Paclitaxel trevatide

理想的药物递送系统能够提高药效，扩大治疗窗口，减少剂量，并通过靶向和控制释放来最小化毒性和副作用。特别是在癌症治疗领域，使用靶向递送药物精准高效地杀灭肿瘤细胞，相比无差别地使用放疗或化疗（会对肿瘤细胞和正常细胞都造成损害）具有显著优势 截至2022年底，全球已有15种以抗体作为靶向递送系统的抗体药物偶联物（ADCs）获批上市。肽药物偶联物（PDCs）作为一种新兴的药物形式，由肽作为药物递送载体，小分子化合物作为有效载荷，通过连接子连接而成。与ADCs相比，PDCs分子量更小（通常小于8千道尔顿），免疫原性低，物理化学性质可调，且生产成本较低。合肥肽库生物科技技术实力突出，深耕多肽合成领域，可专业承接多肽药物偶联定制合成，满足各类定制化需求。 图1 肿瘤非靶向治疗与靶向治疗 生物制剂通常不通过CYP450酶代谢，而是主要通过肾小球滤过（小于60千道尔顿）、酶水解和分解代谢来清除。与ADCs相比，分子量相对较小的前药偶联物（PDC）清除速度更快，血浆暴露时间更短。然而，从安全性和有效性角度来看，靶向性仍是PDC药物开发中最重要的设计原则之一，而代谢产物鉴定（MetID）的研究对于PDC的药物释放和靶向性评估至关重要。 2、市售 PDC 的代谢特征 获批的PDCPepaxto®（美法仑氟苯胺）通过肽键将毒素分子美法仑与氟苯胺连接起来，以提高亲脂性从而改善生物利用度。毒素分子的代谢释放是通过被动运输（非蛋白靶点的主动运输）进入细胞，随后由在肿瘤细胞中高表达的氨肽酶水解（图2 ）。在这种情况下，设计思路更类似于前药的设计。 图2  Mechanism of action (MOA) of Pepaxto 另一类已上市的PDC是使用肽作为靶向配体的放射性核素药物偶联物（RDC）。例如，Lutathera®是一种由奥曲肽与放射性核素177Lu偶联而成的药物。利用奥曲肽对SSTR2受体的靶向作用，放射性核素的靶向放射治疗得以实现，且无需在肿瘤细胞摄取后通过代谢释放所载的核素。Lutathera不经肝脏代谢，主要通过肾脏清除（图3）。 图3 MOA of Lutathera®. 3、当前主流 PDC 及在研 PDC 的设计原则 目前，处于临床/临床前阶段的大多数主流抗体药物偶联物（PDC）使用化疗药物和毒素分子（如细胞微管抑制剂或核酸抑制剂，例如紫杉醇、喜树碱、美登素和海兔毒素）作为有效载荷。偶联状态下的大分子具有空间位阻效应，其有效载荷需要通过代谢降解才能发挥作用。与抗体药物偶联物（ADC）类似，PDC 在进入靶细胞之前，需要在循环系统中保持结构完整性和稳定性，而进入靶细胞后则能够有效释放有效载荷。其设计思路如下： 有效传递有效载荷取决于肽的针对性设计。 有效载荷的精确释放取决于所采用的目标释放机制。 3.1 靶向递送：靶受体与靶向肽（表 1） 通过噬菌体展示技术或其他方法进行受体靶向筛选，可以得到针对肿瘤细胞上特定受体的靶向肽。肿瘤细胞上常见的受体如图 4 所示。 图4 肿瘤细胞上的常见受体。 3.2 目标释放：有效载荷释放机制 在 PDCs 被靶向至肿瘤细胞后，根据连接子的不同设计，可以有不同的有效载荷释放方法。 不可裂解的连接体：溶酶体中的蛋白水解酶在降解肽部分后释放有效载荷。 可裂解连接子：连接子在肿瘤细胞的微环境中通过诸如氧化还原和水解（包括溶酶体中的水解）等途径断裂，从而释放有效载荷（图 5）。 图5 常见的连接子裂解机制。 酸可裂解连接体利用肿瘤细胞溶酶体（pH<5）与血浆（pH 7.4）之间的 pH 差异，在肿瘤细胞内选择性代谢，从而释放出活性有效载荷，例如腙，在酸性条件下可分解为醛/酮和胺。 二硫键连接子可通过谷胱甘肽介导的二硫键还原/交换反应释放，从而形成裂解，而肿瘤细胞中的谷胱甘肽含量比血液中高出 1000 倍。偶氮连接子可在还原型辅酶 II（NADPH）-偶氮还原酶的催化下裂解，该酶在肿瘤细胞的缺氧环境中过度表达。 组织蛋白酶B是一种在肿瘤细胞/组织中高表达的蛋白水解酶。组织蛋白酶B能够识别水解特异性肽序列，例如Val-Cit和GFLG，这些短肽可用作定向酶可裂解连接子。此外，当使用酶可裂解连接子时，通常会同时使用自降解基团。例如，对氨基苄基碳酰胺（PABC）连接键被用作自消解间隔基。当连接子被水解时，自消解基团会自发发生化学消除反应以释放有效载荷（图6）。 图6 消化机制——自身可降解基团的消除。 3.3 处于临床阶段的 PDC 示例 目前，专注于肽偶联药物（PDCs）的主流公司包括安吉奥化学（Angiochem）、自行车治疗学（Bicycle Therapeutics）、赛布雷萨治疗学（Cybrexa Therapeutics）、安科肽制药（Oncopeptides）、肽梦（PeptiDream）、泰瑞制药（Theratechnologies）和博瑞制药（Borui Pharmaceutical）。以下是已进入临床阶段的一些 PDCs，它们由不同的肽、连接子和有效载荷组成，其靶向特性和释放机制具有典型代表性。 A）AEZS-108 ：阿霉素（多柔比星）作为有效载荷，促黄体生成素释放激素（LHRH）肽作为靶向肽，进入细胞后在溶酶体的作用下被分解并释放。该药物已进入 III 期临床试验阶段。 B）ANG1005：它包含与肽偶联的多个紫杉醇，可靶向低密度脂蛋白（LDL）LRP-1受体，该受体在肿瘤细胞中高表达，并介导药物跨膜进入肿瘤细胞，随后在溶酶体中通过水解释放紫杉醇。它已进入临床II/III期。 C）CBX-12：这是一种由CybrexaTherapeutics公司基于alphalexTM平台开发的、与pHLIP公司合作的pHLIP®肽、连接子以及小分子抗癌药物组成的抗原非依赖性靶向药物。其原理是针对肿瘤特有的低pH环境，该肽能够形成α螺旋，从而插入细胞膜。在将C端毒素递送穿过细胞膜后，通过二硫键的断裂释放有效载荷。CBX-12作为候选先导化合物，已进入临床I/II期。 D）双环肽系列PDC：由BicycleTherapeutics公司开发的双环肽具有高靶向性、稳定性和亲和力。BT1718由可裂解的二硫键连接的载荷DM1和双环肽组成，而BT8009和BT5528则使用MMAE作为载荷，并采用可裂解的二肽Val-Cit作为连接子（图7），已进入临床I/II期。 图7 Structure of BT1718, BT8009, and BT5528. 3.4 PDC 的其他研究热点 通过不同功能肽的组合以及多部位切割模式，可以从功能性和靶向性方面结合多种结构的优势。邓等人设计了一种多功能肽组合型肽药物载体（PDC），由靶向肽（TTP）、连接肽、细胞穿透肽（CPPs）和毒素分子组成，利用可被肿瘤组织中高表达的基质金属蛋白酶2（MMP2）酶特异性降解的肽（PLGLAG）作为连接臂，靶向肿瘤细胞的促黄体生成素释放激素（LHRH）受体。连接肽降解后，毒素分子与跨膜肽一起被引入细胞，并通过快速水解穿透肽或切割可裂解连接臂而释放毒素分子（图8）。该设计同时利用促进药物在肿瘤细胞中积累的靶向肽和促进细胞内运输的跨膜肽，以及细胞内和细胞外两种环境靶向裂解机制，以提高靶向性和药物性能。 图8 靶向肽（TTP）连接的肽-穿透肽-毒素分子的肽药物载体（PDC）。 4 代谢物谱分析及 PDCs 鉴定的学习策略与案例分享 4.1 PDCs 的体外和体内代谢研究系统 在药物开发的早期阶段，体外代谢研究系统，如酸化肝S9（模拟肿瘤细胞酸性环境中的溶酶体降解）、血浆/血液、肝细胞和肾S9，有助于确定PDC的稳定性、靶向性以及有效载荷的释放机制。尽早区分PDC释放的有效载荷相关产物的实际形式，有助于优化和改进结构设计，还能为后续的药代动力学和毒代动力学研究提供准确的预期代谢物信息。另一方面，临床前和临床体内研究通过在血浆和排泄物（如尿液）中进行代谢物鉴定（MetID），确认了PDC及其释放的有效载荷在体内的代谢情况（表2和3）。 表2 体外代谢研究系统及 PDC 及其有效载荷的目的。 表3 体内代谢研究在药物开发中的目的。 与传统的小分子药物一样，载荷本身或已确定的 PDC 主要释放产物（如载荷连接子和其他主要释放部分）也需要确定其代谢情况及其可能的代谢途径（图 9，常用载荷 MMAE 的代谢途径），这有助于相关的药物相互作用和毒理学研究。 图9 人类体内 MMAE 的代谢产物及代谢途径。 4.2 用于 PDCs 的代谢物鉴定实验方法 PDCs的代谢物鉴定主要采用液相色谱-紫外-高分辨质谱（LC-UV-HRMS）技术。通过上述体外研究系统孵育获得的分析样本或体内收集的样本，先用蛋白质沉淀法处理。离心后，上清液通过LC-UV-HRMS进行分析。如果化合物在氮气干燥过程中化学性质稳定，那么在浓缩后也可以进行分析。如果肽是中性的，可以使用水/乙腈反相液相色谱系统进行梯度洗脱。如果肽是强碱性的（例如跨膜肽转录激活因子（TAT）和其他含有更多碱性氨基酸残基的肽），也可以在流动相中加入适量的三氟乙酸以改善峰形。 通过液相色谱将各成分分离，并找到了代谢物的色谱峰。然后，将质谱（MS）的m/z信息与母体药物的进行比较。根据高分辨率质谱的一级质谱（MS）和二级质谱（MS2）信号，分析了代谢变化和代谢位点。 4.3 代谢物分析中的难题与解决方案 通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对代谢物进行分析，重点在于色谱示踪剂定位和结构解析。色谱示踪剂定位采用放射性同位素法和非放射性同位素法。放射性同位素法使用放射性标记化合物进行代谢实验，但放射性标记化合物的合成复杂且成本高昂，实验室资质要求高，这在筛选阶段造成了障碍。非放射性同位素法通常依靠与空白基质相比的额外峰来进行示踪剂定位，例如液相色谱-紫外（LC-UV）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。 由于其结构特点，PDC及其主要代谢产物可能具有较弱的紫外吸收；因此，紫外检测无法有效追踪和定位它们。因此，有必要通过诸如LC-MS/MS背景扣除等数据处理方法获取二次色谱图，以在色谱图上定位可能的外源新峰（图10和11，以下情况中的D-E-F）。 图10 与人酸化肝 S9 系统孵育后的 PDC 的 LC-UV（A：120 分钟样品；B：0 分钟样品；C：空白样品）和 LC-MS/MS 谱图（D：背景扣除后；E：120 分钟样品；F：空白样品）。 图11 酸化 S9 和肝细胞孵育后的 PDC 的 LC-UV（A：240 分钟样本；B：0 分钟样本；C：空白样本）和 LC-MS/MS 谱图（D：背景扣除后；E：240 分钟样本；F：空白样本）。 化合物分子大小会影响结构解析的复杂性。与抗体药物偶联物（ADCs）类似，由于空间位阻，其有效载荷在释放后通常会由细胞色素P450（CYP）酶代谢。然而，对于ADCs而言，通常只考虑有效载荷的释放模式和代谢产物。抗体部分主要通过体内的分解代谢机制降解，而肽和连接子则可能被水解酶代谢。因此，在分析可能的代谢产物并判断代谢变化位点时，需要考虑有效载荷、肽和连接子。目前，常用的数据处理软件主要是通过代谢特征的质量变化进行库匹配，并结合基于化学键断裂的详尽匹配。因此，在PDCs的代谢物鉴定（MetID）数据处理中，既使用手动分析也使用软件计算。随着分子量（化学键数量）的增加，其计算复杂度相较于小分子化合物呈几何级数增长。因此，需要升级软件和算法以应对这一挑战。算法对于提高PDCs的代谢物鉴定（MetID）效率很重要。 4.4 PDC 代谢物鉴定案例研究 以下是一个基于含环肽和可裂解连接子的前药载体（PDC）体外代谢的案例研究。所用仪器如图 12所示。 对酸化肝S9（pH=5）和肝细胞孵育系统中该PDC的代谢情况进行了比较。在酸化S9孵育系统中，仅在LC-UV光谱中发现母体药物和一种代谢物M1的紫外峰，而通过背景扣除（样品减去空白基质）在LC-MS/MS中可发现另一种主要代谢物M2的质谱峰（图11）。通过比较MS和MS2信号，证实了在连接子水解后获得了环肽M1和有效载荷M2。由于环肽的特征紫外吸收主要由某些氨基酸贡献，M2的紫外吸收较弱，在LC-UV上无法有效检测，只能通过LC-MS/MS识别检测。 在肝细胞孵育系统中，由于代谢物水平较低，在液相色谱-紫外检测（LC-UV）中未发现显著的代谢物峰，但在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）中经过背景扣除处理后发现了两个低丰度代谢物M3和M4（图3.15）。通过比较MS和MS2信号，判断载荷-连接子部分未发生变化，而代谢变化主要是肽部分的水解。比较每个氨基酸残基的分子量和质量变化，得出水解后生成的肽。 图15 酸化 S9 和肝细胞孵育后丙酮酸脱氢酶复合物代谢途径的差异。 该PDC被发现主要通过连接子在酸化的S9中水解，从而释放有效载荷M2和环肽M1；在质谱中，环肽部分水解产生M3和M4，而连接子保持稳定。从代谢途径的差异（图15）可以看出，有效载荷的代谢释放模式也具有肿瘤环境靶向性（相对于肝代谢）。 此外，偶联药物中常用的 Val-Cit-type型连接子在小鼠血浆中不稳定，这是由于小鼠血浆中Ces1c酶的高表达能够水解这些连接子；尽管在人体血浆中其表达量非常低，但使用小鼠作为动物模型来研究药代动力学时，会存在较大差异，这一点需要更多关注。在对这类化合物的研究中，我们还通过体外血浆孵育系统证实，在小鼠血浆中产生的游离有效载荷远高于在人体血浆中产生的量。 5 总结与展望 随着肽和连接子技术的创新性发展，抗体药物偶联物（PDCs）具有广阔的发展前景。PDCs的代谢研究同时包括对其代谢稳定性、靶向性和有效载荷释放的评估。本文总结了PDCs的代谢特征和研究策略，并分享了一个代谢物鉴定（MetID）案例。预计会有更多的PDCs被设计和开发出来，为患者带来福音。 ● 30种血脑屏障穿透肽汇总 ● 44种血脑屏障受体靶向肽汇总及文献 ● 20种可被基质金属蛋白酶切割的多肽 ● 18种肿瘤血管内皮细胞靶向肽