Diphtheria,Tetanus, Acellular Pertussis and Poliomyelitis Combined Vaccine, Inactivated, Adsorbed(Wuhan Institute of Biological Products/National Vaccine & Serum Institute)

中文摘要目的    评价组分无细胞百日咳-白喉-破伤风（百白破）（diphtheria，tetanus，component acellular pertussis，DTacP）- Sabin株灭活脊髓灰质炎病毒（Sabin strain inactivated poliovirus，sIPV）联合疫苗在模拟运输振动条件下的稳定性。方法    选取3批DTacP-sIPV，设计振动条件模拟疫苗运输过程进行稳定性评价。分别于振动前和振动后取样，按照中国药典2020年版三部和内部制造检定规程要求进行成品检测（包括外观、装量、pH、渗透压摩尔浓度、铝含量、游离甲醛含量、戊二醛含量、鉴别、sIPV D抗原含量、百白破效价、无菌、内毒素含量、特异性毒性、异常毒性和毒性逆转检测）、sIPV效力试验、Zeta电位测定、上清液中抗原测定及电子显微镜观察。结果    振动前后，3批DTacP-sIPV的检测结果均符合质量标准要求，百白破效价与D抗原水平以及sIPV效力试验结果差异无统计学意义（t值分别在0.21~0.73、0.05~1.34和0.16~1.90，P值均＞0.05）；Zeta电位以及上清液中抗原（百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素）含量与振动前结果差异无统计学意义（t值分别为0.49和0.20~0.80，P值均＞0.05）；电子显微镜观察结果与振动前比较无明显变化。结论    DTacP-sIPV联合疫苗在模拟运输振动条件下稳定性良好。正文DTP通常与灭活脊髓灰质炎疫苗联合使用以减少接种剂次、提高接种依从性。中国医学科学院医学生物学研究所研发的组分无细胞百日咳-白喉-破伤风（diphtheria，tetanus，component acellular pertussis，DTacP）-Sabin株灭活脊髓灰质炎病毒（Sabin strain inactivated poliovirus，sIPV）联合疫苗（DTacP-sIPV），用于预防婴幼儿由百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风梭菌及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒感染引起的疾病。其中百日咳抗原采用组分纯化的百日咳毒素（pertussis toxin，PT）、丝状血凝素（filamentous hemagglutinin，FHA）和黏附素（pertactin，PRN）分别吸附氢氧化铝佐剂制备而成，比共纯化百日咳疫苗具有更高纯度和安全性，且临床前研究表明此联合疫苗具有良好的安全性和免疫原性。已有研究证明DTacP在模拟运输振动条件下稳定性良好，本研究依据中国药典2020年版要求和随机振动试验方法的国家标准，设定疫苗经航空、铁路、公路连续运输的最差运输条件，评价DTacP-sIPV在模拟运输振动条件下的稳定性，为疫苗的稳定性研究提供数据支持和参考。1材料与方法1.1疫苗各项质量指标合格的DTacP-sIPV共3批（批号：20190701、 20190702、 20190703，规格0.5 ml/剂），由中国医学科学院医学生物学研究所研制，每剂含 PT 25 μg、FHA 25 μg，PRN 8 μg，白喉类毒素（diphtheria toxoid，DT）12.5 絮状单位（limit of flocculation，Lf）、破伤风类毒素（tetaus toxoid，TT）3.5 Lf 和sIPVⅠ型 30 D 抗原单位（D-antigen unit，DU）、Ⅱ型 32 DU、Ⅲ型45 DU。1.2主要试剂和仪器纯化PT、FHA、PRN，牛抗及兔抗sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IgG均由中国医学科学院医学生物学研究所制备；PT、FHA、PRN抗原检测试剂盒购自中国食品药品检定研究院；鼠抗兔IgG-辣根过氧化物酶抗体购自美国Abcam公司；单组分3，3´，5，5´-四甲基联苯胺底物显色液购自北京索莱宝科技有限公司。LD-50PP吸合式电磁振动台购自广州番禺凡正电磁振动机厂；Multiskan GO酶标仪购自美国赛默飞世尔公司；Nano ZS90 Zeta电位仪购自英国马尔文公司；H-7650型透射电子显微镜（电镜）购自日本日立公司。1.3实验动物无特定病原体级Wistar大鼠，雌雄各半，1月龄，体质量180~220 g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物饲养在无特定病原体环境中，动物使用许可证号：SYXK（滇）K2019-0003。1.4模拟运输振动试验参考国家标准《GB/T 4857.23—2021包装——运输包装件基本试验——第23部分：垂直随机振动试验方法》，设计6种振动模式模拟疫苗连续通过公路运输7 d（低频4 Hz振动90 min、高频16 Hz振动5 min各1次）、铁路运输3 d（低频2 Hz振动15 min、高频50 Hz振动0.2 min各1次）、航空运输12 h（低频12 Hz振动1 min、高频100 Hz振动0.3 min各1次），叠加进行振动试验，获得最差运输条件下的疫苗样品，参数见表1。1.5稳定性试验检测项目1.5.1  制造检定（制检）规程规定成品检测项目   根据中国药典2020年版三部（药典三部）中“吸附无细胞百白破联合疫苗”、“Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗”以及自拟DTacP-sIPV制检规程，对3批振动前后疫苗进行如下检测：外观、pH、渗透压摩尔浓度、装量、铝含量、游离甲醛含量、戊二醛含量、百日咳-白喉-破伤风（百白破）效价、D抗原含量、无菌、内毒素含量、特异性毒性、毒性逆转及鉴别检测（sIPV鉴别试验方法同D抗原含量测定）。1.5.2  sIPV效力试验   根据药典三部中Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗效力试验（大鼠法）以及DTacP-sIPV制检规程进行效力试验。将振动前后的联合疫苗经系列稀释后分别免疫大鼠，测定大鼠血清中针对各型脊髓灰质炎病毒的中和抗体并分别计算其有效中量，样品各型有效中量不显著低于参考疫苗为合格。1.5.3  上清液中抗原测定   采用ELISA检测3批联合疫苗振动前和振动后上清液中PT、FHA、PRN抗原和sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原；采用絮状试验检测上清液中DT、TT絮状反应；比较分析振动前后疫苗上清液中的抗原含量。1.5.4  Zeta电位测定   采用Zeta电位仪测定并比较3批疫苗振动前后的Zeta电位。1.5.5  电镜观察   采用日立H-7650型透射电镜（加速电压80 kV）观察3批疫苗振动前后佐剂吸附结构。1.6统计学分析采用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析，对振动前后的结果采用t检验分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1制检规程规定成品检测项目模拟振动前后，3批DTacP-sIPV均为均匀乳白色混悬液，无异物，预灌封注射器外观完好无破损，装量均不低于0.5 ml。pH、渗透压摩尔浓度、铝含量、游离甲醛含量、戊二醛含量、无菌、内毒素含量、特异性毒性、异常毒性及毒性逆转检测结果如表2所示，振动前后检测结果均符合规定，表明经模拟振动试验后疫苗仍具有良好的稳定性。3批DTacP-sIPV在模拟振动前后分别取样进行解吸附，采用ELISA进行鉴别试验，上清液中均含有疫苗抗原成分，包括PT、FHA、PRN和sIPV Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原；采用絮状试验检测，上清液中均出现DT、TT絮状反应，均符合质量标准的要求。模拟振动后，3批DTacP-sIPV的百白破效价及解吸附后sIPV的D抗原含量检测结果如表3所示，符合质量标准要求，振动前后结果差异无统计学意义（百白破效价：t=0.21~0.73，P=0.544~0.851；D抗原含量：t=0.05~1.34，P=0.250~0.960），表明DTacP-sIPV具有良好的稳定性。2.2sIPV效力试验sIPV大鼠效力试验结果如表4所示。振动前后sIPV效力试验结果均符合制检规程要求，且振动前后差异无统计学意义（t=0.16~1.90，P=0.198~0.890），表明DTacP-sIPV的sIPV 效力不受模拟振动条件的影响。2.3上清液中抗原含量检测模拟振动后，百日咳抗原检测结果如表5所示，3批DTacP-sIPV上清液中，百日咳PT、FHA、PRN抗原含量均值分别为1.74、1.74、0.58 μg/剂。sIPV Ⅰ、Ⅲ型D抗原均低于0.25 DU/ml（检测下限），sIPV Ⅱ型D抗原均低于0.125 DU/ml（检测下限），DT、TT均低于5 Lf/剂（检测下限）。与振动前上清液中各抗原含量相比，差异均无统计学意义（t=0.20~0.80， P=0.508~0.860）。2.4Zeta电位测定在检测的DTacP-sIPV样品体系内，疫苗的表面电位均为负值，检测结果见表6。模拟振动前后，经检测3批疫苗的Zeta电位相近，差异无统计学意义（t=0.49，P=0.648）。2.5电镜检查电镜图片见图1，振动前后，DTacP-sIPV的晶体均呈聚集状态，表明其佐剂吸附结构在振动后无明显改变。3讨论疫苗运输过程中，运输条件可能会对生物制品的稳定性产生影响。药典三部要求对生物制品运输稳定性进行评估，确保其安全性和有效性。目前国内疫苗运输稳定性的研究较少，多为实际储存条件和加速条件下的稳定性研究，仅少数研究对疫苗实际的运输过程进行模拟来评估其运输稳定性。本研究通过模拟振动，评估运输条件对产品质量的影响，评价生物制品的稳定性。已经完成的对DTacP在模拟振动条件下的稳定性研究表明，该疫苗在拟定振动条件下具有良好的稳定性。本研究综合考虑DTacP-sIPV可能的运输过程，评估其在最大模拟振动和持续时间下的稳定性。由于我国地势地形多样，疫苗运输的路线复杂、距离远、时间长，可能需结合多种交通工具（航空、铁路和公路）。为模拟最差运输条件，本研究设计疫苗经过航空运输12 h、火车运输3 d以及汽车运输7 d的最差情况，可覆盖全国范围内任意配送点运输的可能性。依据随机振动试验方法的国家标准（GB/T 4857.23-2021），按照模拟条件分别计算3种运输方式的振动频率及时间，选择其中最具代表性的频率作为振动模拟频率，计算振动台设置参数以模拟与原运输振动强度相同的振动效果。根据药典三部要求和疫苗的实际情况，本研究除制检规程规定的成品检测项目〔物理检查（外观、装量、渗透压摩尔浓度）、效价测定、鉴别试验、化学检定（pH值、铝含量、游离甲醛含量、戊二醛含量）、无菌检查、特异性毒性检查、异常毒性检查、毒性逆转试验、内毒素含量检查〕以外，增加了多个稳定性试验项目（sIPV效力试验、上清液中抗原测定、Zeta电位测定、电镜观察），对疫苗振动前后进行稳定性试验，评价疫苗在模拟振动条件下的稳定性。物理检查、无菌检查主要反映振动对包装密封性的影响。在振动前后，上述试验项目结果均无明显变化，表明拟定的运输振动条件对疫苗包装密封性没有影响。Zeta电位、上清液中抗原及电镜观察主要用于评价振动前后溶液及抗原的稳定性，评价振动对抗原吸附结构的影响，评估是否有解吸附现象的产生。Zeta电位是表征胶体分散系稳定性的重要指标，Zeta电位的绝对值越高，体系越稳定。检测上清液中抗原可评估振动前后佐剂吸附抗原的情况是否有变化。经Zeta电位、上清液中抗原及电镜观察检查，疫苗在振动前后均无明显变化，证明拟定的运输振动条件不会影响铝佐剂吸附情况。其他检测项目包括效价、鉴别及化学检定均表明，拟定的振动条件对DTacP-sIPV的稳定性无影响。综上所述，联合疫苗的稳定性未被拟定振动条件影响，证明该制备和配制工艺生产的联合疫苗有较好的稳定性。疫苗稳定性试验是疫苗质量研究的重要内容，为产品有效期、生产工艺、包装材料、贮存及运输条件等方面的制定提供依据。后续可综合考虑温度偏移及其他非温度影响如冲击、空气压力等因素，进一步进行其他稳定性相关试验。作者李靖妍 蔡路奎 梁疆莉 高娜 王虓宇 顾琴 姬光 姬秋彦 杨净思中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所，昆明市新发突发高致病性病原体疫苗研发和产业化企业科技创新中心，昆明  650118通信作者：杨净思，Email：yjs@imbcams. com. cn引用本文：李靖妍, 蔡路奎, 梁疆莉, 等. DTacP-sIPV联合疫苗在模拟运输振动条件下的稳定性评价 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(1): 1-6.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20230223-00019识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。