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本文为转化医学网原创，转载请注明出处 作者：Jerry 导读： SARS-CoV-2感染破坏上皮屏障并引发气道炎症。冠状病毒的核心毒力结构成分包膜(E)蛋白可能在这一过程中发挥作用。 2024年3月25日，广州医科大学钟南山团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》在线发表题为”SARS-CoV-2 envelope protein impairs airway epithelial barrier function and exacerbates airway inflammation via increased intracellular Cl− concentration“的研究论文， 该研究证明了E蛋白下调紧密连接蛋白的表达，导致气道上皮屏障的破坏。 https://www.nature.com/articles/s41392-024-01753-z 研究背景 01 SARS-CoV-2是导致COVID-19大流行的病原体，对全球公共卫生构成了重大挑战。SARS-CoV-2可能破坏肺泡上皮屏障，引发气道炎症加剧，导致呼吸困难，严重时进展为急性呼吸衰竭。然而，上皮屏障功能破坏和炎症增强的确切分子机制尚不完全清楚。了解SARS-CoV-2的致病机制有助于确定临床干预的新靶点。SARS-CoV-2是一种包膜病毒，具有正义单链RNA基因组。该病毒可破坏上皮细胞的完整性，加剧呼吸道上皮细胞的炎症，这是抵御病毒感染的第一道防线。 SARS-CoV-2编码四种结构蛋白——刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。S蛋白介导病毒与宿主受体血管紧张素转换酶2 (ACE2)的结合和病毒与细胞膜的融合。M蛋白在病毒组装中起着至关重要的作用，而N蛋白对病毒基因组的包装和存活至关重要。值得注意的是，E蛋白是一种核心结构毒力因子，在维持病毒生命周期(如病毒组装)中起着至关重要的作用。一些研究探索了SARS-CoV-2 S、M和N蛋白的致病作用。然而，SARS-CoV-2 E蛋白在上皮紧密连接和粘膜炎症中的作用和机制尚不清楚。 研究进展 02 鉴于E蛋白以PDE4-cAMP依赖的方式增加[Cl−]i，研究人员研究了靶向PDE4的药物对E蛋白介导的[Cl−]i升高和气道炎症的潜在保护作用。罗利普兰，一种选择性PDE4抑制剂，消除了E蛋白在人气道上皮细胞和mPAECs中引起的[Cl−]i升高。此外，罗利普兰治疗减轻了气道上皮细胞中IκB的磷酸化和促炎性细胞因子/趋化因子的上调。重要的是，在SARS-CoV-2 E蛋白刺激的小鼠气管内灌注模型中，罗利普兰抑制了mPAECs中升高的[Cl−]i，并在肺组织中发挥抗炎作用。这些结果表明，针对PDE4抑制的药理学干预可能有效地减轻气道上皮细胞内的细胞内Cl−积累，并减轻SARS-CoV-2感染引起的气道炎症。 为了验证上述发现，研究人员最终采用了hPAECs模型。有趣的是，E蛋白下调了hPAECs中ZO-1和闭合蛋白的表达，而claudin-4的表达则不受影响。此外，E蛋白引发了过度的炎症反应，其特征是促炎细胞因子的表达增加，以及hPAECs中JNK、IκB和SGK1的磷酸化水平升高。与在人气道上皮细胞系中的观察结果一致，E蛋白没有改变CFTR的表达，而是增加了PDE4亚型的表达，导致hPAECs中Cl−的异常积累。 这些结果进一步证实了SARS-CoV-2 E蛋白在破坏气道上皮完整性、促进炎症反应和扰乱气道上皮细胞内Cl−稳态中的作用。 SARS-CoV-2包膜蛋白通过增加细胞内Cl−浓度损害气道上皮屏障功能并加重气道炎症 研究结论 03 总之，SARS-CoV-2 E蛋白下调紧密连接蛋白，破坏气道上皮屏障的完整性。此外，E蛋白通过TLR2/4-JNK-AP-1信号通路上调PDE4表达，显著降低细胞内cAMP水平，导致CFTR介导的Cl−转运受损。本研究结果为E蛋白促进气道上皮细胞内Cl−水平的积累，从而加剧炎症反应提供了新的视角。旨在提高cAMP水平以打开CFTR的治疗干预，或使用CFTR拮抗剂和SGK1抑制剂以消除细胞内炎症级联反应的治疗干预，可能有望减轻SARS-CoV-2诱导的气道炎症。 参考资料： https://www.nature.com/articles/s41392-024-01753-z 注：本文旨在介绍医学研究进展，不能作为治疗方案参考。如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门·直播/活动 🕓 上海｜06月14日-16日 ▶ 第六届上海国际癌症大会将于6月14-16日在上海举办，学科交叉，共同推进肿瘤研究与诊治多模态！ 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会欢迎您的参与！ 点击对应文字 查看详情

随着3月9日司美格鲁肽得到FDA批准用于辅助预防重大心血管事件，司美格鲁肽等GLP-1类减肥药物的跨界效果也得到了监管机构的认可。然而，这类减肥药物目前现阶段的数据表明，这些药物虽然有行之有效，但一旦停药反弹幅度也很大，且反弹过程中可能导致心血管方面的益处也可能因为反弹而恢复原样。既然减肥药能够跨界到心血管领域，那么其他领域的药物能不能跨界到肥胖呢？不仅可以，即便停药后，依然可以做到持续减肥。近日（3月1日），来自丹麦哥本哈根大学的诺和诺德基金会基础代谢研究中心在Science子刊Science Advances上发表了一篇论文。研究人员采用了之前只在神经病性疼痛和中风中进行开发的PSD-95和PICK1靶点，并试图用新方法将其运用在肥胖症上。NMDA受体和AMPA受体的崭新开发方式在过去的十年中，全基因组关联研究（GWAS）揭示了许多可能导致肥胖发病的生物学途径。在这些途径中，不少基因直接在大脑内富集/表达，在肥胖的遗传研究中，与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)和n -甲基-d-天冬氨酸(NMDA)受体相关的谷氨酸能信号传导和突触后可塑性相关的基因尤其丰富，这表明谷氨酸能神经递质系统在调节能量平衡的稳态机制在肥胖症中发挥了重要作用。但问题在于，这两条途径的受体在整个中枢神经系统中普遍表达，强行去开发靶向药物很可能造成神经损伤。上游途径惹不起，那就只能从下游着手。因此，科学家们就试图去探索细胞内受体蛋白复合物的靶向，因为靶向蛋白质复合物就能够实现突触后受体信号的精确干扰。而AMPA和NMDA受体都会直接与细胞内支架蛋白相互作用，这些细胞内支架蛋白能够参与膜上谷氨酸受体的锚定和运输。支架蛋白中的许多又含有PDZ结构域。PDZ结构域（PDZ domain）是一种在多种蛋白质中发现的结构元件，它是蛋白质-蛋白质相互作用的重要模块。PDZ结构域得名于最初发现它的三种蛋白质：Postsynaptic density protein-95 (PSD-95)、Dlg1 ( discs large homolog 1) 和 Zonula occludens-1 (ZO-1)，每个蛋白质的名字首字母组成了“PDZ”。也就是说只要靶向含有PDZ结构域的蛋白质，就能够解决不能直接靶向受体的问题了，而这种含有PDZ结构域的支架蛋白就成为了众多中枢神经系统疾病的理想靶点。而此次该靶点就在肥胖症上得到开发。遗传筛选获得理想蛋白质为了确定肥胖治疗的药物靶点，研究人员寻找了至少由一个PDZ结构域组成的蛋白质，这些蛋白质已知参与谷氨酸能AMPA或NMDA受体的蛋白质相互作用。他们确定了六种符合这些标准的蛋白质:谷氨酸受体相互作用蛋白1（grip 1）、GRIP2、与C激酶1相互作用的蛋白（PICK1）、PSD-95。而下一轮筛选由遗传相关性展开，他们采用了UK Biobank（英国生物银行）的数据，并通过调查转录起始位点周围500 kb区域内的所有常染色体变异与体重指数（身体质量指数）和体脂百分比（BF%）的相关性，最终筛选获得了PSD-95和PICK1这两项与肥胖呈现出正相关的靶点。PSD-95抑制剂可降低小鼠体重其实之前就有PSD-95抑制剂NA-1差点成功上市，但临门一脚却因为主要临床不达终点而功败垂成。当时的适应症是心血管疾病。现在，丹麦的研究人员开发了一种二聚肽抑制剂UCCB 01-147，数据对照来看，与NA-1相比，UCCB 01-147以同等摩尔剂量更显著地降低了体重和食物摄入量，且这一降低并非由脱靶效应驱动。PICK1抑制剂可降低小鼠体重同样，研究人员开发了另外一种PICK1二聚肽抑制剂的脂质化变体mPD5，该抑制剂能够干扰AMPA受体的PICK1依赖性磷酸化。同样做到了以剂量依赖性地降低肥胖小鼠的体重。为了证明mPD5是通过PICK1抑制来实现肥胖降低的，因此研究人员用PICK1敲除小鼠进行对照。在高脂饮食喂养的PICK1敲除小鼠中，研究人员发现在DIO野生型同窝出生小鼠中观察到的mPD5降低体重和食物摄入量的作用在PICK1基因敲除小鼠中完全消失，这表明mPD5抑制食欲和减轻体重的作用确实是通过PICK1介导的。抑制剂的持久性对谷氨酸受体的药物干扰可以通过减少兴奋性神经传递、促进神经回路变化并可能引发持续的疾病缓解益处来诱导持久的神经可塑性效应。为了评估mPD5和UCCB01-147治疗的长期代谢效果，研究人员进行了为期13天的治疗研究，然后进行了为期29天的清除/体重恢复期。在这项研究中，两种化合物在13天的治疗期内都获得了显著的减肥益处。与先前的研究一致，两种化合物的体重减轻仅反映在体脂质量的减少上。值得注意的是，尽管两种PDZ结构域干扰化合物的半衰期在几分钟到几小时的范围内，体重减轻在治疗停止后持续约10天。治疗停止四周后，用mPD5治疗的小鼠仍然没有赶上溶媒对照组的体重，这表明PICK1干扰可能对体重有持久影响。在一项后续研究中，评估了mPD5对GLP-1受体激动剂利拉鲁肽的持续减肥效果。治疗停止后，mPD5治疗的小鼠在3天内体重持续下降，体重下降持续约8天。相反，利拉鲁肽治疗的小鼠在治疗停止后立即开始体重恢复，恢复速度比mPD5治疗的小鼠更快。到第35天，利拉鲁肽治疗的小鼠等于溶媒对照组的体重，而mPD5治疗的小鼠则保持显著低于溶媒对照组的体重。为了解决与利拉鲁肽治疗小鼠和mPD5治疗小鼠之间体重减轻差异相关的潜在混杂因素，研究人员还额外进行了一项研究，他们将mPD5治疗小鼠与一组进行热量限制以实现等效体重减轻的小鼠进行了比较。在停止热量限制和mPD5治疗后，各组的体重恢复立即出现差异。与之前的观察结果一致，mPD5治疗的小鼠在停药后体重恢复缓慢，但在恢复期第16天，两组小鼠已经的体重恢复程度已经达到一致。体重恢复的最初分离反映在热量限制组中强烈的反调节性摄食过度。相比之下，mPD5组恢复了与对照组小鼠相同的卡路里摄入量，没有表现出补偿性行为。这样的试验可能表明，假如一名肥胖症患者得到mPD5治疗后，体重减轻，但是停药后，即便他能够获得充足的饮食，也可能不会表征出补偿性暴饮暴食的情况。总结实际上，近年来，关于PSD-95靶点在如阿尔兹海默症，抑郁症等其他领域也展现出了一定可适用性，这也表明PSD-95抑制剂的潜在跨界应用，而PICK1抑制剂展现出了具有一定持久性治疗效果，考虑到目前是诺和诺德在主要资助这两款靶点的开发，可能引起一部分企业效仿。参考来源：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adg2636

点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769文章来源： 逸芯生命科学血管化类器官一直是组织工程领域的一项挑战，事实上，大多数厚度超过400微米的组织都需要特定的功能性脉管系统，以确保足够的营养和氧气供应，以及清除二氧化碳和细胞废物的能力，防止坏死的内核形成。尽管目前已经有复杂的类器官模型，但对于脉管系统和功能性血管循环仍然是很有必要的。为解决这个问题，通过芯片上生成可灌注的血管网络，或者与其他芯片结合形成功能性的血管化器官芯片。这种方法通常是将水凝胶和内皮细胞接种到中央的微流控腔室中，培养基连徐流入，提供长期的营养物质和气体交换，但这种情况不允许观察到其中的液体通量，因此仍然是一个挑战。为解决这类问题，来自法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学（Univ. Grenoble Alpes）的Xavier Gidrol课题组开发了一种由人成纤维包和内皮写细胞产生球状体以及由人iPSC产生3D类器官的器官芯片，证明了血管类器官的有效温和和受控灌注，以及增强类器官生长、成熟和脉管系统发育。相关论文“A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip”于2024年2月16日发表于期刊《Nature Communication》上。01 用于类器官精准封装的微流控装置设计本研究中，使用COC制造芯片，每个芯片芯片包含10个通道，并使用一台10通道注射泵进行灌注通过设计蛇形通道，可以将类器官球体封装至特定位置。嵌入的纤维蛋白水凝胶中的类器官可以精确定位到预定的位置，且捕获微店的大小可以根据需要进行调整。利用纤维蛋白水凝胶和空气注入，可以使得整个蛇形通道具有纤维蛋白水凝胶黏附，从而为完整的血管化打下基础。该平台的优势之一是稳定性、可扩展性和可靠性，在具体操作时，可以实现10秒完成一个通道的构建，并实现接近100%的捕获率。另外，该芯片也可以相对容易的修改为多个通道并行，以便研究多个多种类器官。总体而言，本研究设计了一种蛇形几何芯片用于微流体通道中精确可控的捕获类器官和其他3D细胞结构。图1：设备设计以及类器官和细胞配置概述02建立相互联系的灌注内皮网络首先通过在静态（每天更换培养基）或流动条件下单独培养间充质球体来检查流体流动的影响。观察到动态灌注下内皮网络的形成增强，与静态条件相比，血管连接处数量、网孔数量、节段数和总节段长度分别显着增加4.4倍、6.5倍、5.0倍和4.8倍。因此，流动条件可以直接驱动这些间充质球状体分化为血管状结构。接下来将HUVEC掺入水凝胶混合物中（如上所述），以在HUVEC衬里微通道和捕获的间充质球体之间建立功能连接。在第0天，间充质球状体被引入微通道并捕获在正确的位置，在那里它保持其球形。在第3天，研究者观察到内皮细胞的初始组织，到第7天，具有三维构型的网络样结构发育并保持稳定直到第13天。观察到RFP-HUVEC内皮床和间充质球体脉管系统之间的自发吻合，在陷阱站点上建立互连网络。为了证明相互连接的内皮网络的功能，研究者使用荧光微珠进行了灌注测定。在培养的第13天，将直径为1μm的珠子以Q = 10μl/ min的流速注入微通道中。珠子示踪覆盖在内皮网络从陷阱入口到出口产生的图案上，表明形成的网络支持灌注的能力。最后通过对网络中的流体性质进行表征，发现器官芯片中的灌注类似于人体毛细胞血管中观察到的生理流。图2：通过间充质球体的功能性血管化产生吻合内皮网络03 血管类器官的血管化此部分使用人iPSC产生3D类器官（BVO），并植入芯片。与在孔中培养的BVOs类似，这些BVOs在芯片上自组织成真正的毛细血管的三维互连网络，该毛细血管包含内皮细胞内衬的管腔，周细胞和平滑肌细胞覆盖，以及紧密连接蛋白ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin的表达。类器官形成毛细血管，毛细血管中空管腔被原型基底膜包围。将成熟的BVO、HUVEC和成纤维细胞嵌入水凝胶中并引入微通道。研究者观察到，从第二天到第十天，内皮细胞逐渐组织生成一个互联的网络。这些网络形成了包含BVO的内皮床，并表现出延伸到陷阱位点的三维组织，在2周的实验期结束后，发现HUVEC可以稳定保持30天以上，证明本器官芯片可以形成稳定可灌注的内皮网络并可以将BVO捕获并血管化。图3：芯片上血管类器官（BVOs）的血管化04HUVEC网络和BVO实现功能吻合为了证明“功能性血管化”，检查了HUVEC内皮网络和接种的BVO之间的吻合。先前表明，移植到小鼠肾囊中的BVO与宿主脉管系统形成功能连接，测试了是否可以通过使用中间HUVEC内皮床来实现类似的体外吻合。结果表明，在HUVEC网络附近观察到许多BVOs血管（CD31GFP），表明从HUVEC内皮床到类器官血管的功能性吻合，当在流动条件下培养时，血管化的BVOs表现出生理分层组织，BVO上游和下游的HUVEC血管较大。小动脉-小静脉大小血管的上游和下游区域表现出平滑肌细胞SM22标志物的强烈表达，而BVOs中狭窄的毛细血管具有被周细胞包围的中空管腔结构。测量BVO上游和下游区域的HUVEC血管的平均直径为37 μm，对应于小动脉-小静脉大小，而BVO内的血管平均直径为8 μm，与体内毛细血管大小一致。重要的是，还能够识别出几个界面，显示HUVEC内皮网络和BVO脉管系统之间的吻合。这些结果表明，此方法适用于将HUVEC内皮网络与真正的血管类器官连接起来，以组织可灌注的功能性维管树。图4：建立包含血管类器官的可灌注HUVEC内皮网络05增强芯片上血管类器官的生长和成熟为了证明该方法在解决该领域有关通过血管化改善3D组织生长和功能的关键问题的适用性，研究者进行了实验，比较了在静态和流动条件下的类器官生长，以及有或没有相邻的HUVEC内皮床（分别称为“有血管”和“无血管”）。反复拍摄明场和GFP荧光图像，以观察BVOs和周围内皮网络的发展。在没有HUVEC和成纤维细胞的纤维蛋白水凝胶中培养的BVOs显示出生长受损，导致凝胶降解，BVO收缩和过早死亡。当在相同条件下在孔中培养时，这些BVO的生长和发芽不受影响，因为它们被封装在大量凝胶中，在培养的最初几天可以防止任何凝胶降解。与流动条件相比，HUVEC内皮网络在静态条件下未能正常成熟。ECM重塑在流动条件下显著增强，导致结构的形成，这些结构随着时间的推移在靠近陷阱位点的微通道中逐渐膨胀。相比之下，在静态培养条件下未观察到ECM重塑和血管重组。进行RNA测序，结果显示，在芯片中形成的类器官中有关血管生成、血管发育和血压调节过程中的关键基因均上调明显，这些结果表明，此方法构建的器官芯片提供的灌注和流动可以促进血管类器官成熟。图5：HUVEC内皮床和干细胞衍生血管类器官之间的功能吻合评估06芯片上血管化胰岛球体的增强功能为验证该系统的血管功能化能力，研究者生成了血管前分泌胰岛素的胰岛球体，作为原理验证。使用与BVO相同的方法，在静态或流动条件下，无论是否有相邻的HUVEC内皮床，在芯片上培养胰岛。在第5天，进行了葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定。结果显示胰岛素分泌因高血糖激发而显著增加。值得注意的是，与芯片上的所有其他条件相比，以及与在常规孔中培养的胰岛相比，具有流动和血管形成的胰岛球状体的相应刺激指数（[高葡萄糖溶液]/[低葡萄糖溶液]）显着更高。具有流动和血管化的胰岛球体的刺激指数表现出较大的变化，这可能归因于血管网络的质量或范围的差异。然而，当仅引入血流或HUVEC内皮床时，刺激指数没有改善。这些数据表明，当在流动条件下在芯片上培养并嵌入 HUVEC 血管床中时，胰岛球体的葡萄糖刺激会改善胰岛素分泌，从而创造改善的功能性β细胞生态位。图6：类器官通过流动和血管形成增强的生长和成熟讨论在本研究中，研究者提出了一个微流控平台，该平台提供了简单、灵活和稳健的解决方案，以形成血管化类器官芯片，并精确控制短期和长期灌注过程中产生的通量。通过这种方法，克服了类器官生长、成熟和器官芯片技术中的常见障碍。细胞和水凝胶上样，以及使用特定生长培养基的长期类器官灌注，通过单个流体入口进行。研究者在该系统中的流体处理自动化促进了工业和医疗环境中微流体设备的广泛使用、分配和适应。所展示的微流控平台通过创新的封装技术提供稳健性，该技术依赖于在很大程度上独立于工作压力的流体动力学和毛细管效应。这里描述的芯片配置导致HUVEC内皮床和人类血管类器官的毛细血管之间的吻合。因此，该系统可以生成灌注的分层网络，这些网络包括从小动脉到小静脉和毛细血管大小不等的血管。目前该研究已经完成血管类器官的血管内灌注，可以以说是第一个在整个微流控捕获嵌入式3D类器官结构中整合功能性脉管系统的设备，也会在生物医学的各个领域有更广泛的应用。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-45710-4点击图片查看OTC2023类器官前沿应用与3D培养论坛会后报告，OTC2024论坛征集投稿做报告，详询：王晨 180 1628 8769