李大力团队开发IscB高效基因编辑工具

在过去的十多年里，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术迅速发展，使我们能够更准确高效地改造基因，从而更好地理解生命过程，并开发精准的基因疗法。到2023年底，首个基于CRISPR/Cas9技术的离体基因编辑疗法Casgevy已获批上市，用于治疗地中海贫血和镰状细胞贫血。此外，通过肝脏靶向的LNP-mRNA递送方式，也取得了在体基因疗法的显著临床试验成果。基因编辑技术已经进入临床应用阶段，但靶向肝脏以外的在体基因编辑治疗仍面临挑战。

目前，适用于肝外基因递送的主要载体是腺相关病毒（AAV），其包装能力约为4.7kb，难以容纳例如Cas9这样的较大核酸酶及其衍生系统。因此，寻找小尺寸、高效率的基因编辑系统至关重要。近年来，研究人员发现了一系列小型Cas蛋白，包括小型Cas12f蛋白、其进化祖先TnpB以及真核同源物Fanzor。然而，由于Cas12f家族只有一个RuvC结构域，难以用于碱基编辑等依赖于缺口酶的技术。

2021年，张锋团队在研究中发现，由IS200/IS605转座子超家族编码的IscB核酸酶具有HNH和RuvC结构域，能够切割DNA。IscB仅包含约400-500个氨基酸（约为SpCas9的三分之一），并通过非编码RNA（ωRNA）引导蛋白识别和切割DNA。因此，IscB有望成为小型碱基编辑器。然而，IscB在哺乳动物细胞中的活性较低，例如OgeuIscB在HEK293FT细胞中的编辑效率不到5%。提高IscB的基因编辑活性是亟需解决的问题。

2024年8月2日，华东师范大学李大力团队在《Molecular Cell》上发表了一篇研究论文，开发出高效的IscB变体eIscB-D。通过蛋白质工程、RNA结构优化、胚胎注射等技术，该团队在哺乳动物细胞和小鼠胚胎中获得了高效的编辑活性。通过将eIscB-D与腺苷脱氨酶（TadA-8e）或胞嘧啶脱氨酶（hA3A*）融合，开发出高活性的迷你单碱基编辑器eiABE和eiCBE。这些系统在小鼠胚胎中展示出高效的体内编辑活性，可用于构建白化病等疾病模型。

为了提高IscB的活性，研究者基于结构设计在关键位点引入精氨酸突变，并经过多轮筛选，成功获得增强型IscB（eIscB），其编辑效率可提升至野生型的22.4倍，平均提升7.5倍。通过融合非序列特异性DNA双链结合蛋白（HMG-D），提高了IscB对目标DNA的亲和力，eIscB-D的最高编辑效率可达91.3%。研究者针对向导RNA也进行了优化，获得了高效的eωRNA，并缩短了其长度，降低了工业合成难度。

此外，研究者通过在RuvC结构域引入丙氨酸突变，开发了IscB切口酶eIscBH339A，并与腺苷脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶分别融合，开发出高效的迷你单碱基编辑器eiABE和eiCBE，最高位编辑效率分别为73.6%和79.2%。在小鼠体内实验中，研究者利用eIscB-D/eωRNA系统靶向Tyr基因，成功制备小鼠白化病模型，F0代小鼠中75%的突变小鼠实现高效编辑。

总的来说，该研究成功开发了基于IscB的高活性迷你基因编辑工具，实现了小鼠体内高效编辑，极大提高了单个AAV载体安全高效递送碱基编辑或先导编辑系统的可能性，为未来体内基因治疗提供了新的候选技术。

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