Hutchinson-Gilford progeria syndrome

*仅供医学专业人士阅读参考 1961年，科学家首次描述了细胞衰老（senescence）的概念，这一机制在癌症、衰老和多种年龄相关疾病中起着至关重要的作用。此前的一些研究发现，通过遗传学或者药理学方法，消除以p16Ink4a（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白）为标志物的衰老细胞，可以延长早衰小鼠的寿命，减轻衰老小鼠的年龄相关表型，改善多种年龄相关疾病。 然而，也有研究显示，完全清除衰老细胞并不是最佳策略，这些衰老细胞中可能仍有部分具有正常的生理功能性。因此，了解不同衰老细胞的病理生理作用，靶向性清除特定类型的衰老细胞，可能是更好的策略。 为此，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的周斌研究员带领研究团队在《细胞》杂志上发表了最新研究成果[1]，他们开发了一个包含三种p16Ink4a相关交叉遗传系统的体内遗传学工具集，可以追踪、消融和调控p16Ink4a+细胞。 以肝损伤和修复为例，研究人员发现，巨噬细胞和内皮细胞代表了不同的衰老细胞类型，清除p16Ink4a+巨噬细胞能够减轻肝细胞损伤，而清除p16Ink4a+内皮细胞则加重了肝损伤，另外，重编程p16Ink4a+内皮细胞显著减少了肝纤维化。这表明了p16Ink4a+衰老细胞的功能多样性，为未来开发细胞类型特异性的衰老细胞清除疗法提供了基础。 为了在单细胞水平上鉴定表达p16Ink4a的细胞类型，研究人员首先创建了一种新的荧光报告基因系p16-tdT，并分离小鼠胚胎成纤维细胞进行重复传代，诱导细胞衰老。随着细胞传代次数增加，表达tdT的细胞比例显著增加。与第二代相比，第六代和第七代细胞的p16蛋白水平也显著增加，这些细胞同样表达tdT，意味着p16-tdT能够反映p16的表达情况。 在老年小鼠中，p16Ink4a+细胞在不同器官中的身份是多样化的，例如大脑中的p16Ink4a+细胞主要是皮层神经元，而胰腺中是各种胰岛内分泌细胞，这些细胞有明显更强的衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性、更弱的增殖能力和更高的衰老相关分泌表型（SASP）因子表达，证实了它们的衰老细胞性质。 不同器官中主要的衰老细胞类型 肝纤维化是肌成纤维细胞活化的结果，细胞衰老与肝纤维化具有因果关联。在诱导肝纤维化的小鼠中，研究人员也观察到了部分位置的tdT富集，与SA-β-Gal相一致。在肝脏不同类型的细胞中，成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞的一组呈p16Ink4a+，由于衰老成纤维细胞与肝损伤和疾病的研究已经相当深入，研究人员决定把目光放在内皮细胞与巨噬细胞上。 为了检测不同类型的p16Ink4a+细胞在肝损伤和修复中的最终命运，研究人员开发了一个名为衰老细胞脉冲追踪示踪器（Sn-pTracer）的遗传系统。 对巨噬细胞和内皮细胞的追踪显示，肝损伤后，p16Ink4a+巨噬细胞显著增加，但在修复后大量凋亡，而p16Ink4a+内皮细胞在损伤后增加的同时，在修复阶段也有大量存活，表明细胞衰老可能是一种细胞周期停滞的暂时形式，根据细胞类型决定是否可逆。 在接下来的实验中，由于Sn-pTracer需要对小鼠进行频繁的处理，并且可能对小鼠有害，研究人员进行了优化，开发了衰老细胞Cre诱导示踪器（Sn-cTracer），使用白喉毒素处理小鼠，相比对照组的磷酸缓冲液，显著减少了p16Ink4a+巨噬细胞，同时，小鼠的肝纤维化面积显著缩小，纤维化标志物PDGFRα、PDGFRβ和肌间线蛋白水平也显著下降。 纤维化标志物水平下降（M）和肝纤维化减轻（N） 研究人员使用同样的方法对p16Ink4a+内皮细胞进行了检测，内皮细胞减少后，小鼠的肝纤维化恶化，PDGFRα、PDGFRβ和肌间线蛋白水平也有相应的增加。也就是说，p16Ink4a+内皮细胞在功能上是限制肝损伤和纤维化的，p16Ink4a+巨噬细胞则刚好相反。 消除p16Ink4a+巨噬细胞后，小鼠肝纤维化的免疫微环境发生变化，包括T细胞活化、增殖、分化和参与免疫反应的淋巴细胞活化增强，流式细胞术也观察到T细胞和NK细胞的比例显著增加，它们在肝纤维化的限制和消退中起重要作用，因此，特异性消除p16Ink4a+巨噬细胞可能通过促进T细胞的生长和活化限制了肝纤维化。 肝纤维化免疫微环境中T细胞和淋巴细胞变化 相反，消除p16Ink4a+内皮细胞后，小鼠肝纤维化的免疫微环境向促纤维化的方向发生了转变。 通过RNA测序，研究人员还发现，p16Ink4a+内皮细胞中Kdr的表达显著下降，Kdr是血管再生和肝脏修复过程中VEGF信号通路的关键受体。鉴于VEGF信号的激活可以改善内皮细胞功能和肝脏的年龄相关变化，研究人员又设计了可以特异性地调控p16Ink4a+细胞中基因表达的衰老细胞基因操作示踪器（Sn-gTracer）。 利用Sn-gTracer过表达Kdr使得p16Ink4a+内皮细胞重编程后，小鼠的肝纤维化得到了显著改善。 综上所述，不同类型的衰老细胞在器官和组织中具有不同的功能，基于细胞类型的特异性衰老细胞清除可能才是改善年龄相关疾病的关键所在，为衰老细胞清除疗法提供了新的研究工具和研究方向。 参考文献： [1] https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01069-9 本文作者 | 应雨妍

IND2025主会场授课已被预定，大会第一天下午茶歇前授课时间段预定开始，咨询热线：177 0186 0390。点击图片，查看IND2024会后报告 文章来源：柯瑞斯·IVD 摘  要  结核病作为世界上最致命的传染病之一,是全球性危害公众健康的公共卫生问题。我国是结核病高负担国家,发病人数仅次于印度,结核病防控形势依然严峻,所以早期迅速、准确诊断是防治结核病的关键。近年来,为更好控制、诊断结核病,国内外已开展多项研究并取得了一定的创新结果。因此,本研究将从细菌学、免疫学、分子生物学的相关检测及结核病组学研究等方面总结结核病实验室诊断的现状与进展,并作如下综述。 结核病(tuberculosis，TB)是一种传染性疾病，由结核分枝杆菌（MTB）引起，多通过空气进行传播，常见症状为咳嗽、发热、盗汗、体重减轻等。结核病感染人数约占全球的1/4，每天约4 000人死于该病，近30 000人感染可预防、治愈的结核病[1]。据世界卫生组织（WHO）统计2021年约有1 060万人患结核病，患病人数与2020年相比增加4.5%，其中160万人死于结核病[包括18.7万人类免疫性缺陷病毒（简称HIV）阳性者][2]。结核病实验室诊断是发现传染源的主要方法，但传统检测方法周期长、灵敏度低，无法满足临床需求。因此联合运用新的辅助诊断方法，对全球结核病研究和防控具有重要意义。本研究将从细菌学、免疫学、分子生物学的相关检测及结核病组学研究等方面总结结核病实验室诊断的现状与进展，并作如下综述。 1 结核病细菌学检测 目前，结核病的细菌学检测仍是诊断感染结核病的金标准。痰涂片和培养是应用最广泛的结核病实验室诊断技术, 常见方法为抗酸涂片染色法、荧光染色法、传统结核菌固体培养和全自动结核分枝杆菌培养仪快速检测。 1.1 涂片染色与荧光染色技术  萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是最经典的结核分枝杆菌检测方法，具有经济、迅速、操作简单的优点，但灵敏度较低。有研究对抗酸染色阳性病例进行分析，在收集的结核抗酸染色14 060例样本中，阳性307例，阳性率为2.18%[3]。可见此方法出现假阴性的情况较多，受主观因素和标本质量影响较大。荧光染色则运用荧光提高显微镜检查的灵敏度，但由于价格昂贵目前难以普及。 1.2 培养技术  传统固态培养法灵敏度略高于涂片法，是鉴定活菌的可靠方法，还可进一步进行菌种鉴定和药敏试验；但其培养时间长，需4~6周才能检测到菌种，且无法区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。培养仪的原理是基于液体培养法，以全自动分枝杆菌培养监测仪为（BD公司，型号：BACTEC MGIT960）代表，其通过测定液体培养基中氧气消耗量来判定 MTB有无生长。王巍等[4]比较了罗氏培养法与BACTEC MGIT960检测系统在肺结核中的应用，结果显示BACTEC MGIT960培养阳性率为67.6%，罗氏培养阳性率为53.3%，且前者检测周期明显缩短。但也存在该技术对实验室生物安全级别要求高、成本高等缺点，不能大规模普及。因此，应联合其他辅助诊断方法提高阳性检出率，在此基础上寻找细菌学证据。 2 结核病免疫学检测 免疫学检测方法包括TB抗原和抗体检测、多种抗体联合检测、结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）、γ-干扰素释放试验（interferon-γ release assays，IGRAs）、重组结核杆菌融合蛋白（ESAT6-CFP10，EC）皮肤试验等。  2.1 结核病抗原和抗体检测技术  TB 抗原包括菌体细胞、结核菌素（PPD）、脂阿拉伯甘露聚糖（LAM)、热休克蛋白65（HSP）抗原、早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6) 等。由于抗原成分复杂且存在交叉抗原，所以，目前通过技术对抗原进行表达和纯化，大量制备TB蛋白质成分以检测人体内是否存在抗体。胶体金免疫层析法检测结核病患者中特异性结核抗体免疫球蛋白（Ig）G／IgM 的灵敏度为41.15%、特异度为91.67%[5]，可见多种抗原和抗体联合检测有助于提高检测的敏感性，但仍受患者年龄、检测的抗体类型(IgG、IgM、 IgA) 、结核病感染类型等多方面因素的影响。 2.2 结核菌素皮肤试验技术  TST是实验室诊断方法之一，是基于Ⅳ型变态反应原理建立的皮肤试验，具有快速、简单、低成本的优点，但特异性较低，曾接种卡介苗(BCG)或接触非结核分枝杆菌的环境均可导致TST假阳性。 2.3 γ-干扰素释放试验技术  IGRAs原理为机体初次感染结核分枝杆菌后致敏T淋巴细胞，再次感染时γ-干扰素在内的细胞因子释放，通过检测γ-干扰素判断感染状况。刘珍敏等[6]对299名儿童研究对象进行结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）、涂片检查，与TST比较灵敏度和特异度，结果显示T-SPOT.TB灵敏度远高于TST，且标本获取方便，能快速诊断。 虽然IGRAs具有较好的诊断价值，但测试费用昂贵，对实验室设备要求较高，给结核病高负担国家带来较大压力。WHO在2022年发表的报告中指出[7]：基于特定抗原的新结核杆菌抗原皮肤试验(TBSTs)已经开始被研究，这些试验结合更简单的皮肤试验和高特异性的IGRAs，将可能成为结核感染诊断的有效工具。 2.4 EC皮肤试验技术  2021年的一项研究显示：EC皮肤试验与T-SPOT.TB试验相比，EC皮肤试验显示出较高的特异性和灵敏度，具有良好的安全性和较高的诊断准确性[8]。此外，EC皮肤试验在HIV感染者诊断中也显示出价值，无论是否接种卡介苗，EC皮肤试验对HIV感染者均有较高的诊断价值。因此，EC皮肤试验可能是一种有效的替代诊断试验，用于HIV流行率高和卡介苗接种高的环境或人群，但尚未得到系统的审查，因此还需进一步研究。 3 结核病分子生物学检测 早诊断、早隔离、早治疗能够减少肺结核发病和死亡，但MTB生长缓慢，通过传统实验室检查难以快速确诊，而分子生物学诊断可更快地进行病原检测。目前，应用分子生物学诊断结核病的方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）技术、环介导等温扩增（LAMP）技术、线性探针分析 (LPA)技术、基因芯片技术、基因组测序技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术等。 3.1 聚合酶链式反应技术  PCR通过在体外模拟体内DNA复制的过程获得大量DNA，包括变性、退火、延伸三个阶段。PCR是传统的分子生物学检测方法，成本低、方法成熟、有较好的检出率，但存在易污染、非特异性扩增、会导致假阳性等缺点。因此产生了很多改进的方法，例如即时检验（point of care testing，POCT）技术、荧光定量（real-time）PCR技术、数字PCR (digital PCR，d PCR)技术。 3.1.1即时检验技术  POCT是一种集核酸提取、检测、扩增为一体的新型结核分子诊断技术，无需在特定的分子实验室操作，该技术主要用于门诊及住院的疑似结核病患者初筛及鉴别诊断中，可在2 h内从痰液等样本中检测是否存在结核分枝杆菌复合群，能够极大提高结核病病原学阳性率，更好地服务于临床并提高诊疗水平。于佳佳等[9]首次成功建立并验证了针对MTB的PCR-CRISPR检测技术具有敏感度与特异度高、稳定性好、成本低等特点。基于CRISPR/Cas的超敏诊断技术为TB诊断提供了可能，且可能适合于POCT。 3.1.2 荧光定量PCR技术  Gene Xpert MTB/RIF检测是基于实时荧光定量PCR原理的一种检测技术，可在2 h内检测样本中是否存在结核分枝杆菌及是否耐药，是目前最快的结核病分子诊断技术之一，可以准确地排除非结核分枝杆菌，并分离鉴定出RIF抗性。该方法操作简便、检测准确性高、污染概率小，但价格昂贵、培养阴性菌量少且对HIV患者的灵敏度不够。为弥补这些不足，Gene Xpert MTB/RIF Ultra（简称Xpert Ultra）增加了两种MTB检测分子靶标(IS1081 和IS6110)以提高检测灵敏度，并且有更低的TB检测限（LOD），与Gene Xpert MTB/RIF特异性相当[10]。因此Ultra可显著提高结核病的检测率，尤其是对于低细菌性患者。对于肺外结核的诊断，一项研究显示Xpert Ultra对76例行CSF培养的结核性脑膜炎患者检测敏感度明显高于MGIT 960培养[11]。此外，Xpert Ultra在HIV阳性患者中表现出高灵敏度。Xpert Ultra 在标本含菌量少、肺外结核和艾滋病合并结核患者中的灵敏度较好。自2021年来，WHO建议将粪便与痰一起作为一种标本类型用于Xpert Ultra检测结核病的初始测定，可在紧急情况时作为首选方法[12]。对于儿童来讲，痰液难以获得，可选择粪便代替检测，但该技术特异性较低，且成本较高，还需进一步研究。 3.1.3 数字 PCR技术  dPCR是一种比荧光定量PCR具有更高灵敏度和绝对定量的微量DNA鉴定技术，是基于单分子PCR方法进行计数的核酸定量，绝对定量不受标准曲线影响，具有高灵敏度、低样本需求量低、高耐受性等特点。研究显示可使用d PCR来调查MTB的异耐受性，通过对katG和rpoB基因进行荧光定量PCR突变检测，确定结核分枝杆菌的异质性耐药率，这两种基因通常分别与异烟肼和利福平耐药有关[13]。微滴数字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）能够检测出突变株和野生型菌株，这使其成为早期诊断和管理耐药结核病的宝贵工具，同时也印证早期发现和管理耐药结核病对于控制结核病进展的重要性。数字PCR技术还未能获得大量临床研究，这也有可能是与其仪器设备和试剂昂贵有关，还需进一步研究。 3.2 环介导等温扩增技术  LAMP技术是一种新的核酸扩增方法，具有简单、快速、操作简便的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于PCR技术。其不依赖热循环设备而实现高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。但因其灵敏度高，开盖容易形成气溶胶污染，易造成假阳性。有研究将LAMP技术与传统方法（涂片镜检和MGIT 960）相比，结果显示TB-LAMP检测MTB的效能更高,且涂片镜检和TB-LAMP并联合检测肺泡灌洗液的敏感性更好[14]，这提示LAMP技术可作为诊断儿童肺结核的替代试验。对于结核性脑膜炎的诊断，LAMP技术阳性率高、耗时短，能早期获得结果[15]，表明LAMP技术对于早期诊断结核性脑膜炎具有较好的参考意义。 3.3 线性探针分析技术  LPA技术是通过应用生物素标记引物进行DNA的扩增，将扩增产物变性后与固定在尼龙膜上的特异寡核苷酸探针进行杂交，通过酶联免疫显色法显示结果，其是耐多药结核病检测方法之一。该方法具有较高的灵敏度和特异度，且检测速度快。利用该技术的仪器比较有代表性的为INNO-LiPA Rif.TB和MTBDRplus。2008年WHO批准使用一线探针法基因型MTBDRplus v1.0，用于快速检测耐多药结核病(MDR-TB)；2011年，新版本的LPA技术出现基因型MTBDRplus v2.0 [16]。二线结核病药物耐药性基因（基因型MTBDRsL v2.0）2015年出现，用于检测与氟喹诺酮(FQs)和二线注射药物(SLDIs)耐药性相关的突变，Singh等[17]研究表明基因型MTBDRsL v2.0检测FQ和SLIDs的特异性分别为92.31%和100.00%，灵敏度为100.00%。MTBDRsL是目前可检测广泛耐药结核的分子诊断技术，但是该方法的成本较高，仍是耐多药结核病高负担国家的问题之一。 3.4 基因芯片技术  基因芯片又称DNA芯片，测序原理为杂交测序法，通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定，得出一组序列完全互补的探针序列，进而重组出靶核酸的序列。该方法将多种探针固定在支持物上，可一次性对样品大量序列进行检测和分析，具有自动化程度高、操作序列多、检测效率高的优点，可用于菌种的鉴定及耐药性检测。2018年，有研究证明生物芯片技术对RIF和INH耐药及耐多药结核病检测具有良好的敏感度和特异度，值得在我国临床推广[18]。其中生物芯片对RIF检测的敏感度为86.08%，特异度为97.7%；对INH耐药的敏感度为79.36%，特异度为98.71%，对MDR-TB检测的敏感度为78.01%，特异度为98.86%。此外，对于涂阳肺结核患者MTB菌种鉴定，基因芯片法对结核分枝杆菌复合群鉴定符合度为100.00%，可较好的鉴定结核分枝杆菌菌种，并与常规菌培养结果具有高度一致性[19]。相较于痰涂片、痰培养方法，基因芯片技术可提高阳性检出率，但是基因芯片仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、重复性差、分析泛围较狭窄等，还需进一步研究。 3.5 基因组测序技术  基因测序是一种新型基因检测技术，主要测序原理是循环微阵列法。其可以预测多种疾病，是将提纯化后的基因组核酸使用高通量测序仪进行测序，获取细菌基因组DNA序列。靶向二代测序（TNGS）可应用于结核分枝杆菌复合体耐药性相关基因突变中，识别耐药性[20]，以粪便为标本并为难以提供呼吸道标本的肺结核患者提供了获得关键诊断信息的机会。宏基因组二代测序（mNGS）由于其全面性，被认为是可能取代传统方法的微生物学方法，是一种很有前途的传染病检测技术，m NGS诊断结核病经meta分析的灵敏度和特异度分别为70%和99%[21]。全基因组测序（WGS）可获得详细的细菌全基因序列,分析耐药基因突变从而预测其耐药表型。WGS可以是结核病耐药监测和确定治疗方案的一种重要方法，虽有明显优势，但是由于操作繁琐且价格高昂，仅在发达国家及低负担结核病国家开展。 3.6 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术  MALDI-TOF MS是近年发展起来的一种质谱技术，已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物及多种合成聚合物的强有力工具。其主要对微生物的核糖体蛋白组进行分析，形成不同的指纹图谱，与数据库中已知菌种的鉴定谱图进行统计学聚类分析，获得未知样本的鉴定结果。该方法具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，且可大量检测。MALDI-TOF MS诊断肺结核涂阴或无痰肺结核敏感度为68.5%[22]，优于其他方法，有较好的应用前景。与基因芯片相比，MALDI-TOF MS分析时间短、简单、快速、成本低且可以区分结核分枝菌与非结核分枝菌。此外，MALDI-TOF MS也可用于结核分枝杆菌耐药性评估。MALDI-TOF MS技术在MTB药敏检测中表现出良好的灵敏度和特异度，但其无法鉴定不能被培养的细菌，只能鉴定培养阳性的细菌，可以作为临床判断的补充。 4 结核病组学相关研究进展 近年来，结核病组学研究发展迅速，其较高的特异度及灵敏度为进一步快速诊断结核病、区分潜伏性肺结核（LTBI）与活动性肺结核（ATB）提供强有力的支持，为深入了解结核病的发病机制、耐药机制及寻找新的治疗靶点提供了重要的帮助，具有较好的临床应用前景。在结核病的组学研究中，基因组学研究是最早开展的领域之一，通过使用高通量DNA测序和生物信息学来分析整个基因组的功能和结构。在1998年首次对结核分枝杆菌H37Rv菌株进行了全基因组测序，结果显示基因表达产物中40％蛋白质有精确的功能[23]。如今随着技术不断发展，现在已经有许多改良的新方法，前文已详细表述过，现不作过多叙述。 4.1 基于转录组学的生物标志物  转录组学是从RNA水平筛选结核相关的特异性差异表达基因，从而确定生物标志物，可有效预测结核病进展。研究筛选出的3个转录标志(FCGR1A、ZNF296和C1QB)可区分ATB和LTBI[24]，其中AUC为97.3%，为结核病患者靶向治疗提供可能。此外对于耐药检测具有重要意义，2021年的一项研究显示7个基因(TRIM1、9、21、32、33、56、66)能够区分利福平耐药菌株的感染，为RR-TB的发病机制提供了新的实验基础[25]。 4.2 基于蛋白组学的生物标志物  蛋白组学通过分析正常与病理个体之间蛋白质组的差异，为疾病找到新的诊断途径，设计新的治疗靶点，利用蛋白组学筛选结核病生物标志物提高结核病诊断准确性。结核病相关蛋白质可作为潜在的诊断标志物用于区分 LTBI 和ATB。贺仁忠等[26]筛选出8个蛋白标志物，其中Ｒv1441c、Ｒ0494可作为鉴别LTBI和ATB的候选标志物。Yang等[27]筛选出8个蛋白生物标志物（I-TAC、I-309、MIG、颗粒溶素、FAP、MEP1B、弗林蛋白酶和LYVE-1），在区分结核和非结核的验证队列中AUC为0.915，特异度为84%，敏感度为75%。2021年对161名参与者痰液进行分析，发现a-1-酸性糖蛋白两种亚型（即：ORM1和ORM2）在TB抗原检测时显著增加，可能成为肺结核显著的生物标志物[28]。 4.3 基于代谢组学的生物标志物  代谢组学是研究生物系统在特定条件下的整体代谢水平，可揭示结核病发病和耐药过程中代谢产物的变化，从而发现新的治疗靶点。2022一项研究通过GC-MS和LC-MS/MS分析研究结核分枝杆菌感染对血清代谢组的影响，发现了7种代谢物在区分肺结核患者与健康组时表现出较好的性能，可能成为新的生物标志物[29]。Berney等[30]利用代谢组学技术研究发现，宿主体内S-腺苷甲硫氨酸和蛋氨酸的消耗可导致MTB无法增殖和死亡，因此为开发有效的抗结核化疗提供了极好的靶点，但作用机制未完全清楚。代谢组学研究目前比较少，因此可以通过多组学联合分析，更全面地了解结核病菌在感染过程中的作用机制，从而发现更多的治疗靶点。 5 小结 综上，当前结核病的实验室诊断方法种类非常多，从传统的试验方法到现在的测序等，有着全方位的研究和探索。各种方法原理上有较大差异，在结核病诊断中需要综合运用多种技术和手段，包括痰液检测、血液检测、免疫学诊断和分子生物学诊断等。临床需根据各种诊断方法的优缺点选择最佳方法，而诊断技术也需不断发展和完善，找到一个具有高灵敏度、高特异度、更加可靠的方法。对于儿童、免疫功能低下等患者，目前诊断及治疗还需进一步研究。 本文引用来源：王泽锦,胡素侠,戚应杰.结核病实验室诊断方法的现状与进展[J].大医生,2024,9(02). END 免责声明：本文仅作知识交流与分享及科普目的，不涉及商业宣传，不作为相关医疗指导或用药建议。文章如有侵权请联系删除。 TDS2025检测自动化建设与应用论坛主会场，大会第一天下午茶歇前授课时间段预定开始，咨询热线：177 0186 0390。点击图片，查看TDS2024会后报告。

近期，英汐智能的研究人员回顾了对 MAT2A 靶点的最新研究进展，重点关注其在 TME 中代谢依赖和基因表达调节中的作用，进一步概述了 MAT2A 抑制剂的当前状况。 1. MAT2A 细胞转录和代谢调节功能 MAT2A 催化 MET（蛋氨酸） 和腺苷合成S -腺苷甲硫氨酸 (SAM)，这是蛋氨酸循环中的限速步骤（图 1）。因此，MAT2A 控制 MET 和 SAM 的细胞水平，这两个细胞代谢和稳态的关键效应器。MET 是一种从食物、肠道微生物和自噬中获得的必需氨基酸，它在蛋氨酸循环中被分解代谢和回收。MET 主要作为生长和发育所需的蛋白质合成的引发分子。相反，SAM 是通过甲基化对 DNA、RNA、蛋白质和代谢物进行通用翻译后修饰的主要甲基供体。MET 代谢以及 MET 和 SAM 的细胞平衡受到从 MET 循环中间体延伸出来的多种途径的复杂调节（图 1）。例如，从 SAM 生产多胺时会产生副产物甲硫腺苷 (MTA)。在 MET 回收途径中，MTA 通过 MTAP 以回收 MET，也称为 MTA 循环。相比之下，转硫途径（在此过程中 MET 的硫转移至丝氨酸以生成半胱氨酸和谷胱甘肽）对于控制细胞氧化还原平衡至关重要。此外，通过叶酸循环，MET 平衡还与一碳 (1C) 代谢相关，将 1C 单位整合到一系列重要的细胞过程中，包括嘌呤和嘧啶的生物合成，从而提供了细胞增殖。因此，MAT2A 催化活性的微妙调节对于维持细胞稳态至关重要。 图1. 蛋氨酸（MET）和一碳代谢循环 2. MAT2A 本身的致癌特性 通过控制通用甲基供体 SAM 和 MET 代谢物库的水平，MAT2A 在致癌的转录和代谢谱中发挥着关键作用。MAT2A 的失调不仅会导致异常的翻译后甲基化模式，从而影响基因表达和基因组稳定性，还会扰乱 MET 代谢，从而导致代谢变化，从而驱动恶性转化。 最早报道的 MAT2A 诱导增殖优势的联系之一是在肝癌中发现的，其中从肝脏特异性 MAT1A 到肝外 MAT2A 表达的转变以及 SAM:SAH 比率和 DNA 甲基化谱的变化被确定为驱动癌细胞生长。多组学分析发现，MAT2A 介导的 MTA 和 SAM 水平升高与肝细胞癌 (HCC) 中的 T 细胞功能障碍和耗竭密切相关。作者表明，MAT2A 缺失可抑制小鼠的 T 细胞功能障碍和 HCC 生长，证明通过 MAT2A 抑制重新编程肿瘤 MET 代谢是改善 HCC 免疫力的一种可能的治疗策略（图 2）。 在白血病和结直肠癌细胞中证实了 MAT2A 驱动的过度增殖。在结直肠癌中，多胺生物合成的增加被证明可以反式激活MAT2A表达并促进肿瘤生长。 在胃癌中，MAT2A 水平升高导致 MET 循环活性增加，通过 RIP1 启动子区域的表观遗传修饰调节肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的表型。MAT2A 介导的 RIP1 启动子的 H3K4me3 修饰诱导促肿瘤 M2 TAM 极化，从而促进肿瘤进展。在宫颈癌中，MAT2A 介导的 AMPK 介导的程序性细胞死亡蛋白 6 (PDCD6) 的稳定性促进了葡萄糖剥夺下的肿瘤发生。高水平的 MAT2A 表达与乳腺癌的较差生存率相关，并且 MAT2A 细胞质定位的增加与侵袭性增加相关。MAT2A 还被发现驱动表观遗传调节，导致侵袭性高级别神经胶质瘤的 MET 代谢依赖性和白血病的致病性转化。此外，还发现肿瘤起始细胞在 MAT2A 表达和酶活性上调的驱动下具有高度升高的 MET 循环活性。 相比之下，MAT2A 表达在肾细胞癌 (RCC) 细胞系和肿瘤中下调，并且 MAT2A 在 RCC 中充当肿瘤抑制因子。这一观察结果可归因于 RCC 亚型高度不同的代谢特征以及 RCC 中 MAT2A 和血红素加氧酶 1 (HO-1) 基因表达的负相关性。HO-1 在肾细胞癌患者中通常过度表达，并促进肾癌细胞的存活。鉴于 MAT2A 可以抑制HO1表达，RCC 细胞对 HO-1 的依赖性可能超过高 MAT2A 水平的促生存刺激，从而促进其他肿瘤类型的癌变。这些观察结果表明靶向 MAT2A 可以对抗癌细胞的转录和代谢依赖。 3. MAT2A 和 MTAP 缺陷的合成致死 MTAP 在 MET 回收途径中催化 MTA 转化为 MET（图 1）。 MTAP位于染色体基因座 9p21.3 上，该基因座还包含多个重要的肿瘤抑制基因，包括CDKN2A （p16.INK4a 和 p14.ARF）和CDKN2B （p15.INK4B），编码两种共同激活 p53 的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂信号传导并负调节细胞周期进程。CDKN2A 是继 p53 之后第二个最常见的癌症失活基因，9p21.3 的缺失突变与许多癌症的不良预后相关。鉴于 MTAP 序列与CDKN2A基因座非常接近，约 15% 的实体瘤中观察到MTAP缺失，其患病率范围为胶质母细胞瘤中的 58%、胰腺癌中的 40% 和成人 T 细胞白血病中的 14%，在结直肠癌中为 2%。  图2 .在甲硫腺苷磷酸化酶 (MTAP) 缺陷的细胞中抑制MAT2A会产生一种合成致死效应 在几个独立的筛选中发现，MTAP 功能的丧失与 MAT2A 抑制具有合成致死，合成致死的原因集中在 MTAP 缺陷细胞对精氨酸甲基转移酶 5 (PRMT5) 的依赖性。PRMT5 使用 SAM 作为甲基供体，将包括组蛋白在内的一系列蛋白质中的精氨酸残基甲基化，从而调节染色质可及性和基因表达。PRMT5 活性和表达增加会促进肿瘤发生，并与不良生存结果相关。重要的是，PRMT5 活性受甲基代谢物池调节：MTA（由 MTAP 回收）和 SAM（由 MET 的 MAT2A 产生）竞争性地结合到 PRMT5 的底物结合口袋，尽管具有不同的亲和力，并且，同时SAM 是 PRMT5 辅助因子，激活 PRMT5 酶活性，MTA 抑制 PRMT5。在 MTAP 缺陷的肿瘤中，细胞内 MTA 与 SAM 竞争结合 PRMT5，从而抑制 PRMT5 活性。为了维持生存，MTAP 缺失的癌细胞依靠 MAT2A 提供 SAM 来维持 PRMT5 的持续功能。因此，MTAP 缺陷细胞容易受到 MAT2A 抑制引起的 SAM 水平降低的影响，从而在 MTAP 缺失与 MAT2A 和 PRMT5 功能之间产生综合致死性。MTAP 缺陷细胞中 MTA 的瘤内积累，加上 MAT2A 生成的 SAM 的丧失，消除了 PRMT5 活性，进而扰乱剪接，抑制 DNA 修复，并导致有丝分裂缺陷和基因组不稳定。这种合成致死效应激发了 MAT2A 和 PRMT5 抑制剂的临床开发，几种新化合物正处于治疗 MTAP 缺陷癌症的临床测试的不同阶段。 4. MAT2A 抑制剂研发进展 哺乳动物细胞表达三种 MAT 基因。MAT1A 和 MAT2A 是具有催化和调节作用的基因同源物，而 MAT2B 与 MAT1A 和 MAT2A 仅具有 7% 的氨基酸序列同一性，并稳定 MAT2A 以实现有效催化。MAT1A 主要在肝脏中表达，在肝脏代谢膳食 MET 中发挥着至关重要的作用；相比之下，MAT2A和MAT2B主要在肝外组织中表达，而MAT2A在肝脏中的表达仅限于胎儿肝脏或肝损伤或恶变后。活性 MAT2A 是一种功能性同二聚体，具有两个对称的活性位点，形成催化 SAM 形成的界面，催化需要二聚化。MAT2B 通过距活性位点约 20 Å 的 C 末端与 MAT2A 二聚体结合，形成化学计量比为：MAT2A:MAT2B= 2:1。 第一代 MAT2A 抑制剂是竞争性 MET 底物类似物，其治疗开发的效力和特异性均低于标准水平。 虽然随着 FIDAS 药物（二苯乙烯衍生物）的开发，MAT2A 抑制效力可以提高至低微摩尔浓度，但它们对 MAT2A 的选择性仍然很差。第一个 MAT2A 变构小分子抑制剂PF-9366于 2017 年报道。PF-9366 与 MAT2B 竞争 MAT2A 结合，虽然它能有效抑制细胞 SAM 的产生，但还驱动MAT2A基因和蛋白质表达的适应性上调，以补偿 MAT2A 功能抑制，因此无法抑制细胞增殖。 表 1. MAT2A 抑制剂概况 2021年，一系列吡唑-嘧啶衍生物被报道为有效的MAT2A抑制剂，占据酶的变构袋，从而抑制SAM从其活性位点释放。其中一种化合物AG-270 (S095033)显示出优异的效力和良好的药物样特性，并使 MTAP-null 癌细胞对紫杉烷类药物（通常用于治疗晚期或转移性疾病的抗肿瘤药物）敏感。此外， AG-270抑制 MAT2A 会诱导 DNA 损伤并降低 MTAP 缺陷细胞中的 DNA 修复活性，表明 MAT2A 抑制可提高针对 DNA 损伤反应的癌症药物的功效。 AG-270已进入针对 MTAP 缺失的晚期实体瘤或淋巴瘤的 I 期临床试验（NCT03435250），但该试验于 2023 年 10 月终止，可能是因为 AG-270 通过抑制 UGT1A1 增加胆红素，限制了剂量的进一步增加，这种脱靶副作用随后在SCR-7952中被消除。  另一项 I/II 期临床试验 (NCT04794699) 正在评估 MAT2A 抑制剂 IDE-397 （GSK-4362676 或 GSK-676）在对标准治疗无反应或对标准治疗无反应的晚期 MTAP 缺失实体瘤中的作用。 IDE-397治疗使一名膀胱癌患者完全缓解，另一名非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者的肿瘤缩小了 33%（数据未发表）。该试验正在进行中，预计试验完成后将对试验结果进行同行评审评估。 IDE397和 PRMT5 抑制剂 AMG193正在晚期 MTAP 缺陷肿瘤患者中进行 I/II 期评估 (NCT05975073)。AMG193 是第二代协同 PRMT5 抑制剂，针对 MTAP 缺失肿瘤中普遍存在的 MTA 结合酶。第一代PRMT5抑制剂具有SAM竞争性，并且由于靶向毒性而具有非常窄的治疗窗，这限制了它们的发展。 基于结构的药物设计已经产生了AGI-41998和AGI-43192作为 MAT2A 抑制剂，分别具有良好的脑渗透性和有效性。使用基于片段的设计优化 MAT2A 抑制剂的核心结构和取代基产生的 AZ-28作为一种有前途的新型口服生物可利用的 MAT2A 抑制剂。尽管化合物AZ-28在 HCT116 MTAP 缺陷肿瘤的小鼠异种移植模型中表现出优异的体外效力，并导致肿瘤完全停滞，但其体内功效受到高清除率的限制需要高剂量皮下给药。 正在开发的两种新颖有前景的 MAT2A 抑制剂是化合物 28 以及 INS化合物 8。该设计与PF9366 、 AG-270和AZ-28形成对比，其共晶结构表明两个对称定位的抑制剂分子占据位于 MAT2A 二聚体表面的变构袋。因此，INS化合物8是第一个用单分子占据MAT2A变构袋、抑制MAT2B结合的MAT2A抑制剂。与之前的 MAT2A 抑制剂相比，这可以显著增强 INS化合物 8的亲和力并降低有效剂量。 5. MAT2A 对衰老和肌肉萎缩的影响 鉴于 MAT2A 信号传导因其在衰老和肌肉萎缩中的作用而受到重视，MAT2A 抑制策略也可能有利于非致癌疾病适应症。Kitada 及其同事的简明总结讨论了多项临床前研究，其中减少 MET 摄入量、药理学 MAT2A 抑制和 MAT2A 信号传导缺陷延长了酵母、果蝇、蠕虫、小鼠和大鼠的寿命。在这些临床前研究中，MET 限制通过诱导自噬、硫酸氢产生和自由基抑制来减少氧化应激，部分延长了寿命和代谢健康。相比之下，增加 MET 摄入量也与高同型半胱氨酸血症、体重减轻和胆固醇水平升高有关，这表明需要在“黄金”的摄入范围内才能实现其有益效果。 最近，Rajabian 及其同事进行的一项具有里程碑意义的研究发现，MAT2A 抑制可以恢复新陈代谢并改善衰老的骨骼肌功能。尽管 MET 分解代谢与衰老相关的肌肉病理学之间的联系是已知的，但将 MET 分解代谢与成肌细胞中这些很大程度上由代谢驱动的变化联系起来的直接生物学机制仅被部分了解。报道称，MAT2A 活性增加会产生高水平的铵，从而加剧成肌细胞衰老标志物。老化的成肌细胞在急性损伤后表现出胰岛素敏感性、葡萄糖摄取和肌肉再生降低。MAT2A 抑制通过增加 Akt2 信号传导、丙酮酸激酶活性和糖酵解来逆转这种恶化，从而提高早衰小鼠模型的肌肉力量。因此，老年人类和小鼠衰老成肌细胞依赖 MET 作为替代能源，这使得 MAT2A 抑制成为逆转这种年龄诱导的代谢转变的有利策略。这项研究的局限性是使用 FIDAS 来抑制 MAT2A，MAT2A 也可能针对其他与生长相关的细胞途径（c-Myc、CyclinD1 等）。使用靶向 MAT2A 特异性抑制剂（表 1 ）转化这些发现，并将这些研究扩展到非人类灵长类动物，为人体测试提供依据，将是该研究领域下一步的重要步骤。 6. 总结 总而言之，MAT2A 是一个有前途的药物靶点，可以立即改善 MTAP 缺陷肿瘤的生存结果。随着对生物标志物和 MTAP 抑制剂的持续研究，MAT2A 抑制也可以作为一种治疗策略来探索，以对抗 MTAP 熟练细胞中的 MET 代谢依赖。此外，它也可能成为一种延长健康寿命的抗衰老疗法。 参考:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359644624003143#b0175 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓