Phorbol 12-myristate 13-acetate

深度解读|内脏臭杆菌修饰的次级胆汁酸通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成缓解结肠炎 文献基本信息 文章标题：Secondary Bile Acids Modified by Odoribacter Splanchnicus Alleviate Colitis by Suppressing Neutrophil Extracellular Trap Formation 文章题目：内脏臭杆菌修饰的次级胆汁酸通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成缓解结肠炎 发表年份：2025年 杂志：Advanced Science 影响因子分区：IF=14.1，中科院综合性期刊1区 作者团队：华南理工大学周有连、聂玉强团队 研究对象： 内脏臭杆菌(Odoribacter Splanchnicus，O.Spl) 石胆酸(Lithocholic Acid，LCA) 1、重要词汇的中英文及缩写 分类 缩写 英文全称 中文翻译 物质 cfDNA Cell-Free DNA 游离DNA PAD4 Peptidyl Arginine Deiminase 4 肽基精氨酸脱亚氨酶4 MPO Myeloperoxidase 髓过氧化物酶 NE Neutrophil Elastase 中性粒细胞弹性蛋白酶 CitH3 Citrullinated Histone H3 瓜氨酸化组蛋白H3 LCA Lithocholic Acid 石胆酸 CDCA Chenodeoxycholic Acid 鹅去氧胆酸 CA Cholic Acid 胆酸 UDCA Ursodeoxycholic Acid 熊去氧胆酸 alloLCA Allolithocholic Acid 别石胆酸 isoLCA Isolithocholic Acid 异石胆酸 3-oxoLCA 3-Oxolithocholic Acid 3-氧代石胆酸 isoalloLCA Isoallolithocholic Acid 异别石胆酸 12-ketoLCA 12-Ketolithocholic Acid 12-酮基石胆酸 BSH Bile Salt Hydrolase 胆盐水解酶 HSDH Hydroxysteroid Dehydrogenase 羟类固醇脱氢酶 BACS Bile Acid CoA Synthetase 胆汁酸辅酶A合成酶 BAAT Bile Acid CoA: Amino Acid N-Acyltransferase 胆汁酸辅酶A：氨基酸N-酰基转移酶 BSEP Bile Salt Export Pump 胆盐外排泵 GSDMD Gasdermin D 消皮素D GSDMD-FL Gasdermin D Full-Length 消皮素D全长形式 GSDMD-N Gasdermin D N-Terminal Fragment 消皮素D N端片段 NLRP3 NLR Family Pyrin Domain Containing 3 NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 ASC Apoptosis-Associated Speck-Like Protein Containing a CARD 凋亡相关斑点样蛋白 FXR Farnesoid X Receptor 法尼醇X受体 VDR Vitamin D Receptor 维生素D受体 GPBAR1 G Protein-Coupled Bile Acid Receptor 1 G蛋白偶联胆汁酸受体1 OSTα/β Organic Solute Transporter Alpha/Beta 有机溶质转运蛋白α/β PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate 佛波酯 Gr-1 Granulocyte Receptor-1 粒细胞受体-1 Ly6G Lymphocyte Antigen 6 Family Member G 淋巴细胞抗原6家族成员G 研究对象 O. spl Odoribacter splanchnicus 内脏臭杆菌 CM Conditioned Medium 细菌培养上清 CMK Conditioned Medium with Proteinase K Treatment 蛋白酶K处理的培养上清 NETs Neutrophil Extracellular Traps 中性粒细胞胞外诱捕网 NETosis NET Formation Process 中性粒细胞胞外诱捕网形成过程 实验技术 FMT Fecal Microbiota Transplantation 粪菌移植 16S rRNA 16S ribosomal RNA 16S核糖体RNA测序 scRNA-seq Single-Cell RNA Sequencing 单细胞RNA测序 LC-MS/MS Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry 液相色谱-串联质谱 SEM Scanning Electron Microscopy 扫描电子显微镜 AB-PAS Alcian Blue-Periodic Acid Schiff 阿尔新蓝-过碘酸雪夫染色 其他 IBD Inflammatory Bowel Disease 炎症性肠病 UC Ulcerative Colitis 溃疡性结肠炎 CD Crohn's Disease 克罗恩病 DSS Dextran Sulfate Sodium 葡聚糖硫酸钠 DAI Disease Activity Index 疾病活动指数 UMI Unique Molecular Identifier 唯一分子标识符 UMAP Uniform Manifold Approximation and Projection 均匀流形近似与投影 2、使用模型： (1)细菌模型 细菌名称 中文全称 Odoribacter Splanchnicus 内脏臭杆菌 heat-killed O. spl 热灭活的内脏臭杆菌 (2)细胞模型 细胞名称 中文全称 物种来源 组织/器官来源 primary murine neutrophils 原代小鼠骨髓中性粒细胞 小鼠 骨髓 (3)小鼠模型 模型类型/实验阶段 小鼠种类/品系 建模与干预方法 急性结肠炎模型 野生型小鼠 (C57BL/6) 2.5%DSS持续7天+饮用水3天；同时灌胃O. spl /热灭活O. spl (10^8CFU/200 μL)持续10天 慢性自发性结肠炎模型 Il-10⁻/⁻小鼠 9周龄开始，每周3次灌胃 O. spl ，持续13周 NETs功能验证模型 Pad4⁻/⁻小鼠 2.5% DSS诱导急性结肠炎，同时每日灌胃O. spl (10⁸ CFU/200 μL) 中性粒细胞清除模型 野生型小鼠(C57BL/6) DSS造模期间腹腔注射抗Ly6G抗体(200 μg/只，第-1、1、3、5天)；同时每日灌胃O. spl 急性结肠炎模型 野生型小鼠 (C57BL/6) 2.5%DSS持续7天+饮用水3天；同时灌胃O. spl (10^8CFU/200 μL)持续10天 急性结肠炎模型 野生型小鼠 (C57BL/6) 每日灌胃CM或CMK或CM不同分子量组分或LCA，持续7天，同时给予3% DSS NLRP3信号通路验证模型 Nlrp3⁻/⁻小鼠 每日灌胃LCA(50 mg/kg)，持续7天，同时给予3% DSS 菌群依赖性验证模型（抗生素处理的菌群缺陷模型； 粪菌移植；GF小鼠） 野生型小鼠 (C57BL/6) 抗生素预处理4周清除菌群，饮用水1周，第6周接受O. spl 灌胃/粪便悬液灌胃(每日1次，持续1周)，同时给予3% DSS GF小鼠(C57BL/6) 每日灌胃O. spl 持续2周，第2周饮用水中加入2% DSS (4)人群研究 人群名称 中文全称 中文全称 HC Healthy Control 健康对照 UC Ulcerative Colitis 溃疡性结肠炎患者 FMT-Donor Fecal Microbiota Transplantation Donor 粪菌移植供体 FMT Responder Fecal Microbiota Transplantation Responder 粪菌移植应答者 FMT Non-Responder Fecal Microbiota Transplantation Non-Responder 粪菌移植无应答者 3、涉及实验 (1)人类临床队列研究 实验名称 检测指标 粪便16S rRNA测序 O. Spl 相对丰度、菌群多样性 粪便qPCR O. Spl 绝对丰度 粪便LC-MS 粪便LCA浓度 结肠组织免疫荧光 NETs形成百分比、NLRP3表达强度、ZO-1表达强度 (2)小鼠实验 实验名称 检测指标 O. spl 功能验证实验 采用DSS诱导结肠炎小鼠和Il10-/-小鼠，观察体重变化、结肠长度、DAI评分、HE染色病理评分、ZO-1/Claudin-1/Muc2表达、AB-PAS杯状细胞计数、O. spl 定植(qPCR/SEM) NETs功能验证实验 观察O. spl 是否影响Pad4⁻/⁻小鼠体重变化、结肠长度、HE染色、肠道屏障功能(验证保护作用是否依赖PAD4-NETs通路) 中性粒细胞清除实验 验证中性粒细胞是否为O. spl 保护作用所必需；观察体重、结肠长度、组织病理变化 NLRP3信号验证实验 采用Nlrp3⁻/⁻小鼠，检测小鼠体重变化、结肠长度、HE染色、肠道屏障功能、NETs相关蛋白(PAD4/MPO/CitH3)、CitH3与MPO/NE共定位 菌群依赖性验证模型构建 采用抗生素处理小鼠和GF小鼠，评估O. spl单独作用对胆汁酸代谢和炎症的影响；采用粪菌移植，观察O.spl影响的肠道菌群对小鼠小鼠肠道炎症的影响 (3)体外细菌培养实验 实验名称 检测指标 体外胆汁酸代谢分析 底物与产物：在培养基中添加胆汁酸，通过液相色谱-质谱法检测生成的LCA及其衍生物的浓度，以确认细菌的代谢能力。 (4)分子机制探索实验 实验名称 检测指标 单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 免疫细胞分型、中性粒细胞亚群分析、Nlrp3表达细胞定位、差异基因与通路富集分析 批量RNA测序 (Bulk RNA-seq) KEGG通路富集分析，鉴定NETs形成通路富集 LC-MS/MS (非靶向代谢组学) 鉴定差异代谢物，发现LCA显著升高 LC-MS-/MS (靶向胆汁酸代谢组学) 检测总胆汁酸、次级/初级胆汁酸比值、LCA及其衍生物(alloLCA、isoLCA、12-ketoLCA)水平、结合型/非结合型胆汁酸比例 原代中性粒细胞体外培养 PMA诱导NETs形成，加入LCA或条件培养基，观察NETs抑制效果 免疫荧光共定位分析 CitH3与MPO/NE共定位染色，评估NETs形成阳性细胞比例 Hoechst染色 观察NETs的网状DNA结构 本文亮点 1、系统阐明内脏臭杆菌(Odoribacter splanchnicus，O.spl)在IBD中的保护作用，证实其在UC患者中丰度显著降低，并通过急慢性结肠炎小鼠模型证实其具有抗炎和修复肠道屏障的保护作用。 2、O. spl 并非直接转化胆汁酸，而是通过重塑肠道菌群结构(富集BSH/HSDH相关菌属)，间接促进次级胆汁酸石胆酸(LCA)的生成。 3、明确LCA通过抑制NLRP3-GSDMD信号通路，减少中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成，从而减轻结肠炎症反应和肠道屏障损伤。 4、揭示“菌群-胆汁酸-中性粒细胞”调控轴在炎症性肠病中的作用机制，为O. spl作为新型益生菌及LCA作为潜在治疗药物提供了理论依据。 前言 1、临床问题：炎症性肠病(IBD)是一种慢性复发性肠道炎症性疾病，现有治疗药物(如5-氨基水杨酸、激素、生物制剂)在部分患者中疗效不佳，亟需探索新的治疗靶点和策略。 2、研究空白：肠道菌群失调在IBD发病中起关键作用，但特定菌种如O. spl 的功能及其与宿主免疫相互作用的机制尚不明确。 3、研究思路：研究旨在探讨O. spl 在IBD中的保护作用，重点关注其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响及胆汁酸代谢在其中扮演的角色。 路线图 全文解读 摘要     肠道菌群在炎症性肠病(IBD)的发病机制中起着重要作用，但具体细菌物种的功能影响仍不明确。本研究鉴定出内脏臭杆菌(Odoribacter splanchnicus；O. spl )是在人类IBD队列中丰度降低的菌种，并证明了其在急性和慢性小鼠结肠炎模型中的保护作用。在小鼠中，给予 O. spl 可减轻结肠炎症、维护屏障完整性，同时伴随着黏膜免疫景观的重构及中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的减少。这种对NETs形成的抑制作用在Pad4-/-小鼠中消失，凸显了其依赖于NETs形成机制。代谢组学分析显示，O. spl 治疗可提升次级胆汁酸石胆酸(LCA)的水平。这种增加在抗生素混合治疗后消失，而通过移植O. spl 处理小鼠的粪便菌群则可恢复，表明其需要完整的肠道菌群。在机制上，补充石胆酸可重现抗NETs形成的表型，并通过抑制NLRP3-GSDMD信号通路来抑制结肠炎症。综上，这些发现定义了IBD发病机制中的肠道菌群-代谢物-中性粒细胞轴，揭示了菌群依赖性调节石胆酸是O. spl的关键保护机制。 1 引言     溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)是炎症性肠病(IBD)的两种主要亚型。IBD是一种以持续性腹痛和腹泻为特征的慢性、复发性炎症性疾病。目前，仍有很大比例的IBD患者对现有疗法(包括5-氨基水杨酸、皮质类固醇和生物制剂)反应不佳，或需要手术干预，这给患者和社会带来了沉重负担。因此，研究基础治疗失败患者的根本原因，以及疾病发病的驱动机制至关重要，这可能为减轻UC患者的痛苦提供策略。     环境因素对遗传易感个体的持续刺激会导致宿主肠道屏障损伤和慢性炎症。越来越多的证据表明，菌群失调在IBD的发病和发展中发挥作用。例如，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)，一种产生短链脂肪酸(SCFA)的有益菌，在IBD患者的粪便和黏膜组织中丰度降低。一些研究发现，双歧杆菌(Bifidobacterium)通过调节免疫细胞(如激活树突状细胞(DCs)和增加调节性T细胞(Tregs))来减轻炎症。此外，我们的研究表明，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)可以通过上调有益菌和下调致病菌来调节肠道菌群组成。另一种与IBD相关的潜在有益菌是阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)，它在调节宿主屏障功能和免疫反应中发挥作用。IBD中肠道菌群与宿主之间的相互作用主要依赖于微生物代谢，这些代谢物可直接来源于细菌，或由肠道细菌转化而来，以维持黏膜免疫稳态和促进肠道屏障完整性。然而，共生菌在IBD中的保护功能，特别是在肠道屏障维持和免疫调节方面，仍然知之甚少。     大量抗原进入肠黏膜会触发过度的免疫反应，导致对宿主不受控制的损伤。在参与的免疫细胞中，中性粒细胞是最早被募集到炎症部位的细胞。通过识别和清除病原体，以及释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，它们在平衡炎症和黏膜愈合中发挥关键作用。特别是，蛋白精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)被多种抗原激活，导致组蛋白瓜氨酸化，进而引发染色质去浓缩和释放。NETosis，其特征是释放由去浓缩DNA和抗菌蛋白(包括髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE))组成的网状结构，存在于许多疾病状况中。然而，在UC患者的炎症结肠和循环中性粒细胞中观察到过度的NET形成，这导致了炎症的持续存在。有证据表明，NETs会损害糖尿病患者的皮肤愈合。此外，最近的研究表明，肠道菌群来源的代谢物，如吲哚，可以通过调节中性粒细胞中的MPO活性来发挥对抗组织损伤的保护作用。这表明特定的细菌及其代谢物可能与中性粒细胞功能相关。然而，触发NET形成的特定宿主来源因素，以及肠道菌群-中性粒细胞在维持黏膜屏障和免疫稳态中相互作用的机制，仍有待阐明。     内脏臭杆菌(Odoribacter splanchnicus，O. spl)是拟杆菌门的一员。O. spl 丰度降低与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、囊性纤维化和IBD相关。最近一项研究表明，O. spl 在粪菌移植(FMT)对UC患者的疗效中起着关键作用。通过对FMT供体和受体粪便样本中IgA包被的细菌进行分类和测序(IgA-seq)，研究人员发现 O. spl 通过产生SCFAs和促进Tregs的分化来抑制小鼠结肠炎。另一项研究通过宏基因组测序将 O. spl 鉴定为一种潜在的益生菌，并验证了其在诱导Th17细胞(对肠道炎症和结肠癌有效)方面的保护作用。然而，关于 O. spl 减少是否与IBD的发展相关，以及补充 O. spl 对IBD黏膜愈合和免疫调节的潜在影响，我们知之甚少。     在本研究中，我们评估了 O. spl 在UC确诊患者中的临床意义。此外，我们利用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎和 Il-10−/− 慢性结肠炎小鼠模型，研究了 O. spl 在抑制炎症和保护肠道屏障方面的功能作用。我们的研究结果支持共生菌通过调节先天免疫来调控炎症稳态和疾病结局的假设。因此，我们探究了 O. spl 是否影响免疫格局，特别是中性粒细胞，以决定炎症和肠道屏障完整性的结局。在此，我们证明O. spl 通过调节NETs的形成和降解来调控结肠免疫，从而减轻结肠炎并缓解肠道屏障损伤。在机制上，我们提出O. spl 通过其在次级胆汁酸石胆酸(LCA)转化中的作用，促进胆汁酸代谢并维持NET稳态。 2 结果 2.1. UC患者中 O. spl 丰度降低且与特定临床特征相关     我们首先利用16S rRNA测序观察了 O. spl 与UC患者之间的相关性。UC患者中 O. spl(Fig.1A)和臭杆菌属(Odoribacter)(Fig.S1A)的丰度均降低，证实了 O. spl 在这些个体中的耗竭。此外，与对照组相比，急性和慢性结肠炎小鼠模型中的臭气杆菌属丰度均持续降低(Fig.S1B)。为了进一步研究这一现象，我们通过定量PCR(qPCR)检测了15例新确诊UC患者样本中 O. spl 的绝对丰度，结果证实了这些患者中 O. spl 的耗竭(Fig.S1B)。为了评估其与治疗反应的相关性，我们重新分析了我课题组既往研究中UC患者在接受粪菌移植(FMT)治疗后粪便样本中的 O. spl 丰度。数据显示，FMT后治疗应答组中IgA包被的 O. spl 丰度增加(Fig.S1C)。总之，O. spl 在结肠炎中丰度降低，其丰度与临床治疗疗效相关。 Fig.S1 (A)新诊断的溃疡性结肠炎(UC)患者与健康对照者粪便样本中 O. spl 属水平的比较。数据以均值±标准误(SEM)表示。**,P < 0.01；***,P < 0.001，采用Mann-Whitney非配对非参数检验确定。(B)急性或慢性结肠炎模型小鼠与对照组小鼠粪便中 Odoribacter 属丰度的比较。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05，采用Mann-Whitney非配对非参数检验确定。(C)UC 患者在接受粪菌移植(FMT)后，IgA 包被的O. spl丰度增加。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01，采用Mann-Whitney非配对非参数检验确定。 2.2. O. spl 减轻DSS诱导结肠炎和Il-10−/−小鼠的炎症及肠道屏障损伤     我们首先利用DSS诱导的结肠炎小鼠模型评估了 O. spl 在结肠炎炎症和屏障损伤修复中的作用。建立了2.5% DSS诱导的急性结肠炎模型，并通过灌胃给予 O. spl 干预(Fig.1C)。O. spl 治疗显著减轻了体重下降(Fig.1D)。此外，炎症诱导的结肠长度缩短也得到了缓解(Fig.1H)。组织学上，结肠炎的炎症相关表现，包括黏膜损伤、隐窝丢失和免疫细胞浸润，均得到改善(Fig.1E,F)。这些结果表明了 O. spl 在急性结肠炎中的保护作用。     为了检测 O. spl 的定植情况，我们采用qPCR测量其绝对丰度。数据显示，O. spl 治疗组中 O. spl 显著增加(Fig.1G)。此外，扫描电子显微镜(SEM)显示，在无菌小鼠和抗生素混合液(Abx)预处理小鼠的肠道表面均存在O. spl (Fig.S2A–C)，进一步支持了 O. spl在结肠的定植。     肠道屏障损伤是结肠炎发病过程中的关键病理生理阶段。为了评估肠道屏障的变化，我们对 O. spl 治疗小鼠的结肠黏膜屏障相关蛋白进行了染色。结果显示，O. spl 上调了紧密连接蛋白Zo-1和Claudin-1的表达(Fig.1I–L)，并且通过AB-PAS染色观察到黏膜蛋白Muc2的表达和杯状细胞数量增加(Fig.1K,M)。此外，在mRNA水平上也观察到了肠道屏障表达的一致结果(Fig.S2D–F)。总之，O. spl 减轻了肠道屏障损伤，包括机械屏障和黏膜屏障。     我们使用另一种Il-10−/−自发结肠炎模型来评估O. spl 对慢性炎症的影响(Fig.1N)。从第17周开始，O. spl 治疗减轻了小鼠的体重下降(Fig.1O)。组织学上，苏木精-伊红(HE)染色图像显示炎症细胞浸润和黏膜损伤减少(Fig.1P)。此外，我们观察到O. spl干预后对肠道屏障的保护作用(Fig.1R,S；Fig.S2G–I)。值得注意的是，O. spl 治疗组中O. spl 的丰度没有显著变化(Fig.1Q)，表明 O. spl 可能无需定植即可发挥抗炎作用。综上所述，这些结果突显了 O. spl 在减轻结肠炎炎症和保护肠道屏障方面的潜力。 Fig.1. O. spl 减轻 DSS 诱导的结肠炎和 Il-10−/− 小鼠的炎症及肠道屏障损伤。 (A)新诊断 UC 患者与健康对照者粪便样本中 O. spl 水平的比较。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01，采用 Mann-Whitney 非配对非参数检验确定。(B)小提琴图显示队列 2 中 UC 患者体内 O. spl 的减少，验证了上述发现。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用 Mann-Whitney 非配对非参数检验确定。(C)O. spl 干预 2.5% DSS 诱导结肠炎小鼠模型的实验方案。每只小鼠每天灌胃 O. spl，浓度为 10^8 CFU/200 μL，持续 10 天。O. spl悬浮于无菌 PBS 中，使用等体积无菌 PBS 作为溶媒对照。O. spl干预后，记录并评估体重下降和 DAI 评分。收集远端结肠进行 HE 染色，剩余结肠保留用于进一步验证。每组 n = 12 只。(D)体重下降, (E) 20× 和 40× 放大倍数下的代表性 HE 染色图像, (F) 统计组织学评分的比较,(G) 通过 qPCR 评估 O. spl 的定植情况, (H)各组间结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(I) 紧密连接蛋白 ZO-1和 CLAUDIN1 的代表性 IHC 染色图像，以及 (J) IHC 评分的统计分析。(K) 使用 MUC2 和 AB-PAS 染色显示黏液和杯状细胞的代表性 IHC 染色图像，以及 (L,M) 这些结果的统计分析。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01；***,P < 0.001；****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(N) O. spl 干预 Il-10−/− 结肠炎小鼠模型的实验方案。每只小鼠每周灌胃 O. spl 三次，浓度为 10^8 CFU/200 μL，持续 13 周。O. spl 悬浮于无菌 PBS 中，使用等体积无菌 PBS 作为溶媒对照。O. spl 干预后，记录体重下降，收集远端结肠进行 HE 染色，剩余结肠保留用于进一步分析。(O) 体重下降，(P) 20× 和 40× 放大倍数下的代表性 HE 染色图像，以及 (Q) 两组中 O. spl 的定植情况。数据以均值±SEM 表示，并通过 Mann-Whitney U 检验进行分析。(R) 肠道屏障蛋白 ZO-1、CLAUDIN1 和 MUC2 的代表性 IF 染色图像。(S) 各组荧光强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。DSS，葡聚糖硫酸钠；O. spl，内脏臭杆菌；HC，健康对照；UC，溃疡性结肠炎；ZO-1，闭锁小带蛋白-1；MUC2，黏蛋白2；IHC，免疫组织化学。 Fig.S2 (A) 扫描电子显微镜(SEM)揭示了 O. spl 在琼脂培养基、肉汤培养基上的形态和存在情况，(B) 抗生素预处理小鼠的肠道表面，(C) 以及无菌小鼠的肠道表面。(D-F) DSS 诱导的结肠炎小鼠中肠道屏障相关基因 Zo-1、Occludin 和 Muc2 的 mRNA 表达水平。(G-I) Il-10−/− 小鼠中肠道屏障相关基因 Zo-1、Occludin 和 Muc2 的 mRNA 表达水平。 2.3. O. spl 调节结肠炎小鼠的结肠免疫格局，尤其是中性粒细胞     肠道屏障损伤导致大量抗原进入结肠黏膜，引发宿主免疫反应失衡。我们假设 O. spl 诱导的抗炎反应和肠道屏障保护作用是通过其与结肠免疫细胞的相互作用介导的。为了全面探究 O. spl 在结肠炎中的潜在免疫调节特性，我们对 O. spl 治疗组和对照组小鼠的结肠组织进行了单细胞RNA测序(Fig.2A)。经过质量控制，O. spl 治疗组共5495个细胞和对照组共9629个细胞被纳入后续分析。O. spl 疗组每个细胞的唯一分子标识符(UMI)为5653.65，对照组为4024.43。利用经典细胞标志物，通过统一流形逼近与投影(UMAP)将所有分析的细胞分为八类(Fig.2B；Fig.S3A)，包括成纤维细胞(Col1a1, Col1a2)、T细胞(Ptprc, Cd3d, Cd3g)、巨噬细胞(Lyz2, C1qa, C1qb)、上皮细胞(Epcam, Krt19)、B细胞(Cd79a, Ms4a1)、中性粒细胞(Csf3r)、浆细胞(Creld2, Derl3)和内皮细胞(Pecam1, Kdr)(Fig.2C)。这些细胞类型在各组中均有检出。中性粒细胞是抵御抗原的第一道防线，并在炎症损伤中发挥抗炎作用。我们的数据表明，O. spl 治疗组中性粒细胞的百分比降低(Fig.2D)。这一显著发现值得进一步研究。     为了解 O. spl 在炎症中的作用，我们分析了 O. spl干预后中性粒细胞的转录和功能变化。通过单细胞RNA测序，我们将中性粒细胞分为七个亚群(Fig.2E)。O.spl 干预后，亚群1、2、4、5和6的百分比降低，而亚群0和3的百分比升高(Fig.2F)。基因和通路富集分析表明，亚群0中上调的基因(例如 Ccl4, Lrrc25, Ptgs2, Nlrp3, Plk3)(Fig.2G)与NOD样受体信号通路、TNF信号通路和趋化因子信号通路相关(Fig.S3B)。在亚群1中，上调的基因(例如 Ngp, Stfa3, Syne1, Cstdc5, Stfa2)(Fig.2G)与细胞凋亡相关(Fig.S3C)。亚群2显示出上调的基因(例如 Fndc3b, Ubr2, Ptpn22, Snrpb, Zzef1)(Fig.2G)，这些基因与C型凝集素受体信号通路和氧化磷酸化相关(Fig.S3D)。最后，在亚群3中，上调的基因(例如 Rsad2, Ifi47, Gbp5, Gbp2b, Cxcl10)(Fig.2G)与自噬、TNF信号和线粒体自噬相关(Fig.S3E)。     为了验证O. spl 干预后中性粒细胞的减少，我们通过流式细胞术评估了DSS诱导结肠炎和Il-10−/−小鼠模型中Gr-1+中性粒细胞的频率。在O. spl 治疗组中，CD45+细胞群中Gr-1+细胞的百分比显著降低(Fig.2H,I)。此外，O. spl 下调了促炎细胞因子Il-6和Il-1β的表达(Fig.2J,K)。在Il-10−/−小鼠中也观察到了一致的结果(Fig.2L–O)。为了评估中性粒细胞是否是O. spl 抗炎作用所必需的，我们使用抗Ly6G抗体进行了体内中性粒细胞清除实验。在DSS诱导结肠炎过程中，于第-1、1、3和5天给小鼠腹腔注射抗体(Fig.S4A)。与同型对照组相比，在中性粒细胞清除小鼠中，O. spl 的抗炎作用被消除(Fig.S4B–D)，表明中性粒细胞对于介导这种保护作用是必需的。总之，O. spl 在炎症条件下调节结肠的免疫格局，并且在DSS诱导的急性结肠炎和Il-10−/−自发结肠炎小鼠模型中，中性粒细胞可能参与了其保护作用。 Fig.2. O. spl 在结肠炎小鼠中诱导免疫景观重塑并抑制中性粒细胞浸润。 (A) 接受 O. spl治疗的结肠炎小鼠单细胞 RNA 测序实验设计。(B) UMAP 图显示了八种细胞类型的结果。两组中的成纤维细胞、B 细胞、巨噬细胞、浆细胞、T 细胞、中性粒细胞、上皮细胞和内皮细胞亚群以不同颜色表示。(C) 不同细胞类型中标志基因的表达。点的大小表示表达该基因的细胞百分比，点的颜色反映表达水平。(D)O. spl治疗的结肠炎小鼠结肠中细胞类型的比例和绝对计数。(E) 来自 O. spl治疗的结肠炎小鼠结肠中性粒细胞的 UMAP 图.。(F)O. spl治疗的结肠炎小鼠结肠中性粒细胞亚群的百分比。(G) 中性粒细胞簇特征基因的热图。每个簇由五个特异性表达的基因表示。(H) 代表性流式细胞术图和(I) 接受或不接受 O. spl治疗的 DSS 诱导结肠炎小鼠中 Gr-1+ 中性粒细胞的统计分析。数据以均值±SEM 表示 (n = 6)。*,P < 0.001，采用非配对 Student's t 检验。(J) O. spl治疗后结肠炎小鼠中促炎细胞因子 Il-6 和 (K) Il-1β 的 mRNA 相对表达量降低。数据以均值±SEM 表示 (n = 6)。*,P < 0.05，采用非配对 Student's t 检验。(L) 代表性流式细胞术图和(M) 接受或不接受 O. spl治疗的 Il-10−/− 小鼠中 Gr-1+ 中性粒细胞的统计分析。数据以均值±SEM 表示 (n = 6)。*,P < 0.05，采用非配对 Student's t 检验。(N)O. spl治疗的 Il-10−/− 小鼠中促炎细胞因子 Il-6 和 (O) Il-1β 的 mRNA 相对表达量降低。数据以均值±SEM 表示 (n = 6)。*,P < 0.05；***,P < 0.001，采用非配对 Student's t 检验。 Fig.S3 (A) UMAP 图显示了O. spl 干预后八种细胞类型的聚类及其标志基因。(B-E) O. spl 干预后，中性粒细胞亚群中富集的前 25 条 KEGG 通路。这些亚群包括：(B) 聚类 0，(C) 聚类 1，(D) 聚类 2，和 (E) 聚类 3。 Fig.S4 (A) 野生型和通过腹腔注射抗 Ly6G 抗体清除中性粒细胞的小鼠中 DSS 诱导结肠炎模型的实验设计。小鼠通过饮水给予 3% DSS 处理 7 天，随后每天口服灌胃 O. spl，浓度为 10^8 CFU/200 μL，持续 7 天。(B) 小鼠的体重下降情况，DAI 评分。(C) 10× 和 40× 放大倍数下 HE 染色的代表性图像，以及 (D) 各组间统计组织学评分的比较。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01，采用单因素方差分析确定。 2.4. O. spl 通过调节NETs的形成与降解发挥抗炎和肠道屏障保护作用 为鉴定O. spl 在结肠炎小鼠中调控的基因，我们对O. spl 治疗组和对照组小鼠的结肠样本进行了整体转录组测序和差异基因分析。火山图显示了O. spl干预后的差异基因(Fig.S5A)，包括255个上调基因和269个下调基因。热图展示了两组间表达差异最显著的前列基因(Fig.3A)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示，多个炎症和免疫通路富集，尤其是与中性粒细胞功能相关的NETs形成通路(Fig.3B)。NETs形成过程，也称为NETosis，其特征是释放由去浓缩DNA和包括MPO及NE在内的抗菌蛋白组成的网状结构。 为验证这一发现，我们首先检视了单细胞RNA测序数据，结果显示与NETs形成相关的基因Cd177在所有中性粒细胞亚群中均有表达(Fig.S5B)。UMAP分析表明，O. spl 降低了Cd177的表达(Fig.S5C)。随后对NETs形成相关蛋白进行了验证。PAD4是促进组蛋白瓜氨酸化(CitH3)的关键酶，进而促进组蛋白去浓缩和CitH3释放。免疫荧光(IF)染色(Fig.3C,H；Fig.S5D)和免疫印迹(Fig.3D,E)结果显示，O. spl 治疗组Pad4的表达显著降低。此外，免疫印迹分析显示，O. spl 下调了中性粒细胞释放的MPO和CitH3蛋白水平。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中CitH3和游离DNA(cfDNA)水平的结果显示，O. spl 显著降低了炎症诱导的CitH3和cfDNA水平(Fig.3F,G)。免疫荧光图像显示了瓜氨酸化组蛋白与中性粒细胞释放的抗菌蛋白的共定位。与DSS组相比，O. spl干预减少了CitH3与MPO的共定位(Fig.3H,I)。此外，DNase促进中性粒细胞释放的NETs降解。 我们的数据表明，O. spl 治疗组中DNase表达升高，提示O. spl 可能增强了NETs的降解(Fig.3D,E)。总体而言，O. spl 通过减少NETs的形成和促炎成分，同时促进NETs降解，来调节中性粒细胞功能。    为评估O. spl在NETs缺陷的Pad4−/−小鼠中是否发挥抑制炎症的保护作用，我们使用2.5% DSS在Pad4−/−小鼠中建立了急性结肠炎模型，以检测O. spl对炎症的影响(Fig.3J)。在Pad4−/−小鼠中，O. spl治疗未能减轻体重下降、结肠缩短、结肠组织学损伤或屏障破坏(Fig.3K–O；Fig.S5E)。总之，这些结果表明，O. spl通过调节PAD4来调控NETs的形成与降解，从而发挥抗炎和肠道屏障保护作用。 Fig.3. O. spl 通过调节 NETs 的形成和降解发挥抗炎和肠道屏障保护作用。 (A)接受或不接受O. spl 干预的结肠炎小鼠差异基因表达热图。(B)O. spl治疗的结肠炎小鼠中差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。(C)显示 Pad4 (绿色) 和 DAPI (蓝色) 染色的代表性 IF 图像，放大倍数为 10× 和 40×。比例尺，50 μm。(D)对照组和 O. spl 治疗组结肠中Pad4、MPO、DNase和CitH3的蛋白质印迹分析，以β-actin作为上样对照。(E)三组中 Pad4、MPO、DNase和CitH3表达相对于β-actin的蛋白质印迹数据统计分析。数据以均值±SEM 表示(DNase 的 n = 8，其他指标的 n = 4)。*,P < 0.05；**,P < 0.01；***,P < 0.001；****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(F)细胞游离 DNA 浓度的 ELISA 结果。(G)瓜氨酸化组蛋白 H3 水平的 ELISA 结果。(H)CitH3 (绿色)和Mpo (红色)以及CitH3 (绿色)和NE (红色) 的代表性 IF 图像。比例尺，50 μm。(I)在CitH3和MPO共染的IF图像中，NETs形成中性粒细胞百分比的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(J)野生型和 Pad4−/− 小鼠中 DSS 诱导结肠炎模型的实验设计。小鼠通过饮水给予 2.5% DSS 处理 7 天，随后用正常水恢复 3 天。每只小鼠每天口服灌胃 10^8 CFU/200 μL O. spl，持续 10 天。实验结束时处死小鼠。显示了结肠外观的代表性图像。远端结肠用 4% 多聚甲醛固定，切片进行 HE 染色。(K)体重下降数据。(L) 结肠形态的代表性图像。(M) 结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示 (n = 10)。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(N) O. spl 干预后野生型和 Pad4−/− 小鼠的代表性 HE 染色图像。(O)O. spl 干预后野生型和 Pad4−/− 小鼠中 Occludin和Muc2 染色的代表性 IF 图像。DSS，葡聚糖硫酸钠；cfDNA，双链 DNA；O. spl，内脏臭杆菌；Muc2，黏蛋白2。 Fig.S5 (A) 基bulk RNA测序分析，火山图显示了O. spl 干预后的差异表达基因。(B) 通过单细胞RNA测序确定的 Cd177在中性粒细胞各聚类中的表达。点的大小代表表达该基因的细胞百分比，颜色代表基因表达水平。(C) UMAP 图显示了有或无 O. spl干预的结肠炎小鼠中 Cd177 的表达情况。(D) IF 图像中 Pad4、(E)OCCLUDIN和MUC2荧光强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用单因素方差分析确定。 2.5. O. spl 重塑胆汁酸池，促进LCA驱动的中性粒细胞调节 已有报道称共生菌通过代谢物或与肠道菌群的相互作用来调节黏膜免疫。为了评估O. spl的膜蛋白是否具有与活菌相似的作用，我们评估了热灭活O. spl的抗炎特性(Fig.S6A)。热灭活O. spl治疗未能减轻炎症和屏障损伤(Fig.S6B–G)。这些结果表明，仅凭膜蛋白不足以抑制结肠炎。 为了探究活O. spl抗炎成分的特性，我们给DSS诱导的结肠炎小鼠分别灌胃磷酸盐缓冲液(PBS)、O. spl条件培养基(CM)以及经蛋白酶K处理后的条件培养基(CMK)(可去除酶和其他蛋白成分)(Fig.S7A)。结果显示，CM和CMK治疗均能有效减轻炎症并维持上皮屏障完整性(Fig.S7B–H)。为了进一步确定活O. spl的保护作用是否需要小分子代谢物或非蛋白成分，我们根据分子量将O. spl条件培养基分为>3 kDa和<3 kDa两个组分(Fig.S8A)。我们发现，只有O. spl上清液的<3 kDa组分在结肠炎小鼠中表现出抗炎特性和修复肠道屏障损伤的能力(Fig.S8B–H)，这表明条件培养基中存在的小分子代谢物可能介导了O. spl的保护作用。为了探究O. spl条件培养基中的代谢物变化，我们进行了非靶向代谢组学分析，发现吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙烯酸和吲哚-3-丙酮酸显著增加(Fig.S9A–C)。综上所述，这些发现表明，与宿主的相互作用主要由活的O. spl及其代谢物介导，而非由其膜蛋白或上清液中的酶类成分介导。 Fig.S6 (A) 使用热灭活 O. spl处理 2.5% DSS 诱导结肠炎小鼠的实验设计。(B) 结肠炎小鼠的体重下降情况。(C) 结肠炎小鼠结肠的代表性图像。(D) 结肠炎小鼠结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示；“ns”表示无显著差异，采用非配对 Student's t 检验确定。(E) 20× 和 40× 放大倍数下的代表性 HE 染色图像，以及各组间统计组织学评分的比较。(F) 结肠炎小鼠中 ZO-1(绿色)、Occludin(绿色)、Claudin1(绿色)和 Muc2(绿色)的 IF 染色代表性图像。细胞核用 DAPI(蓝色)染色。(G) IF 图像中 OCCLUDIN、CLAUDIN1、MUC2 荧光强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示；“ns”表示无显著差异，采用非配对 Student's t 检验确定。 Fig.S7 (A) 使用 O. spl条件培养基不同组分处理 3% DSS 诱导结肠炎小鼠的实验设计。CM：O. spl培养 48 小时后获得的条件培养基；CMK：经 100 μg/mL 蛋白酶 K 处理的条件培养基，50°C 孵育 1 小时，然后 100°C 孵育 5 分钟。(B) 体重下降和 DAI 评分。(C) 结肠代表性图像。(D) 三组结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(E) 20× 和 40× 放大倍数下的代表性 HE 染色图像。(F) 各组间组织学评分的比较。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(G) 经条件培养基处理的结肠炎小鼠中 Occludin(绿色)、Claudin1(绿色)和 Muc2(绿色)的 IF 染色代表性图像。DAPI 用于细胞核染色(蓝色)。(H) IF 图像中 OCCLUDIN、CLAUDIN1、MUC2 荧光强度的统计分析。 Fig.S8 (A) 使用 O. spl条件培养基不同组分处理 3% DSS 诱导结肠炎小鼠的实验设计。小鼠分别接受条件培养基的 >3 kDa 或 <3 kDa 组分处理。GAM 作为溶媒对照，用于评估条件培养基的效果。(B) DAI 评分和体重下降。(C) 不同组别的结肠长度。(D) 结肠代表性图像。(E) 20× 和 40× 放大倍数下的代表性 HE 染色图像。(F) 各组间组织学评分的统计学比较。(G) 接受条件培养基 >3 kDa 或 <3 kDa 组分处理的结肠炎小鼠中，Zo-1(绿色)、Occludin(绿色)、Claudin1(绿色)和 Muc2(绿色)的 IF 染色代表性图像。DAPI 用于细胞核染色(蓝色)。(H) IF 图像中荧光强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01；****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。 Fig.S9 (A) 两组间代谢物的 VIP 评分。(B) O. spl 条件培养基中上调和下调的差异代谢物。(C) 代谢物的火山图。 为鉴定受O. spl 影响的潜在代谢物，我们使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对结肠炎小鼠的粪便进行了非靶向代谢组学测序。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)显示两组间存在不同的代谢谱(Fig.4A)。基于变量投影重要性(VIP)评分筛选出差异代谢物(Fig.4B,C)。次级胆汁酸石胆酸(LCA)在O. spl干预后显著富集(Fig.4C)。胆汁酸靶向代谢组学分析表明，O. spl干预后粪便中总胆汁酸浓度显著增加(Fig.4D)。与DSS组相比，O. spl 治疗组次级胆汁酸与初级胆汁酸的比例升高(Fig.4E)。值得注意的是，粪便中LCA及其衍生物水平升高(Fig.4G)。在另一个Il-10−/−小鼠模型中，O. spl干预后也观察到次级胆汁酸和LCA水平升高的一致结果(Fig.4F,H)。为了验证O. spl 对胆汁酸代谢的影响，我们使用qPCR分析了肝脏、回肠和结肠中参与胆汁酸代谢、合成和排泄的基因表达(Fig.4I–K；Fig.S10A–C)。在肝脏中，O. spl 干预后Bacs、Bsep、Cyp2c70、Cyp7a1、Cyp8b1和Cyp27a1的表达上调(Fig.4I)。此外，O. spl 下调了回肠中胆汁酸转运蛋白Ostb和Astb的表达，同时上调了Vdr的表达(Fig.4J)。在O. spl 治疗组的结肠中，还观察到胆汁酸受体Gpbar1的表达增加(Fig.4K)。次级胆汁酸的转化和产生涉及肠道菌群的酶，这些酶将排入肠道的初级胆汁酸通过去结合反应和随后的二羟基化转化为次级胆汁酸。一致地，在O. spl 治疗组粪便中，结合型胆汁酸下调，而非结合型胆汁酸上调(Fig.4L,M)。为了评估O. spl 是否能够调节结肠炎小鼠中代谢胆汁酸的菌群，我们使用16S rRNA测序分析了肠道菌群组成。O. spl增加了肠道菌群的多样性(Fig.S11A,B)，并且O. spl治疗组中富集了特定的潜在益生菌，包括拟杆菌属(Bacteroides)、颤螺菌属(Oscillibacter)、另枝菌属(Alistipes)和鼠杆菌属(Muribaculum)(Fig.S11C)。此外，我们在Il-10−/−小鼠中也观察到了调控胆汁酸代谢的基因表达变化(Fig.S10D–F；Fig.S11D–F)。总之，这些结果表明，在两种实验性结肠炎模型中，O. spl显著重塑了次级胆汁酸谱，其中对LCA累积的影响最为显著。 Fig.4. O. spl调节 DSS 诱导结肠炎和 Il-10−/− 小鼠模型中的胆汁酸代谢。 (A)OPLS-DA 通过 LC-MS/MS 揭示了两组之间不同的代谢谱。(B)火山图显示两组之间的差异代谢物。点的大小代表 VIP 值，蓝点表示增加的代谢物，灰点表示减少的代谢物。(C)基于 VIP 值显示差异代谢物，O. spl干预后 LCA 富集。(D)O. spl干预后 DSS 诱导结肠炎小鼠粪便中胆汁酸总浓度的 LC-MS 分析。(E) O. spl干预的 DSS 结肠炎小鼠中初级和次级胆汁酸占总胆汁酸的比例。(F)O. spl干预的 Il-10−/− 小鼠中初级和次级胆汁酸占总胆汁酸的比例。(G)O. spl 治疗后 DSS 结肠炎小鼠粪便中 LCA 及其衍生物的浓度。(H)O. spl治疗后 Il-10−/−小鼠粪便中 LCA 及其衍生物的浓度。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01；***,P < 0.001；****,P < 0.0001，采用 Mann-Whitney U 检验确定。(I)O. spl治疗的小鼠肝脏中胆汁酸合成相关基因 (Bacs, Bsep, Cyp2c70, Cyp7a1, Cyp8b1, and Cyp27a1) 的 mRNA 表达。(J)O. spl治疗的小鼠回肠中胆汁酸合成相关基因 (OstB, Vdr, Astb) 的 mRNA 表达。(K)O. spl治疗的小鼠结肠中胆汁酸合成相关基因 (Gpbar1) 的 mRNA 表达。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用 Mann-Whitney U 检验。(L)O. spl治疗后 DSS 诱导结肠炎和 (M)Il-10−/− 小鼠粪便中结合型和非结合型胆汁酸占总胆汁酸的比例。数据以均值±SEM 表示。*，P < 0.05；**,P < 0.01；***,P < 0.001；****,P < 0.0001，采用 Mann-Whitney U 检验。 Fig.S10 (A) DSS 诱导的结肠炎小鼠和 (D) Il-10−/− 小鼠肝脏中胆汁酸合成相关基因的 mRNA 表达。(B) DSS 诱导的结肠炎小鼠和 (E) Il-10−/− 小鼠回肠中胆汁酸转运蛋白的 mRNA 表达。(C) DSS 诱导的结肠炎小鼠和 (F) Il-10−/− 小鼠结肠中胆汁酸受体的 mRNA 表达。数据以均值±SEM 表示。“ns”表示无显著差异，采用非配对 Student's t 检验确定。 Fig.S11 (A) 通过 16S rRNA 测序评估，使用 Chao1 指数衡量O. spl干预后结肠炎小鼠肠道微生物群的 α 多样性。统计分析采用 Wilcoxon 检验进行。(B) PCoA 图描述了O. spl干预后肠道微生物群的 β 多样性。(C) 热图显示 O. spl治疗的结肠炎小鼠中，在属水平上丰度前20的差异分类单元。(D) O. spl干预后Il-10−/−小鼠肝脏中胆汁酸合成相关基因Bsep、Cyp8b1和Ntcp的 mRNA表达。(E)O. spl干预后 Il-10−/−小鼠回肠中胆汁酸转运蛋白 Gpbar1和Ostb的mRNA 表达。(F)O. spl干预后 Il-10−/− 小鼠结肠中胆汁酸受体 Gpbar1 和 Nr1h4 的 mRNA 表达。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01；****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。 LCA是一种主要的次级胆汁酸。我们假设LCA的上调是O. spl在减轻炎症和屏障损伤中发挥保护作用的机制。为了确定单独补充LCA是否足以缓解结肠炎的炎症和屏障损伤，我们给DSS诱导的结肠炎小鼠灌胃LCA(Fig.5A)。结果显示，LCA同样减轻了体重下降、结肠缩短和组织学损伤(Fig.5B,C；Fig.S12A–C)，包括隐窝损伤、促炎免疫细胞浸润和屏障损伤(Fig.S12D)。为了评估补充LCA是否同样调节结肠免疫细胞微环境，我们检测了灌胃LCA的结肠炎小鼠结肠中性粒细胞的数量和功能。结果显示，LCA减少了结肠组织中的Gr-1+中性粒细胞浸润(Fig.S12E,F)和促炎细胞因子Il-1β与Il-6的表达(Fig.S12G)。免疫印迹检测到的NETs形成相关蛋白PAD4、MPO、NE和CitH3的表达在LCA干预后下调(Fig.5E,F)。此外，LCA降低了血清中CitH3的水平(Fig.5D)。同时，在LCA治疗组中观察到形成NETs的中性粒细胞减少，CitH3与MPO和NE的共染结果也证实了这一点(Fig.5I,J)。Ly6G与CitH3及PAD4共定位减少也显示出相同趋势(Fig.5G,H)。 为了确定LCA是否对NETs形成有直接抑制作用，我们使用原代小鼠中性粒细胞进行了体外共培养实验(Fig.5K)。结果显示，LCA显著抑制了NETs的形成，表现为CitH3与MPO共定位减少(Fig.5M,N)以及胞外网状DNA结构减少(Fig.S12H)。ELISA的定量结果也显示cfDNA和MPO水平降低(Fig.5L)。有趣的是，在O. spl培养上清干预后，未观察到上述对NETs形成的抑制作用(Fig.S13A–C)。综上所述，这些数据表明，O. spl触发了与肠道菌群相关的、由次级胆汁酸代谢驱动的中性粒细胞功能调节，从而在抑制炎症和促进肠道屏障修复中发挥保护作用。 Fig.5. O. spl 介导的 LCA 抑制 NET 形成。 (A)用 50 mg/kg LCA 治疗 3% DSS 诱导结肠炎小鼠 7 天的实验设计。(B)三组的体重下降情况。(C)20× 和 40× 放大倍数下 HE 染色的代表性图像。(D) LCA 治疗后检测 CitH3 浓度的 ELISA 结果。(E)蛋白质印迹分析和 (F) 对照组和 LCA 治疗组结肠中 PAD4、MPO、NE 和 CitH3 的统计分析，以 β-actin 作为上样对照。(G) CitH3 (绿色) 和 Ly6G (红色)、Ly6G (绿色) 和 PAD4 (红色) 的 IF 染色代表性图像。Hoechst 33342 用于细胞核染色 (蓝色)。(H) 使用皮尔逊相关系数 (PCC) 量化 Ly-6G 与 CitH3 或 PAD4 的共定位。PCC 值计算自每个样本的五个视野 (n = 3 只小鼠/组)。数据代表每组三只小鼠 NET 形成中性粒细胞的平均百分比，每个样本分析五个视野。数据以均值±SEM 表示 (n = 15)。****，P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(I) CitH3 (红色) 和 MPO (绿色)、CitH3 (红色) 和 NE (绿色) 的 IF 染色代表性图像。DAPI 用于细胞核染色 (蓝色)。比例尺，50 μm。(J) 两组中 NETs 形成中性粒细胞的百分比。数据代表每组三只小鼠 NET 形成中性粒细胞的平均百分比，每个样本分析五个视野。数据以均值±SEM 表示 (n = 15)。****，P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(K) 从小鼠骨髓分离的中性粒细胞用 400 nM PMA 刺激并用 5 μM 和 10 μM 浓度 LCA 处理的实验设计。(L) 检测 cfDNA 和 MPO 浓度的 ELISA 结果。(M) CitH3 (红色)和MPO (绿色)共定位的代表性 IF 图像。Hoechst 33342用于细胞核染色 (蓝色)。(N) NETs 形成中性粒细胞百分比的统计分析。 Fig.S12 (A) 结肠代表性图像，(B) 三组结肠长度。(C) 组织学评分的统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用单因素方差分析确定。(D) 结肠中 Zo-1、Occludin、Muc2 的相对 mRNA 表达量。(E) 流式细胞术检测 Gr-1+ 中性粒细胞的代表性图像。(F) Gr-1+ 中性粒细胞的统计分析。(G) 结肠中 Il-1β 和 Il-6 的相对 mRNA 表达量。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用非配对 Student's t 检验确定。(H) Hoechst 33342 染色的细胞代表性图像。 Fig.S13 (A) 将分离的小鼠中性粒细胞与 O. spl条件培养基共培养的实验设计。(B) 各组中 Hoechst 33342 染色的细胞代表性图像。(C) 共培养后细胞上清液中 cfDNA 和 MPO 的浓度。数据以均值±SEM 表示(n = 6)。****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。 2.6. O. spl促进LCA转化依赖于肠道菌群 接下来，我们探究了O. spl介导的胆汁酸代谢如何抑制炎症并促进肠道屏障修复。臭气杆菌属中的某些菌种能够转化宿主内的次级胆汁酸及其衍生物。然而，O. spl是否具有类似作用尚不明确。为确定O. spl是否直接诱导LCA的转化，我们将其培养上清液与初级胆汁酸底物共孵育72小时(Fig.6A)，随后收集培养上清液进行质谱分析以检测次级胆汁酸水平。尽管补充了底物，但未检测到LCA水平增加(Fig.6B)。值得注意的是，观察到LCA衍生物alloLCA(Fig.6C)和12-酮基石胆酸(12-ketoLCA)(Fig.6D)的水平呈浓度依赖性增加。为进一步评估LCA在体内的转化情况，我们给无菌小鼠口服O. spl处理2周(Fig.6E)。结果显示，O. spl处理的小鼠并未出现LCA水平升高(Fig.6F)。然而，其衍生物异石胆酸(isoLCA)显著升高(Fig.6F)。总体而言，这些数据表明，O. spl在体外或体内均不直接转化LCA。 如前所述，O. spl显著影响肠道菌群组成，这意味着多样化的肠道菌群存在可能是O. spl促进LCA及其衍生物转化所必需的。某些细菌进行去结合和二羟基化反应需要胆汁盐水解酶(BSH)和羟基类固醇脱氢酶(HSDH)。首先，我们分析了含有BSH和HSDH的菌属丰度。值得注意的是，在O. spl治疗组中，含有BSH的拟杆菌属(Bacteroides)以及含有HSDH的细菌(包括拟杆菌属和真杆菌属(Eubacterium))的相对丰度均增加(Fig.6G,H)。综上所述，上述数据表明O. spl干预后肠道菌群组成与胆汁酸之间存在关联。 为探究与改变的肠道菌群相互作用是否介导了O. spl的保护作用，我们进行了FMT实验以评估炎症和胆汁酸水平(Fig.6I)。结果显示，O. spl的抗炎作用可通过FMT传递给经抗生素预处理的小鼠(Fig.6J–L)。与对照组相比，接受O. spl治疗组小鼠粪便的结肠炎小鼠，其结肠免疫细胞浸润(Fig.6M)和肠道屏障损伤(Fig.6N；Fig.S14B)均得到缓解。此外，接受O. spl治疗组小鼠粪便的结肠炎小鼠中，LCA及其衍生物的水平也同样升高(Fig.S15A)。总之，改变的菌群介导了O. spl在小鼠体内肠道LCA的转化，表明肠道菌群对于次级胆汁酸的产生以及O. spl的保护作用至关重要。 在使用抗生素预处理模拟菌群缺陷条件后(Fig.6O)，DSS组和O. spl治疗组小鼠在体重下降(Fig.6P)、DAI评分升高(Fig.6Q)和结肠缩短(Fig.6R)方面表现出相似趋势。此外，经抗生素预处理的O. spl治疗组小鼠在组织学评分(Fig.6S)或肠道屏障修复(Fig.6T；Fig.S14A)方面未观察到差异。值得注意的是，在O. spl干预后，结肠胆汁酸转运蛋白Vdr的表达在FMT小鼠中增加(Fig.S15C)，但在无菌小鼠(Fig.S15D)或抗生素处理小鼠(Fig.S15B)中未见增加。总之，这些结果表明，O. spl与肠道菌群的相互作用是其通过转化LCA发挥保护作用所必需的。 Fig.6. O. spl通过肠道微生物群促进 LCA 转化。 (A)O. spl体外培养的实验设计。O. spl(OD = 0.1) 补充了 CA、CDCA、LCA 和 UDCA。分析条件培养基中的胆汁酸浓度。(B)LCA 的浓度，(C) alloLCA，和 (D) 12-ketoLCA。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(E)用 O. spl治疗无菌小鼠的实验设计。每只小鼠每天灌胃 O. spl，浓度为 10^8 CFU/200 μL，持续 2 周。在实验的最后一周，在饮水中加入 2% DSS。O. spl 悬浮于无菌 PBS 中，使用等体积无菌 PBS 作为溶媒对照。(F)无菌小鼠粪便中 LCA 及其衍生物的浓度。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01；***,P < 0.001；****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(G)O. spl干预后 DSS 诱导结肠炎小鼠中含 BSH 菌属的相对丰度。(H)O. spl干预后 DSS 诱导结肠炎小鼠中含 HSDH 菌属的相对丰度。(I) 接受 FMT 的 3% DSS 诱导结肠炎小鼠的实验设计。小鼠用 Abx 预处理 4 周以消耗肠道中的大多数细菌。供体小鼠通过口服灌胃接受含 O. spl的粪便，同时通过饮水给予 3% DSS 处理。监测体重下降、DAI 和结肠长度。收集远端结肠组织进行 HE 染色，剩余结肠保留用于进一步验证。(J)体重下降，(K) DAI 评分，(L) 结肠代表性图像和结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01；***,P < 0.001，采用非配对 Student's t 检验确定。(M)20× 和 40× 放大倍数下 HE 染色的代表性图像，以及各组间统计组织学评分的比较。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(N)结肠炎小鼠中 Zo-1 (绿色)、Occludin (绿色)、Claudin1 (绿色) 和 Muc2 (绿色) 的 IF 染色代表性图像。(O)接受 Abx 预处理的 3% DSS 诱导结肠炎小鼠的实验设计。将氨苄青霉素 (1 g/L)、新霉素 (1 g/L)、甲硝唑 (1 g/L) 和万古霉素 (0.5 g/L) 加入小鼠饮水中自由饮用 4 周，以清除大多数肠道细菌。随后，通过口服灌胃给予 O. spl，并在饮水中加入 3% DSS 处理 7 天。(P)体重下降，(Q) DAI 评分，(R) 结肠代表性图像和结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。"ns" 表示无显著差异，采用非配对 Student's t 检验确定。(S)20× 和 40× 放大倍数下 HE 染色的代表性图像，以及各组间统计组织学评分的比较。(T)接受 Abx 预处理的结肠炎小鼠中 Zo-1 (绿色)、Occludin (绿色)、Claudin1 (绿色) 和 Muc2 (绿色) 的 IF 染色代表性图像。 Fig.S14 (A) 抗生素鸡尾酒预处理后，DSS组和DSS+O.s组 IF 图像中ZO-1、OCCLUDIN、CLAUDIN1和MUC2荧光强度的统计分析。(B) 粪菌移植(FMT)干预后，DSS 组和 DSS+O.s组IF图像中ZO-1、OCCLUDIN、CLAUDIN1和MUC2荧光强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非配对Student's t 检验确定。 Fig.S15 (A) 接受粪菌移植(FMT)治疗的结肠炎小鼠粪便中 LCA 及其衍生物的浓度。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(B) 抗生素预处理结肠炎小鼠结肠中胆汁酸受体 Gpbar1、Nr1h4 和 Vdr 的 mRNA 表达水平。(C) 粪菌移植(FMT)治疗结肠炎小鼠结肠中胆汁酸受体 Gpbar1、Nr1h4 和 Vdr 的 mRNA 表达水平。(D) 无菌小鼠结肠中胆汁酸受体 Gpbar1、Nr1h4 和 Vdr 的 mRNA 表达水平。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01，采用非配对 Student's t 检验确定。 2.7. O. spl增加LCA产生通过Nlrp3-Gsdmd信号通路抑制NETs形成 NLRP3通路与针对某些肠道菌群及其代谢物的炎症和免疫反应有关。为了探究结肠中NETs平衡的调节是否需要NLRP3的参与，我们通过免疫印迹分析了LCA处理小鼠的结肠组织(Fig.7C)。LCA干预后，NLRP3、ASC和IL-18的表达降低(Fig.7C–F)。与细胞焦亡相关的裂解GSDMD的比例也降低(Fig.7C,G)。这些数据表明LCA干预诱导了NLRP3通路的反应并改变了细胞焦亡表型。这促使我们检查先前获得的单细胞RNA测序数据中免疫细胞内Nlrp3的表达情况。我们证实Nlrp3在中性粒细胞中表达最高，并且在O. spl治疗组中，结肠中性粒细胞的Nlrp3表达降低(Fig.7A)。此外，通过免疫荧光染色检测到的NLRP3与中性粒细胞标志物Ly-6G的共定位(Fig.7B；Fig.S16A)进一步证实了这一发现。 为探究NLRP3是否在LCA抑制NETs形成中发挥作用，我们分析了在缺乏NLRP3信号通路的情况下LCA的调节作用(Fig.7H)。值得注意的是，Nlrp3−/−小鼠中，LCA在免疫环境调节和炎症抑制方面的保护作用消失。在LCA干预后，Nlrp3−/−小鼠中NETs相关蛋白(包括PAD4、MPO和DNase)的表达差异不再存在(Fig.7I–L)。此外，在Nlrp3−/−小鼠中，LCA未能减少CitH3与抗菌蛋白MPO(Fig.7M；Fig.S16B)和NE(Fig.7N；Fig.S16B)的共定位。这些结果表明，NLRP3信号通路对于LCA抑制NETs形成至关重要。此外，在Nlrp3−/−小鼠中，未观察到LCA或O. spl(Fig.S16D,E)在抑制炎症(Fig.7O,P)和肠道屏障修复(Fig.7Q–T；Fig.S16C)方面的保护作用。总之，这些结果表明，O. spl通过促进LCA转化，经由NLRP3-GSDMD通路调节NETs的形成与降解，从而在结肠炎小鼠中发挥保护作用。 Fig.7. O. spl增加 LCA 产量，通过 NLRP3-GSDMD 信号通路抑制 NET 形成。 (A)通过单细胞 RNA 测序数据确定O. spl 干预后 Nlrp3 在不同细胞类型中的表达。(B)IF 染色显示 Nlrp3 (红色) 和 Ly-6G (绿色) 的共定位，DAPI用于细胞核染色 (蓝色)。比例尺，50 μm。(C) 对照组和 LCA 治疗组结肠中 NLRP3、ASC、IL-18、GSDMD-FL 和 GSDMD-N 的蛋白质印迹分析，以 β-actin 作为上样对照。(D–G) 使用 ImageJ 软件对蛋白质印迹数据进行统计分析。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01；***,P < 0.001，采用非配对 Student's t 检验确定。(H)野生型和 Nlrp3−/− 小鼠中 DSS 诱导结肠炎模型的实验设计。小鼠通过饮水给予 3% DSS 处理 7 天，随后每天口服灌胃 50 mg/kg LCA，持续 7 天。研究结束时处死小鼠，并显示其结肠的代表性图像。将远端结肠用 4% 多聚甲醛固定，切片进行 HE 染色。(I)在有或没有 LCA 干预的野生型和 Nlrp3−/−小鼠结肠中Pad4、MPO和DNase的蛋白质印迹分析，以β-actin作为上样对照。(J–L) 使用ImageJ 软件对蛋白质印迹数据进行统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；***,P < 0.001，采用非参数Kruskal-Wallis检验确定。(M) 显示 CitH3 (红色) 和 MPO (绿色) 的代表性 IF 图像。(N) 在有或没有 LCA 干预的野生型和 Nlrp3−/− 小鼠中 CitH3 (红色) 和 Ne (绿色) 的代表性图像。DAPI 用于细胞核染色 (蓝色)。(O) 不同组结肠切片的代表性图像和结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****，P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。(P) LCA 干预后野生型和 Nlrp3−/− 小鼠的代表性 HE 染色图像。(Q) LCA 干预后野生型和 Nlrp3−/− 小鼠中 Occludin (绿色)、Claudin1 (绿色) 和 Muc2 (绿色) 的 IF 染色代表性图像。(R–T) 屏障相关基因 Zo-1、Occludin 和 Muc2 的 mRNA 表达水平。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；****,P < 0.0001，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。 Fig.S16.(A) IF 图像中 Ly6G 和 Nlrp3 共定位的皮尔逊相关系数分析。(B) 各组中 NETs 形成中性粒细胞的百分比。(C) IF 图像中 OCCLUDIN、CLAUDIN1 和 MUC2 荧光强度的统计分析。(D) O. spl干预后野生型小鼠和 Nlrp3−/− 小鼠的 DAI 评分。通过给予小鼠 3% DSS 处理 7 天诱导结肠炎。(E) 所有组中结肠长度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。**,P < 0.01，采用非参数 Kruskal-Wallis 检验确定。 2.8. UC患者中LCA、NETs和Nlrp3表达与O. spl 丰度相关 为阐明上述发现的临床意义，我们接下来评估了UC患者中O. spl与NETs形成的相关性。与健康对照组相比，UC组NETs形成增加，表现为瓜氨酸化组蛋白3与MPO的共定位增强(Fig.8A,C)。此外，我们检测到Nlrp3表达显著增加(Fig.8B,D)，同时观察到ZO-1表达降低(Fig.8F,G)，表明紧密连接破坏和上皮屏障受损。生成Spearman相关性热图以探索O. spl丰度、NETs百分比、Nlrp3表达和紧密连接蛋白ZO-1之间的关系(Fig.8E)。结果显示，O. spl丰度与ZO-1表达呈正相关(r = 0.77, p < 0.0001)，而与NETs百分比(r = −0.83, p < 0.0001)和Nlrp3表达(r = −0.67, p < 0.0001)呈显著负相关。我们还观察到UC患者中LCA水平显著降低(Fig.8H)。总体而言，这些临床数据表明UC患者中O. spl丰度与NETs形成呈负相关，揭示了UC潜在的新治疗靶点。 Fig.8. 在 UC 患者中观察到 LCA 浓度降低、NETs 和 Nlrp3 表达增加。 (A)UC 患者和健康对照者中 CitH3 (红色) 和 MPO (绿色) 的 IF 染色代表性图像。(B)Nlrp3 (红色) 的 IF 染色代表性图像。DAPI 用于细胞核染色 (蓝色)。(C)NETs 形成百分比的统计分析。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05，采用非配对 Student's t 检验确定。(D)IF 图像中 Nlrp3 强度的统计分析。数据以均值±SEM 表示。****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。(E)O. spl丰度、ZO-1 表达、Nlrp3 表达和 NETs 百分比之间的 Spearman 相关热图 (双尾，P < 0.05)。(F)紧密连接蛋白 ZO-1 (绿色) 在 10× 和 40× 放大倍数下的 IF 染色代表性图像，(G)以及 IF 图像中 ZO-1 强度的统计分析。(H) UC 患者和健康对照者粪便中 LCA 的浓度。数据以均值±SEM 表示。*,P < 0.05；**,P < 0.01；****,P < 0.0001，采用非配对 Student's t 检验确定。 3 讨论 肠道屏障的损伤使得肠道微生物易位，导致黏膜免疫系统过度激活，从而驱动炎症的发生发展。UC的治疗方法包括5-ASA、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂；然而，UC患者仍然面临高复发率以及长期使用这些药物带来的不良反应风险。在本研究中，我们鉴定出O. spl是一种能够减轻结肠炎症并保护结肠炎中屏障功能的肠道菌群成员。我们的数据显示，这些作用至少部分是通过抑制NETs形成和依赖菌群的LCA调节来介导的。这些发现扩展了先前关于微生物代谢物与宿主免疫调节相关联的报道，并为IBD中“肠道菌群-代谢物-中性粒细胞轴”的存在提供了直接证据。 肠道黏膜屏障受损和菌群失调是IBD发病机制中不可或缺的部分。某些细菌已被证明能与免疫系统相互作用并发挥抑制炎症的保护作用，凸显了它们强大的临床转化潜力。例如，产丁酸共生菌丁酸梭菌(C. butyricum)在IBD中发挥保护作用。此外，普拉梭菌(F. prausnitizii)及其代谢物通过IL-6/STAT3/IL-17轴抑制炎症并促进FOXP3表达。研究还表明，结合IgA涂层指数和机器学习筛选IgA包被的O. spl被证明是预测UC患者FMT疗效的良好指标。此外，IgA涂层水平对微生物群的反应与疾病进展密切相关。与这些发现一致，我们的研究发现，在我们研究的UC队列中，臭气杆菌属和O. spl的相对丰度显著降低。我们还观察到，在对FMT治疗有反应的UC患者中，存在IgA包被的O. spl增加。很少有研究报道O. spl与疾病之间的关联，但已有研究表明，单一定植O. spl可通过诱导Foxp3+/RORγt+ Tregs来抑制结肠炎小鼠的炎症。Xing等人观察到在Tak1∆M/∆M小鼠中O. spl高度富集，且O. spl干预后明显诱导Th17细胞发育，从而对结肠炎和结直肠癌起到保护作用。与这些研究一致，我们的数据显示，在DSS诱导的结肠炎和Il-10−/−自发结肠炎小鼠模型中，O. spl对抑制炎症和修复肠道屏障均发挥了保护作用。我们的结果表明，补充O. spl可能是一种有前景的改善UC进展的疗法，值得进一步研究。 几种共生微生物已被证明能调节宿主免疫。例如，脆弱拟杆菌(B.fragilis)通过产生结构独特的糖脂，以CD1d依赖性方式调节自然杀伤T(NKT)细胞活性，从而调节宿主免疫。此外，脆弱拟杆菌或其荚膜多糖A(PSA)通过B细胞依赖性途径诱导产生IL-10的调节性T细胞，从而在外周和中枢神经系统中发挥免疫调节作用，防止过度炎症。普拉梭菌是一种著名的具有抗炎特性的共生菌。研究表明，它通过减少髓样细胞驱动的肠道炎症和重塑肠道菌群来减轻免疫检查点抑制剂相关性结肠炎，同时还能增强抗肿瘤免疫的疗效。普拉梭菌也被证明通过上调分泌型IgA反应和重塑肠道菌群来促进肠道免疫稳态。在DSS诱导的结肠炎模型中，普拉梭菌增强了IgA相关基因的表达，并降低了促炎细菌类群的丰度，从而有助于改善黏膜免疫和肠道屏障完整性。 这些发现与我们关于O. spl的数据一起，突显了肠道细菌影响免疫功能的多样化机制。我们的数据发现，O. spl可以调节黏膜免疫格局，这为其减轻炎症和肠道屏障损伤提供了潜在的机制。 中性粒细胞的募集和活化构成了炎症反应的初始和关键阶段。在活动性UC患者的炎症黏膜中观察到大量中性粒细胞，其数量可作为疾病活动度的预测指标。一些研究也表明肠道菌群在中性粒细胞稳态中起调节作用。与这些发现一致，在两个结肠炎模型中观察到的中性粒细胞浸润减少结果表明，O. spl治疗可调节炎症和免疫反应。中性粒细胞清除后该效应的消失，突显了中性粒细胞是O. spl诱导保护作用不可或缺的介质。 我们的数据表明，O. spl 通过抑制NETs形成来减轻结肠炎症并维持屏障完整性，并且这种保护作用在Pad4−/−小鼠中被消除。这一发现强调了PAD4依赖的NETosis在介导O. spl抗炎活性中的必要性。PAD4催化组蛋白瓜氨酸化，这是染色质去浓缩和DNA释放的关键步骤。Pad4−/−小鼠在刺激下无法形成NETs。在UC中，过度的NETs积累会放大炎症信号，驱动IL-1β和IL-6的产生，最终导致上皮屏障破坏。NETs相关的组蛋白和蛋白酶直接损伤上皮细胞并增加肠道通透性，而在脓毒症和缺血再灌注等炎症情况下，NETs水平升高与上皮损伤相关。值得注意的是，O. spl干预还降低了特定中性粒细胞亚群中CD177的表达。鉴于有报道称CD177+中性粒细胞表现出细胞因子产生改变和更强的NETs释放能力，这种下调可能代表了O. spl限制NETs介导的黏膜损伤的另一种机制。在我们的结肠炎模型中，O. spl治疗减少了NETs形成和促炎细胞因子表达。此外，O. spl干预后DNase表达上调提示其可能有助于NETs的清除，尽管需要进一步研究来证实其在胞外DNA降解中的具体作用。总之，这些结果支持这样一个模型：O. spl调节中性粒细胞功能和PAD4依赖的NETosis，从而在结肠炎期间维持黏膜完整性。 肠道菌群-宿主相互作用对于维持免疫稳态至关重要，部分是通过微生物代谢物(如胆汁酸)实现的。我们研究中的非靶向代谢组学揭示了O. spl干预后胆汁酸代谢的富集，表明该通路可能是其作用的潜在介质。O. spl处理的小鼠中，由细胞色素P450酶通过经典和替代途径调节的肝脏胆汁酸合成增强，Cyp7b1、Cyp27a1、Cyp2c70、Cyp7a1和Cyp8b1的上调证明了这一点。在胆汁酸辅酶A合成酶(BACS)和胆汁酸辅酶A：氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)存在下，初级胆汁酸与牛磺酸和甘氨酸结合，随后转化为结合型胆汁酸，并分泌到胆囊中。进入胆管后，结合型胆汁酸被排入小肠，促进脂质和维生素的吸收。胆汁酸被回肠上皮细胞重吸收，并通过门静脉返回肝脏，这一过程称为肠肝循环。除合成外，胆汁酸稳态还受肠道转运的影响。ASBT介导肠肝循环中回肠胆汁酸的重吸收，而BSEP和OSTβ则促进胆汁酸的排泄。与此一致，O. spl治疗降低了回肠Asbt和Ostβ的表达，表明它可能通过减少肠肝循环中的重吸收来影响胆汁酸稳态。 胆汁酸谱的改变与IBD相关，在CD患者和接受结肠切除术的UC患者中，通常观察到初级胆汁酸富集和次级胆汁酸耗竭。次级胆汁酸富集和微生物多样性增加与接受生物制剂治疗的IBD患者治疗反应改善相关，而产BSH细菌丰度降低则被频繁报道。在我们的研究中，靶向代谢组学显示，O. spl治疗降低了粪便中结合型胆汁酸和初级胆汁酸，同时增加了非结合型胆汁酸和次级胆汁酸。值得注意的是，LCA水平显著升高，这与非靶向代谢组学结果一致。这些变化反映了胆汁酸谱向更健康肠道环境特征转变。此外，补充LCA重现了O. spl观察到的抗炎作用，提示菌群驱动的LCA上调可能有助于其保护机制。 微生物将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸需要连续的酶促反应，从BSH介导的去结合开始，随后是由细菌酶催化的结构修饰，包括7α/β-脱羟基化。含有BSH的类群主要是革兰氏阳性菌，如梭菌属(Clostridium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Enterococcus)，拟杆菌门中也有一些革兰氏阴性成员。次级胆汁酸(包括脱氧胆酸(DCA)和LCA)主要通过基因介导的7α/β-脱羟基化产生，而表异构化和氧化等替代途径也有贡献。在我们的研究中，O. spl增加了含有BSH的细菌以及与7α/β-脱羟基化途径相关的类群的丰度，同时小鼠粪便LCA水平升高。这些发现表明，O. spl可能通过调节肠道微生物群落间接促进LCA的产生。 为确定O. spl是否直接产生LCA，我们以鹅去氧胆酸(CDCA)为底物进行了体外共培养实验，并在无菌小鼠中进行了单一定植实验。在这两种情况下，O. spl均未显著增加LCA水平，表明LCA的富集不太可能仅源于其自身的代谢能力。有趣的是，在与CDCA共孵育后，我们在O. spl培养物的条件培养基中检测到了LCA衍生物，包括isoLCA和12-ketoLCA。这一观察结果表明，该细菌可能直接催化LCA的下游修饰，产生免疫调节衍生物。这与以下报道一致：O. spl科的成员可以产生类似的化合物，如异别石胆酸(isoalloLCA)， 并且拟杆菌门含有编码5β-还原酶、5α-还原酶和3β-HSDH等酶的生物合成基因簇，这些酶参与3-氧代石胆酸(3-oxoLCA)向isoalloLCA的转化。与依赖菌群的机制一致，O. spl在经抗生素预处理的小鼠中未能减轻结肠炎症或恢复屏障功能，而来自O. spl处理供体的FMT则恢复了抗炎表型以及LCA及其衍生物的升高。总之，这些结果表明，O. spl主要通过重塑肠道微生物群落以增强LCA产生来发挥保护作用，进而调节中性粒细胞介导的免疫反应。 胆汁酸由宿主和肠道菌群内源性产生，对肠道炎症和免疫调节具有深远影响。其中，经微生物转化的次级胆汁酸已成为免疫稳态和IBD发病机制的关键调节因子。先前的研究主要集中在其对T细胞和巨噬细胞的作用上。例如，某些次级胆汁酸及其衍生物通过直接结合RORγt来抑制Th17细胞分化，而isoalloLCA通过保守的非编码序列3促进Tregs发育。相反，在结肠炎模型中，DCA水平升高会驱动巨噬细胞向促炎M1表型极化。基因组分析进一步鉴定了拟杆菌门中负责将3-oxoLCA转化为isoalloLCA的生物合成基因簇，并且发现该代谢物及其生物合成基因在IBD患者中均减少。总之，这些发现强调了次级胆汁酸在维持肠道稳态中的关键作用。在此框架基础上，我们的研究表明次级胆汁酸也调节中性粒细胞驱动的炎症。补充LCA在体内和体外均显著减少了中性粒细胞浸润和NETosis。总之，结果表明，O. spl以肠道菌群依赖的方式增强LCA转化，从而在结肠炎模型中对中性粒细胞浸润和NETs形成发挥免疫调节作用。值得注意的是，O. spl培养上清在体内具有部分抗炎和屏障保护作用，但它并不直接抑制NETs形成。这表明O. spl可能也通过不依赖于NETs的途径发挥作用，这有待进一步研究。 胆汁酸受体在调节次级胆汁酸对炎症和黏膜免疫的作用中发挥作用。FXR、VDR和G蛋白偶联胆汁酸受体1(GPBAR1)是研究最广泛的胆汁酸受体。缺乏FXR的树突状细胞(DCs)表现出与isoDCA干预后相似的转录谱，表明FXR与isoDCA的相互作用与isoDCA调节的DCs表型相关。在定植了拟杆菌株的无菌小鼠中，Treg分化通过VDR和FXR诱导。 一些研究还表明，FXR及其靶基因FGF19在结肠炎中发挥保护作用。此外，一些研究表明，次级胆汁酸可以通过激活肠道干细胞中的TGR5来促进肠道类器官的再生。TGR5类似物INT-777同样能促进干细胞再生。在免疫细胞特异性缺失TGR5的小鼠中，次级胆汁酸的保护作用消失。与这些发现一致，我们的结果表明，O. spl干预上调了Tgr5的表达，进一步提示其作用可能与调节胆汁酸代谢有关。然而，O. spl干预后Fxr表达变化不显著，这可能是由于采样时间点和位置的差异。 另一个新发现是，O. spl干预后升高的LCA直接抑制了NLRP3信号通路。这种抑制有助于减少NETosis并缓解结肠炎。几项研究报道了胆汁酸与炎症小体之间的相互作用。LCA通过激活TGR5促进巨噬细胞NLRP3的磷酸化和泛素化，从而抑制NLRP3介导的炎症。此外，调节胆汁酸受体以抑制NLRP3活化已被证明可影响与非酒精性肝炎相关的炎症。与这些发现一致，我们观察到在胆汁酸干预后的小鼠中，NLRP3表达降低，裂解GSDMD活化减少，这解释了LCA诱导的NETs抑制。一些研究发现，中性粒细胞和巨噬细胞通过与炎症小体的相互作用在自身免疫性疾病中发挥作用。NETosis增加会促进巨噬细胞炎症小体活化，从而促进狼疮患者的疾病进展和活动性。在本研究中，我们发现O. spl干预后中性粒细胞中的NLRP3表达降低。此外，O. spl和LCA的抗炎作用在缺乏Nlrp3表达的小鼠中被消除。除了LCA调节NETosis的NLRP3-GSDMD轴直接作用外，NLRP3信号通路也参与了O. spl在结肠炎中诱导的炎症抑制和屏障修复。我们的研究结果表明，由O. spl调节的LCA通过降低结肠炎小鼠中NLRP3-GSDMD轴的表达，显著抑制了中性粒细胞浸润和NETosis。 值得注意的是，我们在UC患者中发现的O. spl耗竭，以及对FMT治疗有应答的UC患者中IgA包被的O. spl丰度增加，与先前的研究一致，表明O. spl可能作为一种潜在的益生菌，用于预测治疗效果并更好地调节免疫稳态。在DSS诱导的急性结肠炎小鼠和Il-10−/−自发性慢性IBD模型这两种不同的模型中，我们证明了O. spl干预能显著抑制炎症并有助于肠道屏障修复。总之，O. spl对次级胆汁酸的转化调节了NETs形成与降解之间的平衡，从而保护机体免受肠道炎症和肠道屏障损伤。尽管我们的研究集中在LCA-NETs轴上，但O. spl治疗也诱导了其他免疫细胞群体(包括B细胞、T细胞和巨噬细胞)的转录改变。结合其条件培养基的体内抗炎活性以及细菌上清液中检测到的潜在保护性代谢物，这些发现表明O. spl具有超越中性粒细胞的更广泛的免疫调节作用，可能由其衍生的代谢物介导。需要进一步研究来阐明这些额外途径及其转化意义。总之，这突显了肠道菌群-宿主相互作用通过胆汁酸介导的黏膜免疫调节来维持稳态的机制。因此，O. spl可能作为一种益生菌疗法，用于治疗由菌群失调驱动的疾病，帮助恢复肠道稳态。 4 总结     研究通过溃疡性结肠炎临床队列与DSS 诱导急性结肠炎、IL‑10⁻/⁻慢性结肠炎小鼠模型证实，O. spl 在 IBD 中显著耗竭，补充该菌可显著减轻结肠炎症、修复肠道屏障。机制上，通过Pad4⁻/⁻小鼠、Nlrp3⁻/⁻小鼠、无菌小鼠、抗生素处理小鼠及粪菌移植等小鼠模型实验，证实O. spl依赖完整肠道菌群，影响能够产生次级胆汁酸石胆酸（LCA）的肠道菌群，促进LCA生成，LCA 进而抑制 NLRP3‑GSDMD 信号通路，减少PAD4 依赖性NETs形成，最终发挥抗炎与肠道保护作用。临床样本验证显示，O. spl 丰度与 LCA 水平、肠道屏障功能正相关，与 NETs 及 NLRP3 水平负相关。该研究揭示了菌群–代谢物–中性粒细胞轴在 IBD 中的关键调控机制。 End 图/文丨吴静珍 排 版丨罗心禾 审 核丨李雪萌

在人体对抗病原微生物入侵的复杂防御网络中，中性粒细胞扮演着“第一响应者”的关键角色。其最强大的武器之一，便是在吞噬过程中释放大量活性氧自由基（ROS）的“呼吸爆发”现象。这一过程不仅是先天免疫的核心环节，其功能状态更是评估机体免疫能力、诊断特定疾病及评价药物效果的重要窗口。基于二氢若丹明123（DHR123）与流式细胞术的检测试剂盒，已成为定量解析这一生命过程的标准化、高灵敏度工具。 一、定义与核心原理：从分子事件到可量化信号 1. 什么是中性粒细胞呼吸爆发？ 中性粒细胞在识别并吞噬细菌、真菌等病原体后，细胞膜上的NADPH氧化酶复合体会被迅速激活。该酶催化氧气转化为超氧阴离子，进而引发一系列连锁反应，生成过氧化氢、次氯酸等具有强效杀菌作用的活性氧物质。这一耗氧量急剧增加的生化过程，被称为“呼吸爆发”或“氧化爆发”。它是机体氧依赖性杀伤病原体的主要机制。 2. 检测试剂盒如何工作？ 现代检测试剂盒的核心是构建一个高效的“荧光报告系统”。其通用工作原理如下： 刺激激活：使用佛波酯（PMA）等强力刺激剂，在体外模拟病原体信号，直接、稳定地激活中性粒细胞内的NADPH氧化酶，诱发呼吸爆发。 荧光转化：试剂盒提供的DHR123是一种可穿透细胞膜的惰性荧光染料。当呼吸爆发产生ROS时，DHR123被不可逆地氧化，转化为发出强绿色荧光的物质——若丹明123。 定量检测：利用流式细胞仪，可以对单个细胞进行分析。细胞的荧光强度与细胞内产生的ROS量成正比，通过测量中性粒细胞群体的平均荧光强度，即可对呼吸爆发的水平进行精确定量。 该方法直接、灵敏，且能在全血样本中特异性分析中性粒细胞，无需复杂的细胞分离纯化步骤，最大限度地保持了细胞的功能状态。 二、核心应用领域：从基础研究到转化医学 该技术为免疫学、基础医学和药理学研究提供了强大的工具，其应用贯穿于理解生理机制、揭示病理改变和开发干预策略的全过程。 1. 免疫缺陷病的诊断与研究 这是检测呼吸爆发功能最经典的临床应用。慢性肉芽肿病（CGD）是一种由于NADPH氧化酶基因突变导致呼吸爆发功能缺陷的遗传性免疫缺陷病。使用该试剂盒进行检测，CGD患者的中性粒细胞在PMA刺激后，荧光强度显著低于健康对照，甚至完全无响应，从而成为诊断和分型的关键依据。相关检测流程已在部分专业医疗机构的实验室中作为诊断项目开展。 2. 感染与炎症免疫研究 在细菌或真菌感染模型中，研究人员通过比较感染个体与健康个体中性粒细胞的呼吸爆发能力，可以评估机体天然免疫系统的激活状态和应答效能。此外，该方法也广泛用于研究脓毒症、急性肺损伤等严重炎症状态下，中性粒细胞功能的亢进或失调。 3. 自身免疫性疾病与慢性病机制探索 在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病中，研究者利用该技术探究异常激活的中性粒细胞如何通过过量ROS释放加剧组织损伤。同样，在动脉粥样硬化、糖尿病并发症等慢性炎症相关疾病中，呼吸爆发的水平也与疾病的进展密切相关。 4. 肿瘤免疫微环境分析 肿瘤相关中性粒细胞（TAN）在肿瘤微环境中扮演着复杂角色。检测其呼吸爆发功能，有助于区分具有抗肿瘤活性的N1表型和促进肿瘤进展的N2表型，为理解肿瘤免疫逃逸机制和开发新疗法提供线索。 5. 药效评价与药物筛选 该技术是评价免疫调节药物、抗氧化剂或新型抗菌药物效应的理想平台。例如，在药物研发中： 免疫增强：评估药物能否恢复或增强免疫低下模型（如化疗后）中性粒细胞的功能。 抗炎治疗：测试抗炎药物能否抑制病理状态下中性粒细胞过度的、具有破坏性的ROS释放。 中药药理：研究天然产物提取物对免疫细胞功能的调节作用。 6. 跨物种比较医学研究 值得注意的是，由于该检测方法的原理基于保守的NADPH氧化酶活性，因此它不仅适用于人类样本，还可广泛应用于小鼠、大鼠、兔、犬、牛乃至猪等多种实验动物和畜牧动物的免疫学研究。这为从动物模型到人类疾病的转化研究搭建了桥梁。 三、实验方案设计与关键考量 一个严谨的呼吸爆发检测实验，需在以下几个环节进行周密设计： 1. 刺激剂的选择 PMA是最常用的强效、非特异性刺激剂，能提供稳定、均一的激活信号。但对于更接近生理状态的研究，可以选择其他刺激物： 刺激剂类型 作用机制 应用特点 PMA (佛波酯) 直接激活蛋白激酶C，强力触发呼吸爆发 标准阳性对照，信号强，重复性好 fMLP (甲酰肽) 模拟细菌多肽，通过G蛋白偶联受体激活细胞 更接近生理性趋化和激活路径 免疫复合物/补体 通过Fc受体或补体受体激活 研究特异性抗体介导的细胞功能 表：常用中性粒细胞刺激剂对比 2. 样本准备与处理流程 典型的实验步骤（以全血样本为例）包括： 采集与抗凝：使用肝素钠或ACD-A等抗凝管采集新鲜全血。 刺激与孵育：取少量抗凝全血，加入刺激剂（如PMA），于37°C孵育一段时间（通常15-45分钟）以激活细胞。 探针加载：加入DHR123，继续避光孵育。此时激活细胞产生的ROS将DHR123氧化为荧光物质。 红细胞裂解与固定：加入裂解液去除红细胞，并用缓冲液洗涤细胞，以终止反应并减少背景。 上机分析：使用流式细胞仪采集数据。通常通过设置前向角/侧向角散点图圈定粒细胞群，再分析该群细胞在FL1（绿色荧光）通道的平均荧光强度或阳性细胞百分比。 3. 对照设置 严谨的实验必须设置以下对照： 未刺激对照：只加DHR123，不加刺激剂，用于检测基础ROS水平。 完全激活对照：加PMA和DHR123，作为最大呼吸爆发能力的参考。 仪器补偿对照：如进行多色流式分析，需使用单阳样本调节荧光补偿。 四、技术优势与局限性分析 优势 高灵敏度与单细胞水平：流式细胞术可在单细胞水平进行检测，揭示细胞群体的异质性。 快速高效：整个流程可在数小时内完成，适合批量样本分析。 样本需求量少：仅需微量全血（可低至50微升），尤其适用于儿科患者或小动物实验。 定量客观：荧光强度是连续的数值变量，便于进行统计学分析和比较。 局限性及注意事项 设备依赖：必须配备流式细胞仪。 功能“快照”：检测的是特定时间点的ROS产生能力，不能直接反映持续杀伤的动态过程。 操作影响：样本运输时间、温度、抗凝剂类型（推荐ACD-A或肝素）等均可影响结果，需严格标准化操作流程。 探针特异性：DHR123主要检测过氧化氢、次氯酸等氧化产物，对超氧阴离子的检测能力有限。 五、展望 中性粒细胞呼吸爆发检测试剂盒作为连接基础免疫学与临床研究的精准工具，其价值已得到充分验证。随着技术的发展，例如将该方法与更复杂的多色免疫表型分析、磷酸化流式等技术结合，我们有望在单次实验中同时获得细胞的功能状态、分型及信号通路激活信息，从而在肿瘤免疫治疗、自身免疫病精准分型、新型疫苗佐剂评价等领域，更深入地解码中性粒细胞这一先天免疫卫士的复杂功能网络，为人类健康带来新的突破。 Absin 中性粒细胞呼吸爆发检测试剂盒推荐 货号 产品名称 规格 abs50002 中性粒细胞呼吸爆发检测试剂盒 25T/50T/100T 【免责声明】本篇文章来源于网络公开信息，由AI生成，若不慎涉嫌侵权，请及时联系，我们将第一时间配合处理，不承担任何法律责任。