【JACS】姚少钦/张志民等首次在哺乳动物细胞中实现小分子诱导的激酶催化赖氨酸的乙酰基化修饰

蛋白质翻译后修饰在细胞信号传导、蛋白质稳定性调节、蛋白质识别与相互作用以及空间定位等方面具有重要作用，其中赖氨酸乙酰化修饰是报道最多的修饰之一。深入了解蛋白质乙酰化修饰的机制及其对蛋白质功能调控的影响，对于相关药物的开发和设计至关重要。2024年8月20日，新加坡国立大学的Yao Shao Qin教授团队与暨南大学药学院张志民团队在《美国化学会杂志》上发表了一篇题为“小分子诱导哺乳动物细胞中激酶催化赖氨酸的翻译后乙酰化”的研究论文。这项研究首次在哺乳动物细胞中利用小分子选择性地对激酶催化中心的赖氨酸进行乙酰化修饰，为激酶的生物学研究和靶向药物的开发提供了一个新的化学工具。

赖氨酸乙酰化状态失调与多种疾病密切相关，如心血管疾病、癌症和神经性疾病。赖氨酸乙酰化在生物体内的稳态由赖氨酸乙酰化酶（KACs）和去乙酰化酶（KDACs）精确调控。选择性修饰蛋白的化学工具在哺乳动物细胞中是研究赖氨酸乙酰化生物学功能的有效手段，但开发过程中面临许多挑战。一些传统的生物方法操作复杂，例如通过工程化改造的pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNACUA系统插入非天然的乙酰化赖氨酸；已经报道的小分子如AceTAC和BAHA在诱导蛋白乙酰化修饰方面缺乏广谱性和修饰位点选择性。本文作者以激酶为对象，试图开发同时具有高选择性和高反应性的乙酰化分子工具。

激酶通过水解ATP来磷酸化底物蛋白，从而调控一系列信号通道的活性。在激酶的活性中心通常存在一个保守的催化性赖氨酸，已有研究开发了多个可以共价修饰这一赖氨酸的小分子。为了在哺乳动物细胞中实现这一赖氨酸的乙酰化修饰，作者选择3-aminopyrazole作为化学支架，在其末端芳香环上引入活化酯，并通过不同的取代基微调其反应性与稳定性，成功合成了Ac1-Ac8。这些分子在PBS中具有较高的稳定性和与氨基的反应活性，其中含有两个F作为吸电子取代基的Ac4表现最佳。

Ac4在细胞中能够有效修饰激酶SRC和AURKA的催化赖氨酸。XO44是一个成熟的激酶赖氨酸共价修饰分子，PD/WB实验显示在细胞提前孵育Ac4后，XO44与SRC和AURKA的结合能力急剧降低，证明催化性赖氨酸被Ac4乙酰化后阻止了XO44与SRC/AURKA的共价反应。蛋白质组学实验证明Ac4可以乙酰化上百个内源性激酶，显示了该方法的普适性；而且IP-WB显示Ac4孵育后细胞中SRC和AURKA的乙酰化程度显著提高，进一步证明了Ac4在细胞中对SRC和AURKA的乙酰化能力。竞争条件下的IP-WB研究显示，当活细胞中的AURKA催化赖氨酸被其他小分子共价占据后，Ac4将不能乙酰化AURKA，显示了乙酰化位点选择性。

作者进一步利用这一策略研究了AURKA的催化赖氨酸K162的乙酰化。目前尚无证据表明AURKA上的K162可逆乙酰化在细胞中真实存在。作者通过对AURKA选择性非共价抑制剂VX-680进行改造，在其靠近K162的苯环上引入活化酯作为乙酰化基团，并在旁边位置引入F取代，合成了Ac9-Ac14。这些分子中，Ac13不仅显示了与VX-680类似的对AURKA的体外抑制活性和细胞毒性，还保留了对AURKA激酶的高选择性，并且能够高效选择性地乙酰化AURKA上的K162。Ac13孵育后，细胞中AURKA（K162）的乙酰化明显提高，相应的AURKA（T288）的自磷酸化水平显著降低。Ac13在洗脱实验中也显示了持续的细胞活性和乙酰化AURKA能力。被Ac13乙酰化的AURKA在SIRT3调控下可以实现去乙酰化，这一点在体外和细胞内都得到了证实。在HCT116细胞中，AURKA通过磷酸化p53蛋白，促进其泛素化并被降解。Ac13孵育的细胞中p53的稳定性显著提高，而在细胞中过表达去乙酰化酶SIRT3时，AURKA的乙酰化水平几乎完全逆转，p53的稳定性也随之降低。

综上所述，这篇论文首次开发了一类可以在活细胞中对激酶催化赖氨酸进行选择性乙酰化修饰的化学分子，并基于此证明了AURKA的催化赖氨酸K162的可逆乙酰化，展示了该方法在深入研究激酶赖氨酸乙酰化调控领域的广阔应用前景。