ADCY8

蛋白翻译后修饰在细胞信号转导、蛋白稳定性调控、蛋白识别与相互作用以及空间定位等发挥着重要作用，其中的赖氨酸乙酰化修饰报道的最为广泛下修饰之一。深入认识蛋白的乙酰化修饰的机制以及乙酰化修饰对蛋白的功能调控机制对相关药物的开发和设计至关重要。2024年8月20日，新加坡国立大学的Yao Shao Qin 教授团队联合暨南大学药学院张志民团队在J. Am. Chem. Soc.上发表了题为“Small Molecule-Induced Posttranslational Acetylation of Catalytic Lysine of Kinases in Mammalian Cells”的研究论文，首次在哺乳动物细胞中利用小分子对激酶催化中心的赖氨酸实现了选择性乙酰化修饰，为激酶的生物学研究和靶向药物的开发提供了一个新的化学工具。 赖氨酸乙酰化状态失调与心血管疾病、癌症和神经性疾病等均存在密切的联系。生物体中的赖氨酸乙酰化稳态是由众多赖氨酸乙酰化酶（KACs）和去乙酰化酶（KDACs）精确调控的。在哺乳动物细胞中对蛋白进行选择性修饰的化学工具是研究赖氨酸乙酰化生物学功能的利器，但在开发过程中面临着一系列的挑战。一些传统的生物方法操作复杂，如通过工程化改造的pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNACUA系统在表达过程中插入非天然的乙酰化赖氨酸；已报道的可以诱导蛋白乙酰化修饰的小分子缺乏广谱性和修饰位点选择性，如AceTAC 和 BAHA试剂。本文作者以激酶为对象，尝试开发同时具有高选择性和高反应性的乙酰化分子工具。 激酶可以通过水解ATP来磷酸化底物蛋白，从而调控一系列信号通道的开放。在激酶的活性中心，大都存在一个非常保守的催化性赖氨酸，目前人们已经开发了多个可以共价修饰这个赖氨酸的小分子，包括一个可以在体外对PI3Kδ (K779)进行选择性乙酰化修饰的分子。为了实现在哺乳动物细胞中对这个赖氨酸的乙酰化修饰，作者以3-aminopyrazole这个可以跟众多激酶结合的分子作为化学支架，在它的末端芳香环上引入一个活化酯并通过不同的取代基来微调该warhead的反应性与稳定性，成功的合成Ac1-Ac8。这些分子在PBS中都具有较高的稳定性(t1/2 > 12 h) 和与氨基的反应活性，而含有两个F作为吸电子取代基的Ac4表现最佳。  Ac4在细胞中也可以很好的修饰激酶SRC和AURKA的催化赖氨酸。XO44是一个非常成熟的激酶赖氨酸共价修饰分子，PD/WB实验显示在细胞提前孵育了Ac4后，XO44与SRC和AURKA的结合能力急剧降低，证明催化性赖氨酸被Ac4乙酰化后阻止了XO44与SRC/AURKA的共价反应。蛋白组学实验证明Ac4可以乙酰化上百个内源性激酶，显示该方法的普适性；而且IP-WB显示Ac4孵育后细胞中SRC和AURKA的乙酰化程度都出现了剂量依赖性的提高，更直接证明Ac4可以在细胞中对SRC和AURKA进行乙酰化；最后竞争条件下的IP-WB研究显示活细胞中的AURKA催化赖氨酸被其它小分子共价占据后，Ac4将不能乙酰化AURKA，显示出乙酰化位点选择性。  作者接下来利用这一策略研究了AURKA的催化赖氨酸K162的乙酰化。目前还没有证据显示AURKA 上的K162可逆乙酰化在细胞中是否真实存在。通过对前期开发了一个AURKA选择性非共价抑制剂VX-680进行改造，在靠近K162的苯环上引入活化酯作为乙酰化基团，并将旁边位置引F取代对该活化酯反应性和稳定性进行微调，合成了Ac9-Ac14等系列分子。其中最优异的Ac13不仅显示出与VX-680类似的对AURKA体外抑制活性和细胞毒性，也保留了对AURKA 激酶的高选择性；并且还可以高效地选择性乙酰化AURKA上的K162。Ac13孵育后，细胞中AURKA（K162）的乙酰化明显提高，相应的AURKA（T288）的自磷酸化水平则显著降低。洗脱实验中Ac13也显示出持续的细胞活性和乙酰化AURKA能力。被Ac13乙酰化的AURKA在SIRT3调控下可以实现去乙酰化，这一点在体外和细胞内都被证明。在HCT116细胞中， AURKA可以通过磷酸化p53蛋白，促进其泛素化进而被降解。Ac13孵育的细胞中p53的稳定性显著提高，而当在细胞中过表达去乙酰化酶SIRT3时则可以发现AURKA的乙酰化水平几乎被完全逆转，p53的稳定性也随之降低。综上所述，本论文首次开发成功了一类可以在活细胞中对激酶催化赖氨酸进行选择性乙酰化修饰的化学分子，并以此为基础证明了AURKA的催化赖氨酸K162的可逆乙酰化，显示该方法在深入研究激酶的赖氨酸乙酰化调控领域的广阔应用空间。 论文第一作者为新加坡国立大学唐光辉博士和中山大学王璇博士（现为暨南大学药学院博士后），通讯作者为新加坡国立大学Shao Q. Yao教授和唐光辉博士以及暨南大学药学院张志民研究员。这项工作得到了新加坡NMRC和教育部相关基金、国家重点研发计划和广东省重大基础与应用研究基金的支持。 导师介绍 Shao Q. Yao教授博士毕业于美国普渡大学，随后分别于加州大学伯克利分校癌症研究院和斯克里普斯研究所从事博士后研究工作。2011年起获聘新加坡国立大学终身正教授，2012年起被聘为首席教授。Shao Q. Yao教授以化学生物学为主要研究方向，长期致力于酶及相关生物分子对生命调控的研究，以小分子荧光探针、蛋白质组学、微阵列芯片、高通量筛选等为手段，积极推进疾病的机理研究及治疗手段的开发，先后在Nature、Acc.Chem. Res.、 J. Am. Chem. Soc.、 Angew. Chem. Int. Ed.、 Nat. Commun.和 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.等国际著名期刊上发表高水平学术论文200余篇。 张志民研究员博士生毕业于中科院上海有机化学研究所，随后再加州大学河滨分校（UCR）从事博士后研究，2017年入职暨南大学药学院生物制药系。入选国家级青年拔尖人才和广东省“珠江人才”计划青年拔尖人才。长期以具有重要生理功能和新颖催化机制的酶为研究对象，致力于酶的结构生物与结构药理学研究。近年来以（共）第一/通讯作者在Nature、Nature Communications、Nature Plants、Nature Structural & Molecular Biology、J. Am. Chem. Soc. 、Angew. Chem. Int. Ed.和J. Med. Chem.等国际知名期刊发表研究论文多篇。 唐光辉博士毕业于北京大学，随后加入新加坡国立大学Yao Shao Qin课题组从事博士后研究。长期致力于新型激酶共价抑制剂的开发和活性化合物的药物靶点鉴定。近年来以（共）第一/通讯作者在J. Am. Chem. Soc. 、Angew. Chem. Int. Ed.和Eur. J. Med. Chem. 等国际知名期刊发表研究论文多篇。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

今天给大家分享一篇发表在J. Med. Chem 上的文章：Discovery of a Highly Potent and Selective HDAC8 Degrader: Advancing the Functional Understanding and Therapeutic Potential of HDAC8. 文章的通讯作者为美国佛罗里达大学药学院的Daiqing Liao 和 Guangrong Zheng 教授。 组蛋白去乙酰化酶8（HDAC8）在I类HDACs中十分独特，它是由377氨基酸组成的分子量为42kDa的蛋白质，主要分布在细胞核和细胞质中，在许多生理和病理过程中扮演重要的角色。尽管组蛋白是否是HDAC8底物仍然存在争议，但大量的非组蛋白(如SMC3，ERRα和p53)被报道是HDAC8的底物或是其相互作用的配体。有研究表明HDAC8对于p53的表达是必不可少的，而且HDAC8的敲低(knockdown)在具有p53突变的细胞中表现出抗增殖活性，这就表明HDAC8抑制剂有可能成为具有p53突变肿瘤的辅助治疗药物。此外，越来越多的证据表明，HDAC8活性或表达异常在许多疾病，特别是在T细胞淋巴瘤，儿童成神经细胞瘤和Cornelia de Lange综合征(CdLS)中起着至关重要的作用。此外，也有研究表明HDAC8具有非酶依赖的骨架作用。虽然，已经有多个HDAC8的选择性抑制剂报道，但它们的体外抗增殖活性均不太理想。因此，迫切需要研究HDAC8酶活和非酶活性在癌症中的作用。目前已有多个HDAC8 PROTACs被报道，但是这些HDAC8 PROTACs要么降解活性有待提高，要么选择性有待提高。本文，作者对课题组报道的HDAC3/8 PROTAC进行结构修饰，得到了选择性和活性较好的HDAC8 PROTAC . 作者首先对HDAC8配体就行了探索，通过引入不同的锌离子螯合基团（ZBG）以及对酰肼侧链长度的探索，得到了选择性和抑制活性较好的HDAC8配体 15 and 16。 对接结果表明，化合物15可以伸入HDAC8的活性口袋，为其高选择性提供了解释。 作者根据优化得到的HDAC8配体，设计了一系列基于VHL的HDAC8 PROTACs。降解实验中，2个化合物表现出较好的选择性和HDAC8降解活性YX862和 YX827. WB实验表明，在较高浓度下观察到了histone的乙酰化。 作者接下来进行了降解机制研究，表明其通过PROTAC机制降解HDAC8,而且AlphaLISA 实验结果表明YX862和YX827可以有效地诱导HDAC8和VHL三元复合物的形成。 虽然WB观察到了YX862诱导HDAC8的降解，但是PROTEOMICs study并未观察到HDAC8的降解，这表明PROTEOMICs study 具有局限性。PTM changes (acetylation and methylation)分析没有观察到histone hyperacetylation，但观察到了H2AX hyperacetylation。此外，WB分析表明，YX862可以剂量依赖的诱导HDAC8的非histone底物SMC3 hyperacetylation。 作者对YX862的抗增殖活性进行了研究，发现YX862可以在弥漫性大B细胞淋巴瘤SU-DHL-2和DoHH2细胞中非常有效地降解HDAC8, 且表现出较好的抗增殖活性。然而，YX862的抗增殖活性仅比对照化合物NC-YX862的活性好2倍。 在这项研究中，作者报告了一系列基于酰肼的HDAC8 PROTACs, 其中化合物 YX862和YX827具有较好的选择性和HDAC8降解活性。YX862对 HDAC8 的降解并不能增加组蛋白乙酰化水平，但可以显著增加非组蛋白底物如SMC3的乙酰化水平。YX862对DLBCL 细胞具有更高的抗增殖活性，且明显优于HDAC8 选择性抑制剂 PCI-34051，但仅略优于NC-YX862。总之，YX862可以作为分子工具来进一步研究HDAC8的功能。 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓