BRD0476

靶标识别是药物研究和研发过程的重要组成部分，特别是对天然活性分子的靶点机制研究和药物研发中的二级药理学研究。靶标发现分为两种主要方法：基于亲和力的pulldown方法和无标记方法。基于亲和力标记方法使用需要与标签偶联的小分子来选择性地分离鉴定靶蛋白，而无标记方法则利用自然状态下的小分子来识别靶标。本文概述了当前基于亲和力标记方法和无标记方法的靶点发现，及其优点和局限性。 1. 背景介绍 靶标识别是新药发现和开发的关键阶段，因为它使研究人员了解神秘药物的作用机制。过去两个世纪药物发现和开发取得的大部分进展都可以归功于靶标识别技术的进步。通过发现药物的精确靶点分子，研究人员可以更好地针对特定疾病或靶点优化药物。靶标识别对于优化药物选择性和减少其潜在副作用也很重要。 基于亲和力的pulldown方法需要用标签（例如生物素或荧光标签）标记小分子，然后用它从细胞裂解物或其他蛋白质混合物中亲和纯化其结合蛋白。在许多情况下，标记小分子可能很困难，限制了使用基于亲和力的pulldown方法的可能性。为了避免这种限制，已经开发了无标记方法来识别小分子的潜在靶标，而不需要用亲和标签对分子进行化学修饰。此外还有，在细胞水平上寻找新药物靶点的生物学方法，例如诱变和基因筛选等。 2. 基于亲和力的pulldown方法 亲和纯化是鉴定小分子靶标的常用方法。在此方法中，将测试的小分子与亲和标签（例如生物素）缀合或固定在树脂（例如琼脂糖珠）上。这种化学修饰的结构用作与细胞/细胞裂解物一起孵育的探针分子。孵育后，使用亲和标签纯化出结合的蛋白质，然后可以使用SDS-PAGE 和质谱法等分离和鉴定纯化的蛋白质。这种方法在药物发现和其他研究领域非常有用。此外，它还能够确定小分子与靶标蛋白的互作构效关系。 2.1 亲和基质方法 亲和基质方法是一种使用亲和基质来分离生物活性小分子的靶蛋白的方法。使用聚乙二醇（PEG）等连接子将小分子在特定位点共价连接至固相基质支持物（例如琼脂糖珠），而不改变小分子的原始活性（图1）。然后将小分子亲和基质暴露于含有靶蛋白的细胞裂解物。洗脱并收集与基质结合的任何蛋白质，然后使用质谱法鉴定靶标。该方法已被KL001、Aminopurvalanol、Diminutol、BRD0476和Encephalagen　等分子成功采用。 图1. A. 偶联beads上亲和基质探针、 B. 生物素标记探针、 C. 光亲和探针、D. 光反应基团及其反应中间体的示例。 2.2 生物素标记方法 生物素是一种小分子，由于其与亲和素/链霉亲和素具有很强的结合亲和力，因此常用于基于亲和力的技术。在此方法中，生物素分子通过化学键连接到感兴趣的小分子上，并将生物素标记的小分子与细胞裂解物或含有靶蛋白的活细胞一起孵育。然后，在链霉亲和素包被的固体支持物上捕获目标蛋白后，使用 SDS-PAGE 和质谱分析法来分析目标蛋白（图1 B）。采用生物素标记的方法成功鉴定了激活蛋白1（AP-1）作为PNRI-299的靶蛋白。 优点：低成本且简单的目标蛋白纯化和分离。缺点：需要采用苛刻的条件才能打破它们的相互作用并从树脂中释放结合的蛋白质。释放结合蛋白的一种常见方法是将基质暴露于变性缓冲液中，例如含有 SDS 的溶液和 95-100 °C 范围内的高温。此外，将生物素附着到小分子上也会影响细胞的渗透性和表型结果。 2.3  光亲和标记方法 在光亲和标记 (PAL，photoaffinity labelling) 方法中，化学探针在光照下与其靶标共价结合。在该方法中，探针设计涉及选择光反应基团（例如，将光反应基团连接到小分子的接头）和亲和标签（图1 C）。在这种情况下，光反应基团通过暴露在光下被激活，使探针与目标分子形成永久的共价键。这有助于研究目标分子的结构和功能，因为探针可用于标记目标内的特定位点或区域。PAL 中可使用多种类型的光反应基团，包括苯基叠氮化物、苯基二氮丙啶和二苯甲酮（图1 D）。当被光激活时，这些基团中的每一个都会产生不同类型的反应中间体，其具有不同的性质、并且可以以不同的方式使用。其他光反应基团包括重氮羰基、烯酮、重氮基团、硫自由基、卤化底物、重氮盐、硝基苯、以及二氮丙啶和叠氮化物的烷基衍生物等。 PAL 实验中光反应基团的选择取决于研究的具体目标蛋白或分子的特征。最近，芳基二氮丙啶已成为 PAL 中最常用的光反应基团。它们因其良好的化学稳定性和对各种变量的耐受性而受到青睐，例如温度、亲核试剂、酸性和碱性环境以及氧化剂和还原剂。芳基二氮丙啶的三氟甲基衍生物特别受欢迎，因为它的稳定性更高，并且在暴露于特定波长的光下时容易产生高反应性卡宾。然后卡宾中间体可以共价连接到目标蛋白质或分子。 PAL优点：高度特异性，允许以消除误报并提高结果精度的方式标记感兴趣的小分子。此外，它还具有很高的灵敏度，甚至能够检测低水平的蛋白质-配体相互作用。它还可用于识别与多种细胞和组织类型中的小分子结合的蛋白质。此外，它还能够识别蛋白质-配体相互作用，这对于了解小分子的作用机制和识别药物开发的潜在靶点非常有用。该方法已成功用于鉴定各种小分子的靶蛋白，并且已纳入各种功能手柄和光亲和接头以优化该方法的效率。 光亲和方法的一般实验工作流程如 图2 所示。 图2. 光亲和法的标准实验方案。1. 合成光亲和探针。2. 在细胞或细胞裂解物上使用光亲和探针并让它们与其靶标结合。3. 随后使用紫外线 (UV) 来激活探针与处理样品（细胞或细胞裂解物）中目标蛋白的共价交联（如果实验是在活细胞上进行的，则细胞在紫外线照射后会裂解蛋白质）。4. 使用链霉亲和素，提取复合物（靶标+探针）。5. 通过洗涤除去未结合的蛋白质。6. 可以使用 SDS-PAGE 分析目标蛋白，并通过蛋白消化和质谱进行鉴定。 2.4 基于亲和力方法的局限性和挑战  由于分子的性质和用于开发探针的接头所发挥的不可或缺的作用，这两个因素都对基于亲和力pulldown方法提出了挑战。例如，在采用这种技术时，重要的是要注意修饰探针的设计和合成。此步骤可能需要在不同附着点对不同探针进行频繁测试和评估，以构建构效关系 (SAR) 模型，从而产生既有效又特异的探针。SAR 研究至关重要，涉及对探针结构的系统修饰，以优化其对目标蛋白的结合亲和力和特异性，以及光反应性和其他特性。用于标记小分子的光反应基团也可能干扰其与靶蛋白的结合，这可能导致假阴性结果。另一个限制是需要用亲和标签修饰小分子，这对于某些化合物来说可能是不可能的，并且亲和标签有可能改变小分子的生物活性并导致意想不到的结果。最后，使用紫外线触发小分子与目标蛋白的共价连接可能对细胞有害，这可能导致错误的结果。尽管存在这些缺点，光亲和pulldown方法仍然是研究蛋白质-配体相互作用的重要工具，可用于深入了解小分子的作用机制并识别潜在的药物靶点。 另一方面，光亲和探针中的光亲和标记与生物素标记分子中的化学接头之间的接头或间隔基团对其性能具有显著影响。此外，如果接头太短，探针有可能与其自身交联，从而导致探针不稳定和缺乏特异性的问题。另一方面，如果接头太长，光反应基团可能离目标蛋白太远，无法有效地抓住它。一般来说，理想的接头长度由探针和目标蛋白的特性决定。因此，为了实现目标蛋白的可靠和精确标记，仔细选择接头并调整每个特定应用的条件可能很重要。 报告标签是旨在检测探针的存在并确定其与目标的结合位置。可用的识别标签有多种形式，包括荧光染料、放射性同位素以及生物素和亲和素等特定结合配偶体。研究人员可以使用不同的方法（例如荧光显微镜和免疫沉淀）来寻找和分离探针-蛋白质加合物。总而言之，由于与开发 SAR、连接子和标签以创建有效分子相关的挑战，基于亲和力的pulldown方法存在一些缺点，包括需要经验丰富的化学家来合成光亲和探针，这可能是耗费时间和资源。 3. 无标记目标识别 无标记方法利用自然状态的小分子，无需对其结构进行任何化学修饰，从而保留小分子的天然确认和功能特性。这种方法通常受到研究人员的青睐，因为它不需要对初级分子进行修饰或标记。这种方法避免了与化合物标记相关的任何潜在问题，它几乎没有任何限制，因为这种无标记分子可以与非预期的蛋白质结合并导致假阳性目标的识别。然而，该方法不适用于以低水平表达的蛋白质（图 3）。 3.1药物亲和力响应靶点稳定性  药物亲和力响应靶稳定性技术（DARTS，Drug affinity responsive target stability）是一种基于小分子可以结合并稳定其靶蛋白，从而增加其对蛋白水解（即通过蛋白酶分解）的抗性而开发的技术。DARTS 通过检测结合诱导的蛋白水解抗性增加来识别靶蛋白。为此，将小分子与细胞裂解物一起孵育，然后用蛋白酶处理。如果小分子可以与其靶蛋白结合，则蛋白酶将无法分解它，因为它会增加其稳定性，从而导致处理后剩余的蛋白质量增加。蛋白质稳定性的增加可以使用蛋白质印迹或质谱等技术来检测。 图3. 无标记目标识别方法的示意图。 A．药物亲和力响应靶标稳定性 (DARTS)。 3.2 根据氧化速率测定蛋白质的稳定性  变性蛋白质比其天然对应物更容易被氧化，基于氧化速率的蛋白质稳定性技术 (SPROX，Stability of Proteins from Rates of Oxidation) 方法利用了这一特性，通过测量存在和不存在小分子的情况下蛋白质表面上蛋氨酸残基的蛋白质氧化水平的速率，并检测可能由以下因素引起的任何变化：小分子结合并稳定其靶蛋白。在此方法中，小分子与细胞裂解液一起孵育，然后进行化学变性处理，然后氧化剂（H2O2）处理，随后使用质谱法对蛋白质氧化速率进行量化。SPROX技术用于评估他莫昔芬的靶点，发现MCF-7细胞中的YBX1，观察到该靶点因小分子的存在而稳定。 缺点：SPROX仅适用于含有氨基酸蛋氨酸的蛋白质。这是因为 SPROX 通过测量蛋白质中蛋氨酸残基的氧化水平来确定目标蛋白质。因此，SPROX 可能不适合鉴定缺乏蛋氨酸残基的靶蛋白。 此外，SPROX 和 DARTS方法都适用于细胞裂解物，而不适用于活体生物系统，能用于研究从细胞中分离的蛋白质，而不能用于研究细胞内的蛋白质。 图3. 无标记目标识别方法的示意图。B．氧化速率的蛋白质稳定性 (SPROX) 。 3.3细胞热位移测定 (CETSA) 细胞热位移测定（CETSA，Cellular thermal shift assay）是根据配体诱导的蛋白质靶标热力学稳定的概念而开发的，靶标结合配体后稳定性的增加可以通过测定蛋白质的热稳定性来评估。与SPROX和DARTS技术不同，它可以用于活细胞和细胞裂解液。为了进行 CETSA，首先用小分子或载体处理细胞/细胞裂解物，然后加热。然后使用蛋白质印迹法确定蛋白质是否以温度依赖性方式变性，以及与样品中小分子结合的某些蛋白质的熔解曲线是否发生了变化。通过比较含有和不含小分子的蛋白质的热稳定性，可以识别小分子是否与蛋白质相互作用并估计关联的亲和力。使用CETSA，证实2′-hydroxy cinnamaldehyde直接与STAT3结合，抑制STAT3活性。 缺点：这种方法需要蛋白质印迹，由于抗体的可及性，这限制了它的使用。 此外，目前已经开发出了许多用于识别蛋白质靶标的高通量热位移方法，例如 MS-CETSA、HCIF-CETSA 和 ITDR -MS-CETSA。 图3.  无标记目标识别方法的示意图。C. 细胞热位移测定 (CETSA)。 3.4诱变 诱变是一种很有前途的识别药物靶点的遗传工具，它涉及通过改变DNA或氨基酸的特定序列来操纵基因或蛋白质的表达或功能，并观察这种突变对药物反应的影响。mRNA敲除、定点突变和随机基因组诱变是药物靶标识别中使用的多种遗传筛选方法。其中，CRISPR-Cas9突变作为一种生成基因文库的方法越来越受欢迎，这些基因可用于识别细胞靶蛋白和小分子的分子相互作用位点候选药物。 最近，CRISPR 平铺介导的诱变（CRISPR-tiling–mediated mutagenesis）是一种理想的靶标发现方法，可将烟酰胺磷酸核糖基转移酶 (NAMPT) 识别为临床研究中的抗癌药物 KPT-9274 的主要分子靶点 [ Nat Commun, 2018,10.1038/s41467-017-02349-8]。该方法涉及系统设计大型sgRNA基因文库，以靶向和突变已知抗癌药物的特定基因，并开发可转导生成诱变细胞的慢病毒文库构建体。 诱变的优点是揭示药物与其靶标和其他细胞成分的直接和间接相互作用。此外，它可以通过改变先导化合物的结构或活性来促进其优化。此外，可以筛选由诱变产生的大量遗传变异，不仅可以检测药物敏感性，还可以了解耐药性。诱变可以帮助揭示药物作用模式中涉及的主要和次要靶点和途径。缺点: 包括耗时、劳动密集型和效率低，特别是对于复杂的基因组和由此产生的表型，这可能会引入不需要的或脱靶效应，从而混淆对结果的解释。诱变可能不准确或不完整，导致假阳性或阴性。多个目标、冗余目标或可能掩盖单个突变影响的补偿机制的存在可能会使诱变变得复杂。 3.5 基因筛选 基因筛选是细胞药物靶标识别的另一种独特、无偏倚的方法。在该方法中，设计了感兴趣的选择性靶标的敲除文库（RNAi 或 CRISPR-Cas9）并筛选可能的药物靶标的功能丧失。在最近的一项研究中，利用具有诱导自杀基因表达系统的基于 CRISPR 的靶标识别平台，对带有通过 gRNA 序列测序和功能丧失进行鉴定的被敲除靶标的细胞进行正向富集。利用该平台，作者确认 STING 和 CES1 分别是细胞中小分子 IFN-I 激活剂 BDW568 的主要靶标和关键代谢酶。与传统的基于CRISPR的靶标筛选依赖于药物的抗增殖作用相比，这种智能方法可以适用于任何具有非增殖活性的药物。 4.结论  蛋白质靶点识别研究是药物发现过程的重要组成部分，需要投入大量的时间和资源。通过仔细考虑基于亲和力pulldown方法、无标记方法、诱变和基因筛选方法的主要优点和局限性，研究人员能够在选择药物发现的靶点识别策略时做出明智的决定，以选择最合适的方法取决于研究项目的具体要求。 参考：10.1186/s12896-023-00815-4 声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！ 长按关注本公众号  粉丝群/投稿/授权/广告等 请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓