CR-8071

摘要本综述分析了乙型流感的流行病学和生态学特征，乙型流感是最常见和最严重的呼吸道感染的流感病毒之一，介绍了开发交叉保护性乙型流感疫苗的各种策略，包括重组病毒、病毒样颗粒和重组蛋白，概述了病毒蛋白作为交叉保护性疫苗靶标，以及其他更新的广泛保护性疫苗策略。开发这种疫苗的重要性不仅在于预防乙型流感，还在于实现根除乙型流感病毒的愿景。关键词：乙型流感，病毒，系统发育谱系，病毒蛋白，单克隆抗体，交叉保护疫苗。1、背景乙型流感是最常见的引起呼吸道感染的流感病毒之一，会造成相当大的公共卫生负担。多项研究表明，20%-30%的流感病毒感染是由乙型流感病毒引起的。全球乙型流感研究（GIBS）数据库中一共覆盖了31个国家的820,301,2000例流感病例（2000年至2018年），其中，乙型流感病例数达419,167例（占23.4%）。在一些流感流行期间，与乙型流感有关的疾病的登记频率与甲型H1N1流感或甲型H3N2流感相同，甚至更常见。乙型流感病毒是流感流行相关发病率和死亡率的重要因素。疫苗毒株的选择具有复杂性，一方面，因为存在两种抗原性不同的系统发育谱系B/Yamagata和B/Victoria以及B/Yamagata谱系的两个分支之间的循环传播；另一方面，乙型流感病毒因不同地区的流行株不同而导致世卫组织推荐的疫苗毒株也可能与在特定地区传播的病毒不匹配。所以，开发一种具有广泛保护作用的疫苗毒株是必要的。世卫组织在“世卫组织下一代流感疫苗的首选产品特性”中宣布的今后十年最紧迫的任务之一是制造对严重和复杂形式的甲型和乙型流感提供长期保护的疫苗。许多国家正在开发这种通用疫苗，但重点是甲型流感疫苗。在本文中，我们试图概述交叉保护乙型流感疫苗的当前发展。流感疫苗病毒内部蛋白质（如PB1，NP和M1）的T细胞表位以及血凝素蛋白HA、神经氨酸酶NA的保守表位是开发设计针对B型流感的广泛保护性疫苗的基础。另外，研究mAb库将有助于鉴定靶蛋白/多肽抗原，并指导新型IBV疫苗的设计，以实现更广泛的保护。2、乙型流感感染的流行病学和生态学特征乙型流感病毒通常与甲型流感病毒共同传播，参与了几乎所有年度流感流行，并且在一些流行中占主导地位。世卫组织俄罗斯国家流感中心（圣彼得堡斯莫罗金采夫流感研究所）也获得了类似的数据。在过去十年的三个流行季节（2012-2013年，2014-2015年，2016-2017年），乙型流感相关疾病的登记频率与甲型流感（AH1N1，AH3N2）相同。在2017-2018年的流行中，乙型流感相关疾病比甲型流感引起的疾病高两倍（未发表的数据）。根据GIBS数据库，每七个流行季中约有1个的主要病毒类型是乙型流感病毒。乙型流感病例占流感总病例的比例因地域而异。与北部或南部半球的温带国家相比，热带区域国家的中位值显著更高。大多数IBV感染发生在儿童和青少年中。人们普遍认为，乙型流感的感染程度低于甲型流感，但目前的研究对这一概念提出了挑战。甲型流感和乙型流感在住院频率、ICU收治率或住院流感患者的死亡率方面无差异。此外，乙型流感在较年轻年龄组和14岁或以上人群中被描述为更严重的疾病。2017-2018年乙型流感主要流行的季节是重症病例最多的季节。根据欧盟/欧洲经济区国家的信息，在重症监护室报告的所有乙型流感感染病例和已知结果中，21%患者在2017/18年度死亡。在致命的乙型流感病例中，79%患者为60岁或以上。在B/Yamagata病毒主导的2012-2013季节也观察到病毒类型与年龄之间的类似相关性。在2019-2020年流感季节，65岁或以上的成年人因乙型流感感染而住院率最高。在≥10岁（相对于<6月龄）的儿童中，与乙型流感感染相关的死亡比例高于甲型流感，且与ICU收治几率相关性最大。一项对美国2004-2019年流感监测数据的分析显示，确诊流感的儿科死亡病例中有7%-51%与乙型流感相关，其中不包括2009-2010年大流行性死亡率。在2012-2013季节，美国乙型流感致死病例的儿科死亡人数达到致命性儿科流感病例的52%。由于第二种抗原性不同的FLUBV谱系的出现，以及社会因素（人口结构变化、城市化进程加快、全球人口流动性增加），FLUBV的进化和传播正在加速。与甲型流感病毒不同，尚未发现乙型流感病毒持续存在动物宿主的证据。仅报告了在海豹中分离到乙型流感（图1) 。研究还表明，猪容易感染乙型流感病毒。一项针对家猪群的血清学调查显示，7.3%的猪血清检测到乙型流感病毒抗体。此外，通过RT-PCR在从PRRSV（猪繁殖和呼吸综合征病毒）猪身上收集的三种鼻拭子中检测到乙型流感病毒。在实验环境中，FLUBV能够在豚鼠和雪貂的呼吸道中复制。然而，不能排除FLUBV的宿主范围比目前理解的要广，或者它们可能会随着时间的推移而扩大。图1 甲型和乙型流感病毒的天然宿主FLUBV 的重要流行病学特征（可能出现全新的大流行病毒）主要受到以下因素的制约：几乎不存在天然储库；人类和动物流感病毒之间缺乏基因重组。在不同的FLUBV谱系中存在基因重组。由于编码血凝素 （HA）、神经氨酸酶 （NA） 和 NS1 的基因突变的积累，也会出现抗原漂移。总体而言，这些表明FLUBV具有很高的适应性进化水平。根据 HA 抗原和基因变异，确定了两个不同的 FLUBV谱系。至少从 1983 年起，这些不同的品系（B/山形/16/88-like（BYam）或 B/维多利亚/2/87-like（BVic）病毒）就在全球范围内共同流行。根据中国科学家的研究，这两个主要的 HA 支系可能在20 世纪70年代初开始分化，维多利亚支系是由一个次要支系逐渐进化而来。如前所述，HA的特征将它们区分开来。到 1988 年，这两个血统的 HA1 结构域已有 27 个氨基酸残基不同。此时在 HA2 结构域之间检测到的氨基酸变化很少，系统发生学分析表明，流行的 B/Yamagata/16/88-like 病毒和 B/Victoria/2/87-like 病毒的 HA2 结构域也属于不同的谱系。然而，这两个 FLUBV 世系之间的 HA 氨基酸序列同源性高于季节性 FLUAV 两个亚型之间的同源性。全基因组分析表明，山形/维多利亚的差异不仅限于HA基因。PB1和PB2 系统发生树显示出与 HA 基因类似的深度分化。PB1 基因、PB2 基因和 HA 基因始终来自一个单系 。因此，Yamagata/Victoria 区分目前仅限于 PB2-PB1-HA 复合体。尽管一些研究表明交叉反应性血清抗体可能很重要，但两种 B 系之间的抗体交叉保护作用被认为很低。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6338745/（访问日期：2022 年 3 月 20 日）-CR16 在实验条件下，BYam 系可能会诱导维多利亚系的交叉抗体反应，但反之则不那么有效。对从接种四价季节性疫苗（IIV-4）的个体中分离出的 B 细胞记忆和单克隆抗体（mAbs）的调查证实了 B/Yamagata H。这两个品系出现后，BVic 在 20 世纪80年代末占主导地位，而 BYam 则在 20 世纪 90 年代占上风。自 2001 年以来，FLUBV 的两个品系在每个流行季节都在全球范围内共同流行。此外，在同一季节和某些地区，两个品系的病毒可以以不同或相同的比例共同流行。Vijakrishna 等人的研究表明，一般来说，BYam 的抗原保守性和抗原漂移性较弱。与 BVic 相比，它们通过抗原漂移进化的能力较弱，受到的免疫选择压力也较小。BVic 系病毒在受体结合位点（RBS）附近的 HA 中含有更多的 氨基酸替换。而 BYam 病毒的变化频率较低，往往出现在距离 RBS 较远的位点上。后来，Langat 等人 利用更大的 FLUBV 全基因组序列数据集（2651 个）和更全面的分析模型，发现 BVic 和 BYam 系之间的抗原漂移率没有显著差异。这支持了 Bredford的观点。虽然 BVic 和 BYam 系的抗原漂移率相当，但它们的进化动态却不同。Yamagata系病毒形成了两个共同循环的支系：支系2（B/马萨诸塞州/02/2012）和支系3（B/威斯康星州/1/2010），它们也在整个病毒基因组中进行基因分离，而Victoria系病毒则表现出单一支系的抗原漂移。BYam群体长期缺乏系内重配，并表现出抗原群之间的交替优势。与此相反，BVic 病毒则有证据表明，随着时间的推移，Victoria 系内各支系之间会发生重配。BVic 病毒在广泛传播之前，在局部地理区域存在的时间更长。一般来说，系统发生分析表明，BYam/BVic 的系间重配（NA、NP）比 Yamagata 的系内重配更频繁。有趣的是，BVic 病毒获得 BYam 基因的系间重配比反向重配更为频繁。BYam和BVic共循环系病毒也会发生PA、NP、NA/NB、M1/BM2和NS1/NS2等片段的重组。大多数研究表明，在年轻人群中，BVic 病毒系比 BYam 病毒系更占优势。利用全球乙型流感监测（GIBS）数据库对两种病毒系的流行病学特征进行的综合比较分析也证实，乙型脑炎病毒和乙型脑炎病毒感染者的年龄分布不均。结果表明，比亚酶病例的平均年龄大于乙型脑炎病例。在大多数国家，BVic 病例往往沿着单峰曲线分布在年轻人（0-25 岁）中，10 岁以下为高峰。而白细胞介素瘤病例的年龄分布往往呈双峰曲线：一个较大的主峰（"10 岁以下者"）和一个较小的次峰（通常为 "25 至 50 岁者"）。一种可能的解释是，BVic 病毒和 BYam 病毒感染后的免疫持续时间不同。造成年龄分布不均的另一个原因是，不同血统的病毒会优先结合人体呼吸道中的不同硅酸受体。BVic病毒似乎同时具有结合α-2,3-和α-2,6-链式硅酸的能力；BYam病毒则主要结合α-2,6-链式硅酸。众所周知，与成人相比，α-2,3-连接的硅唾液酸聚糖在儿童呼吸道组织中的表达量更高。利用 GIBS 发现了一个有趣的趋势：BVic 和 BYam 感染的地理分布不均。BVic在热带国家相对更常见，而BYam在温带气候国家更常见。FLUBV 两种病毒系地理分布不均的一个更可能的原因是全球各国的人口结构各不相同。热带国家的平均中位年龄低于温带气候国家。3、乙型流感病毒和基因组结构，作为交叉保护疫苗靶点的病毒蛋白乙型流感病毒与甲型流感病毒一样，都属于正粘病毒科。两种病毒的基因组都由八个负义单链 RNA 片段组成，编码 11 种蛋白质。在这两种病毒中，FLUA 和 FLUB 的 1、3、4 和 5 号片段每个片段只编码一种蛋白质：分别是 PB2、PA、HA 和 NP 蛋白（图 2）。图2 甲型流感病毒（左侧）和乙型流感病毒（右侧）基因组结构乙型流感病毒有一些不同之处。FLUAV 的第 2 段编码聚合酶亚基 PB1。在某些毒株中，该片段还编码具有凋亡活性的小辅助蛋白 PB1-F2。FLUBV 基因组中没有编码这种附属蛋白的片段。FLUAV 的第 6 个基因片段只编码 NA 蛋白，而 FLUBV 的第 6 个基因片段同时编码 NA 蛋白和 NB 基质蛋白。甲型流感病毒和乙型流感病毒的第 7 个区段都编码 M1 基质蛋白。第 7 节还通过 RNA 剪接编码 FLUAV 中的 M2 离子通道。在 FLUBV 中，BM2 膜蛋白由第 7 节段在交替（+2）阅读框中表达。BM2 是产生有活力的病毒后代所必需的，M2 在病毒中的结合减少会降低病毒的感染性。第 8 节编码干扰素拮抗剂 NS1 蛋白，并通过 mRNA 剪接编码 FLUAV 和 FLUBV 的 NEP/NS2 蛋白。一般来说，乙型流感病毒的组织结构与甲型流感病毒相似，有四种包膜蛋白：HA、NA、BM2 和 NB（而不是 M2）。与 FLUAV M2 蛋白一样，BM2 蛋白也是一个对 pH 值敏感的质子通道，对解衣过程至关重要。BM2 蛋白形成四聚体，极性残基衬托着形成的孔隙，这是金刚烷对 BM2 缺乏活性的一个重要特征。NB 蛋白是乙型流感病毒所特有的。它与病毒结合在一起，具有：18 个残基的 N 端外结构域、22 个残基的跨膜结构域和 60 个残基的细胞质尾部。NB 蛋白被认为也具有离子通道活性。但与离子通道 BM2 不同的是，NB 在跨高尔基网络中没有 pH 调节活性（AM2、BM2 和 CM2 离子通道具有这种活性）。研究表明，体外病毒复制不需要这种蛋白质，但它能促进体内病毒的有效复制。在感染动物体内，缺乏 NB 的病毒诱导的 IFN-ɑ 水平较低，但滴度和体重不变。血凝素是流感病毒的主要表面糖蛋白。它负责病毒附着，并通过与硅酸的相互作用进入宿主细胞。功能性 HA 单元是一个同源三聚体，每个单体由 HA1 和 HA2 两个结构域组成，通过二硫键连接。HA2 形成膜锚和长α-螺旋 "茎 "或 "柄"，HA1 形成远端球状头部，其中包含受体结合位点（RBS）和大部分抗原位点。HA 的头部结构域包含四个免疫优势、高度可变的抗原位点：120 环、150 环、160 环和 190 螺旋。这些是中和抗体的主要靶点，并会发生抗原漂移。中和抗体通过阻断（HA头部的）RBS与（宿主细胞上的）sialic acid受体之间的相互作用来防止感染。通过抗体的 Fab 片段与 HA RBS 之间的相互作用，阻止 HA 附着在细胞上。预防或减轻流感感染的其他方法包括：在病毒进入细胞时抑制病毒与内体膜之间的相互作用；抑制病毒排出；以及 Fc 受体介导的效应器功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）。这些Fc-Fcγ受体相互作用是广谱反应性HA头、HA柄和NA定向抗体在体内介导保护所必需的。广谱中和抗体（bnAbs）在这些过程中发挥着关键作用。值得注意的是，在成年人群中，非经典位点诱导的 HI 抗体滴度几乎与经典位点诱导的抗体滴度一样高，而且非经典抗体反应似乎随着年龄的增长而增加。4、将保守蛋白表位作为开发广泛保护性乙型流感疫苗的目标抗原要成功开发具有广泛保护作用的乙型流感疫苗，就必须了解保守表位的位置和具有广泛保护作用的抗体的作用机制。过去十年中，许多针对 IBV 表面蛋白 HA 和 NA 具有广泛反应性的 mAbs 已被描述。通过非中性抗体依赖性效应器功能的被动转移，已在小鼠体内证实了针对这两种病毒的保护作用。在特定情况下（季节性疫苗株、原发性人类感染），IBV 株系之间的交叉反应性体液反应也已得到描述。针对体内 FLUBV 感染的广泛 FLUBV 识别和广泛的预防/治疗保护可由替代表位介导。具有广泛保护作用的 mAbs 可结合以下部位的保守表位：HA 的柄部、HA 头底部的残余酯酶结构域、HA 球状头部的特定区域以及 NA 酶切位点。值得注意的是，具有广泛保护作用的 HA 靶向 mAbs 与 FLUAV 和 FLUBV 不同。对于 FLUAV，大多数广谱保护性 mAbs 都以柄结构域为靶标；只有少数特殊的 mAbs 与保守的头部结构域表位结合。对于 FLUBV，广谱保护性抗头部抗体更为常见。表 1 列出了其中一些 mAbs。表1 针对乙型流感病毒的交叉反应性单克隆抗体reyfus 等人利用接种疫苗的人的 B 细胞获得了三种广谱中和抗体，这些抗体与两种血统的 HAs都有结合：CR8033、CR8071 和 CR9114。分别给小鼠注射低剂量的这些 mAbs 可完全保护小鼠免受 BYam 和 BVic 系病毒的侵袭。CR8033 和 CR8071 mAbs 可在体外中和 FLUBV 两系的代表性病毒。CR9114 mAb 在体外没有显示出中和活性，但在体内却能提供完全的抗感染保护；这表明 Fc 介导的效应机制参与了抗体的作用。值得注意的是，CR9114 mAb 对甲型流感 H1、H3、H7 和 H9 亚型也有保护作用。抗体 CR8033、CR8071 和 CR9114 识别不同的抗原 HA 表位。根据三维重建，CR8033 的三个 Fabs 与受体结合袋和周围抗原位点重叠的表位上的 HA 三聚体结合。CR8071 与 HA 头底部的残余酯酶结构域结合。CR9114 结合并中和甲型和乙型流感 HA 柄上的一个表位。一种源自人类的 mAb（5A7）能够通过结合柄中 HA1 的 C 末端来中和 FLUBV。在小鼠模型中显示了它对 BVic 株致死性感染的保护作用。三种 mAbs（34B5、33F8 和 46B8）能中和 FLUBV 的两个品系和祖先毒株。抗体 46B8 对所有测试过的 FLUBV 株系都最有效（在中和试验中），时间跨度超过 70 年。它与 HA 的残余酯酶结构域中的一个保守表位结合，通过阻止膜融合步骤中低 pH 引起的 HA 构象变化来阻断 FLUBV 感染。不过，它并不能阻止病毒附着到细胞表面受体上。46B8 mAb 介导的抗体依赖性细胞毒性，虽然不能排除其他 Fc 依赖性效应器功能（如抗体依赖性吞噬作用、抗体依赖性呼吸溶解作用）对 46B8 的体内保护作用的贡献。C12G6 mAb 可交叉中和跨越 76 年 FLUBV 抗原进化史的代表性病毒，包括 BYam、BVic 和早期毒系的病毒。C12G6 具有广泛的预防和治疗活性（在小鼠和雪貂中），效果与奥司他韦相当。表位图显示，C12G6 的目标表位与 HA 区域的受体结合位点重叠。这说明了为什么它能如此有效地中和病毒。C12G6 可通过抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性反应抑制 FLUBV（阻止病毒进入、排出和 HA 介导的膜融合）。利用单细胞筛选技术从人类 B 细胞中获得了一些与 HA 中和或非中和的 mAbs。这些 mAbs 可识别来自两种血统的 HA。其中 11 种是柄结合型非中和剂，9 种是中和剂。后者中有四种在 HI 试验中表现出活性，但未作进一步分析。利用肽与支架的化学连接（CLIPS）技术确定了四种柄结合型中和 mAbs（不包括 TRL847）和两种以前发表的 FLUBV 柄结合型 mAbs 5A7和 CR9114）的表位。在某些情况下可以看到肽识别的趋同模式。例如，TRL849 mAb 和先前表征的 CR9114 mAb 可识别一组相关的肽，尽管它们的 氨基酸序列不同，体内活性也不同。三种 mAb（TRL845、TRL848 和 TRL849）对两种 IBV 系的多种菌株具有广泛的反应性和中和性。它们以及已发表的 mAb 5A7 在体内显示出很高的疗效。Arunkumar等人获得并鉴定了22种针对FLUBV HA的广义反应性（小鼠）特异性mAbs，其中相当一部分mAbs能识别并结合柄上的保守结构域（准确地说，是α螺旋上的）。虽然这些 mAbs 在体外对多种纯化的 FLUVs 没有显示出中和活性，但它们能完全或部分抵御来自两种血统的致死剂量的 FLUBV。在蚕特异性 ADCC 报告实验（测量与 Fcγ 受体的接触）中，保护水平与各自 mAbs 的活性之间也显示出很强的相关性。作者认为保护作用是由依赖 Fc 的效应器功能介导的，但似乎与表位无关。交叉反应抗体提供的保护程度有明确的等级。例如，研究表明，能够介导 HIA 的抗体对实验性 FLUBV 挑战具有最大的预防和治疗保护作用。单克隆抗体可提供中等程度的保护，其特点是可广泛识别 FLUBV 但无 HIA 活性。这些抗体通过 Fc 受体与宿主效应细胞接触来提供保护。最后，与 IBV 柄结构域结合的 mAbs 未能在体外中和，对实验性挑战的保护作用最弱。值得注意的是，与针对 FLUAV 的高度株特异性 HIA 抗体不同，季节性流感疫苗诱导的抗 FLUBV mAbs 通常能识别在 20 多年的抗原漂移过程中在各自的 FLUBV 抗原系中测试的所有株。分离出的多种人类 FLUBV 干结合抗体既能在体外中和，又能在小鼠体内提供有效的跨系保护。在人类中，与 FLUBV 干结合的血清抗体广泛流行，滴度随年龄或 IBV 感染而增加。利用 FLUAV 进行的研究证实，在小鼠挑战模型中，基于抗体的保护可通过直接中和病毒和/或通过 Fc 受体（FcR）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6338745/（2022 年 3 月 20 日访问）-CR35 与宿主效应细胞接触来实现。当 mAb 失去通过其 Fab 结构域中和病毒的能力时，Fc 功能就会在保护中发挥关键作用。FcR 保护功能的参与能力高度依赖于病毒上的表位位置。一般来说，HA 柄特异性抗体可介导 ADCC，并与 FLUBV 的两个系统发育系和随时间演变的不同病毒产生交叉反应。在此之前，已检测到 FLUBV NA 球状头部结构域的高度保守表位和针对 FLUBV NA 的 mAbs，但未对这些抗体进行体内保护评估，也未解决与 NA 结合的抗体结构问题。后来的研究表明，从小鼠和兔子体内分离出的 NA 反应性 mAbs 对两种 IBV 均有保护作用。由于抗 NA 抗体能够与异源毒株的 NA 结合，从而抑制病毒从感染细胞中释放并随后传播，因此它们能够在病毒亚型中形成广泛的防御。Wohlbold 等人利用杂交瘤技术，鉴定出了一组针对 FLUBV NA 的五种具有广泛交叉反应性的小鼠 mAbs。在酶联凝集素试验（ELLA）中，所有 mAbs 都显示出与纯化的全病毒和重组 NA 的交叉反应，并在体外对 NA 的酶活性有功能抑制作用。当小鼠接受五次小鼠致死剂量（mLD50）的属于任一 HA 系的 FLUBV 病毒挑战后，以测试剂量（5 毫克/千克）预防性给药，它们能保护小鼠。在小鼠挑战模型中，1F2 mAb 在 72 hpi 给药后显示出优于奥司他韦标准治疗的疗效。保留的 NA 表位位于分子头部，与酶活性位点不同。对 RNA 与抗体 1F2 和 4F11 的 Fab 部分之间的复合物进行的电子显微镜分析表明，两种 Fab 的结合位点似乎并不直接与 NA 的酶活性位点重叠。因此，抑制 NA 可能并不需要与催化位点直接接触。它可能是通过结合或立体阻碍底物进入 NA 而产生的。4F11 和 1F2 的结构足迹彼此相邻，但又相互独立。与感染了 B/Malaysia/2506/04 (BVic) 或 B/Florida/04/06 (BYam) 病毒株的 MDCK 细胞培养时，所有五种 mAbs 都显示出 ADCC 活性。对人类 FLUBV NA B 细胞反应的详细分析显示，在 IIV 免疫 7 天后，NA 特异性外周血浆细胞同时扩增。这些浆细胞表达的 mAbs 对 FLUBV 两系（BVic、BYam）均具有抗病毒活性，对小鼠具有预防/治疗活性。这些 FLUBV NA 特异性 B 细胞克隆系持续存在于 CD138+ 长寿命骨髓浆细胞中。这项研究证实了 IIV 诱导具有广泛保护潜能的 FLUBV NA 特异性 B 细胞亚群的能力，这对开发具有广泛保护潜能的流感疫苗非常重要。然而，与变异 HA 头部的毒株特异性抗体相比，这种广泛的交叉反应性抗体非常罕见，而且在免疫中处于次要地位。相反，广泛交叉反应的 CD8 T 细胞非常丰富，可导致对流感的大量免疫反应。T 细胞免疫与对流感感染的广泛保护相关。CD8 T 细胞（CTLs）对广泛的异种保护性免疫做出了特殊贡献。流感特异性 CD8 T 细胞可在不同 IAV 亚型和 FLUBV 两系中提供交叉保护。CD4 T 细胞在免疫反应中发挥着重要作用，通常是核心作用，它们通过提高亲和力和转换抗体类别，为 B 细胞合成有效的中和抗体提供 "帮助"。它们还能促进病毒特异性 CD8 T 淋巴细胞反应的发展和维持。此外，以高度保守的流感病毒蛋白为靶点的 CD4 T 细胞具有交叉反应性，甚至能抵御新型和可能大流行的流感毒株。CD4 效应 T 细胞通过刺激 B 细胞成熟和抗体产生，以及通过穿孔素介导的细胞溶解活性（可控制病毒复制），提供不依赖于 IFNγ 的保护。在开发旨在提供有效 T 细胞免疫的疫苗时，应考虑到 CD4 T 细胞的这种非传统作用机制。T 细胞不能提供针对流感病毒的中和免疫力，但能减轻疾病的严重程度，缩短感染持续时间，从而促进疾病的康复。一些 CD4 和 CD8 T 细胞表位在 NP、M1 和 PB1 等内部蛋白中高度保守。这些保守表位已成为开发基于 T 细胞的交叉保护性流感疫苗的主要策略之一。CD8 T 细胞已发现三个 FLUBV NP 表位。其中一个是 NP+82-94 (MVVKLGEFYNQMM)，受 HLA-A*021 限制。另外两个（NP30-38 RPIIRPAT、NP263-271 ADRGLLRDI）受 HLA-B8 限制。然而，只有 NP30-38 肽能诱导 FLUBV 特异性多克隆 CTL 产生γ干扰素。据推测，针对 FLUBV 的 CTL 反应优先针对 HLA-B8 表位。上述 HLA 在人类中很常见；这表明，由于 NP T 细胞表位在全球的高流行率，预计大多数人都能识别该等位基因。在健康捐献者的血液和肺组织中检测到了预先存在的 PB1413-421+ CD8 记忆 T 细胞，在感染 FLUAV 或 FLUBV 后会出现克隆扩增。此外，在大多数（80%）接受测试的供体中都发现了这种 CD8 T 细胞，因此在 HLA-A*02:01 供体中这种细胞非常丰富。候选疫苗 BM2SR 的保护机制部分源于对 FLUBV HA2 柄中更普遍的 CD8 T 细胞表位的反应。CD8 表位 YYSTAASSL（FLUBV HA2+++++190）与 MHC I 类有很高的亲和力，能有效诱导小鼠脾细胞产生 IL-2 和 TNF-α。因此，确定 T 细胞对 FLUAV 和 FLUBV 的交叉反应是了解普遍的抗流感 T 细胞免疫的关键一步。这种交叉反应为设计基于 T 细胞的 UIV 带来了希望。5、开发交叉保护性乙型流感疫苗的策略目前正在研究一些替代策略，以确定其作为通用流感疫苗 (UIV) 平台的潜力。传递平台包括：复制或非复制病毒载体；重组 VLP；重组蛋白或肽疫苗；以及 RNA/DNA 疫苗。此外，UIV 的开发工作主要集中在 FLUAV 上。然而，开发针对两种流感类型（A/B）的疫苗是流感疫苗开发领域的主要目标。迄今为止，已开发出两种包含 FLUAV 和 FLUBV 抗原的通用疫苗，它们仅处于临床试验阶段（表 2）。一种名为 Multimeric-001 的新型疫苗旨在预防季节性和大流行性流感病毒株，无论其是否发生变异。它含有来自甲型和乙型流感病毒特定蛋白（HA、NP、M1）的保守线性表位。该疫苗可诱导体液免疫和细胞免疫。细胞介导免疫和 HAI 水平的升高支持 M-001 作为通用疫苗的潜力。该疫苗还有一个重要特性：与使用安慰剂接种相比，M-001 接种可提高对所有三种三价流感疫苗 (TIV) 株的血清转换率。表2 乙型流感通用疫苗候选者FLU-v 是 "通用"流感候选疫苗的又一范例，可针对大多数甲型/乙型流感病毒株提供长效保护。该疫苗含有四种多肽，分别代表流感病毒中具有免疫活性的保守区域：M1，32氨基酸（DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVP）；NPA，21氨基酸（DLIFLARSALILRGSVAHKSC）；NPB，20氨基酸（PGIADIEDLTLLARSMVVR）；M2，24氨基酸（IIGILHLILWILDRLFFKCIYRLF）。FLU-v与佐剂ISA-51一起皮下注射。佐剂由轻质矿物油和表面活性剂系统组成，可制成油/水乳剂。所选的皮下注射途径既便于给药，又能增加与皮肤抗原呈递细胞的接触。在没有中和抗体的情况下，疫苗诱导的 CD8 T 细胞反应可保护小鼠免受流感病毒的致命挑战。临床研究表明，对 FLU-v 的细胞免疫反应与志愿者在接受流感挑战（A/H3N2、A/H1N1）后病毒脱落和症状的减少有关。迄今为止，FLU-v 已成功完成了 IIb 期临床试验。吉林大学开发了另一种通用疫苗模型（甲型/乙型流感）。研究人员以诺如病毒（NoV）P 蛋白为平台，展示了甲型 H1N1、甲型 H3N2 和乙型流感病毒 HA 的保守表位。NoV P 蛋白能够自组装成病毒样颗粒，被认为是开发预防传染病疫苗的良好平台。病毒样 P 颗粒由 24 份 NoV 荚膜蛋白的突起（P）结构域组成；它易于表达和纯化，极其稳定，免疫原性高。每个 P 结构域包含三个表面环，已被证明可用于外来抗原呈递。将 FLUAV H1、FLUAV H3 和 FLUBV 的 HA290-105 多肽序列分别插入环 1、环 2 和环 3。更准确地说 H1 FLUAV 共识 HA290-105 序列的一个拷贝（DIWTYNAELLVLLENE）被插入环 1（残基 G274 和 T275 之间）；H3 FLUAV 共识 HA290-105 序列的一个拷贝（DLWSYNAELLVALENQ）被插入环 2（残基 S372 和 N373 之间）；一个 FLUBV 共识 HA290-105 序列拷贝（DTISSQIELAVLLSNE）通过 GGGGS 连接器插入 NoV P 结构域的环 3（残基 G392 和 S393 之间）。对小鼠进行免疫接种后，这种嵌合 P 粒子可诱导针对亚型特异性 HA2 表位的强特异性 IgG Ab 反应。接种三价 HA2-PP 后，肺部的病毒滴度明显降低。有趣的是，三价 HA2-PP 诱导的血清抗体滴度会被亚型特异性病毒提高，反之亦然。HA茎部、NA 和内部蛋白（PB1、NP、M1）T 细胞表位的几种保守病毒抗原已被定义为引起交叉反应性免疫应答的靶标。2004 年，默克（Merck）商业实验室的一组研究人员研制出了首个针对乙型流感的广泛保护性候选疫苗。该疫苗的特点是基因融合：在所有 FLUBV 中都保留的一个裂解位点；脑膜炎奈瑟菌的膜表面蛋白复合物。用包含该序列的重组蛋白对小鼠进行免疫后，小鼠在受到来自任一系的致命 FLUBV 挑战后，存活率均为 100%。此外，该序列（PAKLLKER GFFGAIAGFLE）不仅在两个系统发育系的FLUBV中相同，而且与相应的FLUAV位点具有高度同源性。2017 年底，该多肽疫苗的第一阶段临床试验开始。先前的研究表明，针对 FLUAV HA 柄的抗体具有广泛的保护作用（156）。利用嵌合 HA（cHA）分子的策略，针对两种甲型流感亚型的广谱保护性疫苗正在被成功开发出来。基于嵌合 HA 的疫苗接种方案已适用于 FLUBV。疫苗株的 HA 含有来自 FLUAV HA 亚型（H5、H7 或 H8）的头部结构域和来自 IBV HAs 的茎部结构域。构建体被亚克隆到哺乳动物表达载体中，然后转染到人类胚胎肾脏 293T 细胞（HEK 293T）中。嵌合病毒也在杆状病毒系统中表达，以产生用于疫苗接种的抗原蛋白。为了将免疫反应从 HA 头部的免疫优势位点转向保守的 HA 柄结构域，首先用表达 cH5/B 的质粒 DNA 诱导小鼠，然后用 cH7/B 和 cH8/B 抗原进行蛋白疫苗接种。嵌合 HA/B 疫苗接种方案可诱导针对更多不同 FLUIBV 的交叉反应性非中和抗体，并保护小鼠免受来自两个系统发育系的 FLUBV 的致命挑战。血清转移实验和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）测定结果表明，这种保护作用是由抗体介导的，很可能是通过 Fc 效应器功能实现的。后来，一种基于 "马赛克 "HA（mHA）的通用乙型流感疫苗开发新方法被描述出来。通过用不同外来甲型流感 HA（H5、H8、H11、H13）的相应序列替换 B/Yamagata/16/88 病毒的四个主要抗原位点，构建了马赛克 HA。这种替换可以：克服主要抗原位点的优势；将免疫反应重新定向到头部和茎部结构域的次优势保守表位。使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达嵌合型 HA。疫苗接种方案包括质粒 DNA（mH13/BYam）原体，然后每隔 3 周用不同的 mHA 进行两次加强免疫。不出所料，候选乙型流感疫苗（乙型 mHA）的免疫接种诱导了针对两个系统发育系的乙型病毒的广泛反应性抗体应答。用 5 LD50 的乙型流感病毒连续挑战显示，接种 mHA 可对同源和异源 FLUBV 产生保护作用。作者认为，与 B cHA 病毒相比，mHA 病毒诱导的抗体具有更强的 ADCC 活性。作者对此解释如下：B mHA 方法能诱导出不同的抗体库；它包含交叉反应性、非 HI 活性和非中和的头部抗体，能诱导出比抗茎抗体更强的 ADCC。此外，B mHA 相对于 B cHA 更具优势。这是因为含有 B mHAs 的重组病毒在鸡蛋中生长旺盛，适合多种疫苗生产平台，包括重组 HA、灭活疫苗和减毒活疫苗。一种新型、M2缺陷、单一复制（M2SR）乙型流感疫苗在动物模型中显示出高度的保护作用。疫苗病毒的 RNA 包括：1、2、3、5、8 号段；缺少来自 B/Lee/1940 流感的整个 BM2 开放阅读框（ORF）的 7 号段；以及来自 B/Brisbane/60/2008 流感（B/Bris60，BVic 系）或 B/Wisconsin/01/2010 流感（B/WI01，BYam 系）的 HA 和 NA vRNA（4、6 号段）。M2SR 疫苗病毒（缺乏 BM2 离子通道蛋白的编码序列）在正常 MDCK 细胞中复制缺陷，但在稳定表达 BM2 蛋白的互补 MDCK 细胞中生长。BM2SR-WI01 和 BM2SR-Bris60the 疫苗在体内均无致病性，而且 BM2SR 病毒不会在小鼠呼吸道中复制。这些疫苗可诱导肺部适度的细胞浸润，并仅刺激有限的炎症反应。它们能诱导血清和粘膜抗体（IgA、IgG）以及针对 FLUBV 两系的细胞反应。在体内致死模型中，每种 BM2SR 疫苗都能提供完全的保护，防止感染漂移的和异源的 FLUBV。交叉保护很可能是针对高度保守的 HA 柄区的交叉反应 Abs 提供的。2019 年，该疫苗完成了 II 期临床试验。传统疫苗的重点是与流感病毒的主要表面抗原 HA 形成抗体，而神经氨酸酶作为流感疫苗的抗原却很少受到关注。因此，季节性流感疫苗与流感病毒感染不同，不能很好地代表关键的 NA 表位，也很少诱导 NA 反应性 B 细胞。不过，有证据表明，现代四价疫苗（QIVs）可诱导 NA 抗体，对人类的两种病毒系均具有广泛而有效的抗病毒活性。事实上，NA 抗体可提供可靠、广泛的保护，并有可能通过新的疫苗策略预防性地激发出来。用5 µg poly(I⋅C)佐剂重组乙型/山形/16/88 流感病毒 NA 进行免疫，可保护小鼠免受同源的 BYam 病毒或异源的 FLUBV 毒株 Vic87 和 Mal04 的 1.1 × 106 PFU 的挑战，这两种病毒都属于抗原性不同的 Victoria 系。乙型流感病毒 NA 并未像 FLUBV HA 一样分化成两个系，这可能是交叉反应良好的部分原因。此外，在 FLUBV NA 中还检测到了保守的线性 B 细胞表位。其中一个表位（DILLKFSPTEITAPT）与一些著名的 MHC II 类等位基因有高亲和性结合，可用作交叉保护性 FLUBV 疫苗的靶抗原。研究表明，重组 NA 蛋白免疫接种可显著减少 FLUBV 的脱落，并可防止或限制病毒从感染 BYam 或 BVic FLUBV 的豚鼠向天真受体的传播。然而，接受i.m.或i.n.接种的动物的病毒滴度相似，只有i.n.接种能有效阻止传播。作者提出了病毒脱落减少的机制。其一是，即使鼻腔滴度略有下降，也会对流感病毒的传播产生不利影响。第二种解释是，抑制病毒 NA 酶活性的脱氧核糖核酸改变了病毒的传播性。据报道，在缺乏 NA 活性的情况下，流感病毒往往会聚集在一起，这可能会对病毒的传播性产生负面影响。此外，病毒可能被天然防御蛋白（如粘蛋白）上的诱饵受体捕获，也会导致聚集和传播能力下降。最后，病毒有可能从感染宿主处有效释放并传播到易感宿主处，但病毒被抗 NA 抗原包被，削弱了其启动新感染的能力，从而被受体呼吸道中的粘蛋白困住。其他研究人员已经证明，针对病毒 NA 的粘膜免疫（不太重要的是血清抗体）在阻止宿主间有效传播方面发挥着重要作用。各种病毒被用作疫苗目标抗原的载体。结合保守流感病毒抗原的腺病毒载体疫苗是诱导粘膜和全身免疫并提供广泛保护的有效疫苗平台之一。以高度保守的 T 细胞抗原为靶标已成为开发交叉保护性流感疫苗的主要策略之一。此前有研究表明，仅用 rAd 编码的 NP 单剂量静注疫苗就能保护小鼠免受异源 FLUAV（包括 H1N1 大流行毒株）的感染。一位韩国研究人员获得了编码高度保守 NP 的复制缺陷腺病毒（rAd）（来源于 B/Yamagata/16/1988 或 B/Shangdong/7/1997），并开发出一种通用候选疫苗。B/Yamagata/16/1988 病毒的 NP 包括一个显性 CTL 表位 FSPIRITFL（rAd/B-NP(Y)），而 B/Shangdong/7/1997（Victoria 系）则包括表位 FSPIRVTFL（rAd/B-NP(V)，B-NP 位置 171 存在一个氨基酸变异）。因此，这两个菌株分别携带异亮氨酸或缬氨酸。给 BALB/c 小鼠接种两种设计的疫苗，并检测 NP 特异性免疫反应。两种rAd/B-NP疫苗具有相同的免疫原性，并能诱导相似的NP特异性CD8 T细胞和NP特异性体液免疫反应。尽管接种了相同疫苗的小鼠面临不同的病毒挑战，但它们体内都出现了大量相似的 Dd/NP(Y)166-174 或 Dd/NP(V)166-174 四聚体特异性 CD8 T 细胞。接种疫苗的小鼠在同源/异源 FLUBV 病毒挑战中存活下来，几乎没有发病。Dhakal 等人也获得了类似的数据。在接种 A/NP-r Ad 或 B/NP-r Ad 后，小鼠表现出强大的全身和肺部疫苗特异性 B 细胞和 T 细胞反应。候选疫苗对不同的流感病毒株产生了持久的保护作用。基于 NP 的疫苗的保护作用与肺部常驻记忆 CD8 T 细胞的建立有关。因此，NP 可进一步开发为 FLUBV 的交叉保护疫苗，或作为 FLUAV/FLUBV 通用疫苗的两种成分之一。长期以来，人们一直担心强效的局部 T 细胞反应可能会损伤肺部，但实验证明，尽管肺部存在 CD8 T 细胞反应，但接种疫苗后肺部并未受损，功能正常。接种 PBS 的小鼠与接种 A/NP-rAd 或 B/NP-rAd 的小鼠在总肺活量、肺顺应性、肺气流阻力或允许气体交换的肺扩散能力方面没有差异。这项研究为基于 T 细胞介导的保护的疫苗提供了重要支持。一种有前途且有趣的策略是设计可提供交叉型免疫力的嵌合 A/B 病毒。一些研究小组已经获得了各种嵌合构建体。以 PR/8/34、A/WSN/33、A/Len/134/17/57 或 B/Yamagata/16/88 为病毒骨架，获得了甲型和乙型流感病毒之间的工程重配体。已在动物身上研究了其中一些工程重配株的免疫原性和保护特性；它们在面对不同类型病毒的挑战时表现出不同程度的保护作用。6、结论2020年以前，乙型流感是最常见和最严重的呼吸道传染病之一，发病率呈上升趋势。SARS-CoV-2 的出现改变了急性呼吸道感染的病原学结构。不过，根据流行过程动力学的基本原理，SARS-CoV-2 在 2-3 年内显然不会像现在这样咄咄逼人，预防包括乙型流感在内的其他急性呼吸道病毒感染的问题将继续存在。虽然 FLUBV 抗原漂移不如 FLUAV 那么明显，但季节性疫苗每隔 2-4 年就需要更换 FLUB 疫苗株。属于不同系统发育系和两个抗原不同的 BYam 支系的病毒同时流通，使疫苗毒株的选择变得复杂，并突出了开发一种具有广泛保护作用的疫苗的明确需求。与 FLUA 相比，在选择指定的 FLUB 疫苗毒株时，另一项相对更困难的任务是地区流行毒株的变异。这可能导致世卫组织推荐的疫苗菌株与当地流行的菌株不一致。所描述的广谱保护性mAbs表明，病毒表面糖蛋白中存在保守表位。它们与两个系统发育系的病毒共有的内部蛋白的保守表位一样，可作为开发具有广泛保护性的乙型流感疫苗的基础。将广泛中和抗体与大量交叉反应 CD8 T 细胞相结合，对于针对不同流感病毒株的最佳普遍保护非常重要。这种疫苗能诱导免疫系统的细胞和体液两个分支产生免疫反应，从而提供长期保护。在开发通用 FLUA/FLUB 疫苗的同时，也在开发纯 FLUB 疫苗。后者的重要性不仅在于预防 FLUB，还在于从人类中根除 FLUBV 的诱人前景。由于缺乏持续的动物贮藏库，以及 FLUBV 糖蛋白的系统发育差异相对较小，因此在不久的将来开发出一种具有广泛保护作用的疫苗是完全可能的。参考资料：Tsybalova LM, Stepanova LA, Ramsay ES, Vasin AV. Influenza B: Prospects for the Development of Cross-Protective Vaccines. Viruses. 2022 Jun 17;14(6):1323. doi: 10.3390/v14061323. PMID: 35746794; PMCID: PMC9228933.识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。