BCAT2 x BCAT1

感谢关注转发，欢迎学术交流请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程支链氨基酸转氨酶（BCATs）催化必需的支链氨基酸分解代谢为支链酮氨酸，在不同类型的癌症中起着关键作用。采用高通量筛选和基于X射线晶体结构指导的SAR研究，发现一类新颖的（三氟甲基）嘧啶二酮结构类BCAT1/2抑制剂。其中BAY-069具有良好的细胞活性和选择性，目前作为开源的探针分子使用。本文梳理BAY-069的设计策略与优化路线，可为类似项目结构优化提供宝贵经验。图1. BAY-069的优化过程支链氨基酸转氨酶（BCATs）利用α-酮戊二酸（α-KG）作为α-氨基的受体，催化必需的支链氨基酸（BCAAs）缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸分解代谢为支链酮氨酸。已知的两种同工酶分别是胞质BCAT1和线粒体BCAT2。BCAT2的表达广泛，而BCAT1表达仅限于特定的器官和组织，包括大脑和外周神经系统的神经元，此时BCAT1是合成神经递质谷氨酸的主要氮源。BCAT1在多种肿瘤中过表达，包括原发性胶质母细胞瘤、乳腺癌、急性白血病、非小细胞肺癌和前列腺癌等，并在肿瘤的发生和代谢中发挥作用。此外，BCAT1可能参与了化疗药物的耐药，参与胶质母细胞瘤局部免疫逃避。因此，BCAT1是肿瘤治疗的潜在靶点。目前已经报道了多个BCATs抑制剂。如图2所示，GSK/Strathclyde大学的吡唑并嘧啶酮衍生物A，具有合适的药代动力学特征，并在小鼠体内进行了概念验证。GSK/Northeastern大学的苯并咪唑化合物B和辉瑞公司报道的治疗神经退行性疾病的BCAT1抑制剂C。图2. 已报道的BCAT1/2抑制剂近日拜耳公司在JMC上报道了有关BCAT1/2拮抗剂的研究工作。研究人员采用高通量表型筛选方法，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，分别对2’的氧取代芳基、5’官能团、6位三氟甲基、3’氰基等开展SAR研究。优化过程中，不断平衡分子的BCAT1/2活性，PKa性质、渗透性和细胞活性。最后，将中间苯环替换为萘环，获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。设计和优化过程总结如下：Hit发现亮氨酸脱氢酶（LeuDH）催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖的BCAAα-酮异己酸（α-KIC）还原为亮氨酸，其中NADH的消耗可通过荧光和发光读数测量（图3）。基于该实验，可以检测到具有细胞活性的BCAT1抑制剂。研究人员筛选了一个包含788,762个化合物的结构库，筛选到399个具有抑制BCAT1蛋白的化合物（＜20μM），其中BCAT1和BCAT2活性高度相关。71%的BCAT1活性分子含有酸性片段，说明BCAT1易与带负电荷的分子结合。但高电荷难以穿透细胞膜，所以需要平衡分子活性和细胞通透性。图3. 生化实验和Hit发现流程一类芳基取代嘧啶二酮结构分子（图4），包括化合物1，具有良好活性（BCAT1 IC50=554nM）和理化性质，如BEI值（17.87），LLE值（4.47），log D（1.9）和Caco2通透性（30.0nm/s，外排率为6.2）。化合物1和2具有相同的骨架结构，X晶体衍射数据显示两个分子均占据支链氨基酸的结合位点，但骨架结构的结合模式不同（图4B，C）。化合物1的甲基苯基部分伸入疏水部分，与3PP（促进BCAT1结晶的添加剂）的苯基重叠。而化合物2结构发生翻转，三氟甲基部分进入疏水口袋。两个化合物与Val175的羰基氧原子形成的氢键是唯一的共同特征。图4. （A）化合物1和2的化学结构；（B，C）化合物1和3PP与BCAT1的X晶体结构叠合；（D）化合物2与BCAT1的X晶体结构；（E）化合物1和2的结构叠合SAR研究化合物1的晶体结构显示，邻位甲基伸向Phe49和Leu173之间的口袋，可能是活性的关键，因此主要考察在邻位进行单取代或二取代。邻二甲基（3）和邻氯（8）是最好的取代基。尤其是邻氯取代，活性明显提高，这可能是氯原子距离Tyr90的OH和Arg163的NH较近的原因。化合物1的晶体结构显示，5‘位置可容纳体积较大的取代基（表2）。但结果显示：（1）5‘位置耐受体积较小的官能团，如甲基（10）、甲氧基（12）或卤素（11、15、17），BCAT1的活性相较1提高了1-2倍；（2）三氟甲氧基（16）和丙氧基（14）活性降低，可能是由于体积较大的官能团会诱导产生轴手性；（3）化合物12和15具有良好的体外药代性质（大鼠微粒体Fmax分别为95%和88%）。嘧啶二酮的1-NH具有明显的酸性，影响化合物的活性和渗透性，因此，对化合物12的临近1-NH的6位取代基进行修饰（表3），尝试调节1-NH的pKa值。（1）不同的吸电子取代基（12、18−24、27和28）或供电子取代基（25和26）对活性、Caco-2细胞通透性和pKa值的影响没有发现相关性；（2）酰胺取代基（28）化合物具有轻度酸性，说明渗透性与化合物pKa值无关；（3）活性最强的化合物24（BCAT1 IC50=60nM，BEI 14.75），但渗透率较低（PappA−B=0.5nm/s）和较高的流出率（34）；（4）化合物26虽然没有外排，但对BCAT1活性较差；（5）化合物21活性与12类似，但pKa值为7.0，酸性明显低于12；（5）酸性最强的化合物23，活性没有改善。化合物1的三氟甲基伸向较小的结构口袋，但苯磺酰（化合物24）或α-二氟苯基（化合物21）等体积较大的官能团却显示出良好的活性。24和21的的X射线晶体结构与化合物1不同（图4）。但以化合物21的结合模式为依据开展进一步结构优化，似乎不可行，因为21的芳基醚部分没有与蛋白产生紧密的相互作用，也没有提供伸向Phe49两侧的位置。图4. （A）化合物24与BCAT1的X晶体结构；（B）化合物21与BCAT1的X晶体结构在化合物1的X射线共晶中，1’位氰基没有与BCAT1形成极性相互作用，但填充了Lys99、Phe49和Ala334侧链之间的一个小口袋。接下来，研究人员针对化合物1的1’基团进行修饰（表4）。（1）1‘位为吸电子基团降低pKa值，去除氰基导致pKa值显著升高（29、30和31），但活性大大降低；（2）甲基衍生物32的BCAT1活性为2.3μM；（3）氯衍生物33具有良好的活性（BCAT1 IC50=438nM）和渗透性；（4）甲氧基（化合物34）取代氰基不耐受。化合物1结构中的苯环与Phe49形成π−π相互作用。因此，采用萘环替换苯环（表5）。（1）氰基衍生物35的BCAT1的活性为70nM，分离获得相应的阻转异构体35a和35b；（2）氯取代衍生物36活性略低，但其阻转异构体36a的BCAT1活性为31nM，BEI为19.28，且无外排；（3）α，α-二氟苯取代衍生物37也具有良好的活性。将GSK公司的苯并咪唑类BCAT2抑制剂（B）和化合物12的晶体结构进行叠合（图5），显示芳香环部分构象相似，因此，设计了咪唑吡啶（化合物38）代替苯环。结果显示，BCAT1活性为850nM。化合物38的复合物晶体结构显示，嘧啶二酮的结合模式再次翻转。图5. （A）化合物38的优化策略；（B）化合物B与BCAT2的复合物晶体和化合物12与BCAT1的晶体结构叠合；（C）化合物38与BCAT1的X晶体结构细胞水平活性研究（1）在不同肿瘤细胞系（U-87MG和MDA-MB-231）培养基中测量亮氨酸的含量，用以评价小分子的细胞水平活性。结果如表6所示，化合物的细胞活性明显弱于蛋白活性。可能是由于对细胞的渗透性较低的原因。2%血清白蛋白存在，导致IC50至微摩尔水平。因此，高血浆蛋白结合可能导致36a缺乏有效性。由于化合物36a（BAY-069）具有最好的细胞活性，因此被选为体外候选探针。（2）测试化合物36a（BAY-069）和化合物A对U-87MG（高BCAT1表达）和MDA-MB-231（BCAT2高表达）细胞增殖的影响。结果显示它们未能抑制细胞增殖。此外，在BCAT1和/或BCAT2高表达SEM、CAL-51、HCC-33和NCI-H2110细胞中，也未表显出抗增殖作用。然而，多项研究证明，与体内研究中获得的抗肿瘤效果相比，BCAT1在体外（如增殖、谷氨酸水平和菌落数）敲低的效果很弱。这可能是化合物活性与肿瘤环境和其他宿主因素具有依赖性。体内外药代动力学性质（1）化合物36a（BAY-069）在体外人肝微粒体代谢稳定性较高（Fmax=92%），在大鼠肝细胞代谢稳定性中等（Fmax=56%）（表7）；（2）Caco-2渗透率高且没有外排迹象，可能具有良好的口腔吸收特性；（3）BAY-069在大鼠体内的药代动力学研究显示，较低的血清除率（CLblood=0.64L/h/Kg）、中等的体积分布（Vss=0.25L/Kg）和较高的口服生物利用度（F=89%）。BAY-069的选择性（1）BAY-069在天冬氨酸转氨酶（GOT1和GOT2）的酶活实验中IC50>50μM；（2）对包含30个蛋白酶和30个激酶的实验中，大部分IC50>10μM，但对一个蛋白酶IC50=6μM，对一个激酶IC50=2μM；（3）在Eurofins LeadProfilingScreen（包含77个潜在靶点）活性筛选中，10μM的BAY-069，没有发现抑制或激动效率超过45%的情况；（4）为了识别（三氟甲基）嘧啶二酮潜在附加靶点，采用化合物35的共晶结构，对CavBase方法对PDB库进行搜寻，未找到类似的结合口袋。采用高通量筛选，获得（三氟甲基）嘧啶二酮骨架的BCAT1/2抑制剂。通过SAR分析和X射线晶体研究表明，发现嘧啶二酮的活性在于骨架结构的酸性。基于化合物Hit 1的结合模式，采用基于蛋白−结构的设计，在多个位点进行优化，最终获得高亲和力、良好细胞通透性和较高的细胞活性的化合物BAY-069。其在体内的整体体外药代动力学特性和选择性表明，BAY-069适用于体内实验。BAY-069已被提供给SGC联盟，供更广泛的科学研究使用。文章来源doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c00441请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程药渡Cyber平台整合药物设计思想，挖掘了文献及专利报道的活性结构，通过Cyber平台可以方便快速获得研发人员兴趣靶向结构，以供开拓思路，就BCAT1抑制剂举例如下：1.进入CyberSAR首页，在靶点下拉项中，输入“BCAT1”，选中关联“BCAT1 (Homo sapiens)”搜索BCAT1相关靶点信息。2.在靶点界面选中“化学空间”选项标签下级联“聚类空间”选项卡，可以将CyberSAR平台收录的文献和专利具有关于BCAT1相关实验测试活性的分子以“分子母核聚类“的形式展示。3.在靶点界面选中“试验数据”选项，可以看到BCAT1靶点分子的活性数据。4.单击分子结构，可见感兴趣分子进一步扩展信息。5.单击“骨架相似“选项卡或者”预测靶点“选项卡，还可以进一步提供结构的衍生类型，可下载进行分子学习。登录方式CyberSAR在电脑浏览器端登录网址：https://data.pharmacodia.com/cybersar/，欢迎猛烈试用。请点击此处链接观看CyberSAR系统详细使用教程如需进一步沟通，请扫码添加微信联系药渡赵博士或药渡CyberSAR沟通群。

研究表明，肿瘤发生发展导致代谢重塑来适应体内营养/代谢应激，促进细胞恶性转化和肿瘤演进，例如氨基酸代谢在许多肿瘤中失调。支链氨基酸（BCAA）包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，BCAA代谢的变化特异性地影响肿瘤细胞状态以及罹患恶性肿瘤个体的全身代谢，如支链氨基酸转氨酶1或2（BCAT1、BCAT2）催化BCAA和其分解代谢产物支链α-酮酸（BCKA）的可逆反应，BCAT1和BCAT2的表达增加与不同肿瘤的生长和侵袭等恶性表型有关。支链氨基酸不能在人体中合成，但它们既可以被高度可逆的BCAT1和2分解代谢，为肿瘤细胞提供能量，也可以逆向由BCKA转化为亮氨酸激活mTOR信号通路，从而造成体内不同的细胞或组织器官间的代谢串话，促进肿瘤生长。图片来自：Emerging Roles for Branched-Chain Amino Acid Metabolism in Cancer. Cancer cell, 37(2), 147–1562023年6月19日，复旦大学上海医学院雷群英团队在 Nature 子刊 Nature Metabolism上发表了题为：Enhanced BCAT1 activity and BCAA metabolism promotes RhoC activity in cancer progression的研究论文。该研究发现并鉴定了肿瘤细胞中BCAT1的一个功能获得性突变，进而揭示了BCAA通过细胞内代谢的区室化调控和代谢感知，作用于下游RhoC介导的小G蛋白信号通路，影响细胞迁移和增殖，对靶向依赖BCAA的肿瘤诊疗具有潜在的转化意义。该研究团队此前的研究发现了BCAA-BCAT2代谢轴在肥胖和KRAS突变驱动的胰腺导管腺癌发生中的重要作用，阐明了BCAT2介导的分解代谢不依赖于mTOR信号通路在肥胖和胰腺癌发生发展的分子机制，并提出了靶向干预的新策略（Nature Cell Biology 2020；National Science Review 2021，Nature Metabolism 2022）。基于此，团队进一步探索BCAA代谢在肿瘤发生发展过程中的功能。该研究分析肿瘤细胞系百科全书（CCLE）数据库中BCAA代谢通路关键代谢酶的突变频率时发现，BCAT1在密码子61处发生谷氨酸（Glu，E）转变为丙氨酸（Ala，A）的高频率突变——BCAT1E61A，突变细胞系主要集中于白血病和胃癌细胞。对临床胃癌样本中进行测序确认，该突变的发生率约为2.8%，病理分析结果显示携带BCAT1E61A突变的肿瘤组织弥散性胃癌。通过体外酶活，代谢组学及代谢流等分析，发现BCAT1E61A增强酶活性和BCAA分解代谢，促进细胞生长和迁移，并有助于肿瘤的发展。进一步蛋白组学研究发现，BCAT1直接与小G蛋白RhoC相互作用，导致RhoC活性升高。值得注意的是，体外数据及分子模拟显示，BCAA下游代谢产物BCKA直接与RhoC结合并促进其活性。随后，研究发现BCAT1敲除抑制的细胞迁移可以通过表达BCAT1/BCAT1E61A或添加BCKA来回补。利用已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物库, 筛选发现血管紧张素II受体拮抗剂坎地沙坦可作为BCAT1E61A的抑制剂，在体外抑制RhoC活性和肿瘤细胞迁移，并在体内阻止肿瘤细胞的小鼠腹膜转移。有意思的是，研究团队使用CRSPR-Cas9系统进行基因编辑，建立了敲入点突变Bcat1KI/KI 转基因小鼠。在胃癌、肝癌及肺癌模型中，BCAT1E61A都显著促进肿瘤发生发展。更为重要的是，有6只在15月龄的Bcat1KI/KI转基因小鼠自发形成肝癌。总的来说，该研究发现并鉴定了肿瘤细胞中BCAT1的一个功能获得性突变，进而揭示了BCAA通过细胞内代谢的区室化调控和代谢感知，作用于下游RhoC介导的小G蛋白信号通路，影响细胞迁移和增殖，对靶向依赖BCAA的肿瘤诊疗具有潜在的转化意义。复旦大学附属肿瘤医院/生物医学院研究院钱林博士、李娜博士、陆孝晨博士研究生和许蜜蝶副研究员为论文共同第一作者，复旦大学上海医学院雷群英教授为论文通讯作者。此外，论文合作作者还包括复旦大学上海医学院的多位教授和上海交通大学基础医学院吴英理教授、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈正军研究员等。该研究受到了国家自然科学基金、科技部重点基础研发项目和上海市教委科创项目的支持。论文链接：https://www.nature.com/articles/s42255-023-00818-7识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。