BAY-069

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程支链氨基酸转氨酶（BCATs）催化必需的支链氨基酸分解代谢为支链酮氨酸，在不同类型的癌症中起着关键作用。采用高通量筛选和基于X射线晶体结构指导的SAR研究，发现一类新颖的（三氟甲基）嘧啶二酮结构类BCAT1/2抑制剂。其中BAY-069具有良好的细胞活性和选择性，目前作为开源的探针分子使用。本文梳理BAY-069的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-069的优化过程支链氨基酸转氨酶（BCATs）利用α-酮戊二酸（α-KG）作为α-氨基的受体，催化必需的支链氨基酸（BCAAs）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢为支链酮氨酸。已知的两种同工酶分别是胞质BCAT1和线粒体BCAT2。BCAT2的表达广泛，而BCAT1表达仅限于特定的器官和组织，包括大脑和外周神经系统的神经元，此时BCAT1是合成神经递质谷氨酸的主要氮源。BCAT1在多种肿瘤中过表达，包括原发性胶质母细胞瘤、乳腺癌、急性白血病、非小细胞肺癌和前列腺癌等，并在肿瘤的发生和代谢中发挥作用。此外，BCAT1可能参与了化疗药物的耐药，参与胶质母细胞瘤局部免疫逃避。因此，BCAT1是肿瘤治疗的潜在靶点。目前已经报道了多个BCATs抑制剂。如图2所示，GSK/Strathclyde大学的吡唑并嘧啶酮衍生物A，具有合适的药代动力学特征，并在小鼠体内进行了概念验证。GSK/Northeastern大学的苯并咪唑化合物B和辉瑞公司报道的治疗神经退行性疾病的BCAT1抑制剂C。图2. 已报道的BCAT1/2抑制剂近日拜耳公司在JMC上报道了有关BCAT1/2拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，分别对2’的氧取代芳基、5’官能团、6位三氟甲基、3’氰基等开展SAR研究。优化过程中，不断平衡分子的BCAT1/2活性，PKa性质、渗透性和细胞活性。最后，将中间苯环替换为萘环，获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。设计和优化过程总结如下：Hit发现亮氨酸脱氢酶（LeuDH）催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的BCAAα-酮异己酸（α-KIC）还原为亮氨酸，其中NADH的消耗可通过荧光和发光读数测量（图3）。基于该实验，可以检测到具有细胞活性的BCAT1抑制剂。研究人员筛选了一个包含788,762个化合物的结构库，筛选到399个具有抑制BCAT1蛋白的化合物（＜20μM），其中BCAT1和BCAT2活性高度相关。71%的BCAT1活性分子含有酸性片段，说明BCAT1易与带负电荷的分子结合。但高电荷难以穿透细胞膜，所以需要平衡分子活性和细胞通透性。图3. 生化实验和Hit发现流程一类芳基取代嘧啶二酮结构分子（图4），包括化合物1，具有良好活性（BCAT1 IC50=554nM）和理化性质，如BEI值（17.87），LLE值（4.47），log D（1.9）和Caco2通透性（30.0nm/s，外排率为6.2）。化合物1和2具有相同的骨架结构，X晶体衍射数据显示两个分子均占据支链氨基酸的结合位点，但骨架结构的结合模式不同（图4B，C）。化合物1的甲基苯基部分伸入疏水部分，与3PP（促进BCAT1结晶的添加剂）的苯基重叠。而化合物2结构发生翻转，三氟甲基部分进入疏水口袋。两个化合物与Val175的羰基氧原子形成的氢键是唯一的共同特征。图4. （A）化合物1和2的化学结构；（B，C）化合物1和3PP与BCAT1的X晶体结构叠合；（D）化合物2与BCAT1的X晶体结构；（E）化合物1和2的结构叠合SAR研究化合物1的晶体结构显示，邻位甲基伸向Phe49和Leu173之间的口袋，可能是活性的关键，因此主要考察在邻位进行单取代或二取代。邻二甲基（3）和邻氯（8）是最好的取代基。尤其是邻氯取代，活性明显提高，这可能是氯原子距离Tyr90的OH和Arg163的NH较近的原因。化合物1的晶体结构显示，5‘位置可容纳体积较大的取代基（表2）。但结果显示：（1）5‘位置耐受体积较小的官能团，如甲基（10）、甲氧基（12）或卤素（11、15、17），BCAT1的活性相较1提高了1-2倍；（2）三氟甲氧基（16）和丙氧基（14）活性降低，可能是由于体积较大的官能团会诱导产生轴手性；（3）化合物12和15具有良好的体外药代性质（大鼠微粒体Fmax分别为95%和88%）。嘧啶二酮的1-NH具有明显的酸性，影响化合物的活性和渗透性，因此，对化合物12的临近1-NH的6位取代基进行修饰（表3），尝试调节1-NH的pKa值。（1）不同的吸电子取代基（12、18−24、27和28）或供电子取代基（25和26）对活性、Caco-2细胞通透性和pKa值的影响没有发现相关性；（2）酰胺取代基（28）化合物具有轻度酸性，说明渗透性与化合物pKa值无关；（3）活性最强的化合物24（BCAT1 IC50=60nM，BEI 14.75），但渗透率较低（PappA−B=0.5nm/s）和较高的流出率（34）；（4）化合物26虽然没有外排，但对BCAT1活性较差；（5）化合物21活性与12类似，但pKa值为7.0，酸性明显低于12；（5）酸性最强的化合物23，活性没有改善。化合物1的三氟甲基伸向较小的结构口袋，但苯磺酰（化合物24）或α-二氟苯基（化合物21）等体积较大的官能团却显示出良好的活性。24和21的的X射线晶体结构与化合物1不同（图4）。但以化合物21的结合模式为依据开展进一步结构优化，似乎不可行，因为21的芳基醚部分没有与蛋白产生紧密的相互作用，也没有提供伸向Phe49两侧的位置。图4. （A）化合物24与BCAT1的X晶体结构；（B）化合物21与BCAT1的X晶体结构在化合物1的X射线共晶中，1’位氰基没有与BCAT1形成极性相互作用，但填充了Lys99、Phe49和Ala334侧链之间的一个小口袋。接下来，研究人员针对化合物1的1’基团进行修饰（表4）。（1）1‘位为吸电子基团降低pKa值，去除氰基导致pKa值显著升高（29、30和31），但活性大大降低；（2）甲基衍生物32的BCAT1活性为2.3μM；（3）氯衍生物33具有良好的活性（BCAT1 IC50=438nM）和渗透性；（4）甲氧基（化合物34）取代氰基不耐受。化合物1结构中的苯环与Phe49形成π−π相互作用。因此，采用萘环替换苯环（表5）。（1）氰基衍生物35的BCAT1的活性为70nM，分离获得相应的阻转异构体35a和35b；（2）氯取代衍生物36活性略低，但其阻转异构体36a的BCAT1活性为31nM，BEI为19.28，且无外排；（3）α，α-二氟苯取代衍生物37也具有良好的活性。将GSK公司的苯并咪唑类BCAT2抑制剂（B）和化合物12的晶体结构进行叠合（图5），显示芳香环部分构象相似，因此，设计了咪唑吡啶（化合物38）代替苯环。结果显示，BCAT1活性为850nM。化合物38的复合物晶体结构显示，嘧啶二酮的结合模式再次翻转。图5. （A）化合物38的优化策略；（B）化合物B与BCAT2的复合物晶体和化合物12与BCAT1的晶体结构叠合；（C）化合物38与BCAT1的X晶体结构细胞水平活性研究（1）在不同肿瘤细胞系（U-87MG和MDA-MB-231）培养基中测量亮氨酸的含量，用以评价小分子的细胞水平活性。结果如表6所示，化合物的细胞活性明显弱于蛋白活性。可能是由于对细胞的渗透性较低的原因。2%血清白蛋白存在，导致IC50至微摩尔水平。因此，高血浆蛋白结合可能导致36a缺乏有效性。由于化合物36a（BAY-069）具有最好的细胞活性，因此被选为体外候选探针。（2）测试化合物36a（BAY-069）和化合物A对U-87MG（高BCAT1表达）和MDA-MB-231（BCAT2高表达）细胞增殖的影响。结果显示它们未能抑制细胞增殖。此外，在BCAT1和/或BCAT2高表达SEM、CAL-51、HCC-33和NCI-H2110细胞中，也未表显出抗增殖作用。然而，多项研究证明，与体内研究中获得的抗肿瘤效果相比，BCAT1在体外（如增殖、谷氨酸水平和菌落数）敲低的效果很弱。这可能是化合物活性与肿瘤环境和其他宿主因素具有依赖性。体内外药代动力学性质（1）化合物36a（BAY-069）在体外人肝微粒体代谢稳定性较高（Fmax=92%），在大鼠肝细胞代谢稳定性中等（Fmax=56%）（表7）；（2）Caco-2渗透率高且没有外排迹象，可能具有良好的口腔吸收特性；（3）BAY-069在大鼠体内的药代动力学研究显示，较低的血清除率（CLblood=0.64L/h/Kg）、中等的体积分布（Vss=0.25L/Kg）和较高的口服生物利用度（F=89%）。BAY-069的选择性（1）BAY-069在天冬氨酸转氨酶（GOT1和GOT2）的酶活实验中IC50>50μM；（2）对包含30个蛋白酶和30个激酶的实验中，大部分IC50>10μM，但对一个蛋白酶IC50=6μM，对一个激酶IC50=2μM；（3）在Eurofins LeadProfilingScreen（包含77个潜在靶点）活性筛选中，10μM的BAY-069，没有发现抑制或激动效率超过45%的情况；（4）为了识别（三氟甲基）嘧啶二酮潜在附加靶点，采用化合物35的共晶结构，对CavBase方法对PDB库进行搜寻，未找到类似的结合口袋。采用高通量筛选，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。通过SAR分析和X射线晶体研究表明，发现嘧啶二酮的活性在于骨架结构的酸性。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，在多个位点进行优化，最终获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。其在体内的整体体外药代动力学特性和选择性表明，BAY-069适用于体内实验。BAY-069已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c00441请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就BCAT1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“BCAT1”，选中关联“BCAT1 (Homo sapiens)”搜索BCAT1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于BCAT1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3.在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到BCAT1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。