ADA

Adapted from iStock, Drypsiak Vertex may have pivoted away from the space, but candidates in development by Arrowhead/Takeda, Wave, Korro and others could address the damage underlying alpha-1 antitrypsin deficiency and make today’s treatments a thing of the past. Alpha-1 antitrypsin deficiency is a genetic disorder that affects the liver and/or lungs. Approximately 1 in 3,500 people have two abnormal SERPINA1 genes for the alpha-1 antitrypsin (AAT) protein and are at risk of serious organ damage due to AATD. While M-AAT is produced in healthy humans to inhibit neutrophil elastase in the lungs, AATD patients produce Z-AAT, which does not inhibit neutrophil elastase as effectively. If too much neutrophil elastase builds up in the lungs or liver, the result is inflammation which, untreated, can lead to lifelong complications. The only currently approved treatment option for AATD is augmentation therapy , which entails delivering normal alpha-1 antitrypsin collected and purified from blood donors through weekly intravenous administration. But this treatment does not reverse pulmonary damage or stop the progression of liver damage. Multiple companies are developing candidates that would prevent or reverse this damage, and despite some setbacks in the field, in the next 5 to 10 years we could see augmentation therapy become a thing of the past. In August 2024 , Vertex Pharmaceuticals announced that the company would cease research into both of its investigational small molecules for AATD. While Vertex had hoped that VX-634 and VX-668 would treat the disease by correcting the AAT protein, the efficacy was not transformative enough. Along with Vertex’s November 2023 discontinuation of the development of VX-864 for AATD due to reports of rashes and elevated liver enzymes, these setbacks highlight some of the challenges associated with researching new treatments for AATD. Meanwhile, Arrowhead Pharmaceuticals and Takeda are recruiting for three Phase III trials for fazirsiran, an investigational subcutaneous first-in-class investigational RNA interference (RNAi) therapy for AATD-associated liver disease. While Phase II AROAAT-2002 results indicated that fazirsiran led to significant reductions in Z-AAT, the evidence for pulmonary efficacy and improvement is murky because the Phase II trial did not have a placebo arm and the median FEV1 and mean DLCOhbg—markers of pulmonary function—were stable over time in all subjects receiving experimental treatment compared to baseline. While these data do not show any signs of pulmonary decline, there is no sign of overall pulmonary improvement either. In addition, Sanofi is working on SAR447537, an AATD asset acquired from Inhibrx. Formerly known as INBRX-101 , SAR447537 is a fusion protein currently in the recruitment stage for Phase II trials involving AATD emphysema. In Phase I results, safety and pharmacokinetic data supported the intravenous use of SAR447537 every three or four weeks. However, efficacy data related to the liver are not available. In the in vivo base editing space, Beam Therapeutics is investigating the use of BEAM-302 to treat AATD. BEAM-302 is a liver-targeting lipid nanoparticle formulation that is currently undergoing Phase I/II trials and is formulated to be a one-time intravenous injection of an adenine base editor. When tested in rat and mouse models , toxic liver protein levels decreased. Finally, Wave Life Sciences, AIRNA and Korro Bio are competing in the early phases of preclinical/clinical research to develop AATD-targeting subcutaneous RNA-editing oligonucleotides. On Oct. 16, Wave reported positive proof-of-mechanism data from a Phase Ib/IIa trial of WVE-006 in AATD, while Korro Bio released preclinical data this month for its AATD investigational treatment, KRRO-110 . AIRNA had yet to release its adenosine deaminase acting on RNA (ADAR) preclinical data publicly as of July 2024. With all these investigational treatments aiming to transform the way AATD is treated, augmentation therapy could soon be obsolete. If efficacy data for RNA-based oligonucleotides is significant and points to clinical success, RNA-based oligonucleotides could hit the market as soon as four to five years from now. In the meantime, at the current trajectory, fazirsiran could reach the market as early as two to four years from now if all goes well. Given these developments in the AATD space, competition could heat up within the next decade as more efficacy data are released from therapies currently at earlier stages of development.

昨日，国内血液制品板块公司哀鸿遍野。 血制品公司无论是股价和业绩在生物医药行业均以稳健著称，如今以天坛生物、博雅生物为首龙头们单日跌幅各超过5个点以上，实属罕见。 酿造这一风波的直接推手是一款可白蛋白替代品“奥福民”的上市受理。 9月12日，禾元生物1类创新生物制品奥福民（植物源重组人血清白蛋白注射液）NDA获得CDE受理。据禾元生物早前对外公开介绍称，公司在上市前沟通交流中，CDE认为奥福民具有明显临床价值，符合优先审评审批纳入条件，所以公司正在按照优先审评审批要求准备注册资料。一旦奥福民获得CDE颁发的优先审评资格，那么相信其很快将在2025年面市。 01 白蛋白的供需格局与窘境 重组人血清白蛋白，顾名思义就是要对血浆提取得到的人血白蛋白进行替代。 白蛋白人体中非常重要的物质，其能够维持血容量、调节渗透压，还具有运输物质等功效与作用，如果人体白蛋白缺乏可能会导致身体代谢受到影响。而作为日常治疗药物而言，其可以视为重要的战略物资（在重症监护有时发挥重要作用），作用和功效包括治疗失血、受伤、低蛋白血症等，也可使人体出现的不良症状得到改善。 基于战略属性、日常治疗需求和随着国内批签发的增长，白蛋白的市场表现出不错的成长性。据弗若沙利文数据显示，2023年中国人血白蛋白药用市场规模达到 361亿元，预计2025年该市场将达到425亿元。 不过，由于国内血制品竞争格局较稳定（2001年后无新批血液制品生产企业，新增浆站有政策把控）、血浆供给短缺，导致国产人血白蛋白药品存在较大的市场缺口。 根据中检院及各检验所批签发数据，2023年进口人血白蛋白占比64.4%，进口依赖严重。所以，目前血制品公司核心成长逻辑之一是扩张浆站、提升单产以实现进口替代。 从2023年1-11月批签发格局来看，天坛生物、泰邦生物、上海莱士和华兰生物市场份额占据前列，受到的情绪影响或首当其冲。 02 重组人血清白蛋白，国内要批个FIC？ 目前，全球市场在售的仅有通过人血浆提取得到的人血白蛋白药品，尚未有重组人血白蛋白药品在主流市场商业化。 日本田边三菱药用级重组人血白蛋白（商品名Medway®）于2007年上市，因临床前数据篡改涉嫌造假于2009年撤市；今年4月，通化安睿特自研的重组人白蛋白注射液，正式完成在俄罗斯的注册流程，获准在俄罗斯境内上市销售。 全球一直有研发者试图通过基因工程技术生产高纯度的重组人血白蛋白，由于人血白蛋白使用剂量高、用量大，对安全性、成本、规模化生产要求高，一直未能有超高纯度且安全性拉满的重组人血白蛋白产品出现。 按照目前全球各国重组人血白蛋白管线进度来看，如果禾元生物的“奥福民”在国内获得上市批准，那么可以视为CDE作出的一个准FIC创新生物制剂的重要审批决策。 禾元生物的奥福民非常“特别”，从过往研发思路来看，大量重组人血白蛋白管线多采用酵母菌、大肠杆菌进行表达体系构建，而奥福民选择水稻胚乳细胞作为生物反应器（植物源）。 这样带来的好处非常多，包括：1）原料扩大生产不通过发酵，仅需扩大水稻种植规模（稻谷易储存且储存过程蛋白不易降解）；2）由于稻米与人类有长期接触史，人体对植物源（稻米）人血白蛋白有较高耐受性，免疫原性较低，可以杜绝因各类病毒或动物源病原污染的风险；3）重组蛋白合成通过植物光合作用完成，绿色环保。 对于奥福民（OsrHSA）来说，自己只需要证明其非劣于血浆提取人血白蛋白药品的疗效，同时证明自身安全性没问题即可。值得注意的是，禾元生物水稻胚乳细胞表达体系生产的重组人血清白蛋白，纯度达到99.9999%以上。 安全性方面，经一期和二期临床验证，均没有产生具有临床意义的ADA（抗药抗体）和抗HCP（异源蛋白）抗体，没有与药物相关的SAE，表现出良好的安全性和耐受性，与对照组人血浆来源白蛋白（pHSA）相比，在安全性上无显著差别。 有效性层面，在一项已经完成的OsrHSA对照pHSA的对失代偿性肝硬化腹水患者二期临床数据显示，FAS集（全分析集）和PPS集（符合方案集）中所有剂量水平下OsrHSA均非劣于pHSA。同时，在评估所有次要终点的数据结果后，所有数据支撑OsrHSA均非劣于pHSA，且OsrHSA具备优秀的安全性。 另外，据已披露的公开信息显示：三期临床在已按方案完成给药的311例受试者中，有307例受试者治疗期内达到预设疗效目标，应答率达到98.71%，证实了OsrHSA可让肝硬化低白蛋白血症患者获益。 奥福民的获批，似乎有充分和足够的数据进行支撑。 03 替代蓝海？ 血制品企业们和投资者们，不用太过于紧张。 一方面，奥福民的本次NDA的适应症为肝硬化低白蛋白血症，适应症仅仅为目前国内批准的人血白蛋白的冰山一角，赛道也更细分，而且作为新上市产品，奥福民还很难进入一些高危的适应症市场，后续放量仍有待观察。 （国内已经批准的人血清白蛋白适应症） 另一方面，禾元生物由于连续多年的亏损，公司现金较为紧张，截至2023年12月31日公司账面货币资金余额合计2.36亿元，尽管公司称资金可支撑其递交注册申请，但如果不通过BD授权出去或者尽快IPO、再融资，公司也无力进行奥福民的适应症拓展。 不过，重组人血白蛋白的市场潜力仍足够广阔，尤其是禾元生物这种通过植物表达体系生产重组人血白蛋白的企业，拥有一定竞争力。 据禾元生物披露数据显示，目前重组人血白蛋白的成本大概是在10-13元/g，未来随着技术升级迭代带动表达量的提升，成本有望进一步降至7-10/g。 从血源性白蛋白的价格看，单g价格在30-50元，对应单g成本大约在20-25元。对比之下，重组人血白蛋白的成本较血源性人血白蛋白的低不少。若随着重组人血白蛋白成本端进一步下降，未来更多重组产品适应症的拓宽，较大的价差的确能够抢占一部分替代血源性白蛋白份额，不过可能率先替代的是进口产品。 结语：我们固然要热烈鼓励和欢迎创新技术的到来并解决重要生物医药战略物资短缺问题，也应以谨慎、高标准的眼光来看待其应用，毕竟涉及到人民的生命安全。 但就这样一条讯息让机构或投资者对国内血制品企业进行预期大反转，那大可不必。 药渡媒体商务合作 媒体公关 | 新闻&会议发稿 张经理：18600036371（微信同号） 点击下方“药渡“，关注更多精彩内容 免责声明 “药渡”公众号所转载该篇文章来源于其他公众号平台，主要目的在于分享行业相关知识，传递当前最新资讯。图片、文章版权均属于原作者所有，如有侵权，请及时告知，我们会在24小时内删除相关信息。 微信公众号的推送规则又双叒叕改啦，如果您不点个“在看”或者没设为"星标"，我们可能就消散在茫茫文海之中~点这里，千万不要错过药渡的最新消息哦！👇👇👇

摘要：抗体药物偶联物（ADCs）是一类新型生物治疗药物，由一个细胞毒素通过连接子共价结合到抗体上。配体结合测定（LBA）和液相色谱-质谱（LC-MS）是分析生物基质中 ADCs 的首选技术。本文综述的目的是提供与一系列药代动力学（PK）和抗药物抗体（ADA）评估相关的当前生物分析策略。此外，比较了 LBA 和 LC-MS 平台的优势和局限性。最后，还提供了可能影响所开发分析方法性能的潜在因素。希望本综述能为生物分析科学家提供有价值的见解，以便使用涉及 LBA 和 LC-MS 的综合分析策略进行 ADCs 的生物分析和相关的免疫原性评估。 1.引言 抗体药物偶联物（ADCs）由单克隆抗体（mAbs）、细胞毒素有效载荷和连接mAbs与细胞毒素有效载荷的连接子组成。ADC 是一种新型靶向药物，大多数 ADC 针对肿瘤学适应症，将特定抗体的癌症靶向能力与细胞毒素有效载荷的癌症杀伤能力相结合，选择性地杀死癌细胞。它的设计旨在提高化疗的有效性并减少其毒性。自1983年进行的第一次 ADC 疗法人体试验以来，在抗体、连接子和有效载荷技术方面取得了显著进展，与早期产品相比，开发出了具有更好疗效和安全性的 ADC。截至2021年12月，已有14种 ADC 获得 FDA 批准用于临床使用，目前有100多种 ADC 处于不同的临床试验阶段。 亲和捕获试剂，如蛋白质 A/G 和目标抗原，以及免疫亲和捕获试剂，如抗人 IgG 和抗独特型抗体，在分析领域中被广泛用于从生物基质中提取感兴趣的分析物。在 ADCs 的生物分析中，配体结合测定（LBA）历史上是主要的测定平台，但亲和捕获或免疫捕获推动了液相色谱-质谱（LC–MS）作为药代动力学（PK）和抗药物抗体（ADA）评估的补充测定技术。由于这些混合测定是配体结合平台和 LC–MS 技术的结合，我们在本文中将它们命名为 LBA-LC–MS 或基于 LBA-LC–MS/MS 的测定。 LBA 和 LC-MS 已成为定量 ADCs 的首选生物分析技术。长期以来，LBA 一直是生物基质中大分子定量的稳健可靠方法选择。与 LBA 相比，LC–MS 一直是小分子定量的首选技术。然而，质谱仪的最新进展以及样品制备技术使得 LC–MS 成为蛋白质治疗药物生物分析的补充技术。因此，已有报道称多种 LBA、LC-MS 和 LBA-LC-MS 分析方法可用于定量测量 ADC 分子。除此之外，药代动力学（PK）和毒代动力学（TK）的生物分析方法应根据相关监管和行业指南进行验证。 与其他生物药物一样，ADC 可能会引发抗药物抗体（ADA）反应。评估对 ADC 的免疫反应对于理解 PK、安全性和随时间的疗效很重要。因此，监测和表征针对 ADC 的抗药物抗体（ADA）是监管机构的期望。目前，桥接配体结合测定是免疫原性评估最常用的格式。桥接测定格式的免疫原性测试本质上是定性或半定量的，通常采用分层测定策略，在生物基质样品中筛选、确认和滴定 ADA 水平。与 PK 测定一样，免疫原性测定应遵循当前的监管和行业指南进行生物治疗药物的验证。通常，样品首先用筛选测定进行测试，然后筛选阳性样品用确认性测定进行测试。此后，确认阳性样品进一步通过滴定测定、特定领域测定和中和测定进行测试。 同时，过去几年中探索了一种用于免疫原性测试的 LBA-LC–MS/MS 方法。LBA-LC–MS/MS 测定能够提供样品中 ADA 同种型相对浓度，无需使用分层测定策略和设置截止点。尽管 LBA-LC–MS/MS 测定的灵敏度目前与 LBA 相比尚不理想，但 LBA-LC–MS/MS 测定是测量 ADA 水平的补充生物分析技术，并同时提供 ADA 的有用同种型信息。 在这篇综述中，我们旨在提供与一系列 PK 和 ADA 评估相关的当前策略。此外，我们比较了 LC-MS 和 LBA 在 PK 和 ADA 测定方面的测定平台的优势和局限性。最后，我们讨论了可能影响所开发测定性能的潜在因素。我们希望这篇综述能为生物分析师提供有价值的见解，使用涉及 LBA 和 LC–MS 的综合分析策略进行 ADCs 的生物分析和相关的免疫原性评估。 2.PK 测定要定量的 ADC 形式  由于生物转化，ADC 可以产生不同的体内形式，这可能导致药物与抗体比率（DAR）的变化或有效载荷/连接子的修饰。如果对有效载荷/连接子的修饰可以忽略不计，PK 测定通常配置为测量 ADC（所有 DAR > 0 的 ADC 形式）、总抗体（包括 DAR = 0 的所有形式的 ADC）和释放的有效载荷。理论上，ADC 和总抗体剖面之间的差异表明了药物解离的程度。如果对有效载荷/连接子的修饰显著，需要开发的 PK 测定数量将增加。Myler 等人给出的一个例子是使用六种开发的 PK 测定来测量实体瘤靶向 ADC 的总抗体（T-Ab）、活性-ADC（与活性有效载荷结合的抗体）、总-ADC（与任何有效载荷结合的抗体）、Ab 结合活性有效载荷（结合有效载荷）、Ab 结合有效载荷代谢物（结合-有效载荷代谢物）和未结合活性有效载荷（未结合有效载荷）。Faria 等人给出的另一个例子是使用多重方法来定量总抗体、具有未修饰有效载荷的抗体、具有修饰有效载荷的抗体、释放的修饰有效载荷和释放的未修饰有效载荷。然而，确定不同形式 ADC 的潜在测定列表可以根据需要知道或有特定机制原因时制定。重要的是，结合有效载荷与总抗体的比率是平均 DAR。DAR 是反映有效载荷与抗体结合数量的重要参数，其随时间的变化表明 ADC 解离和其他生物转化过程，包括 ADC 聚集。 3.测定平台  3.1.LBA 平台  LBA 是用于总抗体（Total Ab）和 ADC 测量的首选测定平台，因为它具有足够的灵敏度、良好的精确度和高样本通量。通常使用夹心测定格式，涉及使用捕获和检测试剂，这些试剂专门结合 ADC 的抗体或有效载荷部分。对于总抗体（TAb），通常使用抗原或抗独特型抗体捕获 ADC，并通过结合 ADC 抗体部分的不同表位的另一抗体进行检测。后者包括非阻断型抗独特型抗体或通用的抗人 IgG 试剂（见图 1A）。对于总结合 ADC，通常使用针对有效载荷的抗体捕获 ADC，并通过抗原或抗独特型抗体或针对 mAb 的通用抗体进行检测（见图 1B）。Pei 等人在一项临床前研究中使用了两种酶联免疫吸附测定（ELISA）方法，用于量化由针对滋养层细胞表面抗原 2（TROP-2）的抗体和 MMAE 毒素组成的治疗性 ADC 的 TAb 和 ADC。用于 TAb 的 ELISA 配置了重组 TROP-2 用于捕获，以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠抗人 IgG Fc 用于检测，而用于药物结合 ADC 的 ELISA 配置了小鼠抗毒素抗体用于捕获，以及相同的 HRP 标记的小鼠抗人 IgG Fc 用于检测。如果一个 ADC 的有效载荷在体内生物转化为非活性代谢物，也可以通过使用专一结合活性有效载荷的试剂，通过 LBA 确定活性 ADC 的 PK 轮廓。例如，Myler 等人开发并验证了一种使用 Meso Scale Discovery（MSD）平台对活性 ADC 进行定量的方法。然而，在第二个例子中，LC-MS 方法似乎比 LBA 方法更实用，因为用于检测生物转化有效载荷的特定试剂通常很难生成。 图 1. 生物基质中检测 TAb 和 ADC 的 LBA 测定格式。(A) 显示了 TAb 的测定格式，其中测定 1 配置了抗独特型抗体用于捕获和抗 Fc 抗体用于检测；测定 2 配置了药物靶标用于捕获和抗 Fc 抗体用于检测；测定 3 是一种通用测定，配置了一种抗 Fc 抗体用于捕获和另一种抗 Fc 抗体用于检测；(B) 显示了 ADC 的测定格式，其中测定 1 配置了抗毒素抗体用于捕获和抗 Fc 抗体用于检测；测定 2 配置了抗毒素抗体用于捕获和抗独特型抗体用于检测；测定 3 配置了抗毒素抗体用于捕获，生物素标记的药物靶标与 HRP 标记的链霉亲和素用于检测。 在动物研究中，使用人源化单克隆抗体（mAbs）制成的 ADCs，可以使用一种通用的 LBA 方法，该方法配置了作为总抗体的捕获和检测试剂的通用抗人免疫球蛋白抗体，用于药代动力学评估（见图 1A3）。在药物开发的早期阶段，当定制的 ELISA 试剂（如重组抗原或抗独特型抗体）很可能不可用时，通用的 ELISA 测定策略特别有用。随后，量化总抗体需要使用一种特选试剂，该试剂专门针对感兴趣的抗体。 3.2.LC-MS 平台 3.2.1.LC-MS/MS LC-MS/MS 通常被视为小分子分析最合适的平台。对于 ADC，它传统上用于小分子未结合有效载荷分析。由于细胞毒素的高疏水性，通常通过从生物基质中沉淀蛋白质（PP）或固相萃取（SPE）或液-液萃取（LLE）分析物，然后通过带有多重反应监测（MRM）模式的 LC-MS/MS 分析来实现循环中解结合有效载荷的定量（见图 2）。此外，LC-MS/MS 平台还允许分析小分子代谢物。 图 2. 使用 LC-MS/MS、LBA-LC/MS/MS 和 LBA-LC/HRMS 方法在生物样本中对 ADCs 进行生物分析的工作流程。IS：内标。Anti-ID Ab：抗独特型抗体。 然而，由于不同的释放机制，具有不可裂解连接子的 ADC 解结合产生的未结合有效载荷的不同形式与具有可裂解连接子的 ADC 相比较有所不同。对于具有不可裂解连接子的 ADC，可以产生包括游离有效载荷在内的几种含有效载荷形式，这些也可以定量。例如，Kaur 等人在 T-DM1 的 PK 和 TK 研究中定量了 DM1、Lys-mcc-DM1 和 mcc-DM1。 3.2.2.LBA-LC-MS/MS 对于具有可裂解连接子的 ADCs，结合的有效载荷主要通过亲和捕获或免疫捕获 LC-MS/MS 测定进行测量。在捕获的 ADCs 的连接子裂解后分离出小分子，然后对结合的有效载荷进行定量。例如，对于使用对酶敏感的二肽 Val-Cit 连接子的 ADC，可以通过使用组织蛋白酶 B 和木瓜蛋白酶等蛋白酶消化来释放有效载荷。对于具有二硫键连接子的 ADC，使用还原剂二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）进行裂解。免疫亲和捕获涉及使用生物素标记的特定抗独特型抗体或目标抗原，其固定在链霉亲和素包被的珠子或柱子上。然后，生物基质中的 ADC 被捕获，随后进行洗脱步骤。之后，洗脱的 ADC 在连接子位点被溶酶体酶特异性裂解，最后从 ADC 释放的有效载荷可以通过 LC-MS/MS 进行分析（见图 2）。 值得注意的是，蛋白质 A 或蛋白质 G 或抗人 IgG 可用于分析结合的有效载荷，特别是在早期开发和非临床研究中。此外，通过非可裂解连接子结合的有效载荷通常通过将体内平均 DAR 值乘以总抗体浓度间接确定。结合有效载荷的测量提供了与抗体结合的细胞毒素有效载荷数量的信息。 LBA-LC-MS/MS 也可用于 TAb 和 ADC 的定量，特别是在适当的 LBA 试剂不可用的早期发现阶段。使用自下而上的 LC-MS 策略用于总抗体和 ADC 的定量确定（见图 2）。对于 TAb 定量，首先通过亲和捕获使用抗独特型抗体或通用捕获试剂如针对 ADC 的 mAb 组分的抗人 IgG，从生物基质中提取 ADC。然后对亲和富集的 ADC 进行变性/还原、烷基化，并用酶消化，随后加入稳定同位素标记的内标，并通过 LC-MS/MS 定量来自互补决定区（CDR）的特征肽段。值得一提的是，稳定同位素标记的抗体作为内标也可以从富集过程的一开始就结合。对于 ADC 定量，通过使用抗有效载荷抗体的免疫捕获富集的样品进行消化，然后使用与总 Ab 定量相同的策略对抗体进行定量。可为 TAb 配置通用的 LBA-LC-MS/MS 方法，使用通用抗人 IgG Fc 抗体从动物血浆中捕获 ADCs，并使用来自抗体部分的恒定区域的特征肽段进行检测。已经选择了几种独特的人类免疫球蛋白框架的 Fc 区域肽段作为动物研究的检测特征肽段。 3.2.3.LBA-LC-HRMS（高分辨率质谱） 亲和捕获与基于 HRMS 的完整质量分析相结合，为在完整蛋白质/亚基水平上表征 DAR 提供了一种准确的方法。这涉及将质量谱分解为一系列“零电荷”质量，然后通过整合和加权光谱峰面积或峰强度来计算平均 DAR。此外，这种方法还可以确定不同时间点的 DAR 分布。例如，Kaur 等人展示了使用生物素化的 HER2 固定在链霉亲和素包被的顺磁性珠子上可以捕获所有 DARs。洗涤后，珠子结合的 ADC 形式的所有 DARs 首先使用 PNGase F 去糖基化，然后使用含有 1% 甲酸的水的 30% 乙腈洗脱，用于涉及使用聚合物反相柱（安捷伦 PLRP-S 柱）的 LC-MS 分析。通过电子喷雾电离（ESI）电离分析物，并由在正 TOF（时间飞行）-MS 模式下操作的 Q-Star® XL 质谱仪（AB Sciex）检测。使用 Analyst QS 1.1 软件（Applied Biosystems, Waltham, MA, USA）对原始数据进行去卷积，并获得了每个感兴趣 DAR 的峰面积。计算了 DARs 的相对强度。通过这种方式，亲和捕获 LC-HRMS 方法直接测量了体内的 DARs。此外，这种“自上而下”的策略还使得从生物基质中完整 ADC 的定量（见图 2） 和循环中 ADCs 的体内生物转化的特征。 4.LBA 与基于 LC-MS 的 PK 测定 对于体内分析，ADCs 在血浆和血清中的定量涉及基于 LBA 或基于 LC-MS 的方法，或两种方法的结合。通常，基于 LBA 的方法比基于 LC-MS 的方法更常用于血浆和血清中 ADCs 的定量。基于 LBA 的方法提供高通量和低设备成本，并已用于几种获批 ADCs 的药代动力学评估。然而，基于 LBA 的方法通常是物种依赖性的，而且大多数情况下，相关方法开发需要专业试剂并且耗时，这是 ADC 开发早期阶段遇到的情况，也是使用通用方法的价值所在。基于 LBA 的方法的另一个特点是它们无法区分具有不同 DAR 值的 ADCs。相比之下，基于 LC-MS 的测定是基质和物种独立的。当结构和生物转化信息尚未准备好，或关键试剂不可用时，更倾向于使用 LC-MS 方法，因为它们的发展不使用专业试剂，耗时更少。此外，由于它们在分子分辨率方面的高特异性，基于 LC-MS 的方法能够直接确定生物样本中的 DARs，有助于表征具有不同 DAR 值的 ADC 形式。然而，应该注意的是，目前没有针对 ADCs 的基于 LBA-LC–MS 的测定的监管指南。 5.ADAs 的检测 通常，针对 ADCs 引发的 ADAs 包括那些针对完整 ADCs、连接子、有效载荷和未结合抗体的。应对针对 ADC 的所有 ADAs 进行适当的检测。通常，在 ADA 测定中使用整个 ADC 分子，以识别针对完整 ADC 的任何组分的 ADAs 的特异性。 5.1.测定平台 5.1.1.LBA 平台 目前，桥接配体结合测定（Bridging LBA）是免疫原性测试中最常用的格式，其中使用生物素化药物用于捕获 ADAs，使用钌或 HRP 标记的药物甚至地高辛（DIG）标记的药物来检测桥接的 ADA–药物复合物（见图 3A）。在免疫原性测试中使用的其他测定格式包括直接和间接测定格式。直接测定格式涉及使用药物或生物素化药物捕获 ADAs，并使用抗 IgG 物种特异性抗体来检测 ADAs。间接测定格式涉及使用药物特异性 mAb 捕获 ADA 结合和未结合药物，并使用抗 IgG 物种特异性抗体来检测 ADAs（药物必须不含测试物种 Ig Fc）。 图 3. 用于总 ADA 检测的桥接测定格式，以及用于领域特异性测试的两种测定格式，即表位竞争方法和表位检测方法。(A) 显示了用于检测针对 ADC 不同部分表位的 ADAs 的典型桥接格式；(B) 显示了用于检测与 ADC 抗体部分反应的 ADAs 的表位竞争方法，该方法基于与图 (A) 所示测定信号相比获得的抑制信号；(C) 显示了用于检测与 ADC 抗体部分反应的 ADAs 的表位检测方法，该方法基于获得的特定结合信号。 通常采用分层测定策略来筛选、确认和滴定样本中的 ADA 水平。基于来自相对大量人群（非临床研究 n ≥ 30，临床研究 n ≥ 50）的药物未接触者的响应信号，统计学上建立筛选测定的截止点，并用于确定筛选阳性样本（95% 置信水平）。然后，这些筛选阳性样本经过确认性测定，其中使用竞争格式来确认药物特异性（99% 置信水平）。此后，确认阳性样本通过滴定测定进一步分析。根据彻底的风险评估，确认阳性样本可以进一步表征特定领域特异性，并且在开发后期，中和抗体（NAb）测定可能用于进一步评估 ADAs 的影响。 用于领域特异性测试的两种方法，即表位竞争方法和表位检测方法（见图 3）。表位竞争方法能够识别与 ADC 中的连接子/小分子药物的反应性（见图 3B），而表位检测方法对多克隆抗体反应的次要成分敏感（见图 3C）。例如，Hoofring 等人证明，使用替代对照，只有表位检测方法才能检测到次要的抗连接子/毒素或抗 mAb ADA。 已经使用了两种测定格式来测量 NAb 活性，基于细胞的生物测定和非基于细胞的竞争性 LBA。选择适当的测定格式应反映治疗作用机制（MoA）。由于 ADCs 的 MoA，基于细胞的 NAb 测定是监管机构首选的方法，用于检测 NAbs 的存在。这些测定使用细胞反应作为测定终点，以检测 NAb 介导的 ADC 生物功能的抑制，并且被认为比 LBA 更反映体内情况。如果由于细胞对基质或药物干扰的敏感性，或相关 MoA 根本不涉及细胞，因此无法成功开发可靠的基于细胞的测定，则认为使用 LBA 是适当的。 为了简化非临床研究中的 ADA 测定开发，已经使用了通用 ADA ELISA 来测量小鼠和猕猴研究中人源化抗体治疗药物的免疫原性。这些测定使用抗人恒定区域抗体来捕获药物，并使用抗小鼠或抗猕猴 IgG 物种特异性抗体来检测药物-ADA 复合物。 还为三种动物物种的非临床研究开发了通用 ADA 电化学发光（ECL）免疫测定：小鼠、大鼠和猕猴。这些测定的格式是在碳表面板上包被治疗药物以捕获 ADA，然后使用物种特异性抗体进行检测。 5.1.2.LBA-LC-MS/MS 平台 直接 LBA-LC-MS/MS 测定格式 在直接 LBA-LC-MS/MS 测定格式中（见图 4），ADA 样本首先与生物素化药物预孵化以形成生物素化药物-ADA 复合物，然后被链霉亲和素磁珠捕获。随后，非药物特异性蛋白通过缓冲液洗涤从珠子上去除。结合的 ADAs 通过 pH 2-3 的酸性缓冲液洗脱，然后中和至 pH 8。之后，洗脱的抗体经历 DTT 还原，碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶消化以获得 ADA 胰蛋白酶肽段。来自 ADAs 的特征肽段被色谱分离，然后在特定的选择反应监测（SRM）模式下通过测量每个特征肽段进行检测。重要的是，校准曲线样本是用纯化的 Ig 类型或亚类（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgD、IgA1 和/或 IgA2）在洗脱/中和缓冲液混合物中准备的，然后除了亲和捕获过程外，经过与未知样本相同的样本处理步骤。每个特定 SRM 的签名肽段的 LC-MS 响应与相应完整 Ig 类型浓度成比例，签名肽段与内标的色谱峰面积比用于定量。未知样本中每种 Ig 类型的浓度通过使用建立的校准曲线从其签名肽段响应反算。值得一提的是，洗脱步骤使用酸性缓冲液（pH 3）执行，因为它不会破坏生物素/链霉亲和素相互作用，并且对检测的贡献最小。 图 4. 用于 ADA 检测的直接和间接 LBA-LC-MS/MS 测定格式。(A) 显示了用于检测 ADAs 的直接 LBA-LC-MS/MS 测定格式，其中样本与生物素化药物预孵化以形成生物素化药物-ADA 复合物，然后被链霉亲和素磁珠捕获。随后，非药物特异性蛋白通过洗涤从珠子上去除。结合的 ADAs 通过酸性缓冲液洗脱，随后中和。之后，洗脱的抗体经过还原、烷基化，并用胰蛋白酶消化以获得 ADA 胰蛋白酶肽段。来自 ADAs 的特征肽段被色谱分离，然后在特定的选择反应监测（SRM）模式下通过测量每个特征肽段进行检测；(B) 显示了用于检测 ADAs 的间接 LBA-LC-MS/MS 测定格式，其中将过量药物加入血清样本以饱和 ADA 结合位点，随后使用固定在磁珠上的小鼠抗药物单克隆抗体捕获 ADA-药物复合物。之后，直接通过 ADA 的特征肽段测量 ADAs。 间接 LBA-LC-MS/MS 测定格式 对于间接 LBA-LC-MS/MS 测定格式（见图 4），将过量药物加入血清样本以饱和 ADA 结合位点，随后使用针对药物的小鼠单克隆抗体捕获 ADA-药物复合物。之后，使用针对每种亚型/亚类的通用肽段测量结合的 ADAs 。目前，基于免疫原性测试的 LBA-LC–MS/MS 被视为具有可接受的特异性、足够的药物耐受性和多重检测 ADA 分型能力的半定量测定。由于 LBA-LC–MS/MS 测定提供了样本中 ADA 同种型的相对浓度，因此不需要分层方法。 6.基于 LBA 与基于 LBA-LC-MS/MS 的 ADA 测定 LBA 更常用于检测血浆和血清中的 ADA，但通常受基质影响。无论使用何种格式，LBA 的测定灵敏度都优于基于 LBA-LC-MS/MS 的测定。基于 LBA-LC-MS/MS 的测定是 LBA 的补充，能够提供相对 ADA 水平和同种型信息。LBA-LC–MS/MS 测定可以克服 LBA 难以轻易克服的一些独特挑战，并作为 ADA 阳性样本的确证性测试。直接从 ADA 分子中检测独特的签名肽段可以提高测定的特异性，这可能解决了一些 LBA 的限制。在直接测定格式中，使用高浓度的生物素化药物进行免疫捕获，结合捕获和检测时不受双价结合的独立性，减少了药物和药物靶标的干扰。然而，间接测定格式的免疫捕获效率仍可能受到样本中药物的干扰。值得注意的是，当前的免疫原性测试指南基于 LBA，而没有针对基于 LBA-LC–MS/MS 平台的 ADA 测定的指南。此外，PK 测定中看到的一些其他特征可能也存在于 ADA 测定中（见基于 LBA 与 LC-MS 的 PK 测定部分）。 7.影响测定性能的因素  7.1.PK 测定  7.1.1.DAR  药物给药后，由于解结合或生物转化，体内的 DAR 随时间变化。因此，定量测定中使用的 ADC 标准品可能与体内研究样本中的 ADC 混合物不完全相同，特别是在后期 PK 时间点。如果测定 TAb 和 ADC 的抗体受到 DAR 的影响，那么 TAb 和 ADC 的浓度可能无法代表分析物的真实浓度，从而影响研究数据的解释。 Kaur 等人报告了一项关于抗 STEAP1 ADC 的 LBA 表征的案例研究。该测定使用抗药物 mAb 进行捕获，使用生物素标记的抗 CDR mAb 和链霉亲和素-HRP 进行检测。研究表明，ADC ELISA 没有测量 DAR1。因此，如果样本中存在相对丰度较高的 DAR1，可能会严重低估样本中的 ADC 浓度。Stephan 等人的另一份报告表明，具有不同 DAR 值的 ADC 结合物在总抗体和结合抗体测定中表现不同。因此，无论测定平台如何，都应评估 TAb 和 ADC 测定对体内预期的所有 DAR 的性能。为了防止这种现象发生，应建立对各种 DAR 成分的 ADC 测量均等的 DAR 不敏感测定，从而使测定不会偏向 ADC 的不同 DAR 值。 我们曾经为一种靶向 HER2 的 ADC 配置了一种总抗体测定，该 ADC 特异性地结合了 eribulin（DAR = 4）。最初，该测定使用 HER2 作为捕获试剂，使用 HRP 标记的山羊抗人 IgG 作为检测试剂。然后，该测定被用来分析未结合抗体和 TAb。如图 5A 所示，在不同浓度下，未结合抗体的特异性结合信号水平普遍高于 TAb，表明 ADC 上的毒素分子可能对标记抗体的结合造成空间位阻。我们随后将 HRP 标记的检测试剂替换为抗 Fc 的单克隆抗体，修改后的测定对 TAb 和未结合抗体都表现良好，表明结合到抗体的小毒素不影响标记的单克隆抗体与 ADC 的结合（见图 5B）。因此，选择了后者测定进行验证和随后的样本生物分析。 图 5. DAR 对 TAb 测定的影响。一个 TAb 测定配置了目标抗原用于捕获和 HRP 标记的多克隆抗体用于检测，但该测定给出的未结合药物抗体的结合信号高于 TAb（见 (A)。另一个 TAb 测定配置了相同的目标抗原用于捕获，但使用 HRP 标记的抗 Fc 单克隆抗体进行检测，该测定给出的未结合药物抗体和 TAb 的结合信号几乎相同（见 (B)。蓝线代表未结合药物的抗体，即裸抗体，红线代表 TAb。 7.1.2. ADA ADA 反应原则上是一种多克隆反应，针对不同的表位，具有多样化的 ADA 浓度和亲和力以及不同的抗体同种型和亚型。ADA 可分为两类，即中和性和结合性 ADA。中和性 ADA 结合到 ADC 的抗体部分的活性位点，而结合性 ADA 结合到 ADC 的其他部分。结合性和中和性 ADA 都有可能影响 PK 测定。中和性 ADA 可能破坏目标抗原或抗独特型抗体的捕获或结合效率，导致 ADCs 的浓度被低估。结合性 ADA 可能与标记的检测试剂竞争，结合到 ADC 上相同的表位，导致响应信号减少。此外，由于相关表位在线性或构象上与目标结合位点非常接近，结合性 ADA 也可能影响目标抗原或抗独特型抗体的捕获或结合效率。 7.1.3. 可溶性靶标或靶标外细胞域 当使用目标抗原或抗独特型抗体在 PK 测定中富集或结合 ADC 时，应评估可溶性靶标的干扰。PK 测定检测的是 ADC 的完整形式。如果可溶性靶标有足够的量，它可以与 ADC 结合，这可能破坏固定化抗原或抗独特型抗体的捕获或结合效率，导致 ADCs 的浓度被低估。 7.1.4. 样本准备 在基于 LC-MS/MS 的方法中，样本准备和电荷状态可以影响分析物的定量。由于典型的细胞毒素具有很高的疏水性，通常使用 LLE 和 SPE 进行提取。重要的是，应避免与样本准备相关的有效载荷解结合。例如，为了避免解结合，应调整 pH 值以适应酸敏感的连接子，如酸可裂解的水合肼连接子和基于苄基碳酸酯的连接子；可能需要添加蛋白酶抑制剂以避免样本中存在的蛋白酶引起的连接子裂解，并且最好在冰水浴中进行样本提取以最小化解结合。此外，美登素类有效载荷的反应性巯基可能与基质中其他含巯基的分子发生二硫交换，导致释放后形成二聚体。因此，在对这类有效载荷进行 LC-MS 分析之前，通常进行巯基的还原和衍生化。 7.2. ADA 测定 7.2.1. 药物靶标 有必要识别和减轻由可溶性药物靶标存在引起的干扰。当药物靶标在血液中浓度足够高时，可能会干扰 ADA 和 NAb 测定的性能，导致 ADA 和 NAb 测定结果出现假阳性或在某些情况下出现假阴性。相关的减轻方法包括使用抗靶标抗体、可溶性受体版本、靶标结合蛋白、凝集素和固定相去除靶标。例如，Wang 等人使用多克隆抗可溶性 B 细胞成熟抗原（sBCMA）抗体作为清除剂，以耗尽浓度是多发性骨髓瘤患者群体中观察到的这种肿瘤相关抗原中位水平四倍的 sBCMA，从而减轻了相关功能性测定中 sBCMA 的干扰，用于检测针对 BCMA-CD3 双特异性抗体的中和抗体。另一个例子是，Dengler 等人通过使用特异性抗体来克服先前检查点抑制剂对免疫原性测定的干扰，这些抗体针对 pembrolizumab 或 nivolumab。 7.2.2. 药物 用于检测 ADA 的桥接免疫测定容易受到循环药物的干扰。在桥接测定中，药物分别用不同的标记分子（如生物素和磺标）标记，样本中存在的一些抗药物抗体将在两个标记分子之间形成桥接。当药物在血液中浓度足够高时，可以与标记药物竞争结合 ADAs，降低 ADA 测定的信号，从而导致假阴性结果。值得注意的是，基于细胞的 NAb 测定也容易受到药物干扰。 为了克服 ADA 测定中的药物干扰，已经使用了各种减轻方法，包括使用酸解离、亲和捕获洗脱（ACE）、酸解离的固相提取（SPEAD）、珠子提取和热解离（BEHD）、沉淀和酸解离（PandA）、酸解离的珠子提取（BEAD）等。酸解离和固相提取通常被纳入 ADA 测定中，以减少研究样本中发生的药物干扰，并防止低估 ADA 反应。例如，Niu 等人通过将生物素-药物提取与酸解离（BEAD）程序结合到 ECL 直接 ADA 测定中，成功克服了基质和药物干扰。开发的 ADA 测定利用两步酸解离和过量生物素-药物在磁性链霉亲和素珠子上提取总 ADA，然后通过可溶性生物素-药物进一步捕获并在 ECL 半均相直接测定格式中检测。BEAD 程序消除了血清基质和游离药物的干扰，并提高了测定的灵敏度。我们使用与猴子血清样本中吸收的多克隆抗人 IgG 共轭的 Sepharose 珠子从单剂量 PK 研究中收集的猴子血清样本中去除游离药物，并发现 ADA 可以在给药后第 8 天早期检测到，而且，获得了更多 ADA 阳性样本和更高滴度结果（见图 6）。 图 6. 通过去除样本中的游离药物减轻药物对桥接测定的干扰。 (A) 显示在不同时间收集的动物（猕猴）样本中药物的浓度；(B) 显示使用 ADA 筛选测定确定的每个样本的信噪比，无论是在有样本预处理步骤的情况下还是在没有样本预处理步骤的情况下。去除样本中的游离药物后，可以更早地检测到 ADA 阳性动物，并具有更高的 ADA 滴度。 7.2.3. 关键试剂的修饰 ADA 方法需要将 ADC 与标签结合以进行捕获和/或检测，这可能对 ADC 有问题，因为标记修饰可能会改变其免疫反应性。ADC 的抗体部分已经进行了一轮（或更多）与小分子药物的结合。如果结合和标记化学都利用赖氨酸残基的氨基，那么双重标记的 ADC 试剂的净正电荷可能会减少。结果，这些试剂的溶解度可能与亲本 mAb 不同，当额外的标签是疏水性的生物素分子或磺标分子时。此外，ADC 的稳定性可能会随着标记修饰而改变。最后，CDRs 内的结合位点可能被修饰，关键试剂检测针对修饰区域的 ADA 的能力可能因高标记水平而受到损害。因此，需要仔细设计测定和选择测定平台及关键试剂，以优化对 ADC 所有组分的 ADAs 的检测。 7.2.4. 预先存在的抗体 当预先存在的抗体存在时，可以使用替代定性筛选测定方法来评估 ADA 的数量和质量。在预先存在的抗体存在的情况下，如果抗体的滴度在暴露于 ADC 后增加，那么可以将其报告为治疗增强型，以区分它们与治疗诱导的抗体滴度。例如，增强型 ADA 反应可以定义为比预处理滴度高两个稀释步骤的滴度，当使用二倍稀释来确定滴度时。 7.2.5. 类风湿因子（RF） RF 通常是一种 IgM 抗体，可以结合 IgG 的 Fc 区域，从而在两个标记的 ADC 分子之间形成桥接并产生假阳性反应。然而，可以通过在结合缓冲液中添加阿斯巴甜或 Asp-Phe 或其酰胺衍生物和 CaCl2 来减轻 RF 干扰。添加的阿斯巴甜结合到人类 IgG 抗体的 Fc 上，这将抑制 RF 与 Fc 的反应性。此外，在临床环境中，可以开发一种针对 ADCs 非 Fc 区域而非完整 ADCs 的测定，以绕过 RF 干扰。 8.结论  ADCs 通常是复杂且结构异质的混合物，通常包含由体内不断解离和生物转化产生众多产品相关形式。与此同时，有多种分析平台可用，其中一种由 LBA、LC-MS、LBA-LC-MS 和 HRMS 组成的综合平台对更好地理解 ADCs 的药代动力学、代谢和生物分布特别有用。迄今为止，在药物开发的早期阶段、非临床和临床研究中，已经采用了多种生物分析策略来构建 PK 和 ADA 测定。然而，目前蛋白质水平的富集仅在血浆和血清中表现良好，而不是组织，这限制了生物分析方法仅适用于血浆和血清基质。此外，选择分析的产品相关形式应反映研究目的，相应地，根据它们的分子属性量身定制的生物分析策略以及相应开发的分析方法应能够测量所选的分析物。此外，为每种 ADC 形式采用的生物分析策略应主要基于以下基础，即可用的测定平台、关键试剂、生物基质、研究性质以及测定应用的药物开发阶段。值得注意的是，目前尚无针对基于 LBA-LC–MS/MS 的 PK 和 ADA 测定的监管指南；然而，在此平台上开发的任何测定在受监管的研究中的应用需要在应用前进行验证。最后，随着技术的发展，未来的 ADCs 可能会使用双特异性抗体、双重有效载荷和免疫刺激有效载荷。因此，预计会开发新的分析策略来应对新形式带来的新兴挑战。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。