RPA1

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖性、配体门控的离子通道，其激活与多种疼痛状况有关。临床前研究已经证明TRPA1受体在急性、炎症和神经性疼痛动物模型中的作用。TRPA1拮抗剂GRC-17536（Glenmark公司）的临床研究已证实其在疼痛性糖尿病神经病变患者上具有疗效。因此，TRPA1是镇痛药物的潜在靶点。采用高通量筛选（HTS）命中在人和啮齿动物TRPA1均具有活性的化合物15，对其芳香片段、连接基团和环己基片段分别进行SAR研究，发现一种新型的血脑屏障通透性TRPA1拮抗剂（化合物18，BAY-390），该拮抗剂目前正作为开源的探针分子使用。本文梳理了BAY-390的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-390的优化过程瞬时受体电位 A1（TRPA1）是一种电压依赖的配体门控通道，可渗透一价和二价阳离子。TRPA1在外周和中央神经系统中均有表达，也在胶质细胞，免疫细胞，血管内皮，屏障组织，肺细胞，关节细胞和癌细胞中表达。RPA1通过直接或间接，内源性或外源性，非反应性配体等多种方式激活，并受pH和/或温度的变化影响。内源性介质，如氧化脂质、前列腺素、代谢物和反应分子（即过氧化氢），可在体外激活TRPA1，从而启动Ca2+信号。TRPA1与多种病理疾病有关，如疼痛性疾病、皮肤病、肺部疾病、泌尿生殖系统疾病和胃肠道疾病。特别是，TRPA1受体在急性痛觉、慢性炎症性和神经性疼痛中的作用被广泛研究。TRPA1基因的功能获得突变被证明是导致家族性发作性疼痛综合征的原因。临床研究证明TRPA1拮抗剂2（GRC-17536）对患有疼痛性糖尿病神经病变患者有疗效。在一项I期研究中，TRPA1拮抗剂GDC-0334能够减少TRPA1激动剂诱导的皮肤血流量、疼痛和瘙痒。近年来，多种化学结构分子被鉴定为TRPA1拮抗剂（图2），这些化合物有些具有显著的物种差异，有些物理化学性质，如溶解性、代谢稳定性和血脑屏障通透性等不足，导致仅有少数化合物进入了临床研究。近日JMC报道了有关TRPA1拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，命中了化合物15，对该分子进行针对不同的位点开展SAR研究，获得双重抑制人及啮齿动物TRPA1的先导化合物18。采用位置突变的方法，发现化合物18的结合位点在TRPA1的位点1a。化合物18不仅具有良好的药理性质，并且在多种疼痛及炎症模型上显示出体内药效活性。设计和优化过程总结如下：图2. 文献中报道的TRPA1拮抗剂Hit发现研究人员用重组表达人TRPA1和遗传编码钙指示剂GCaMP6的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行Ca2+内流检测。针对包含400万个化合物的结构库进行高通量筛选，旨在识别具有可口服等特性的新型TRPA1拮抗剂。其中，化合物15在人类（hTRPA1 IC50=14nM）和啮齿动物（rTRPA1 IC50=1370nM）TRPA1上均具有较高活性（表1）。SAR研究化合物15包含非对映异构体（未知比例），具有合适的亲脂性（log D 4.1），但结构中的硝基结构不利于成药。因此，针对硝基进行修饰（表1）：（1）F原子取代硝基后，分离对映体，只有一种对映体（(rac)-16）与15几乎等效；（2）Cl或氰基的引入导致活性下降；（3）供电子基团，如甲基（24c）、对甲氧基（24d）或酰胺（24e）的引入，导致完全失去活性；（4）间位F（24f）及氰基（24g）取代，邻对位双F（24h）导致活性明显降低。说明苯环上引入取代基的耐受性较差。去除化合物(rac)-16上的偕二甲基，然后分离单一异构体，得到对人类和大鼠TRPA1活性（hTRPA1 IC50＝4.0nM，rTRPA1 IC50＝24nM）均明显提高的17（表2）。化合物17的立体化学性质与16a相反，但log D（3.8）改善不明显。进一步对17进行结构修饰：（1）将苯环变为Cl-噻吩27a，对hTRPA1活性相似，但rTRPA1下降。（2）将苯环变为极性杂环（27b−h），导致TRPA1活性下降，且rTRPA1活性下降更明显；（3）将亚甲基连接基团变为O（31）或NH（18，BAY-390），活性高效且亲脂性（logD分别为3.5和3.0）略低于早期化合物。采用圆二色谱（VCD）测定18的绝对立体构型为R,R-构型，该分子表现出更好的溶解度；（4）对化合物18进一步改构，如N上烷基化（32a和32b）或环化（32e和32f），导致活性降低。结合位点研究目前缺乏TRPA1与小分子结合的结构信息，研究人员对hTRPA1进行突变，比较前期发表的不同结构类型的化合物与突变和野生型hTRPA1蛋白结合的研究。图3显示的是化合物4的冷冻电镜（cryoEM）结构。F909T和T874V突变体被称为结合位点1a；M911A突变接近F909，为结合位点1b；N855S突变和G238K/N249S/K270N突变分别为结合位点2和3。图3. TRPA1拮抗剂的结合位点瞬时转染上述突变体及野生型，采用基于荧光的FLIPR钙离子检测，比较目前报道的活性分子对突变型和野生型的活性。如表3所示，大于3倍的变化被认为是显著的，具体分析如下：（1）化合物BAY-390、3、4、5、10和13对T874V和F909T突变体显示活性的显著变化，表明它们结合在TRPA1的位点1a；（2）化合物6对M911A突变体活性差别较小，可能需要双突变（M911A/M912A）才能看到显著的效果；（3）化合物1和2对N855S突变活性发生显著变化，证实了它们与位点2的结合；（4）测试的化合物均未受到G238K/N249S/K270N突变的影响，说明这些化合物都没有结合在位点3；（5）化合物14和7对任何突变体都没有活性损失，化合物14被推测与蛋白内半胱氨酸共价结合，化合物7的结合未知。所述突变研究的结果与已发表的数据一致，表明BAY-390与1a位点结合。BAY-390药理性质评价化合物BAY-390在大鼠肝细胞中的体外代谢稳定性为中等水平（Clblood 2.4 [L/h/kg]），但其具有高渗透性和低外排（CaCo-2A−B：293nm/s；efflux ratio=0.6），合适的溶解度和口服暴露量。在多种动物模型中表现出了良好的疗效，最低暴露量（fu%rat=0.6）均高于体外IC50。BAY-390药效性质评价BAY-390减弱肉桂醛（CA）诱导的大鼠的伤害行为在大鼠足底注射TRPA1激动剂CA会导致TRPA1介导的伤害性反应，其特征是强烈的退缩和舔舐行为（图4A）。使用这种动物模型可以直接研究TRPA1介导的反应，并评估TRPA1拮抗剂的靶向效应。BAY-390口服剂量分别为3、10和30 mg/kg，显示显著减少退缩的数量和舔爪的时间（图4A），从而证实了BAY-390在体内抑制TRPA1激活的能力。给药1h后的游离血浆浓度（3、10和30mg/kg对应浓度为10、35和115nM）达到了体外IC5016nM)。图4. BAY-390在大鼠体内疼痛模型中的药理疗效。（A）肉桂醛（CA）诱导的伤害行为；（B）完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎症性疼痛；（C，D）脊神经结扎（SNL）引起的神经性疼痛BAY-390减少完全弗氏佐剂（CFA）诱导的大鼠炎症性疼痛在大鼠足底注射CFA可引起炎症性疼痛。这种外周炎症性疼痛模型的特征是产生机械性疼痛，可用于评估化合物的镇痛和抗炎作用。如图4B所示，口服BAY-390，在给药2h及4h后，10和30mg/kg给药组均显著减少机械性疼痛。BAY-390逆转大鼠脊神经结扎（SNL）神经性疼痛模型中机械异常性疼痛从SNL手术后的第15天到第24天，连续10天，给药BAY-390（p.o., b.i.d），2小时后进行疼痛测试（图4C）。口服90mg/kg的BAY-390，6天后开始产生明显影响（p<0.05），10天后能够持续保持（p<0.05）（图4D）。先导化合物进一步优化BAY-390的苯胺类代谢物可能会有遗传毒性（Ames）风险，因此进行进一步SAR优化（表4）：（1）氰基（34b）取代导致了活性的丧失；（2）Cl原子（34a）取代具有很好的耐受性；（3）取代基位置的变化都降低活性，特别是对rTRPA1；（4）34e具有良好的hTRPA1和中等rTRPA1活性，代谢稳定性（Clblood 2.3 [L/h/kg]）也与BAY-390相当，但PK研究显示暴露量（fu%rat=0.36）降低；（5）34f和34g对rTRPA1活性显著下降；（6）吡啶（34d）等杂环的引入耐受性较差（hTRPA1 IC50=440nM，rTRPA1 IC50=6300nM）。结论采用高通量筛选方法，获得Hit化合物15（hTRPA1 IC50=14nM，rTRPA1  IC50=1370nM）。优化活性和理化性质，成功获得先导化合物18（BAY-390），该分子在炎症和神经性疼痛的体内模型中具有良好的药效，适合作为体外和体内探针来研究TRPA1在啮齿类动物临床前模型中发挥的中枢和外周作用。BAY-390已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01830请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就TRPA1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“TRPA1”，选中关联“TRPA1 (Homo sapiens)”搜索TRPA1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于TRPA1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3. 在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到TRPA1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

CAR-T在细胞治疗领域备受瞩目，通过将嵌合抗原受体（CAR）导入T细胞，极大地改善了临床对肿瘤的治疗效果。CAR-T的大获成功的同时也加速了CAR-Treg向临床转化的进展。通过CAR技术，CAR-Treg能够绕过MHC限制性和提高治疗靶向性，在自身免疫性疾病及抑制物抗宿主病（GVHD）中表现出很好的治疗潜力，目前已有多家公司参与开发。‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/然而，尽管CAR-T对肿瘤疗效非常好，但由于生产成本极高，所产生的昂贵治疗费用让普通患者只能望而止步，CAR-Treg自然绕不开这个难题。人们一直在积极寻找CAR-T工艺优化手段，以期改进疗效的同时减少生产成本，进而推动其市场化进程。工艺流程同样，CAR-Treg的生产也大致可以分为以下步骤：获取细胞，分选富集 → 活化 → 基因传递 → 扩增 → 质检、储存、运输、回输Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.工艺优化方向1. 采集，分选富集：CAR-Treg以单采和来自外周血单核细胞（PBMC）为原料，主要也是通过磁珠细胞分选(MACS)，获得维持免疫耐受的主要亚群：CD4+CD25highFoxp3+Treg。目前CAR技术细胞来源均为自体细胞，Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5-10%，部分疾病患者Treg含量更低，甚至在之后表现出无法扩增。原材料无法标准化，细胞活力不可控，以及最主要的个性化定制均为造价昂贵的原因，因此细胞健康人的Treg细胞捐献是未来趋势。以及通过CAR-Foxp3共载体转染可以将CD4或CD3T细胞转化为Treg，这也可以解决外周Treg细胞数量少和内源性TregFoxp3表达不足的。推荐阅读：调节Treg的转录因子：FoxP3/RelA/c-Re/...Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.2. 基因导入：通过慢病毒转染，将CAR基因传递到Treg细胞中是目前最主要基因导入方式。该方法两个词总结：高效，昂贵。病毒载体生产耗时耗力，并且有引起炎症反应和基因插入的致癌风险。电穿孔技术是应用广泛的非病毒转染策略之一通过短的脉冲使细胞产生短暂通透性，允许目的基因DNA或mRNA进入。但是这种方法容易引起细胞应激。"sleeping beauty"转座子系统（SB）将CAR转基因插入转座子序列中，再将相应质粒和转座子酶（hsSB）一同导入细胞，hsSB会将序列切下来整合到T细胞基因组，该技术整合效率接近病毒。Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.而且相较于病毒载体，SB系统在转染后质粒水平逐渐降低。而且质粒相对容易设计，在基因破坏方面也有很高的安全性。4. 扩增和产量：扩增在整个制备过程最为耗时、耗材、耗财。原料Treg获取量非常少，所需达到治疗标准的CAR-Treg量非常大，而且考虑储存运输过程的消耗，相较治疗量产品药甚至需要近100倍的数量。扩增所需培养基中必须加入胎牛血清或人血清，使用无血清培养基不但能够节省成本，并能降低外源物的污染。扩增过程包含多种需人工变异操作，需要考虑多种外接因素的影响。(如温度、湿度、气体张力、无菌性等)作为未来各行业的发展趋势，人工智能(半)自动化及封闭性系统在保证操作精细度的同时能确保环境参数稳定，在提高产量的同时大大降低批次间差异。5. 质量检测：用于CAR-Treg的QC检测标准化尚且未制定。常通过流式细胞术对CD4+CD25highFoxp3+Treg进行验证，并辅以Foxp3启动子区域的甲基化分析。常规观察Treg对Tconv的抑制作用非常耗时，而且对体内的预测价值不大。Foxp3对Treg在治疗过程维持表型而不会向Teff转化至关重要，添加雷帕霉素能够通过抑制mTOR通路维持Treg稳定性。或者基于CRISPR/Cas9的表观遗传编辑也可能是维持Treg表型的手段。6. 治疗：Treg细胞能通过分泌TGF-β、IL-10、IL-35能够将T细胞诱导转化成为Treg细胞，但也会在炎症因子IL-6和IL-1的协同刺激下，通过STAT-3依赖途径介导的Foxp3表达下调而转化成为为Teff细胞。以及外周CD25-Treg细胞也容易转化成Th17细胞，并且由于Teff细胞比Treg细胞具有更快的激活速度与增殖能力，从而成为自身免疫性疾病的致病因素或在治疗过程中加重病情。通过细胞工程技术增加“自杀开关”，在Foxp3表达缺失或炎症因子接触时激活Treg细胞“凋亡“以及CAR-T异位表达的Foxp3能够维持抑制功能和阻止细胞转化。在自身免疫性患者中长期使用CAR-Treg进行治疗，将有可能引起潜在的肿瘤免疫抑制和局部机会性感染，为此设计可调平台使CAR-Treg在症状严重时发挥作用，轻微症状时处于休眠状态。每个生产环节的工艺改进都是促进CAR-Treg平民化的关键一步。参考资料‍https://www.biopharmadive.com/news/treg-cell-therapy-biotech-startups/629634/Fritsche E et al. Toward an Optimized Process for Clinical Manufacturing of CAR-Treg Cell Therapy. Trends Biotechnol. 2020 Oct;38(10):1099-1112.Abou-El-Enein M et al. Scalable Manufacturing of CAR T cells for Cancer Immunotherapy. Blood Cancer Discov. 2021 Sep;2(5):408-422.Arjomandnejad M et al. CAR-T Regulatory (CAR-Treg) Cells: Engineering and Applications. Biomedicines. 2022 Jan 26;10(2):287.Querques I et al. A highly soluble Sleeping Beauty transposase improves control of gene insertion. Nat Biotechnol. 2019 Dec;37(12):1502-1512.Diaconu I et al. Inducible Caspase-9 Selectively Modulates the Toxicities of CD19-Specific Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells. Mol Ther. 2017 Mar 1;25(3):580-592.近期热门视频更多精彩视频，尽在佰傲谷视频号，欢迎关注~本周好文推荐如需转载请联系佰傲谷并在醒目位置注明出处﹀ 点亮在看，传递信息♥

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝脏疾病之一，以过量脂质在肝细胞内蓄积为主要病理特征。NAFLD病理生理机制仍未完全阐明，临床上仍缺乏有效的治疗手段。因此，深入研究NAFLD的发病机制成为肝脏领域和代谢领域的研究热点。2022年7月12日，北大-清华生命科学联合中心、北京大学基础医学院尹玉新团队在《Cell Reports》杂志上在线发表了题为“RPA1 Controls Chromatin Architecture and Maintains Lipid Metabolic Homeostasis” 的研究论文。该论文通过构建小鼠模型，应用pull-down、RNA-seq、ATAC-seq以及Cut&tag等多组学手段发现了单链DNA结合蛋白RPA1在脂肪肝发生发展中起着重要作用。尹玉新课题组于2015年首次建立了Rpa1敲除小鼠模型(Cell Res. 2015.)，观察显示杂合丢失Rpa1的小鼠(Rpa1+/-)更易诱发结直肠癌。该论文进一步发现Rpa1+/-小鼠对脂肪肝更易感，在年龄增长或者高脂饮食（high fat diet）的诱导下会出现脂肪肝表型。为了深入研究RPA1在脂肪肝发生发展中的作用，课题组新构建了肝脏组织特异性Rpa1 (Liver-Rpa1-KO) 敲除的小鼠模型，发现Liver-Rpa1-KO小鼠在四周年龄患脂肪肝并逐渐进展为肝癌，在56周年龄的时候66.7% Liver-Rpa1-KO小鼠进展为肝癌。通过Pull-down，RNA-seq，ATAC-seq，Cut&tag等多组学手段，以及Seahorse等实验，发现了RPA1可以通过与转录因子HNF4A，染色质重塑因子FACT复合体等相互作用，调控脂代谢相关基因染色质可及性，从而调控脂代谢相关基因的转录。敲除Rpa1导致肝脏染色质处于更加致密的状态，抑制脂代谢相关基因的转录，导致肝细胞脂肪酸β-氧化速率的降低，脂肪的积累，小鼠脂肪肝的发生。另外，通过组织芯片免疫组化染色发现RPA1蛋白在临床脂肪肝病人肝脏样本中表达水平降低，说明了RPA1在临床脂肪肝发生中起着重要作用。综上所述，该研究证实了RPA1可以通过调控染色质构象调控基因转录，发现了RPA1蛋白在非酒精性脂肪性肝病中的重要作用，从表观遗传的角度进一步揭示了非酒精性脂肪性肝病的发病机制，为相关疾病预防以及创新药物研发提供了新的思路。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111071