）将CAR转基因插入转座子序列中，再将相应质粒和转座子酶（hsSB）一同导入细胞，hsSB会将序列切下来整合到T细胞基因组，该技术整合效率接近病毒。Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.而且相较于病毒载体，SB系统在转染后质粒水平逐渐降低。而且质粒相对容易设计，在基因破坏方面也有很高的安全性。4. 扩增和产量：扩增在整个制备过程最为耗时、耗材、耗财。原料Treg获取量非常少，所需达到治疗标准的CAR-Treg量非常大，而且考虑储存运输过程的消耗，相较治疗量产品药甚至需要近100倍的数量。扩增所需培养基中必须加入胎牛血清或人血清，使用无血清培养基不但能够节省成本，并能降低外源物的污染。扩增过程包含多种需人工变异操作，需要考虑多种外接因素的影响。(如温度、湿度、气体张力、无菌性等)作为未来各行业的发展趋势，人工智能(半)自动化及封闭性系统在保证操作精细度的同时能确保环境参数稳定，在提高产量的同时大大降低批次间差异。5. 质量检测：用于CAR-Treg的QC检测标准化尚且未制定。常通过流式细胞术对CD4+CD25highFoxp3+Treg进行验证，并辅以Foxp3启动子区域的甲基化分析。常规观察Treg对Tconv的抑制作用非常耗时，而且对体内的预测价值不大。Foxp3对Treg在治疗过程维持表型而不会向Teff转化至关重要，添加雷帕霉素能够通过抑制mTOR通路维持Treg稳定性。或者基于CRISPR/Cas9的表观遗传编辑也可能是维持Treg表型的手段。6. 治疗：Treg细胞能通过分泌TGF-β、IL-10、IL-35能够将T细胞诱导转化成为Treg细胞，但也会在炎症因子IL-6和IL-1的协同刺激下，通过STAT-3依赖途径介导的Foxp3表达下调而转化成为为Teff细胞。以及外周CD25-Treg细胞也容易转化成Th17细胞，并且由于Teff细胞比Treg细胞具有更快的激活速度与增殖能力，从而成为自身免疫性疾病的致病因素或在治疗过程中加重病情。通过细胞工程技术增加“自杀开关”，在Foxp3表达缺失或炎症因子接触时激活Treg细胞“凋亡“以及CAR-T异位表达的Foxp3能够维持抑制功能和阻止细胞转化。在自身免疫性患者中长期使用CAR-Treg进行治疗，将有可能引起潜在的肿瘤免疫抑制和局部机会性感染，为此设计可调平台使CAR-Treg在症状严重时发挥作用，轻微症状时处于休眠状态。每个生产环节的工艺改进都是促进CAR-Treg平民化的关键一步。参考资料‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/Fritsche E et al. Toward an Optimized Process for Clinical Manufacturing of CAR-Treg Cell Therapy. Trends Biotechnol. 2020 Oct;38(10):1099-1112.Abou-El-Enein M et al. Scalable Manufacturing of CAR T cells for Cancer Immunotherapy. Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.Arjomandnejad M et al. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells: Engineering and Applications. Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.Querques I et al. A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.Diaconu I et al. Inducible Caspase-9 Selectively Modulates the Toxicities of CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells. Mol Ther. 2017 Mar 1;25(3):580-592.近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀点亮在看，传递信息♥

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