Ivacaftor/Lumacaftor

类器官是由干细胞衍生的三维结构，能够重现相应组织的关键结构和功能特点。与传统的二维细胞系相比，人类类器官提供了更接近人类生理的实验模型。类器官能够模拟人体组织的复杂性和异质性，从而可用于研究疾病机制、药物疗效和毒性。当使用患者组织构建时，类器官还能用于评估个体对药物的反应。本文将探讨类器官在药物研发中的应用。我们将概述目前类器官的构建和培养方法，考察其在疾病建模、药物筛选和安全性评估中的应用，并探讨其在药物研发中更⼴泛应用所面临的监管问题和挑战。在药物研发中，体外模型发挥着至关重要的作用，它们为研究细胞对药物的反应提供了明确的实验系统。由于人类细胞系相对简单、成本低廉且在各个研究实验室中⼴泛应用，因此它们历来是药物研发的主要工具。细胞系通常来源于肿瘤，并已适应在二维塑料表面上生长。因此，细胞系既不能代表组织结构，也不能包含单个器官的全部功能细胞类型。这促使人们探索更接近生理状态的三维培养系统，例如类器官，以更精确地模拟体内微环境。与动物实验相比，类器官更具成本效益，并可实现高通量筛选（high-throughput screening, HTS），同时避免了与动物实验相关的物种差异和伦理问题。Mina Bissell及其同事使用Matrigel（一种细胞外基质(ECM)样的水凝胶）进行上皮细胞三维培养作出了开创性的重要贡献。在三维基质胶培养中，细胞会进行更接近生理状态的细胞间和细胞与基质间的相互作用。事实上，Bissell的研究表明，乳腺来源的上皮细胞可以在基质胶中形成三维腺体结构，这些类器官甚至可以被诱导分泌乳汁（Lee, G. Y. et al. Nat. Methods. 2007）。利用多能干细胞（pluripotent stem cells, PS细胞）开发类器官技术起源于20世纪80年代胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）的发现。ES细胞天然存在于囊胚期胚胎中，但在特定条件下可以长期培养，理论上，在合适的生长因子条件下，可以诱导其分化成任何细胞类型，例如神经元或心肌细胞。然而，操作和伦理方面的挑战阻碍了人类ES细胞的⼴泛应用。这些挑战直接源于ES细胞来源于早期人类胚胎，而这一过程会导致胚胎的破坏。2006年，山中伸弥发明了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS细胞），通过转染4种转录因子，将成人组织中的体细胞重编程为iPS细胞，从而在很大程度上解决了这些问题。目前，PS细胞的研究主要采用二维培养方法。当科学家开始探索三维培养技术，例如球形诱导iPS细胞聚集时，他们发现PS细胞能够自发形成更加复杂的结构。首个基于PS细胞的类器官模型由笹井芳树（Yoshiki Sasai）团队开发，他们构建了类似于视⽹膜和中枢神经系统（CNS）其他部分的结构。这些结构能够自组织，重现真实器官的关键特征，包括细胞类型多样性和空间组织。目前，用于生成代表各种人体组织的基于PS细胞的类器官的标准化方案正在以前所未有的速度发展。这些方案通常需要数周或数月的时间，从少量iPS细胞开始，重点在于优化营养供应，同时模拟连续的发育信号环境，引导PS细胞分化为目标组织（图1a）。目前常用的PS细胞衍生类器官可以模拟大脑、视网膜、肺、肾脏、肝脏和肠道组织。 图 1 | 多能干细胞和组织干细胞衍生的人类类器官。 a，诱导多能干细胞 (iPS 细胞) 衍生类器官的生成流程。从 iPS 细胞生成类器官需要逐步进行谱系分化，模拟体内胚胎发育，从多能性阶段发展到目标器官。iPS 细胞通常以细胞聚集体的形式收集，这些聚集体保持细胞间接触并自发形成复杂的结构。首先通过施加适当的微环境因子将类器官定向到特定的胚层，然后利用组织特异性的发育信号进一步分化为器官特异性的细胞类型。最终得到的类器官通常达到胎儿发育晚期。图中显示了参与胚层分化以及细胞类型特异性分化或成熟的代表性信号因子。 b，生成组织干细胞 (TSC) 衍生类器官的工作流程。组织被处理成单细胞或小碎片，直接嵌入细胞外基质（例如 Matrigel）中进行三维培养。由于细胞来源于靶器官的活检样本，因此绕过了 PS 细胞衍生类器官所必需的谱系分化步骤。基于 TSC 的类器官培养仅需支持长期扩增的因子，因此通常所需时间更短。TSC 衍生类器官中功能性细胞类型的分化可以随着干细胞的自我更新而自发发生，也可以通过细胞类型特异性微环境因子进一步诱导。 TSC衍生的类器官可以高效地从含有活性干细胞的组织（例如消化道）中建立，而非自我更新组织（脑、视网膜、心肌）只能由iPS细胞生成。疾病相关的基因突变可以通过基于CRISPR的基因编辑技术引入类器官模型。该过程要求编辑后的细胞具有高度增殖能力以支持其从单个细胞生长，因此基因编辑通常在iPS细胞或TSC中进行，在谱系分化和细胞分化之前。ALK，间变性淋巴瘤激酶；BMP，骨形态发生蛋白；EGF，表皮生长因子；FGF，成纤维细胞生长因子；HGF，肝细胞生长因子；HHi，刺猬信号通路抑制剂；IGF，胰岛素样生长因子；OSM，抑瘤素M；RA，维甲酸；TGF，转化生长因子；VEGF，血管内皮生长因子；VitC，维生素C。 几乎所有器官都具备通过组织干细胞（tissue stem cells, TSCs）的作用来替换受损或衰老细胞的能力，可能只有心肌、肾小球和中枢神经系统的大部分区域例外。骨髓中的造血干细胞是最早被发现的组织干细胞。后来，在皮肤、角膜和肠道内壁等组织中发现了上皮组织干细胞。2009年，我们证明，源自肠道上皮的单个组织干细胞可以生成不断增殖的上皮类器官，其中包含所有相关的肠道细胞类型，这展现了组织干细胞及其子代细胞固有的自组织能力（Sato, T. et al. Nature. 2009）。与诱导iPS细胞类似，特定的生长因子和细胞外基质 (ECM) 成分对于引导组织干细胞的扩增和分化为各种目标细胞类型至关重要（图1b）。与基于多能干细胞的方法的主要区别在于，基于TSC的类器官是由活检样本或其他原代组织来源（而非基于iPS细胞的培养物）建立的，并且不需要体外定向分化为目标组织。过去十年，类器官研究的数量迅速增长，这项技术似乎已准备好开始兑现其在药物研发方面的各种承诺。人类类器官提供了一种体外实验模型，可以作为传统二维人类细胞系和动物模型的补充（表1）。如上所述，细胞系很难代表其来源组织：它们⼏乎无一例外地经历了某种形式的恶性转化，要么是因为它们来源于癌症，要么是因为它们已被⼴泛适应在塑料表面上的二维生长。事实上，移植后的细胞系通常会形成肿瘤，而移植的类器官则能产生健康、功能性的组织。与细胞系相比，动物模型具有在完整生物体背景下重现生物学现象的优势，但它们也存在局限性：由于物种间固有的差异，许多人类疾病仍然难以在动物身上重现。同样，动物和人类之间的生理差异也限制了对药物安全性和有效性的准确预测。此外，出于伦理方面的考虑，动物的使用正受到越来越多的监管。2022年，美国国会通过了《FDA现代化法案2.0》，随后又通过了《FDA现代化法案3.0》，以明确药物研发中对动物模型的必要性。近期，FDA宣布计划逐步淘汰单克隆抗体疗法和其他药物研发中的动物试验。因此，监管机构正在积极探索替代方案。 表1 | 人类类器官与传统临床前模型的比较 本文概述了类器官的生成和维持方法，并重点介绍了其在疾病建模、治疗筛选以及药物药理学和毒性评估中的应用。我们还探讨了类器官在个性化医疗中的应用潜力，即利用患者自身细胞构建类器官，从而实现个体化的药物测试。最后，我们分析了监管方面的考量以及类器官平台成为药物研发成熟工具所面临的挑战。疾病建模类器官已被应用于多种疾病领域，包括遗传性疾病、癌症和传染病（图2）。 图 2 | 疾病建模中不同类型的类器官。类器官能够复制真实器官（如大脑、肾脏、肝脏、肺和肠道）的（病理）生理特征。与永生化细胞系相比，类器官展现出复杂的组织结构，具有区域特异性和正确的细胞极性。它们包含成熟的细胞谱系，便于进行功能分析。值得注意的是，类器官表达必需的受体和细胞内成分，这些成分能够促进病原体感染并支持这些病原体的完整生命周期。这些独特的特征（如上图所示）使类器官在疾病建模方面具有重要价值，包括遗传性疾病、感染和各种癌症。此外，通过整合免疫细胞等微环境成分，类器官可以模拟和研究炎症性疾病，并深入了解疾病机制和潜在治疗方法。下图展示了一些已建模疾病的示例。MASH，代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎；EEC，肠内分泌细胞；SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。 遗传性疾病 人类类器官似乎特别适合用于模拟遗传疾病。它们可以直接从患者受累器官的活检样本中获得（患者来源的类器官，patient-derived organoids，PDOs），也可以通过CRISPR介导的基因编辑技术从健康个体获得的类器官中获得。囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) 是一种常染色体隐性遗传病，由CFTR 基因的功能缺失突变引起。该基因编码氯离子/碳酸氢根离子通道囊性纤维化跨膜传导调节因子 (CFTR)，该因子对包括肺和肠在内的多种上皮组织的离子和体液稳态至关重要。目前已开发出多种CFTR调节剂，例如Orkambi，它由两种化合物（ivacaftor和lumacaftor）组成，专门用于治疗携带纯合CFTRΔ508突变的患者，这类患者约占CF人群的50%。即使携带相同的基因突变，患者对该药物的反应也各不相同，因为CFTR调节剂的活性受细胞和遗传背景的影响。值得注意的是，囊性纤维化(CF) 的遗传基础和由此产生的症状在人类和现有的小鼠模型之间也存在显著差异。Cftr突变小鼠（包括CftrΔ508）不会出现囊性纤维化患者常见的严重气道疾病，例如黏液积聚、气道阻塞或慢性肺部感染。囊性纤维化是第一个利用PDOs实现个性化医疗的疾病。CFTR通道由cAMP激活。在健康的肠道或气道类器官中，添加福斯克林（一种通过刺激腺苷酸环化酶将ATP转化为cAMP来提高cAMP水平的化合物）会触发快速肿胀，这是由于CFTR介导的水流入管腔所致。相比之下，来自囊性纤维化患者的类器官对福斯克林无反应，无法肿胀。这种肿胀缺陷可以通过基于CRISPR的CFTR突变校正或使用有效的CFTR调节剂治疗来挽救。重要的是，在此肿胀检测中测得的药物反应与患者的临床结果（例如预测用力呼气容积百分比（ppFEV1）和痰细胞计数（SCC））密切相关。类器官肿胀读数的简便性也使得该检测方法适用于药物高通量筛选。原发性纤毛运动障碍 (primary ciliary dyskinesia, PCD) 是另一种影响气道的遗传性疾病，由与纤毛结构相关的基因突变引起，包括DNAH5/11、DNAI1和CCDC39/40。可以使用来自原发性纤毛运动障碍患者的鼻腔气道类器官进行研究。这些类器官可以通过电子显微镜成像直接观察纤毛的摆动和结构变化。通过先导编辑纠正DNAH11基因的突变，已在该类器官模型中证实了基因治疗的潜力。肺表面活性蛋白缺乏症是由SFTPB（编码肺表面活性蛋白B）和SFTPC等基因突变引起的，会导致家族性肺纤维化。肺泡II型（AT2）细胞产生的表面活性蛋白可降低肺泡内气液界面处的表面张力，从而防止呼吸过程中肺泡塌陷（肺不张），促进肺部扩张和气体交换。最近，有报道称，从胎肺中分离出了AT2细胞类器官，而来自SFTPB缺陷患者的iPS细胞衍生的肺类器官重现了特征性的异常板层小体形成，重新表达野生型SFTPB可挽救这种异常。肾脏疾病也可以用类器官进行建模。多囊肾病（polycystic kidney disease, PKD）是最常见的遗传性肾脏疾病，研究人员利用携带PKD1或PKD2基因突变的患者的肾脏类器官对其进行了研究，PKD1和PKD2分别编码多囊蛋白1和多囊蛋白2。这些类器官重现了常染色体显性多囊肾病 (ADPKD) 的标志性特征囊肿形成，同时表达了ADPKD基因特征。利用可扩展的ADPKD类器官进行高通量筛选已鉴定出一些有前景的化合物，这些化合物能够减少囊肿生长，其中包括喹唑啉，一种潜在的核因子‑κB (NF‑κB) 通路调节剂。最近，研究人员利用携带PKHD1基因（编码纤维囊蛋白）突变的iPS细胞来源的肾脏类器官，建立了一种芯片类器官平台（图3a）。该系统模拟了天然组织微环境的流体流动，并重现了常染色体隐性多囊肾病(ARPKD) 患者的囊肿形成过程，从而为药物测试提供了具有临床意义的表型。遗传性肝脏疾病。α1‑抗胰蛋白酶缺乏症 (AATD) 是一种单基因疾病，由SERPINA1基因突变引起，导致α1‑抗胰蛋白酶 (A1AT) 水平降低。A1AT主要在肝脏中产生，作为一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，保护肺组织免受中性粒细胞弹性蛋白酶介导的破坏。AATD患者对肺和肝脏损伤的易感性增加，源自AATD患者的肝脏类器官模型模拟了疾病特征，包括A1AT聚集、蛋白质分泌减少和弹性蛋白酶抑制受损。该模型为探索基因治疗和其他旨在阻止肝细胞内A1AT聚合和聚集的策略提供了机会。由JAG1突变型阿拉吉尔综合征患者生成的类器官显示，其向胆管细胞分化延迟，且管腔内细胞凋亡增加，这反映了胆道系统的体内异常。由ATP7B基因（编码铜转运ATPase‑β）突变引起的威尔逊病患者的胆管细胞类器官，由于铜转运缺陷和细胞内毒性积累，对铜治疗表现出更高的敏感性。尽管Atp7b敲除小鼠模型能够捕捉到该疾病的某些肝脏特征，例如铜过载、炎症和纤维化，但它无法重现患者所表现出的神经系统和精神症状。胆道闭锁患者的肝脏类器官显示出异常的形态，其特征是存在多个空泡、增殖能力降低、顶端‑基底结构紊乱以及CFTR蛋白水平低下。这些表型与患者的阻塞性胆管疾病一致，转录组分析进一步揭示了胆管周围的淀粉样蛋白β (Aβ) 沉积是一种新的病理和诊断特征。中枢神经系统遗传性疾病。帕金森病（Parkinson disease, PD）的特征是中脑多巴胺能神经元的丢失，导致运动和非运动症状。由于iPS细胞衍生的多巴胺能神经元处于胎儿成熟状态，因此，利用类器官模拟PD症状性神经退行性表型以及其他通常发病较晚的中枢神经系统疾病仍然具有挑战性。因此，大多数研究工作集中于利用携带疾病相关突变的类器官重现早期病理过程，从而揭示突变特异性的疾病机制。例如，人类ES细胞衍生的中脑类器官，其DNAJC6基因（与帕金森病早期发作相关）发生功能性丧失突变，由于WNT‑LMX1A信号传导受损，导致多巴胺神经元发育受损、病理性α突触核蛋白聚集、固有神经元放电频率增加以及线粒体和溶酶体功能障碍。值得注意的是，Dnajc6基因敲除小鼠并未重现帕金森病相关表型。同样，携带帕金森病相关富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(LRRK2) G2019S突变的iPS细胞来源的中脑类器官，能够重现患者中观察到的典型特征，包括α‑突触核蛋白聚集增加和清除受损。进一步分析表明，TXNIP是LRRK2相关帕金森病的关键因素。在另一个涉及常见神经退行性疾病的例子中，载脂蛋白E变体APOE4是阿尔茨海默病（AD）最强的遗传风险因素。携带APOE4变体的iPS细胞衍生的脑类器官表现出增强的AD病理特征，包括Aβ和磷酸化tau蛋白水平升高、细胞凋亡以及突触完整性降低。值得注意的是，除了APOE4变体对神经元的直接影响外，包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的共培养类器官模型揭示了小胶质细胞中的APOE4通过诱导神经元炎症在AD病理中的作用。进一步的转录组分析发现了与APOE4变体相关的细胞类型特异性变化，包括神经元突触功能受损、星形胶质细胞Aβ摄取减少和胆固醇积累减少，以及小胶质细胞样细胞形态改变和Aβ吞噬作用降低。源自家族性阿尔茨海默病患者的iPS细胞（携带编码淀粉样β前体蛋白的APP重复，或分别编码早老素1或2的PSEN1或PSEN2突变）的类器官会自发出现病理变化，如淀粉样蛋白聚集、tau蛋白过度磷酸化和内体异常这些病理变化，其可通过β‑和γ‑分泌酶抑制剂进行挽救。尽管过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病（AD）的标志性特征，但编码tau蛋白的MAPT基因突变可导致额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD），这是一种异质性疾病，其特征是tau蛋白积累和谷氨酸能皮质神经元丢失。携带MAPT基因突变（R406W）的iPS细胞衍生的脑类器官已被用于研究tau蛋白病理的具体机制。R406W突变通过微管不稳定诱导tau蛋白错位和轴突营养不良，同时也会破坏突变神经元中的线粒体运输。突变型tau蛋白的磷酸化水平降低，更容易受到钙蛋白酶介导的切割和片段化。同样，携带另一种MAPT突变（V337M）的类器官已被用于研究早期FTD的发病机制。这些类器官在多个时间点进行表型评估，以识别FTD-tau病理发展过程中的各个步骤。FTD的标志性特征，包括神经元丢失、进行性tau蛋白积累和对谷氨酸毒性的易感性，在后期（4个月后）出现。tau蛋白的积累主要是由于蛋白水解活性缺陷，而非tau蛋白表达增加，而蛋白水解活性缺陷是由自噬-溶酶体通路紊乱引起的。进一步的基因富集分析显示，ELAVL4（一种编码神经元RNA结合蛋白的剪接调节基因）的表达增加，导致剪接失调和兴奋性神经元功能受损。兴奋性神经元发育的失调导致兴奋性毒性——一种由兴奋性神经递质（主要是谷氨酸）过度刺激引起的过程，导致钙离子过度流入神经元，造成细胞功能障碍并最终死亡——以及发育后期发生的细胞凋亡。此外，突变tau类器官中谷氨酸能神经元的丢失可以通过脂质激酶抑制剂apilimod来挽救，该抑制剂可阻止谷氨酸受体与细胞膜的再结合，从而减少谷氨酸诱导的兴奋性毒性。另一种方法是将突变tau（P301L）通过腺相关病毒（AAV）注射到iPS细胞衍生的前脑类器官中，也能诱导产生明显的含有tau原纤维的tau聚集体。除了MAPT基因突变外，FTD还有多种其他遗传病因，包括GRN基因突变导致前粒蛋白单倍体不足以及C9ORF72基因中GGGGCC重复序列扩增。由iPS细胞衍生的脑类器官切片模型能够重现皮质结构，并展现C9ORF72相关FTD的早期分子病理特征。在这些类器官中，星形胶质细胞表现出自噬相关蛋白P62水平升高，而深层神经元则积累了二肽重复蛋白poly(GA)，导致DNA损伤，并发生核固缩，而GSK2606414可以逆转这一过程。C9ORF72扩增的iPS细胞衍生FTD类器官还表现出TDP43功能障碍加剧，这是导致急性损伤的关键因素。基于FTD类器官的CRISPR干扰(CRISPRi) 筛选已发现KCNJ2抑制是一种有前景的治疗靶点，可以缓解神经退行性过程。神经发育障碍也可以在类器官中建模。脆性X综合征（Fragile X syndrome, FXS）是由脆性X智力低下蛋白（FMRP）的缺失引起的，FMRP是一种RNA结合蛋白，它调节参与突触发育和可塑性的特定mRNA的翻译，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、代谢型谷氨酸受体（mGluRs）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）和突触后致密区蛋白95（PSD95）。在源自FXS患者前脑的类器官中，FMRP的缺失会导致神经发生、神经元成熟和兴奋性失调。这些缺陷可以通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路来挽救，但不能通过mGluR5拮抗剂来挽救。值得注意的是，以mGluR5为靶点的疗法在临床试验中疗效有限，但在动物模型中却展现出令人鼓舞的结果。对这些FXS类器官的转录组分析进一步揭示了人类FMRP mRNA靶点，例如CDH2，从而为FXS的治疗开发提供了机制方面的见解和潜在的药物靶点。该模型的一个显著局限性是FXS类器官中GABA能抑制性神经元的显著减少。因此，若要进一步研究FMRP缺失对GABA能神经元发育的影响，则需要借助富含GABA能神经元的其他模型系统，例如腹侧前脑类器官。此外，该FXS类器官模型无法完全捕捉细胞类型的多样性及其复杂的相互作用，尤其是涉及星形胶质细胞的相互作用。据报道，星形胶质细胞介导人类FXS神经元异常放电的非自主性校正。最近一项研究表明，FMRP可以抑制由YTH结构域蛋白家族1 (YTHDF1)介导的神经元翻译。在iPS细胞来源的前脑类器官模型中，一种靶向YTHDF1的小分子抑制剂逆转了与FMRP缺乏相关的发育缺陷。 代谢疾病 代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH）是一种以肝细胞内脂质蓄积为特征的疾病，其导致慢性炎症和纤维化，影响着全球约5%的成年人口。MASH的危险因素包括营养过剩，或极少数情况下是遗传性脂质代谢紊乱。由基因改变（瘦素或瘦素受体突变，或与脂质代谢相关的基因如Apoa5、Nr1h4、Pparg、Cebpa的敲除）或饮食因素（高脂饮食、西式饮食或过量糖摄入）驱动的MASH动物模型被广泛应用。然而，这些动物模型不适用于大规模药物筛选，此外，物种间的差异也使得研究结果难以转化到人类生理学中。肝细胞类器官能够模拟肝脏组织的三维结构，并重现原代肝细胞的基因表达谱和细胞功能。源自患者或经代谢物刺激诱导的MASH类器官能够捕捉疾病的关键特征，其表现为促炎通路和肿瘤相关标志物的上调、脂质积累增加以及对细胞凋亡的敏感性。例如，一种经游离脂肪酸（FFA）处理后出现脂质积累的肝脏类器官系统已被用于研究二甲双胍和左旋肉碱的作用，这两种药物均用于治疗2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）。源自沃尔曼病患者的肝脏类器官（该病由溶酶体酸性脂肪酶（LAL）的基因功能障碍引起，导致甘油三酯水解受损）表现出大量的脂质积累和严重的脂肪性肝炎。这些表型可通过成纤维细胞生长因子19 (FGF19) 治疗得到挽救，FGF19可激活法尼醇X受体 (FXR)以降低脂质储存诱导的活性氧 (ROS) 活性。其他化合物也在肝脏相关类器官模型中进行了评估，但结果不一。镁虽然被报道可改善2型糖尿病和肝脏代谢紊乱，但在3D类器官模型中逆转疾病表型无效。相比之下，索拉非尼（sorafenib）是一种⼴谱酪氨酸激酶抑制剂，临床上用于治疗肝癌和肾癌，已显示出在MASH的3D共培养模型中降低脂肪变性诱导的纤维化的潜力。值得注意的是，MASH中炎症变化与纤维化进展之间的相互作用涉及库普弗细胞（Kupffer cells, KCs）和肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）。源自iPS细胞的多细胞类型肝脏类器官已被用于研究MASH的发病机制并促进药物筛选。在该系统中，游离脂肪酸（FFAs）刺激前胶原蛋白的生成。长期暴露于脂肪酸会导致KCs中炎症细胞因子的表达增加、HSCs的激活以及类器官硬度的升高。这些发现强调了构建多系细胞相互作用模型对于改进MASH建模的重要性。类器官不仅能够模拟代谢性疾病，而且还促进了新的治疗方法的发现。来自家族性高胆固醇血症患者的iPS细胞衍生的肝细胞揭示了强心苷在降低载脂蛋白B生成方面的作用。来自线粒体DNA耗竭综合征患者的肝细胞显示，NAD治疗能够改善线粒体功能，NAD治疗通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC1α）来恢复ATP水平。肝细胞类器官对于筛选小分子抑制剂或在临床前代谢功能障碍相关脂肪肝（metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD）和MASH的背景下开展基于CRISPR的功能研究具有重要价值。我们利用胎肝细胞类器官模拟了遗传性脂肪变性（APOB−/− 或MTTP−/−，分别编码载脂蛋白B和微粒体甘油三酯转移蛋白的基因）或FFA过量背景下的MASLD早期发病。作为概念验证，可以在这些MASLD类器官中进行常规药物筛选和CRISPR介导的功能缺失筛选，结果表明FADS2（编码脂肪酸去饱和酶2）是肝脂肪变性的一个决定因素。 慢性炎症性疾病 对炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）或乳糜泻（coeliac disease, CeD）等免疫介导疾病进行建模，需要将类器官与适当的免疫细胞和/或炎症介质相结合。通过对炎症性肠病患者的基因组和转录组分析，已鉴定出多种风险因素。然而，在动物模型中阐明这些风险因素的主要细胞靶点和潜在机制仍面临挑战。源自IBD患者或暴露于促炎细胞因子的类器官可用于直接研究。例如，对IL-22刺激的结肠类器官的分析显示，参与募集CXCR2+中性粒细胞的基因表达上调。值得注意的是，源自IBD炎症黏膜的类器官保留了炎症组织的转录特征，并且即使在去除炎症环境后，IBD患儿的疾病特异性表观遗传改变仍可在类器官中持续存在。研究IBD发病机制的一种生理相关方法是类器官-免疫细胞共培养系统。例如，来自克罗恩病患者的自体黏膜T细胞可以浸润类器官并直接诱导上皮细胞死亡。这种浸润和细胞毒性依赖于T细胞通过CD103（一种介导T细胞黏附于上皮细胞的整合素）和NKG2D（一种激活受体，可与上皮细胞上的应激诱导配体结合）进行识别。阻断CD103和NKG2D的抗体靶向免疫细胞与上皮细胞的相互作用，从而减少T细胞浸润和上皮损伤。乳糜泻是一种由麸质引发的自身免疫性疾病，与特定的HLA‑DQ单倍型相关。小鼠天然不具有这些人类HLA单倍型，尽管已开发出表达人类HLA分子的转基因小鼠，但它们并不能完全复制乳糜泻的免疫反应或疾病病理，或者需要人工诱导或基因改造，而这些方法并不能完全复制自然疾病进程。乳糜泻患者的十二指肠活检样本可以直接在气液界面系统中进行培养（图3a），该系统能够保留肠道上皮以及多种组织驻留免疫细胞群，从而重现麸质依赖性病理。利用该共培养系统进行的功能研究表明，IL‑7是一种麸质诱导的致病调节因子，是诱导乳糜泻发病机制中上皮细胞破坏的必要且充分条件。甲状腺（thyroid gland）是器官特异性自身免疫的已知靶器官：甲状腺功能亢进症（格雷夫斯病）和甲状腺功能减退症（桥本甲状腺炎）是自身免疫性疾病，其特征是激素分泌异常。含有激素分泌滤泡细胞的组织来源的甲状腺类器官很容易生成。暴露于格雷夫斯病自身抗体（已知可激活促甲状腺激素受体，TSHR）的甲状腺类器官表现出细胞增殖和激素分泌增加，重现了该疾病的关键特征。来自桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis）患者的类器官显示出趋化因子CCL2和CCL3水平升高，这些趋化因子可能在桥本甲状腺炎发病过程中募集免疫细胞方面发挥关键作用。慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）主要由肺泡和气道损伤引起，导致气流减少、黏液分泌增加和炎症，这些因素共同导致呼吸困难。来自COPD患者的支气管类器官证实存在杯状细胞增生和纤毛摆动频率降低。研究人员通过将人肺类器官暴露于香烟烟雾提取物中，研究了吸烟相关性COPD，结果发现与健康气道类器官相比，吸烟类器官的形成受到抑制，且肺泡类器官对香烟烟雾的敏感性增加。传染病小隐孢子虫是一种引起腹泻的原生动物寄生虫，其生活史复杂，既有无性繁殖也有有性繁殖，且一直难以在实验室中繁殖。人类肠道类器官，特别是分化的肠细胞，能够支持小隐孢子虫生活史的无性繁殖和有性繁殖阶段，并产生具有与来自受感染宿主动物的卵囊相当的二次感染能力的卵囊。同样，人类肠道类器官提供了首个体外人诺如病毒（human norovirus, HuNoV）平台，并确定肠细胞是病毒复制的靶细胞。HuNoV感染是全球急性胃肠炎的主要病因，但传统的细胞系无法支持HuNoV的感染和复制，而且由于病毒受体和免疫反应的物种特异性差异，小鼠天然具有抗感染能力。此外，鼠诺如病毒模型在病毒结构、受体利用和致病性方面与HuNoV存在差异，限制了研究结果直接应用于人类疾病。肠道类器官克服了这些障碍，展现出HuNoV对组织血型抗原的毒株依赖性结合特异性，这与动物和人体研究的结果一致。除HuNoV外，肠道类器官还被用于模拟其他肠道病毒感染，包括轮状病毒 (rotavirus)、柯萨奇B病毒(coxsackie B virus)和肠道病毒 (enterovirus)。2016年，世界卫生组织宣布寨卡病毒（ZIKA virus, ZIKV）感染与巴西新生儿小头畸形及其他神经系统疾病聚集性病例相关，构成国际关注的突发公共卫生事件。由于缺乏活体感染的人类胎儿组织，人们对寨卡病毒在发育中的中枢神经系统中的致病机制了解有限。小头畸形表型需要3D结构模型，而该模型只能通过感染脑类器官来模拟。利用人iPS细胞衍生的脑类器官进行的实验表明，寨卡病毒感染会破坏大脑皮层结构，降低细胞增殖，并减少功能性神经元的数量。在旋转生物反应器中培养的区域特异性脑类器官表明，亚洲和非洲的寨卡病毒株均能优先且有效地感染神经祖细胞，引发过早分化和细胞死亡增加，这与在人类胎儿中观察到的感染模式相似。脑室区和脑室下区的祖细胞均可受到影响，这支持了人类神经发育过程中增殖的祖细胞是该疾病关键靶点的假设。基于这些类器官模型的机制研究表明，寨卡病毒蛋白NS2A会损害人前脑类器官中放射状胶质细胞的增殖，并破坏神经干细胞的顶端连接形成。寨卡病毒蛋白NS4A和NS4B的表达通过抑制AKT‑mTOR信号通路来阻断神经发生并促进自噬。寨卡病毒蛋白NS5特异性靶向人STAT2（而非小鼠STAT2），从而抑制I型干扰素信号通路。寨卡病毒还能激活Toll样受体3（TLR3）介导的先天免疫反应，导致参与神经发生、轴突导向和细胞凋亡的基因表达失调。人类前脑类器官也被用于药物筛选，筛选结果显示，hippeastrine hydrobromide可清除感染的人类神经祖细胞中的ZIKV，并挽救ZIKV诱导的小头畸形表型。另一项药物重定位筛选发现，泛半胱天冬酶抑制剂emricasan可抑制ZIKV诱导的半胱天冬酶3活性，从而保护类器官培养中的人类皮层神经祖细胞；此外，FDA批准的B类驱虫药尼克酰胺可阻断ZIKV复制。此外，寨卡病毒感染通过病毒NS3蛋白与CaMKII的相互作用，增加宿主细胞中瞬时受体电位通道4（TRPC4）的表达，从而增强TRPC4介导的钙离子内流。药理学抑制CaMKII或TRPC4可能减少癫痫发作，并阻断寨卡病毒在iPS细胞衍生的脑类器官中的传播。呼吸道感染。呼吸道是病原体的主要靶器官，2019冠状病毒病（COVID-19）大流行引发了对体外模型的空前需求。表达血管紧张素转化酶2（ACE2）和跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的气道纤毛细胞是分化气道类器官中初始感染的主要细胞靶点。鉴于ACE2和TMPRSS2在多种上皮组织中均有表达，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）在呼吸道初始感染后可扩散至其他器官。含有表达ACE2的肠细胞的人类肠道类器官能够实现SARS-CoV-2的有效感染和复制。利用CRISPR介导的基因工程类器官生物库进行的后续研究表明，SARS-CoV-2、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV均特异性地利用TMPRSS2，TMPRSS2可蛋白水解激活刺突蛋白，使病毒包膜与宿主细胞膜直接融合。因此，这些病毒无需内吞作用即可感染宿主细胞，这使得TMPRSS2成为泛冠状病毒治疗的理想靶点。值得注意的是，(羟基)氯喹（(hydroxy)chloroquine）是一种内吞作用阻断剂，最初是基于细胞系研究提出的，并被广泛用于治疗COVID-19 患者。然而，这种药物并不能抑制类器官模型中的病毒复制。这一发现与临床观察结果一致，即（羟基）氯喹对SARS-CoV-2无效，凸显了类器官作为更精确的转化平台在筛选新型药物疗法方面的潜力。更广泛地说，气道类器官可用于研究呼吸道病毒，例如甲型流感病毒 (IAV)、呼吸道合胞病毒 (RSV) 或人鼻病毒C (HRV‑C)）的感染动力学和人畜共患溢出潜力。它们表达TMPRSS2和TMPRSS4，这两种蛋白介导IAV表面⾎凝素的裂解，从而促进病毒与宿主细胞膜的融合。分化的二维类器官（见图3a）可以区分人感染性IAV与人感染性较弱的禽流感和猪流感亚型的复制能力，并已被用于评估近期禽流感H5N6和H5N8毒株的溢出风险。长期可扩张的人类呼吸道类器官也重现了RSV感染的关键特征，包括由非结构病毒NS2蛋白驱动的细胞运动性增强以及在共培养过程中中性粒细胞的优先募集。同样，它们可以维持可重复的HRV‑C传播，从而深入了解病毒与宿主的相互作用。HRV‑C感染后，气道类器官比鼻类器官产生更强的先天免疫反应，用α‑CDHR3和抗病毒药物治疗可显著降低病毒生长，表明它们有潜力成为抗病毒药物开发的平台。 图 3 | 疾病建模和药物安全性评估中的先进类器官系统。  a，物质递送和扩散策略。病原体受体和化合物转运蛋白或通道可能在细胞的顶端表面呈不对称分布。传统的类器官通常包埋在 Matrigel 中，其基底外侧表面（顶端朝内）暴露在外，需要将病原体或化合物显微注射到类器官腔内以提高递送效率。通过去除 Matrigel 生成的翻转（顶端朝外）类器官，在保留类器官三维结构的同时，减轻了与递送和扩散相关的挑战。在二维 Transwell 培养中，类器官细胞的顶端和基底外侧表面都易于接触，能够与外部环境进行全面的相互作用。与Transwell系统类似，生物工程微流控平台能够通过配备入口和出口的多个腔室，精确控制物质从类器官细胞的顶端和基底外侧表面的输送。  b，具有更高组织水平复杂性和组织结构的先进类器官模型。在无Matrigel的悬浮培养系统中，各种细胞类型的混合物可以自发聚集形成组装体，细胞外基质由内皮细胞和基质细胞等不同细胞类型提供。尽管组装体显著增强了细胞复杂性，但它们仍无法精确地反映组织结构。生物打印的类器官展现出更优异的细胞谱系排列，与天然组织的结构高度相似，即具有更完善的血管网络、神经支配模式和区域划分。当在生物工程芯片上进行培养时，可以利用定制设计，将不同类型的细胞（例如内皮细胞、基质细胞或免疫细胞）系统地整合和组织起来，从而实现复杂的组织级结构。 癌症许多类型的癌症——例如胰腺癌、肝癌和乳腺癌——不会在动物模型中自发形成。当通过引入特定的癌症突变来诱导肿瘤时（这通常需要相当长的时间），它们仍然无法捕捉到人类癌症的复杂性和异质性，包括其遗传多样性和免疫微环境。过去十年，患者来源的肿瘤类器官（patient-derived tumour organoids, PDTOs）的出现极大地扩展了临床前癌症模型的种类。这些培养物几乎可以从所有癌组织中轻松建立，使用活检或切除材料作为起始组织。它们易于规模化，能够高度重现原发肿瘤的组织学、遗传学和转录组学特征，并且可以稳定地异种移植到小鼠体内进行体内表征。携带特定基因突变的PDTOs可以独立于通过突变激活的致癌通路发出信号的生长因子而生长。例如，携带KRASG12V突变的类器官可以在缺乏表皮生长因子（EGF）的情况下生长，而EGF是健康类器官生长所必需的，这种方法常用于区分肿瘤来源的增生和正常组织生长。药物测试研究进一步证实了肿瘤类器官的实用性，这些研究显示了突变特异性的细胞毒性效应。例如，对ERBB家族受体酪氨酸激酶的不可逆抑制剂阿法替尼（afatinib）的敏感性与乳腺癌类器官中HER2的表达水平相关。类似地，具有BRCA1/2突变特征的类器官对聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂更敏感，从而导致肿瘤细胞死亡。此外，可以通过对野生型类器官进行CRISPR基因编辑，逐步引入致癌突变，从而构建特定的癌症模型。这种人工构建的癌症类器官在异种移植后能够产生预期的组织学特征。PDTOs及其对应的健康类器官已在多种肿瘤类型中⼴泛构建并储存于生物样本库中（详见表2和补充表1）。这些PDTOs反映了肿瘤间和肿瘤内的异质性，可用于研究肿瘤的演变和进展、测试治疗反应的差异性、了解耐药机制以及识别新的治疗靶点。例如，MCLA‑158（petosemtamab）是一种靶向EGFR和LGR5的双特异性抗体，完全利用结肠癌PDO细胞系开发而成。重要的是，PDTOs对其亲代肿瘤组织表现出与亲代肿瘤组织相当的抗肿瘤疗法敏感性，这突显了PDTOs在药物筛选中的可靠性。值得注意的是，在“基态(ground state)”下，PDTO细胞系不含免疫细胞、肿瘤基质或⾎管，但这些成分可以通过共培养轻松添加，这得益于微流控系统和生物工程技术，例如芯片上的类器官和3D生物打印（见图3b）。尽管类器官具有这些优势，但它们代表了一种高度还原论的实验平台，虽然读数往往稳健且可重复，但在将类器官常规应用于药物开发之前，必须根据现有的体外平台、动物研究和临床试验数据对结果进行⼴泛验证。PDTOs在推进多种癌种的个性化医疗方面展现出前景，类器官药物反应与胰腺癌、胃肠道癌以及乳腺癌等临床结果之间存在相关性。然而，其更⼴泛的转化应用仍需最终证实，目前正在进行多项随机临床试验以评估其预测价值，尤其是在放疗和化疗方面。重要的是，在肿瘤学以外的领域，转化证据仍然匮乏，且缺乏对照临床验证。此外，阴性预测数据鲜有报道，这限制了我们对基于类器官的预测局限性的理解。在神经系统疾病和其他复杂的系统性疾病中，类器官还面临着模拟多细胞相互作用和系统药代动力学的困难，这限制了其预测效用。 表 2 | 用于药物筛选和评估的代表性PDTOs生物样本库 转化安全应用尽管大多数研究都集中在类器官的药物疗效和疾病建模上，但现在类器官在制药行业的应用正在扩大，以评估药物化合物在多个器官中的安全性。肝毒性肝脏在药物代谢中起着核心作用，肝毒性是导致药物减产、撤市和获批后使用受限的主要原因之一。药物性肝损伤（Drug-induced liver injury, DILI）是治疗相关发病率和死亡率的重要原因，预测和减轻仍然具有挑战性。源自TSCs或PS细胞的肝脏类器官为预测药物性肝毒性提供了一个有前景的机会。由PS细胞分化而来的功能成熟的人类肝脏类器官（human liver organoids, HLOs）能够重现已知的曲格列酮（一种因肝毒性而被撤市的抗糖尿病药物）、对乙酰氨基酚（也称扑热息痛；一种广泛使用的镇痛药）以及抗生素曲伐沙星和左氧氟沙星的肝毒性，并且在临床相关浓度下，其敏感性高于二维肝细胞。同样，TSC来源的HLOs在模拟药物诱导的磷脂沉积症（一种与多种药物相关的严重不良反应）方面优于传统的肝细胞癌来源的HepG2细胞，这凸显了它们在评估代谢物介导的肝毒性方面的能力。此外，PS细胞衍生的HLOs已被用于建立大规模化合物筛选的高通量检测方法，能够准确注释238种药物的DILI潜在风险，并利用多重读数证明其能够模拟个体供体对波生坦（一种内皮素受体拮抗剂，可引起胆汁淤积性肝损伤）的基因型特异性易感性。基于这些进展，HLOs能够模拟一系列DILI相关表型，包括脂肪变性、纤维化和免疫反应，并与使用对乙酰氨基酚和TAK-875（一种G蛋白偶联受体40 (GPR40)激动剂，曾用于治疗2型糖尿病，但因肝毒性而停用）等化合物的临床数据高度一致。HLO的应用范围不断扩大，已被用于研究氯丙嗪诱导的胆管损伤，并证实该模型能有效模拟药物引起的胆道毒性。最近，HLOs还被用于评估AAV载体，AAV载体广泛应用于基因治疗，特别是肝脏靶向治疗，为评估基因治疗开发中载体的性能和靶向肝毒性提供了一个新的平台。肾毒性尽管人多能干细胞来源的肾脏类器官仍缺乏一些关键的转运蛋白和肾小管滤过功能，但它们可以模拟药物引起的急性肾损伤，这是药物研发中一个重要的安全隐患。这些类器官包含肾单位、集合管、肾间质和内皮细胞，并且可以自组织成类似肾单位的结构，包括足细胞、近端小管、亨利氏袢和远端小管，进一步重现了体内肾单位的组织结构。研究表明，这些类器官对顺铂和庆大霉素等肾毒性药物表现出不同的细胞凋亡反应，并伴有肾损伤标志物肾损伤分子1 (KIM1) 的剂量依赖性上调，从而确立了其在肾毒性测试中的应用价值。后续研究进一步改进了肾脏类器官模型，以更好地模拟肾毒性反应。顺铂和阿霉素诱导的损伤，包括剂量依赖性细胞凋亡，已在传统类器官和悬浮培养的微型类器官中得到重现，生物打印的肾脏类器官也已证实对阿霉素和氨基糖苷类抗生素具有毒性。一种包含灌注外周⾎单核细胞(PBMC) 的免疫活性⾎管化芯片肾脏类器官系统，进一步实现了对免疫介导毒性的评估，例如，针对HLA‑A2呈递的WT1肽段的T细胞双特异性抗体(TCB)可选择性地杀伤表达WT1的细胞。这凸显了该系统在动态微环境中评估化学和免疫介导毒性的能力。 胃肠道毒性 利用类器官模型更好地预测小分子和大分子药物的胃肠道毒性，可以大大改善临床前风险效益评估，并减少药物开发过程中的损耗。一项开创性研究利用人回肠TSC衍生类器官构建了药物性腹泻模型，建立了一种基于类器官的检测方法，并用31种参考药物进行了验证。该检测方法在预测药物性腹泻的临床发生率方面表现出90%的准确率。在此基础上，研究人员利用TSC衍生的小肠和结肠类器官探索了胃肠道毒性的分子决定因素，并研究了阿霉素和吉非替尼诱导副作用的机制。一种经济高效的肠道类器官培养方法已被开发出来，能够对小分子进行表型高通量筛选，从而简化临床前工作流程。利用该平台，未分化的人类类器官可以准确区分具有细胞毒性或非细胞毒性的化合物。此外，比较人、大鼠和犬类类器官中化合物的反应，揭示了物种特异性的敏感性差异，这与临床前研究结果一致，并证明了类器官在早期安全性评估中的实用性。肠道类器官平台的预测能力还扩展到对蛋白质生物制剂（如TCB）的“靶向、脱靶”效应的评估，包括缺乏交叉反应的临床前物种。补充了免疫细胞的肠道PDOs和肿瘤类器官已显示出TCB的组织特异性脱靶毒性，成功捕捉到了缺乏这些免疫成分的传统组织模型无法预测的临床不良反应。进一步拓展这一方法，通过将上皮类器官与自体组织驻留记忆（tissue-resident memory, TRM）T细胞整合，生成了人肠道免疫类器官，并已用于研究癌症患者中观察到的TCB诱导的肠道炎症。 中枢神经系统毒性 药物引起的神经毒性是候选药物研发中止的主要原因，据报道，中枢神经系统不良反应导致早期和晚期项目中止的7%-34%。类器官为揭示使用更传统的方法可能无法检测到的毒性机制提供了一个强大的模型。诸如二维细胞培养等较为简单的系统可能会忽略依赖于细胞与中枢神经系统微环境之间复杂相互作用的独特毒性机制。尽管小鼠模型确实能够复制中枢神经系统的部分复杂性和多样性，但它们可能无法准确代表人类对毒素的特异性反应。例如，由于缺乏类似于人脑组织的体外模型，长春新碱神经毒性的机制研究历来集中于外周神经元。而最近，iPS细胞衍生的脑类器官揭示了长春新碱对大脑发育的神经毒性作用，并确定了细胞外基质（ECM）介导的信号通路，同时强调了基质金属蛋白酶在这一过程中的作用。这些发现强调了利用复杂的三维脑类器官系统探索可能涉及发育中人脑组织结构和细胞复杂性的毒性机制的重要性。脑类器官可以长期培养以使其功能成熟。成熟的脑类器官已被用于研究治疗难治性抑郁症的药物反苯环丙胺对大脑发育的影响，并发现其通过抑制BHC110/LSD1靶基因的转录和组蛋白H3赖氨酸4去甲基化，对神经元和星形胶质细胞造成剂量依赖性的脑损伤。最近，iPS细胞衍生的脑类器官已被用于评估化疗药物（特别是紫杉醇）引起的神经毒性，证明了类器官在评估小分子药物引起的神经毒性方面的实用性。 心脏毒性 尽管预测性临床前试验已经发展和实施，但心脏毒性仍然是药物研发失败和上市后撤回的主要原因。由干细胞衍生的心肌细胞和支持细胞类型组成的人类心脏类器官应该能够重现心脏组织结构、收缩功能和电生理的基本方面，从而为预测心脏对药物化合物的反应提供一种替代方法。阿霉素诱导的心脏毒性已在心脏类器官模型中得到验证。阿霉素暴露会降低类器官的活力，增加乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 和脑钠肽(brain natriuretic peptide, BNP) 的水平，并诱导细胞凋亡、纤维化和线粒体功能障碍。在无细胞外基质 (ECM) 模型中，阿霉素治疗会导致类器官萎缩、节律紊乱、胶原沉积、成纤维细胞活化以及内皮‑间质转化的早期迹象。在模拟缺⾎后组织的心肌梗死类器官模型中，阿霉素会加剧缺氧敏感性损伤，破坏协调收缩所需的钙循环，并促进梗死核心区纤维化的出现。心脏类器官平台已被用于筛选一系列具有临床意义的药物。一项评估FDA召回化合物（阿司咪唑、西沙必利、米贝地尔、培高利特、特罗地林、罗非昔布、伐地昔布、溴芬酸、噻吩利尿酸和曲格列酮）的研究表明，类器官比二维单层细胞能更有效地检测剂量依赖性的ATP耗竭和心搏紊乱。此外，高通量筛选还发现了一些靶向GSK3、TGFβ和甲羟戊酸途径的促增殖化合物，这些化合物能刺激心肌细胞增殖，但同时也会导致收缩时间延长或收缩力下降，表明尽管具有再生潜力，但存在功能性副作用。空间组织化的心脏类器官已被用于模拟发育毒性。沙利度胺暴露会减少心脏组织形成并损害其功能，较大的构建体表现出更稳定的搏动模式，而较小的构建体则表现出舒张延迟和形态变异。此外，多器官平台揭示了其他组织中的代谢如何驱动心脏毒性。在肝‑心共培养中，氯丙咪嗪（clomipramine）通过细胞色素P450酶在肝脏中转化为去甲基氯丙咪嗪，导致心脏类器官搏动减少、钙离子流紊乱和细胞死亡；而当缺少肝脏类器官时，则未观察到这些效应，这表明肝细胞是导致所观察到的毒性的原因。一个包含六种组织的平台也同样表明，卡培他滨和异环磷酰胺的肝脏代谢会诱导下游心脏毒性反应，突显了器官间相互作用在心脏毒性中的作用。基于类器官的平台用于临床前安全性研究目前，人们正在探索传统类器官预测现有药物安全性的能力，但新一代生物工程类器官平台凭借其更高的复杂性，已经展现出进一步改进药物安全性测试的能力（图3b）。这类模型整合了⾎管和免疫成分，能够研究药物对组织微环境和全身反应的影响，或者内置生物传感器，可以实时检测ATP与ADP的比值，从而评估药物引起的肾毒性。此外，结合肝脏、心脏、肺、⾎管、睾丸、结肠和大脑的多器官类器官系统已被用于“芯片上的身体”平台，从而能够筛选FDA召回的药物，并深入了解多器官毒性和系统相互作用。类似地，肝脏和胰岛类器官的微工程组装体被用于测量二甲双胍的活性。近年来，生物工程二维类器官，例如芯片上的微型结肠和微型肠道平台，通过维持类器官的分化和顶底极性，同时促进流体流动，从而进一步扩展了药物安全性评估能力（图3a）。在这种设置中，三维类器官被“打开”，其外侧或基底面被放置在二维基质上。类器官的内侧/腔面/顶端面可以从上方自由接触。这种方法已被证明对测试靶向干细胞的癌症化疗药物（例如阿糖胞苷和idasanutlin）尤为有效。这些结合了类器官生物学和生物工程方法的先进平台，为应对作用机制日益复杂的治疗药物所带来的转化安全性挑战提供了新的选择。此外，基于Transwell的类器官单层还可以利用跨上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance, TEER）测量对上皮屏障完整性进行定量评估，从而提供组织极化和紧密连接功能的非侵入性和动态读数。值得注意的是，作为TEER测量的替代方法，利用荧光染料跨组织屏障扩散的基于图像的检测方法也被用于确定体外完整肠道类器官的屏障完整性，方法是将荧光染料添加到培养基中，并在屏障降解后观察其内化情况，或者直接将染料微注射到类器官的腔内空间，并量化上皮屏障的渗漏性。基于类器官的吸收和代谢测定预测药物的吸收、分布和代谢是药物研发的关键，它直接影响药物的药代动力学，进而影响候选药物的疗效、安全性和剂量。了解这些参数对于优化药物制剂、减轻不良反应和确保临床成功至关重要。肝脏、肠道和肾脏是负责药物吸收、代谢和清除的主要器官，因此也是制药行业关注的主要体外器官模型。用于药物代谢的肝脏类器官肝脏是药物代谢的主要器官，促进三个关键过程：某些药物被肝脏主动摄取、生物转化成代谢物以及药物和代谢物分泌到胆汁中。目前最先进的体外模型，例如短期悬浮的冷冻保存的原代肝细胞或肝细胞共培养系统，可用于测定药物的固有清除率和主动摄取。然而，这些模型存在一些局限性，例如无法完全复制肝脏代谢和转运表型（原代人肝细胞在培养中迅速恶化）、细胞与培养基比例欠佳（影响代谢和转运过程的测量能力）以及评估胆汁分泌的能力有限。肝细胞系表达的药物代谢酶和转运蛋白水平不足，限制了其预测人体药代动力学的能力。为了解决这个问题，研究人员开发了一种源自TSC的肝脏类器官系统，该系统表达多种I期药物代谢酶（例如细胞色素P450酶CYP3A4和CYP2D6，它们对药物进行化学修饰）、II期酶（例如UDP-葡萄糖醛酸转移酶和磺基转移酶，它们将这些代谢物结合以促进其排泄）以及药物转运蛋白（包括阴离子转运蛋白OATP1B3、ATP依赖性转位酶ABCB1（也称为MDR1）和MRP3）。该系统与微流控芯片集成，已被应用于研究咪达唑仑的代谢和生物利用度，以及在结合肠道和肾脏类器官的多器官平台上研究香豆素和二甲双胍的排泄。此外，肝内胆管细胞类器官（intrahepatic cholangiocyte organoids, ICOs）已被用于评估对乙酰氨基酚、羟基咪达唑仑和7-羟基香豆素葡萄糖醛酸苷的代谢产物生成。尽管ICOs成功模拟了代谢产物的产生，但其CYP酶表达水平低于原代人肝细胞，这凸显了进一步优化以匹配原代组织功能的必要性。用于药物代谢和转运的肠道类器官早期概念验证研究表明，肠道类器官系统有助于更好地理解和预测肠道吸收和代谢。地塞米松、β‑萘黄酮和组成型雄甾烷受体激动剂TCPOBOP可成功诱导TSC来源的肠道和肝脏类器官中CYP酶的活性，从而开展药物代谢研究。事实上，小鼠来源的隐窝类器官已被用于研究肠道药物代谢酶（drug-metabolizing enzymes, DMEs），结果表明前药CPT‑11可转化为其毒性代谢物SN‑38。人十二指肠类器官已被用于研究肽类药物的转运，结果表明其可吸收头孢羟氨苄、β‑内酰胺类抗生素和环状六肽。此外，基于Transwell小室的二维单层培养系统便于进行双向（顶端/基底）转运研究（图3a）。如上所述，这种二维培养系统以三维类器官为基础，将其打开并置于二维基底上。在三维类器官中，将化合物递送至上皮细胞顶端需要注射到类器官腔内，而二维Transwell培养系统则可以轻松接触到上皮结构的顶端和基底侧（图3a）。因此，富含肠细胞的极化人十二指肠类器官单层培养物能够成功区分高渗透性和低渗透性化合物，并显示出主要外排转运蛋白（包括MDR1和BCRP1）的功能活性。此外，三维十二指肠和结肠类器官对I期和II期DMEs表现出代谢活性，且不同节段的差异与已知的DMEs表达谱相符。为了能够直接接触顶端表面，研究人员构建了具有反转上皮极性的PS细胞来源的肠道类器官，这有助于研究转运蛋白和酶的活性。这些“由内而外”的类器官（图3a）显示，利福平和骨化三醇可诱导CYP3A4和MDR1的功能表达，而维拉帕米和伊伐卡托则可抑制其表达。用于药物运输和清除的肾脏类器官尽管复杂的肾脏芯片系统、生物打印肾脏模型和⾎管化类器官芯片平台取得了进展，但肾脏类器官在药物转运和清除研究中的实际应用仍然有限，鲜有令人信服的应用案例。一种基于类器官的近端肾小管上皮细胞芯片模型显示，关键转运蛋白（包括有机阳离子转运蛋白2 (OCT2)、有机阴离子转运蛋白1 (OAT1) 和OAT3）的表达显著上调。与使用永生化近端肾小管上皮细胞的对照芯片相比，这种增强的转运蛋白表达提高了药物吸收率。类似地，一种基于尿液来源肾脏类器官的肾小管芯片平台在微流控系统中模拟了功能性肾小管屏障。利用荧光罗丹明，该模型已证实了OCT1和OCT2介导的转运，突显了该平台在研究P‑糖蛋白活性和跨上皮药物转运方面的实用性。类器官在ADME中的应用类器官在吸收、分布、代谢和排泄（absorption, distribution, metabolism, and excretion, ADME）领域的应用仍然有限。主要挑战包括肝脏和肾脏类器官分化成熟度相对不足。此外，尽管存在转化性方面的限制，但动物药代动力学研究的相对简便性往往超过了基于类器官平台预测的预期优势。要确定药物的ADME参数，需要一个具有代表体内情况的酶活性、能够重现人体生理功能的屏障功能以及足够组织量（数百万个细胞）以催化药物生物转化的平台。尽管如此，人们已经开始探索利用类器官来解决与ADME相关的问题。尽管存在技术挑战，类器官在满足ADME测试需求和解决预测药物代谢途径的关键行业难题方面展现出巨大潜力。对于小分子药物而言，类器官主要优势在于能够重现相关的转运、屏障功能和生理代谢活动。近年来，具有功能性肝胆结构的肝脏类器官取得了显著进展，有望弥补药物胆汁清除评估中的关键空白；肾脏类器官的研发进展则可用于加强药物肾脏分泌的临床前评估。类器官能够忠实地模拟组织靶点的表达，这对于评估大分子结合、靶点评价以及靶点介导的药物处置尤为重要。将流体连接的类器官组织与⾎管类器官相结合，有望通过重复取样和精确评估药物代谢及向靶组织的递送，解决药代动力学和组织分布方面的难题。应对当前挑战的潜在解决方案如上所述，类器官技术仍面临诸多挑战，限制了其在药物研发中的广泛应用。其中一个挑战在于，尽管类器官比细胞系复杂得多，但它们仍然是一种还原论模型，缺乏真实组织的基本要素。大多数类器官缺乏血管，这限制了营养和氧气的输送，从而影响其生长、成熟和功能，尤其是在较大的类器官中。由于大多数药物都是通过静脉注射给药，类器官模型缺乏血管化给药物的准确评估带来了挑战。类器官培养通常不包含免疫细胞，因此对免疫反应、炎症或免疫疗法相互作用的分析也面临挑战。其他复杂的组织成分，例如细胞外基质（ECM）、基质细胞和神经元，在类器官中也缺失，这影响了它们的功能和疾病建模能力。类器官无法模拟系统性相互作用，例如激素信号传导或多器官串扰。原代组织会受到生物力学力的作用，例如剪切应力、拉伸和压力，这些作用力很难在类器官培养中重现。另一个主要障碍是类器官培养的变异性，这会导致难以实现可重复性：不同实验室之间的实验方案差异，例如细胞来源、培养基成分和生长条件的不同，会导致类器官发育的不一致性；来自不同患者供体的细胞的遗传多样性会导致不同批次类器官之间的差异；实现均匀且可控的分化或功能仍然具有挑战性，并导致类器官批次内部和批次之间的异质性；数据分析通常需要复杂且定制的分析工具，这也增加了研究过程和结论的复杂性。这些局限性反过来又使类器官作为高通量筛选和大规模药物测试的标准化模型的应用变得复杂。同样，可扩展性仍然是药物研发面临的挑战。克服这些挑战需要改进培养方案、整合微流控技术并提高模型复杂性，这些共同作用将使类器官能够充分发挥其作为个性化医疗和药物发现可靠工具的潜力。 图 4 | 自动化高通量药物筛选策略。  a，一种传统方法，使用多滴装置自动将类器官-Matrigel混合物接种到多孔板中。  b，生物工程微流控装置能够快速生成大量重复的类器官液滴，并精确控制其形状、大小和细胞数量。  c,d，这些类器官液滴随后可以引入多孔板（a部分）、微孔阵列（c部分）或微柱芯片（d部分）中进行进一步的药物评估。不同的颜色代表微孔中不同的药物。  e，多腔微流控芯片可用于高通量筛选 (HTS)，只需将类器官细胞直接接种到腔室中即可；或者，它可以无缝集成到现有的 HTS 装置（即微孔或微柱芯片）中，以方便药物递送。  f，自动化成像和数据处理，基于荧光或吸光度读数，并借助人工智能 (AI) 驱动的算法。高通量筛选 (HTS) 读数示例包括细胞活力检测，例如 CellTiter-Glo 或 MTT；用于传染病药物筛选的荧光病原体；以及基于疾病相关表型的评估，例如疾病标志物的表达、疾病酶的活性、用于监测代谢性疾病中代谢物动态的荧光染料以及与疾病相关的形态学变化。 传统的基于类器官的药物筛选方法是将类器官包埋在基质中，然后将其接种到多孔板中，并在上面添加培养基。自动化机器人和液体处理系统可以简化这一过程（图4a）。该方法已用于从乳腺癌和结直肠癌（colorectal cancers，CRCs）衍生的PDTOs的药物筛选。然而，该方法缺乏对播种类器官的数量和空间分布的精确控制，限制了高通量筛选检测的可重复性。生物工程微流控装置能够快速生成大量嵌入少量细胞外基质（ECM）中的重复类器官，例如Matrigel——一种从Engelbreth‑Holm‑Swarm小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜，富含ECM蛋白（层粘连蛋白、IV型胶原蛋白和纤连蛋白），可维持细胞极性和存活。这些装置可将类器官接种于多孔板、微孔/微阵列或微柱芯片中（图4a‑d），从而精确控制类器官的形状、大小和细胞数量，显著提高其均一性和可重复性（图4b）。此类系统非常适合高通量筛选（HTS），因为高通量筛选需要简便且稳健的检测方法。理想情况下，生成的类器官应均匀分布在水平和垂直平面上，以便进行基于成像的表型分析。例如，嵌入多孔板中的微工程水凝胶薄膜可以同时生成数千个均匀的类器官，这些类器官被捕获在同一焦平面上的微腔阵列中，从而能够对数千个经抗癌药物治疗的CRC类器官进行实时自动成像。利用微流控技术高通量打印Matrigel包埋的类器官液滴，可确保类器官间的同质性，同时保持组织异质性，从而提供与患者预后相符的可靠药物反应预测。这种小液滴形式具有较大的表面积/体积比也能够实现高效的病毒感染和T细胞穿透，并已应用于SARS-CoV‑2的药物测试和快速嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）‑T细胞效力检测。微孔阵列（图4c）已被用于分析肺癌类器官，预测一周内的药物反应，而3D培养的神经干细胞在384微柱板中生长（图4d），从而能够对大型化学库进行神经毒性筛选。这些3D高通量平台通常使用生物相容性涂层基质，例如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、水凝胶或Matrigel，以维持类器官的3D结构并支持细胞生长。对于某些类型的类器官，例如脑类器官和肝脏组装体，可以使用带有转子装置的超低吸附培养板进行无基质悬浮培养。这些悬浮培养还可以集成到微流控系统中，以生成尺寸可控的均一类器官，用于高通量筛选（HTS）分析。自动化方法自动化技术的早期发展进一步改进了类器官与基于微流控的高通量筛选平台的整合（图4e）。例如，Mimetas的器官培养板能够实现培养基的自动更换、对环境条件的精确控制，甚至在极少人工干预的情况下进行药物筛选。该平台已被用于测试肝脏类器官的肝毒性和肺部类器官的呼吸系统疾病模型，展现了自动化在药物筛选和疾病建模方面的潜力。Emulate也推出了另一种早期的芯片类器官方法。轨道摇床平台可实现类器官的自动化培养，并维持持续温和的振荡，这对于3D类器官培养的最佳生长和均一性至关重要。此类系统可与多孔板集成，以实现规模化培养。类器官研究中自动化的另一个显著例子是利用高通量自动化平台培养和筛选源自结直肠癌、胰腺癌和其他癌症的PDTOs。该平台集成了机器人液体处理系统，可自动进行培养基更换、药物添加和化合物筛选，从而能够快速测试大型药物库。为了从类器官复杂的组织结构中提取信息，基于图像的技术和高内涵筛选系统已被集成到类器官自动化系统中，以实现稳健的数据采集和分析。荧光显微镜和自动化成像平台（例如CellInsight CX7）能够实时监测类器官的生长、形态变化和药物反应。这些系统利用计算机视觉和图像分析算法来量化细胞活力、结构完整性、基因表达和药物疗效等参数。例如，在阿尔茨海默病（AD）研究中，研究人员已利用自动化显微镜系统筛选脑类器官，以评估靶向淀粉样斑块或tau蛋白缠结的候选药物的效果。对于自动化高通量筛选（HTS）检测的读数，最简单可靠的方法是对荧光或吸光度信号进行定量（图4f），例如⼴泛使用的基于CellTiter‑Glo或MTT的细胞活力检测。酶标仪生成的数据可以进行数字化定量，并直接使用标准化的统计方法进行处理。这些原理可以扩展到疾病特异性读数的设计。例如，关键疾病蛋白的表达或活性（例如，AATD中的A1AT生成）可以与催化化学反应或ELISA检测相关联。疾病相关表型（例如，脂肪肝疾病中的脂质积累）可以使用荧光指示剂进行可视化，并通过表型成像进行分析。一些遗传性疾病可以使用功能性检测进行检测（例如，CFTR功能介导的肿胀检测）。传染病相关药物筛选可能依赖于荧光标记的病原体或病原体相关RNA或蛋白质的检测。此外，先进的组织学技术（一种高度标准化的方法，常用于诊断和毒理病理学，并以形态学为终点）正逐步应用于类器官研究，以提高其通量和标准化程度。类器官可以固定于福尔马林中并包埋于石蜡（fixed in formalin and embedded in paraffin, FFPE），也可以新鲜冷冻后包埋于最佳切割温度化合物或明胶中。组织微阵列可以将一整块96孔板的类器官包埋于FFPE块中，为人工智能（AI）支持的定量图像分析提供了一个强大的工具，该分析方法源自新兴的数字病理学领域。这使得分子病理学方法——包括免疫组织化学、多重免疫荧光、空间转录组学和电子显微镜以及基质辅助激光解吸/电离（MALDI）成像——能够应用于类器官系统。监管方面的挑战和机遇 尽管类器官具有诸多优势，但监管审批仍然是其顺利融入药物研发流程的一大障碍。解决这些挑战有助于加强药物安全性评估，促进更有效疗法的开发，并减少对动物试验的依赖。类器官在药物安全性测试中的应用类器官在药物安全性测试中应用的主要挑战仍然在于模型验证、可重复性、临床转化、成本效益优化以及监管审批。为了支持首次人体临床试验，临床前测试通常结合体内和体外模型，以最大限度地提高临床预测能力，同时最大限度地减少动物的使用。当需要功能性和生理相关的终点指标时，类器官可以作为传统二维细胞培养实验的补充，尤其是在解决机制问题时。然而，目前监管审批更倾向于采用复杂度低、通量高、成本低的体外工具。证明其相对于传统方法的明显优势，例如在特定应用场景中具有更强的预测能力，对于更广泛地应用至关重要。此外，扩大在不同使用环境和治疗方式中的资质认证工作，对于提高人们对类器官预测价值的信心，使其优于更简单的传统体外方法，至关重要。值得注意的是，尽管类器官作为毒性预测的转化模型展现出潜力，但本文所呈现的大多数研究仍处于临床前概念验证阶段，缺乏体内和患者数据的验证。未来需要开展更多正向和反向转化研究，以确立类器官作为转化医学的标准。类器官在临床前药物开发中的应用通常分为两类：内部决策（例如，筛选和机制研究）和纳入监管文件。制药公司已在特定使用背景下使用类器官进行探索性和机制研究，但这些研究很少对确定临床试验的安全性起关键作用。类器官的复杂性也带来了实际操作上的障碍。它们的构建和维护需要大量的时间、资源和技术专长，通常需要先进的成像和数据分析流程。对于资源有限或应用场景零星的机构而言，维持内部所需的专业技术可能并不现实。将类器官研究外包给拥有大量类器官项目且商业模式稳健的专业合同研究机构，是内部研发之外的可行选择。此外，标准化和自动化实验方案、简化工作流程对于充分发挥类器官的效用，并确保其融入药物研发流程至关重要。类器官在药物研发中的应用监管框架在首次人体临床试验之前进行非临床研究的目标是：评估产品的药理活性，并确保健康志愿者或患者在I期临床试验中的安全性。对于人类药物研发，FDA法规并未规定用于支持一种拟用于临床研究的药物在人体中安全可能性的研究类型或设计（无论是体内、体外还是计算机模拟）。尽管动物毒性研究已被证明对于识别潜在的人类风险至关重要，但寻找减少动物使用并开发有效替代方案的方法是一项重要的工作。在监管层面，对更多具有人类预测性的转化平台和技术（例如类器官）有着巨大的需求，这些平台和技术被定义为新方法论（new approach methodologies, NAMs）。美国国会于2022年通过了《FDA现代化法案2.0》，随后又通过了《FDA现代化法案3.0》，明确了药物研发中动物试验的必要性。这要求FDA建立一条途径，允许相关机构申请批准非临床试验方法用于特定用途。为此，FDA启动了“替代方法计划(Alternative Methods Program)”，旨在：首先，扩大替代方法获得监管认可的流程；其次，为开发替代方法的外部利益相关者提供明确的指导方针；第三，通过应用研究填补信息空白，以推进新政策和指南的制定。最近，FDA宣布计划用一系列实验室方法（包括基于人工智能的毒性计算模型、细胞系和类器官毒性测试）取代单克隆抗体疗法和其他药物研发中的动物试验。然而，要成功地将类器官应用于临床前测试流程，需要对其进行适当的表征、验证和鉴定，以向最终用户和卫生监管机构证明其适用于特定用途或使用环境。经济合作与发展组织 (Economic Cooperation and Development, OECD) 对验证原则进行了详尽的阐述，并为如何评估类器官在不同使用环境中的适用性提供了有益的指导。此类评估是监管环境下常用的标准方法。目前，跨行业联盟和卫生监管机构正在共同努力，以期获得包括类器官在内的NAMs的监管认可，重点在于制定标准和培训相关人员。理想情况下，由生物工程师、生物学家、毒理学家和病理学家等不同领域的科学家组成的团队应合作开发类器官模型，并共同评估其使用环境。监管展望目前，经合组织（OECD）测试指南中仅描述了少数基于细胞的测试方法。大多数毒性测试仍属于非指南方法。近期，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）都提出了推进NAMs在药物研发中监管认可的路线图。例如，EMA的自愿提交数据程序（也称为“安全港”方法）旨在允许生成、收集和审查数据，以帮助确定NAM的使用背景。此外，EMA还会评估特定NAM在特定使用背景下获得监管认可的准备情况和局限性。此过程旨在建立对NAM的信心，并可能支持基于已定义的使用背景制定资格标准，从而指导模型开发者如何对新型模型进行资格认证以用于监管申请。FDA的路线图则侧重于在几年内逐步取代单克隆抗体和其他药物的动物试验。因此，逐步将类器官作为非动物模型纳入监管申报，以替代、简化和优化动物模型，具有潜在价值。然而，这不应降低药物评估所需的既定标准。至关重要的是，要保持谨慎的平衡既要接纳包括类器官在内的这些创新方法，又要坚持欧洲药品监管⽹络（EMRN）的严格标准。结论类器官在药物研发中的应用为临床前研究带来了变革性的⻜跃，使其能够构建更精准、更贴近患者的模型。如前所述，类器官能够重现人体组织的复杂性，提供比传统二维细胞培养和动物模型更符合生理环境的实验条件。然而，尽管该领域已取得显著进展，但仍面临诸多挑战。类器官培养的可扩展性和可重复性，尤其是在高通量筛选的背景下，仍需进一步改进。这需要持续开发和验证标准化、自动化的类器官平台，并建立清晰的监管框架，以促进其在业界的应用。此外，提高类器官对人类治疗反应的预测能力尤其是在癌症、神经退行性疾病以及慢性炎症和代谢性疾病等复杂疾病方面还需要在⾎管化、免疫系统整合和多器官建模等方面进行创新，并结合单细胞组学、高速图像采集和人工智能辅助数据分析等前沿分析技术。随着技术的成熟，我们预期基于类器官的平台将成为药物研发流程中不可或缺的一部分，弥合基础科学与临床结果之间的鸿沟。类器官有望彻底改变我们理解和治疗疾病的方式，其在药物研发领域的未来潜力巨大。Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H. &Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breastepithelial cells. Nat. Methods 4, 359–365 (2007).  本文代表了使用Matrigel作为支架进行上皮细胞3D培养的突破。Eiraku, M. et al. Self-organizing optic-cupmorphogenesis in three-dimensional culture. Nature 472, 51–56 (2011).  该研究结果表明，ESC聚集体可以自主组织成结构化的3D培养物，从而建立了第一个PS细胞衍生的类器官模型。Sato, T. et al. Single Lgr5 stem cellsbuild crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262–265 (2009). 这项概念验证研究报告了首例源自TSC的肠道类器官，证明TSC在生成类器官方面的应用潜力。Dekkers, J. F. et al. A functional CFTRassay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat. Med. 19,939–945 (2013).  这项研究开发了第一个利用类器官评估CFTR功能的体外检测方法，该方法已进一步应用于个性化CF治疗。Geurts, M. H. et al. CRISPR-based adenineeditors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell 26, 503–510.e507 (2020).  这项关于PDOs的研究凸显了基于CRISPR的基因编辑技术在纠正与CF相关的致病突变方面的潜力。Igarashi, R. et al. Generation of humanadult hepatocyte organoids with metabolic functions. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-025-08861-y (2025).  本研究报告称，直接从成人肝组织中建立了可扩增和功能性的肝细胞类器官。Hendriks, D. et al. Engineered humanhepatocyte organoids enable CRISPR-based target discovery and drug screeningfor steatosis. Nat. Biotechnol. 41, 1567–1581(2023).  这项代表性研究将肝细胞类器官系统与表型成像技术相结合，以增强常规药物筛选和基于CRISPR的机制探索。Santos, A. J. M. et al. A human autoimmuneorganoid model reveals IL-7 function in coeliac disease. Nature 632, 401–410 (2024).  本研究首次引入了乳糜泻类器官模型，将上皮细胞和免疫细胞整合到共培养系统中，以促进潜在治疗靶点IL‑7的识别。Ettayebi, K. et al. Replication of humannoroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science 353, 1387–1393 (2016).  这项研究突出了人类肠道类器官系统在支持完整病毒生命周期方面的优势，而这种能力在传统的2D细胞系中仍然具有挑战性。van de Wetering, M. et al. Prospectivederivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 161, 933–945 (2015). 这项概念验证研究描述了CRC的PDTO生物样本库的建立，重点介绍了它们能够保存细胞异质性和遗传多样性，从而证明其对药物筛选应用具有价值。Matano, M. et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR–Cas9–mediatedengineering of human intestinal organoids. Nat. Med. 21, 256–262 (2015).  作为概念验证，本研究报告称，通过对CRC相关基因进行明确的CRISPR基因编辑，从野生型人类类器官模型中生成CRC类器官，并进一步证明了移植的CRC类器官与实际肿瘤之间的病理相似性。Tiriac, H. et al. Organoid profilingidentifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discov. 8, 1112–1129 (2018).  本文表明，使用PDTOs进行药物分型与个体患者的治疗反应相关，突显了类器官模型作为一种个性化治疗方法的作用。Brandenberg, N. et al. High-throughput automatedorganoid culture via stem-cell aggregation in microcavity arrays. Nat. Biomed. Eng.4, 863–874 (2020).  这项代表性研究展示了一个专为药物发现中的高通量筛选而设计的自动化类器官平台，该平台融合了基于高内涵图像的表型分析。Wang, D., Villenave, R., Stokar-Regenscheit, N. et al. Human organoids as 3D in vitro platforms for drug discovery: opportunities and challenges. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01317-y