Kanamycin Sulfate

基于Rep蛋白定向进化与高通量筛选提高rAAV产量 宋紫川 任和 莫婉婷 聂简琪 白仲虎 DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2026-0320 （点击此处下载全文） 目的  对Rep蛋白编码基因进行随机突变，构建突变体文库并建立高通量筛选平台，以获得可提高rAAV产量的Rep蛋白突变体，并解析其作用机制。 方法采用易错PCR构建Rep蛋白突变文库。利用带挡板24孔深孔板培养HEK293细胞并进行三质粒转染，以rAAV基因组滴度为指标，将产量接近或高于对照组80%的培养孔定义为候选突变组。对候选组中Rep蛋白突变体进行摇瓶复验，获得Rep蛋白有益突变体。通过分析rep基因和cap基因转录、Rep蛋白和Cap蛋白表达、rAAV转导效率，并基于AlphaFold3预测Rep78蛋白结构以及突变位点定位，解析突变体rAAV产量提高机制。 结果基于高通量筛选与摇瓶验证获得2个Rep蛋白有益突变体P39L与Q202H，其rAAV产量分别提高至对照组的2.0倍与1.8倍。对Rep蛋白的P39位点与Q202位点进行饱和突变未进一步提高rAAV产量。进一步分析表明，Rep蛋白突变体P39L和Q202H未显著影响Rep蛋白与Cap蛋白的表达量及rAAV的转导效率。结构定位结果表明，P39位于起源结构域（origin-binding domain，OBD）区域，Q202位于OBD与同源异型结构域（homeodomain，HD）的过渡区域且靠近OBD。 结论建立了Rep蛋白定向进化与高通量筛选技术，获得了可将rAAV产量分别提高至对照组的2.02倍和1.87倍的Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H。OBD及其邻近区域是影响rAAV产量的重要敏感区域。 关键词 重组腺相关病毒；Rep蛋白；随机突变；高通量筛选；病毒产量 引用本文：宋紫川,任和,莫婉婷等.基于Rep蛋白定向进化与高通量筛选提高rAAV产量[J].生物技术通报,2026. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2026-0320. 重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus，rAAV）具有免疫原性低、体内表达持续时间长及安全性较高等优点，已成为当前体内基因递送中应用最广、临床转化最成熟的载体体系之一［1-3］。近年来，rAAV相关基因治疗已在脊髓性肌萎缩症、遗传性视网膜疾病和血友病等疾病中取得重要进展［4-5］。截至2026年，全球已有9款AAV相关基因治疗产品获批上市，同时有超过200项临床试验持续推进，显示出巨大的临床应用潜力［4，6-7］。随着临床需求不断增长，rAAV高剂量给药、制备成本高和产能不足等问题日益突出，高效生产rAAV成为制约其进一步应用的重要瓶颈［8］。 目前，基于HEK293细胞的三质粒瞬时转染体系是rAAV实验室研究和产业化生产中最常用的技术路线［9-11］。近年来，围绕强化rAAV生成效率的研究逐渐由培养工艺优化转向生产质粒和包装元件的分子生物学设计［12-14］。已有研究表明，通过重组辅助元件、优化生产质粒组成或重新设计包装相关顺式/反式元件，可改善rAAV的产量。Ren等［15］进一步构建了对Rep蛋白和Cap蛋白进行双重诱导调控的表达系统，通过调节两者的表达时序与强度，将rAAV产量提高2.6倍，表明包装元件表达平衡与时序控制对生产效率具有显著影响。因此，包装相关元件的分子生物学设计是决定rAAV生产效率的重要因素之一［16-18］。 在三质粒转染系统中，Rep蛋白直接参与病毒基因组复制、包装及转录调控，是影响rAAV产量的核心因子之一［19-20］。相较于衣壳蛋白，Rep蛋白并非最终rAAV制剂的结构组成成分，因此对其进行工程改造理论上可在不改变组织特异性的前提下提高生产效率［21］。Jain等［22］通过对AAV2的rep基因全扫描突变文库系统评估单密码子替换和缺失对产量的影响，发现有益突变主要富集于起源结构域（origin-binding domain, OBD）区域，表明Rep蛋白具有可供工程改造的功能空间。此外，Rep蛋白的寡聚化在其多功能性中起关键作用。Musayev等［23］发现，连接Rep蛋白N端结构域与解旋酶结构域的连接子区域是寡聚化的重要组成，其中的保守芳香族残基Y224对Rep68的寡聚化和病毒活性至关重要。上述研究表明，Rep蛋白改造是提高rAAV产量的一种有效策略，但针对Rep蛋白关键位点的系统筛选、功能验证及结构-功能关系分析仍相对不足［24］。 本研究围绕Rep蛋白工程改造提高三质粒转染HEK293细胞生产rAAV产量这一目标，拟探究Rep蛋白序列变化对rAAV生产效率的影响，明确可提高rAAV产量的有益突变体及其位点特征；分析相关突变体在提高rAAV产量的同时是否影响病毒转导效率，并阐明其可能的作用基础，期望通过识别影响rAAV产量的Rep蛋白关键敏感位点，为Rep蛋白理性设计及rAAV高效生产策略优化提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料与主要试剂 DH5α大肠杆菌感受态购自上海生工生物工程股份有限公司。质粒pAAV-RC5（#104964）购自美国Addgene公司；质粒pHelper购自日本TaKaRa公司；质粒pAAV-CMV-EGFP购自美国Thermo Fisher Scientific公司。QuickMutation基因随机突变试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；MultiF Seamless Assembly Mix购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒和DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司；基因组DNA提取、逆转录及qPCR相关试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技股份有限公司。硫酸卡那霉素购自麦克林生化科技股份有限公司；PEI Max购自美国Polysciences公司；三角摇瓶购自广州洁特生物过滤股份有限公司；带挡板24孔深孔板购自成都英德生物医药设备有限公司；BalanCD培养基购自美国FUJIFILM Irvine Scientific公司，使用前添加4 mmol/L L-谷氨酰胺。 1.1.2 主要仪器 实时荧光定量PCR：Applied Biosystems；WB化学发光成像系统：ThermoFisher Scientific；荧光显微镜：Olympus；流式细胞仪：BD Biosciences；二氧化碳培养箱：ThermoFisher Scientific；酶标仪：BioTek Synergy H1。 1.2 方法 1.2.1 Rep蛋白随机突变文库的构建与定点饱和突变 以质粒pAAV-RC5为模板，设计随机突变片段上下游引物（附表），并按照随机突变试剂盒说明书对反应体系进行优化，对rep基因编码区进行随机突变扩增。PCR扩增产物经DpnⅠ消化去除甲基化模板后进行纯化，并采用Gibson Assembly方法组装至线性化的pAAV-RC5质粒骨架中，构建Rep蛋白随机突变表达质粒文库。重组质粒转化至感受态大肠杆菌中扩增，挑取单菌落进行测序，对文库的突变频率及突变偏好性进行初步评估，以确保文库中突变体主要包含1-3个氨基酸突变。随后挑取单菌落培养并提取质粒，作为后续筛选文库。 针对筛选获得的Rep蛋白突变体，分析其突变位点后，进一步采用定点饱和突变构建Rep蛋白突变体。通过设计含目标突变位点的引物（附表），以包装质粒为模板进行扩增，PCR产物经纯化后通过Gibson Assembly方法组装回载体骨架中。重组质粒经测序确认正确后，用于后续功能验证实验。 1.2.2 摇瓶中HEK293细胞三质粒瞬时转染生产rAAV 将HEK293细胞按照1.3×106 cells/mL接种至含30 mL BalanCD培养基的125 mL带挡板摇瓶中，并进行三质粒瞬时转染生成rAAV。以PEI Max为转染试剂，DNA与PEI的质量比为1∶1.4，总DNA用量为0.70 μg/mL。三质粒体系包括辅助质粒pHelper、穿梭质粒pAAV-CMV-EGFP和包装质粒pAAV-RC5，三者质量比为1∶1∶1。将质粒与转染试剂分别使用BalanCD培养基稀释后混匀，室温孵育15 min后加入细胞培养液中，然后放入摇床中继续培养。转染后24 h取样，用于检测rep/cap基因转录水平；转染后72 h收获细胞悬液，用于rAAV基因组滴度（vector genome, vg）测定及Rep蛋白与Cap蛋白表达分析。 1.2.3 Rep蛋白突变体高通量筛选技术 为实现Rep蛋白突变体的高效筛选，本研究建立了基于带挡板24孔深孔板的高通量筛选体系。采用带挡板的24孔深孔板进行细胞培养与三质粒瞬时转染，每孔培养体积为2 mL，摇床转速为200 r/min，转染方法参照摇瓶中细胞转染并按体积等比例缩放。转染后将24孔深孔板置于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续培养72 h，随后检测各培养孔rAAV产量。为提升筛选通量，在初筛阶段将两种含不同Rep突变体的包装质粒等质量混合后共转染HEK293细胞，以rAAV基因组滴度为指标，将产量接近或高于对照组80%的培养孔定义为候选突变组。随后，将候选突变组内的两个Rep蛋白突变体分别在摇瓶中单独转染复验，并将rAAV产量显著高于野生型Rep蛋白对照组的突变体定义为Rep蛋白有益突变体。 1.2.4 rAAV基因组滴度检测 使用qPCR方法对样品中rAAV基因组滴度进行检测，用于表征rAAV产量。具体操作方法为：转染后72 h收集细胞悬液，采用含1% Pluronic F-68的TE缓冲液进行适当稀释。随后加入1 U TURBO DNase（Merck，德国），并于37 ℃孵育30 min，随后于75 ℃孵育10 min灭活DNase。然后加入1% SDS并于95 ℃加热处理10 min，使AAV衣壳变性并释放基因组DNA。采用EGFP特异性引物（附表）对样品中rAAV基因组DNA进行扩增并进行定量。以pAAV-EGFP质粒为标准品建立标准曲线。根据探针法qPCR试剂说明书配置反应体系，并使用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统进行检测，并根据标准曲线计算样品中rAAV基因组滴度，结果以vg/mL表示。 1.2.5 Rep蛋白与Cap蛋白转录水平与蛋白表达水平检测 为分析Rep蛋白突变体对rep基因和cap基因转录的影响，在转染后24 h和72 h取样，按照总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。随后使用反转录试剂盒去除基因组DNA并进行逆转录反应获得cDNA。以cDNA为模板，基于SYBR Green法使用StepOnePlus实时荧光定量PCR系统检测rep基因、Rep78/68基因和cap基因转录水平。以GAPDH作为内参基因，对样品的基因表达水平进行归一化处理。 为检测Rep蛋白与Cap蛋白表达水平，转染后72 h取样并提取细胞总蛋白。蛋白样品经SDS-PAGE分离后转膜，分别采用Rep蛋白与Cap蛋白特异性抗体进行孵育和显色。以β-actin为内参蛋白，比较不同样品间Rep蛋白和Cap蛋白的表达差异。 1.2.6 rAAV样品制备及转导效率检测 在转导前24 h将受体细胞HEK293细胞按照3.0×105 cells/well接种至6孔板中，培养基为DMEM培养基补加5%胎牛血清。转导前更换为无血清DMEM培养基，并将rAAV样品按照1×105 vg/cell加入6孔板中进行转导。转导24 h后更换为含血清DMEM培养基继续培养。转导48 h后，使用胰酶消化并收集细胞，使用荧光显微镜观察EGFP表达情况，并使用流式细胞术检测EGFP阳性细胞比例，进行rAAV样品转导效率分析。 1.2.7 Rep78蛋白结构预测与突变位点定位分析 使用AlphaFold3 Server对Rep78蛋白氨基酸序列进行结构预测，并使用PyMOL软件对Rep蛋白有益突变体的关键突变位点进行三维定位。通过可视化分析突变位点在Rep78蛋白中的空间分布特征及其与功能区域的相对位置关系，从结构层面对突变体的功能进行分析。 1.2.8 统计学分析 实验结果以平均值±标准差（Mean ± SD）表示。除特别说明外，各实验均至少进行3次独立重复。数据整理、作图及统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件完成。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。 2 结果 2.1 高通量筛选获得Rep蛋白有益突变体 为获得能够提高rAAV产量的Rep蛋白突变体，本研究基于三质粒瞬时转染HEK293细胞生产rAAV体系，对Rep蛋白突变体文库进行24孔深孔板初筛和摇瓶复验，实验流程见图1。 图1   Rep蛋白突变体高通量筛选与功能分析流程图Fig. 1   Schematic workflow of high-throughput screening and functional analysis of Rep protein mutants 2.1.1 24孔深孔板高通量筛选获得候选突变组 基于HEK293细胞三质粒瞬时转染体系，以rAAV基因组滴度作为主要评价指标，对Rep蛋白突变文库进行24孔板高通量筛选。本研究共筛选了400个Rep蛋白突变体，展示其中具有代表性的两批次筛选（图2-A，B）。结果显示多数候选突变组rAAV产量低于对照组，仅约10%候选突变组的rAAV产量高于对照组。挑选rAAV产量接近或高于对照组80%的培养孔，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.99±0.56）×1011 vg/mL，最终获得R5、R8、R9、R15、R17、R19、R21、R26和R34共9个候选突变组，其rAAV产量范围为对照组的0.73-1.13倍，并对候选突变组所用的包装质粒进行基因测序。测序结果显示，各候选突变组中Rep蛋白突变体分别为R5：S25G与P39L，R8：T65S与M43L+L45P+V104A，R9：R119K与A56T+V148M+V189L，R15：A168V与C179T，R17：C151S与E6K+N46K+R61C，R19：M91V与Q202H，R21：I330M与M445L，R26：I502K与N532Y+P573H，R34：C604N与D615V+D616H。上述结果表明，该筛选体系可用于Rep蛋白突变体文库的初步筛选。 图2   Rep蛋白突变体高通量筛选及摇瓶验证Fig. 2   High-throughput screening and shake-flask validation of Rep protein mutants A，B：候选突变组的rAAV产量；C：候选突变组中单点突变体摇瓶复验结果；D：候选突变组中多点组合突变体摇瓶验证结果。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示差异无统计学意义，下同 A, B: rAAV yields of candidate mutant groups. C: Shake-flask validation results of single-point mutants from candidate mutant groups. D: Shake-flask validation results of multi-point combination mutants from candidate mutant groups. *, **, and *** indicate P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively; ns indicates no significant difference. The same below 2.1.2 摇瓶复验获得Rep蛋白有益突变体 基于24孔深孔板筛选结果，将R5、R8、R9、R15、R17、R19、R21、R26和R34共9个候选突变组内的两个Rep蛋白突变体分别在摇瓶中进行三质粒转染生产rAAV验证。摇瓶复验结果显示，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.93±0.19）×1011 vg/mL，Rep蛋白突变体P39L和Q202H的rAAV产量分别为（3.91±0.15）×1011 vg/mL与（3.61±0.19）×1011 vg/mL，分别为对照组的2.02和1.87倍（图2-C，D）。相比之下，Rep蛋白突变体M445L与C604N的rAAV产量分别为对照组的1.10倍与1.20倍，但与对照组相比差异无统计学意义；Rep蛋白多位点突变体（M43L+L45P+V104A，A56T+V148M+V189L，E6K+N46K+R61C，N532Y+P573H，D615V+D616H）的rAAV产量为对照组的0.66-0.99倍，均未表现出显著性增产效果。综合24孔深孔板筛选和摇瓶验证结果，确定Rep蛋白突变体P39L和Q202H为Rep蛋白有益突变体。上述结果表明，带挡板24孔深孔板高通量筛选与摇瓶复验可高效获得Rep蛋白有益突变体。 2.1.3 Rep蛋白有益突变体突变位点饱和突变 为进一步提高rAAV产量，对Rep蛋白有益突变体突变位点P39和Q202进行饱和突变，并分析不同氨基酸替换对rAAV产量的影响（图3-A，B）。对于P39位点，在该批次转染中，野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（2.22±0.31）×1011 vg/mL，P39L突变体的rAAV产量为（3.63±0.56）×1011 vg/mL，为对照组的1.65倍，提高效果最为明显；碱性氨基酸替换P39R和P39K的rAAV产量分别为对照组的1.54倍和1.29倍，但其产量低于P39L；疏水/非极性氨基酸替换对rAAV产量影响不具有规律性，其中P39L突变体对rAAV产量的提高表现最佳，而P39A与P39G突变体导致rAAV产量降低；而对于极性不带电氨基酸替换，P39S、P39T、P39N突变体的rAAV产量略微提高但未表现出显著性差异，而P39Q突变体导致rAAV产量降低；酸性氨基酸替换P39D、P39E的rAAV产量与对照组相比差异无统计学意义。 图3   P39和Q202位点饱和突变体rAAV产量分析Fig. 3   rAAV yields of saturation mutants at P39 and Q202 sites A：P39位点饱和突变体rAAV产量；B：Q202位点饱和突变体rAAV产量 A: rAAV yields of saturation mutants at the P39 site. B: rAAV yields of saturation mutants at the Q202 site 对于Q202位点，该批次野生型Rep蛋白对照组的rAAV产量为（1.63±0.13）×1011 vg/mL。Q202H和Q202R突变体的rAAV产量较高，分别为（3.29±0.44）×1011 vg/mL和（2.30±0.54）×1011 vg/mL，分别是对照组的2.02倍和1.41倍；极性不带电氨基酸替换有利于提高rAAV产量，其中Q202S和Q202T突变体优于Q202N和Q202C突变体；而对于疏水/非极性氨基酸，Q202A、Q202F、Q202W、Q202M、Q202I、Q202Y、Q202P突变体可提高rAAV产量，而Q202L、Q202G、Q202V突变体的rAAV产量无显著性差异或降低；酸性氨基酸替换有利于提高rAAV产量。综上所述，对P39和Q202位点进行饱和突变未获得进一步优于P39L或Q202H的突变体，说明P39L和Q202H仍是本研究筛选范围内较有利于提高rAAV产量的突变形式。 2.2 Rep蛋白有益突变体提高rAAV产量的机制分析 为探索Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H提高rAAV产量的作用基础，进一步对Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H的Rep蛋白与Cap蛋白转录和翻译水平、rAAV转导效率、三维结构进行分析。 2.2.1 Rep蛋白有益突变体Rep蛋白与Cap蛋白转录水平及表达水平分析 为探究Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H提高rAAV产量的机制，本研究检测了转染后24 h和72 h的rep基因、Rep78/68基因与cap基因的转录水平，以及转染72 h后的Rep/Cap蛋白表达水平。结果显示，转染24 h后Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H的rep基因转录水平（Rep蛋白总mRNA）分别为对照组的1.38倍和1.57倍，均高于对照组；P39L组Rep78/68基因转录水平为对照组的1.31倍，而Q202H组为对照组的0.75倍（图4-A、B）。转染72 h后，P39L组和Q202H组与对照组的rep基因转录水平与Rep78/68基因转录水平未表现出显著差异。转染24 h后，P39L和Q202H组cap基因转录水平分别为对照组的1.60倍和1.37倍，均高于对照组；转染72 h后，两组cap基因转录水平分别为对照组的0.56倍和0.53倍，低于对照组（图4-C）。Western blot结果显示，转染72 h后，P39L和Q202H组Rep78/68、Rep52/40及VP1/2/3蛋白条带强度与对照组接近，未观察到明显表达差异（图4-D）。上述结果表明，P39L和Q202H突变体可提高转染早期rep/cap转录水平，但在转染后期未持续提高Rep/Cap蛋白表达水平。 图4   P39L和Q202H突变体对rep/cap基因转录、蛋白表达及rAAV转导效率的影响Fig. 4   Effects of P39L and Q202H mutations on rep/cap gene transcription, protein expression and rAAV transduction efficiency A：转染后24 h和72 h的rep基因转录水平；B：转染后24 h和72 h的Rep78/68基因转录水平；C：转染后24 h和72 h的cap基因转录水平；D：Western blot检测转染72 h后Rep78/68、Rep52/40、VP1/2/3蛋白表达情况；E：转染后48 h流式细胞术检测EGFP阳性细胞比例；F：转染后48 h EGFP表达的代表性荧光显微照片，比例尺100 μm A: rep gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. B: Rep78/68 gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. C: cap gene transcription levels at 24 h and 72 h post-transfection. D: Western blot analysis of Rep78/68, Rep52/40, and VP1/2/3 protein expression at 72 h post-transfection. E: Percentage of EGFP-positive cells detected by flow cytometry at 48 h post‑infection. F: Representative fluorescence micrographs showing EGFP expression at 48 h post-transduction. Scale bars, 100 μm 2.2.2 rAAV转导效率分析 为评估Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H对rAAV转导效率的影响，使用流式细胞术和荧光显微镜检测相同vg用量下rAAV样品转导HEK293细胞48 h后的EGFP阳性细胞比例。结果显示，对照组、P39L组和Q202H组EGFP阳性细胞比例分别为46.37%±0.84%、47.10%±2.63%和45.47%±1.83%，组间差异无统计学意义（图4-E，F）。该结果表明，P39L和Q202H突变体可显著提高rAAV产量，但未显著改变所获rAAV的体外转导效率。 2.3 Rep78蛋白结构预测及有益突变位点定位分析 为进一步分析P39L和Q202H突变位点的结构分布特征，本研究基于AlphaFold3预测Rep78蛋白三维结构模型，对Rep蛋白P39和Q202两个位点进行空间定位分析（图5）。结果显示，P39位于Rep78蛋白的OBD区域，并处于该结构域表面。Q202位于OBD与HD的过渡区域，且更靠近OBD一侧。局部结构放大图显示，P39周围分布有密集的氨基酸侧链，Q202同样位于侧链分布较密集的结构域衔接区域，在Rep78全长结构中位于结构域衔接部位的邻近区域。上述功能实验表明，P39L与Q202H突变体分别将rAAV产量提升至对照组的2.02倍和1.87倍，而P39与Q202位点的饱和突变均未获得产量更高的突变体。综合饱和突变与结构定位分析可知，P39与Q202在氨基酸替换偏好及空间分布特征上存在显著差异：P39位于OBD结构边缘，对残基侧链长度及局部空间填充能力较为敏感；Q202毗邻结构域连接区，更偏好能参与极性相互作用或介导构象调节的残基类型。上述结果提示，P39与Q202虽不能直接认定为DNA接触残基，但其所处的OBD区域及OBD-HD过渡区域可能是影响Rep蛋白功能与rAAV产量的重要敏感区域。 图5   基于AlphaFold3预测的Rep78蛋白结构及P39、Q202位点定位Fig. 5   AlphaFold3‑predicted structure of Rep78 protein and the localization of P39 and Q202 A：Rep78蛋白预测结构及主要功能区域标注；B：P39位点在OBD区域中的空间位置；C：Q202位点在OBD-HD过渡区域中的空间位置 A: Predicted structure of Rep78 protein with annotation of major functional regions. B: Spatial localization of P39 in the OBD region. C: Spatial localization of Q202 in the OBD-HD transition region 3 讨论 随着rAAV在基因治疗领域的应用持续扩展，生产效率不足已成为制约其规模化制备与成本控制的关键瓶颈［14］。除培养工艺优化外，包装相关元件的工程化改造亦是提升rAAV产量的重要策略。Rep蛋白作为病毒基因组复制与包装过程的核心调控因子，其序列优化对提高rAAV产量具有重要研究价值［15，25-26］。本研究基于Rep蛋白随机突变文库，建立了“24孔深孔板初筛+摇瓶复筛”的高通量筛选流程，成功获得可显著提高rAAV产量的Rep蛋白有益突变体P39L和Q202H，其rAAV产量分别提高至野生型Rep蛋白对照组的2.02倍和1.87倍。 高通量筛选方法的效率与可靠性是获得有益突变体的关键。本研究采用“双突变体等质量比混合转染”策略，在24孔深孔板中进行初筛，有效提升了筛选通量；随后通过摇瓶复验对候选孔内单个突变体进行独立验证，最终获得P39L和Q202H两个稳定增产突变体。该策略在兼顾筛选效率的同时，亦保证了结果的可靠性。值得注意的是，混合转染策略存在突变体效应相互抵消的可能性：若同一培养孔中同时包含增产与减产的两种突变体，可能导致该孔整体产量无显著提升，从而使增产突变体被漏筛。尽管如此，“24孔深孔板初筛+摇瓶复筛”的两步筛选策略仍为Rep蛋白突变体的高效挖掘提供了可行路径。 饱和突变分析显示，P39和Q202位点均具有明确的氨基酸替换偏好，但偏好模式存在差异。P39位点对具有适当侧链长度和局部填充能力的氨基酸（L、R、K）更为兼容；Q202位点则更偏好能够参与局部极性相互作用或构象调节的氨基酸（H、R、S、T、Y）。该结果表明，Rep蛋白的有益突变并非遵循统一的理化性质规律，而表现出强烈的位点依赖性，与大规模扫描研究结论相呼应［22，27-28］。 机制研究表明，P39L和Q202H虽在转染早期（24 h）对rep基因转录水平及Rep78/68基因水平产生一定影响，但在转染后期（72 h）其rep基因转录水平及蛋白表达水平均与野生型无显著差异，表明P39L和Q202H突变体并未通过改变Rep/Cap蛋白表达量来提高rAAV产量。结合其rAAV产量显著提升的结果，推测rAAV增产效应可能与病毒基因组复制或包装过程效率变化有关，而非通过持续提高Rep/Cap蛋白表达量实现。Rep78和Rep68作为复制起始的核心蛋白，其OBD负责识别复制起点，解旋酶结构域（helicase domain, HD）负责解旋DNA，二者协同决定病毒基因组复制效率［23，27-30］。因此，氨基酸替换可能在不改变蛋白表达水平的前提下，通过调控复制功能影响rAAV产量［31］。 结合结构定位分析，Rep蛋白的P39位于OBD区域的外围侧链堆积环境，Q202位于OBD与HD过渡区且更靠近OBD一侧。根据Jaiswal等［24］报道的AAV2 Rep68-AAVS1复合物结构，并结合本研究预测的Rep78蛋白结构发现两个位点虽均不直接位于DNA结合表面，但均能显著影响rAAV产量。这一发现揭示，除直接参与DNA结合或切割的残基外，位于功能结构域内部或结构域连接区的局部位点也可能对rAAV产量产生重要影响，与其他研究中将OBD及其邻近区域作为Rep蛋白工程改造的热点区域的结论相一致［24］。 综上，本研究建立的Rep蛋白突变体筛选流程为挖掘rAAV增产突变体提供了有效工具，筛选获得Rep蛋白突变体P39L和Q202H的位点特征分析进一步证实OBD及其邻近区域是Rep工程改造的重要靶区。结合近年来Rep蛋白工程化改造、包装质粒设计及表达调控研究进展，进一步证明Rep蛋白序列优化是提升rAAV生产效率的关键方向之一。 4 结论 本研究建立了Rep蛋白突变文库高通量筛选平台，通过“24孔深孔板初筛+摇瓶复验”策略，获得可将rAAV产量分别提高至对照组2.02倍和1.87倍的有益突变体P39L和Q202H，且未显著影响Rep/Cap蛋白表达水平及转导效率，提示其增产效应可能与基因组复制效率增强相关。结构定位显示P39位于OBD区域，Q202位于OBD-HD过渡区且靠近OBD，进一步证实OBD及其邻近区域是Rep工程改造的关键敏感区域。 文章所有附图附表请点击链接查看（https：//biotech.aiijournal.com/fileup/1002-5464/NEWS/20260819173459_NewsFile_62.pdf）。 推荐阅读 生物技术通报 | CRISPR高通量筛选技术及其在畜牧研究中的应用 生物技术通报 | 重组腺相关病毒瞬时表达系统的理性设计及其高效生产工艺的建立 生物技术通报 | 徐炜—基于R-loop靶向编辑技术的R-loop功能位点高通量筛选系统 《生物技术通报》是由中国农业科学院农业信息研究所主办、生物工程技术领域高水平综合性学术期刊，由知名科学家谢旗研究员担任期刊主编。主要报道与农业科学相关的国内外生物技术领域最新基础研究成果，致力于为学术共同体打造学术成果传播和交流的优秀平台。目前是EI、中文核心期刊、中国科技核心期刊，入选CSCD核心库、RCCSE核心，“百种中国杰出学术期刊” “中国精品科技期刊” “中国科技期刊卓越行动计划——中文领军期刊”“首都科技期刊卓越行动计划中文期刊”。 投稿网站：http://biotech.aiijournal.com 当 前 目 次 2026年 1期 2026年 2期 2026年 3期 2026年 4期 2026年 5期 2026年 6期 2026年 7期 2026年 8期 2025年 9期 2025年 10期 2025年 11期 2025年 12期 （点击图片阅读对应期次文章） 欢迎订阅： 1. 各地邮局订阅：邮发代号18-92 2. 科学出版社期刊发行部：电话 010-64017032；010-64017539 3. 网上购买：扫描下方二维码或在淘宝、微店搜店铺名称“中科期刊”可直接订阅 赞助单位 投稿、转载信息发布及合作等事宜请联系:010-82109925/82109903 官方唯一投稿系统：http://biotech.aiijournal.com 长按关注：生物技术通报

点击蓝字 关注我们 2022年3月21日，美国Lumen Bioscience等研究团队在《Nature Biotechnology》在线发表题为“Development of spirulina for the manufacture and oral delivery of protein therapeutics”的研究论文。 研究建立了可稳定遗传改造的螺旋藻（Arthrospira platensis）蛋白药制造平台，实现VHH、酶、信号蛋白和疫苗抗原等多类重组蛋白的高水平表达，并发展了室内规模化培养、喷雾干燥和直接口服递送工艺。以抗弯曲杆菌VHH为例，干燥螺旋藻能够在胃环境中保护抗体，在小鼠中预防感染；一期临床试验进一步验证了口服制剂LMN-101的安全性。 研究背景 蛋白质药物通常依赖大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞生产，但口服制剂还面临纯化成本、冷链储运以及胃酸和消化酶降解等问题。螺旋藻是一种可食用、可大规模培养且蛋白含量较高的光合微生物，但过去受限于遗传操作困难和外源蛋白表达不稳定。本研究从遗传改造、重组蛋白表达、规模化生产到胃肠道递送和人体安全性进行系统验证，探索将“生产宿主”本身直接作为口服蛋白药载体。 研究内容 01 建立稳定、可无标记改造的螺旋藻遗传工程体系 研究人员发现，螺旋藻具有天然转化能力。带有左右同源臂的外源DNA可通过双交换同源重组定点整合至染色体；一次转化可获得约100个独立转化体。由于螺旋藻为多倍体，外源基因在持续筛选约8～10周后可逐步纯合。 获得纯合菌株后，转基因表现出很高的遗传稳定性：9株连续培养至少1年的菌株及2株连续培养3年、超过800个细胞世代的菌株均未发现转基因序列改变。 作者进一步利用天然卡那霉素抗性位点建立无外源筛选标记的改造方法，并成功整合单基因、串联基因和操纵子。最大测试片段为6.0 kb、包含7个基因。强组成型Pcpc600启动子驱动的部分外源蛋白可达到可溶性蛋白的约29%。 02 螺旋藻可表达单体及多聚体VHH，并通过多价化显著增强结合活性 作者将VHH以单体、二聚体、三聚体和七聚体等多种形式在螺旋藻胞内组成型表达。不同支架能够稳定获得预期分子量的融合蛋白，其中二聚体和七聚体还可通过亚基间二硫键进一步稳定结构。 以SARS-CoV-2 RBD结合VHH为例，多聚化显著提高表观结合活性。纯化单体和二聚体VHH的EC50分别为18.3 nM和0.32 nM；在螺旋藻提取物中，相应EC50分别为52.3 nM和1.29 nM，说明二聚化可带来数量级上的亲和/多价效应提升。 研究中不同VHH构建体的表达量覆盖可溶性蛋白的0.7%～29%。这说明螺旋藻不仅能够生产VHH，还可以通过支架化直接构建高亲合力的多价抗体片段。 03 抗弯曲杆菌VHH在螺旋藻中高水平表达并抑制细菌运动 为验证口服抗感染应用，研究选择靶向空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白FlaA的VHH FlagV6，并确定其结合位点位于FlaA的D3结构域。螺旋藻菌株SP526表达FlagV6-MBP融合蛋白，其含量约占干生物量的3%，相当于可溶性蛋白的约8%。 螺旋藻表达的FlagV6-MBP与重组FlaA的结合KD约为53 nM，并能够直接识别完整活菌表面的鞭毛。由于FlaA及鞭毛运动是弯曲杆菌定植和致病的重要因素，FlagV6-MBP进一步显著抑制了两株C. jejuni的运动能力。 这些结果证明，从螺旋藻细胞中获得的VHH不仅具有正确的抗原结合能力，而且能够直接干扰病原菌关键致病表型。 04 直接口服含VHH的螺旋藻可显著预防小鼠弯曲杆菌感染 在C. jejuni感染小鼠中，研究人员直接口服含FlagV6-MBP的干燥螺旋藻SP526，无需先纯化VHH。较高剂量实验中，SP526使粪便中的弯曲杆菌排出量降低3～4个数量级，并降低LCN-2和MPO等肠道炎症指标；对照组均出现腹泻，而SP526治疗组未观察到腹泻。 在更高的10^8 CFU挑战剂量下，仅在感染前给予一次2 mg干燥SP526生物量（约含60 μg FlagV6-MBP），即可预防弯曲杆菌相关疾病，并降低粪便LCN-2和盲肠髓系细胞浸润。 单次预防性口服还加速了感染后24 h病原菌从肠道中的清除，并在72 h继续降低细菌排出量，说明“螺旋藻细胞＋胞内VHH”能够作为可直接服用的局部肠道抗感染制剂。 05 喷雾干燥支持规模化制造，并实现无需冷链的高稳定性制剂 为满足生物药生产要求，作者建立了160～2,000 L模块化室内平板光生物反应器。螺旋藻可在高pH、高盐环境下培养，并使用一次性培养袋，从而减少传统无菌发酵中的复杂灭菌操作。 收获后的螺旋藻经海藻糖清洗并喷雾干燥。优化条件下，干燥过程可保留超过90%的抗体活性；工艺随后放大到5 kg/h喷雾干燥设备，实现约20倍的单步规模放大。 干燥粉末在避光、隔湿包装条件下表现出良好的热稳定性，不同温度测试显示抗体活性在最高42 ℃条件下至少可保持6个月。最终粉末可直接装入植物胶囊，形成不依赖传统蛋白纯化和冷链储运的口服固体制剂。 06 干燥螺旋藻保护VHH通过胃环境，并完成一期人体安全性验证 纯化的aa682在模拟胃液和胃蛋白酶条件下2 min内即完全降解；但当aa682包埋在干燥螺旋藻细胞内时，胃环境处理2 h后仍有超过70%的蛋白保持完整，证明螺旋藻生物质本身能够提供明显的胃内保护。 当体系从胃环境转入较高pH的模拟十二指肠环境后，60 min内可从螺旋藻中释放超过90%的aa682，且此前经历胃环境后，其FlaA结合活性基本保留。aa682对常规肠道水平的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶也具有较好耐受性，仅在较高餐后水平的胰凝乳蛋白酶下表现出一定敏感性。 随后，研究使用无标记菌株SP1182生产临床制剂LMN-101。20名18～50岁健康受试者随机接受LMN-101或安慰剂，最高剂量达到每次3,000 mg螺旋藻生物量、每日3次。试验未报告重大不良事件或实验室异常，出现的不良事件均为1级且与安慰剂组频率相近；血清中未检测到VHH吸收，符合该药物在胃肠道局部发挥作用的设计。 结论 本研究从遗传改造、蛋白表达、规模化制造、干燥稳定性、胃肠道递送、动物药效到一期人体安全性，系统建立了螺旋藻蛋白治疗药物平台。外源基因可通过同源重组稳定整合并长期遗传，VHH等重组蛋白能够达到较高胞内表达水平，并可进一步构建二聚体、三聚体和多聚体以增强功能。 更重要的是，干燥螺旋藻并非单纯的生产原料，而是同时作为口服递送载体：细胞生物质可保护VHH抵抗胃酸和胃蛋白酶，在进入较高pH肠道环境后释放具有结合活性的蛋白。抗弯曲杆菌VHH在小鼠中显著降低病原菌负荷和肠道炎症，验证了无需纯化即可直接口服的可行性。 一期临床试验显示LMN-101在健康受试者中具有良好耐受性，且未检测到系统性VHH吸收。该研究因此提出了一条“在可食用宿主中制造—干燥保存—直接口服—肠道局部释放”的蛋白药路线，为低成本、无冷链和黏膜局部治疗提供了新的生物制造模式。 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01249-7 -撰稿人|曾海锋- -编辑|孙亚杰- -审稿人|许丽文- -责任编辑|白雪- 声明:本文内容仅用于学术交流若有侵权，请联系删除。