Cytomegalovirus immune globulin (Biotest)

中文摘要目的   实验室确认静注巨细胞病毒人免疫球蛋白（pH4）（human cytomegalovirus immunoglobulin for intravenous injection，CMV-IVIG）抑制巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染的有效性。方法   分别通过免疫荧光染色和细胞病变实验测定CMV-IVIG抑制CMV的即早基因1表达和致细胞病变能力，确认CMV-IVIG有效性。结果   即早基因1表达量与病变细胞数量随着制品稀释倍数的增加而增加；27倍稀释的CMV-IVIG可抑制90.77%~95.85%的CMV感染力；103倍稀释的CMV-IVIG可抑制＞90%的细胞病变。结论   CMV-IVIG中的中和抗体能特异性中和CMV，阻止CMV感染细胞，且具有良好的量效关系。正文巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是疱疹病毒科β属的DNA病毒[1]，在发展中国家成年人中感染率可达100%[2]。虽然通常呈隐性感染，但当机体免疫功能低下时，病毒可被激活而发生显性感染[3]。孕妇初次或复发CMV感染引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，是导致先天畸形的重要原因之一[4]。目前尚无治疗CMV感染疾病的特效药物，由于抗CMV抗体可以保护特定人群抵抗CMV感染疾病[5-9]，因此，目前使用抗病毒药物或联合抗病毒药物和静注巨细胞病毒人免疫球蛋白（human CMV immunoglobulin for intravenous injection，CMV-IVIG）（pH4）预防和治疗 CMV感染疾病[10]。成都蓉生药业有限责任公司（成都蓉生）研制的CMV-IVIG（pH4）系从健康人血浆中筛选含高效价CMV中和抗体（CMV neutralizing antibody，CMV-NA）的血浆，采用成都蓉生分离工艺和成品配方，经两步病毒灭活（低pH孵放和纳米膜过滤）制备的特异性CMV-IVIG冻干制剂，供静脉输注。输注后可迅速提高患者血浆中CMV-NA水平，理论上可通过CMV-NA与CMV中的抗原结合，阻止病毒侵入健康细胞并清除CMV，起到预防和治疗CMV感染及相关性疾病的作用。由于人CMV种属特异性高，难以建立动物模型，因此本品未能做动物实验以验证其药效，只能选择体外药效实验，而离体人源组织和器官珍贵难觅，且涉及伦理规范，我们选择用正规商业来源的敏感人源细胞进行了药效学实验研究。CMV基因组复制缓慢，基因表达具有严格的时相性。即早基因（immediate early gene，IE）1在感染后3 h开始在细胞核中表达，6 h后即可被检出；而CMV晚期基因的转录和翻译发生在感染后的36~48 h[11]。因此，采用免疫组织化学法可使感染CMV的细胞核特异性着色。1材料与方法1.1材料1.1.1  实验样品  成都蓉生研制的6批CMV-IVIG（pH4）：V002、V003、V004、V005、V006、V007为2种规格，浓度相同，装量不同，其中V002、V004、V006 为20 000 U（25 ml）/瓶，V003、V005、V007为40 000 U（50 ml）/瓶，制品的纯度分别为98.3%、98.1%、98.3%、98.4%、98.2%、98.4%；分子大小分布分别为99.2%、99.2%、99.1%、99.2%、99.1%、99.1%。复溶后用维持液（含2%胎牛血清的MEM培养基）根据不同实验特点稀释成不同稀释倍数（IE1表达量抑制实验样品：128、256、512······4 096倍；细胞病变实验样品：1 000、1 050、1 100······1 350倍）溶液待用。1.1.2  细胞和病毒株  MRC-5人胚肺成纤维细胞、CMV均购自美国典型培养物保藏中心。1.1.3  主要试剂  MEM基础培养基购自美国Life Technologies公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，生物素化抗鼠IgG购自美国Jackson ImmunoResearch公司，亲和素化链霉抗生物素蛋白和TrueBlue显色剂购自美国KPL公司，抗CMV IE1单克隆抗体购自美国Merck Millipore公司。1.1.4  主要设备  BSC-1500Ⅱ A2-X生物安全柜购自济南鑫贝西生物技术有限公司，XDS-1B倒置显微镜购自重庆光电仪器有限公司，GL-99T Ⅰ型体视显微镜购自桂林桂光仪器有限公司。1.2方法1.2.1  IE1表达量抑制实验  CMV-IVIG与中和用CMV等量混和，每个浓度样品2个复孔，37 °C、5%CO2中和1 h。然后加入MRC-5细胞于37 ℃、5%CO2培养16~18 h。同时设阳性对照（维持液代替CMV-IVIG）和阴性对照（维持液代替CMV-IVIG和病毒）。经过细胞固定、封闭及加抗CMV IE1单克隆抗体、生物素化抗鼠IgG、亲和素化链霉抗生物素蛋白，最后显色。显色后在体视显微镜下采集各孔图像，用克隆计数软件计数每孔的特异性着色细胞核。降低感染力程度（％）=100－样品孔平均核着色个数÷病毒孔平均核着色个数×1001.2.2  细胞病变实验  CMV-IVIG与同体积的CMV于37 ℃、5%CO2中和1 h后，加入 MRC-5细胞于37 ℃、5%CO2培养48 h，设阳性对照（维持液代替CMV-IVIG）和阴性对照（维持液代替CMV-IVIG和病毒），在倒置生物显微镜下观察MRC-5细胞的致细胞病变程度，记录观察结果。2结果2.1IE1表达量抑制实验结果同体积的不同稀释倍数CMV-IVIG在加入相同量的CMV后，残留病毒数不同，残留病毒感染细胞后在细胞核内表达的IE1数量也不同，经染色后计数结果也不同。稀释倍数越高，特异性着色的细胞核越多，即IE1表达越多，见图1。随着CMV-IVIG稀释倍数的增加，降低病毒感染力的程度减小，病毒感染力增强（IE1表达越多）。在128倍稀释度时，能降低约93%的病毒感染力，而在4 096倍稀释度时50%样品降低病毒感染力的能力已降到0，见表1。2.2细胞病变实验结果同体积的不同稀释倍数的CMV-IVIG能中和的同体积病毒液中的病毒数不同，残存的病毒导致的MRC-5细胞病变的范围程度也不同。随着CMV-IVIG稀释程度的增加，相同体积样品内含有的CMV-NA量也减少，而致细胞病变的程度增加，说明CMV-NA能特异性有效阻止CMV感染细胞，避免细胞发生病变（图2、3）。3讨论目前全球仅有CytoGam®和Cytotect®品牌的CMV-IVIG应用于欧美市场，且已上市多年，国内至今仍无同类产品上市。为了在实验室确认成都蓉生研制的CMV-IVIG产品对CMV的有效性，我们用CMV敏感的MRC-5细胞开展了本研究。从两方面进行试验设计：（1）CMV感染MRC-5细胞数小时后会在细胞核内大量表达IE1，通过组织化学染色使病毒感染的细胞核出现特异性着色现象，且1个着色细胞核代表1个感染并表达IE1细胞[12]。将系列稀释的CMV-IVIG分别与CMV悬液混和，再感染MRC-5细胞。感染细胞培养后，通过对感染细胞中的染色颗粒的计数测定中和后的残留病毒IE1的表达能力。（2）CMV感染MRC-5细胞，在细胞内的繁殖过程引起细胞肿胀变形，由细长梭形变为球形（巨细胞），即细胞病变。将系列稀释的CMV-IVIG分别与CMV悬液混和，然后感染MRC-5细胞。感染后的细胞经过培养，在倒置显微镜下观察残余病毒引起的致细胞病变程度。IE1表达量抑制实验结果中，随着CMV-IVIG稀释倍数的增加，相同体积样品内含有的CMV-NA量也减少，IE1表达越多，即病毒感染力越强，CMV-IVIG 能降低病毒感染力的程度越小，在128倍稀释时，杀灭了绝大部分病毒（平均93%），而在4 096倍稀释时50%样品已无降低病毒感染力能力（IE1表达与阳性对照一致）。细胞病变实验结果显示，随着制品稀释程度的增加，致细胞病变的程度也在增加，说明CMV-NA能特异性有效阻止CMV感染细胞，避免细胞发生病变。成都蓉生研制的CMV-IVIG标示效价单位为可以直接有效中和活病毒的中和抗体效价单位，而非对应病毒抗原片段的抗体总量。我们的体外药效学研究结果显示：产品所含有的特异性中和抗体能有效中和病毒，阻止CMV感染细胞；中和病毒的能力与CMV-IVIG中的中和抗体含量呈正相关，具有良好的量效关系。基于上述结果，该产品应具有相应的临床药效。作者刘波1  吴强2  张航3  李小姣3  李伟4  杨春4  吴佳君5  秦婷婷51成都蓉生药业有限责任公司质量检定部，成都  610219；2成都蓉生药业有限责任公司生产管理部，成都  610219；3北京天坛生物制品股份有限公司科研管理部，北京  100024；4成都蓉生药业有限责任公司血液制品研发部，成都  610219；5成都蓉生药业有限责任公司科研质量部，成都  610219通信作者：秦婷婷，Email：1590825@qq.com引用本文：刘波, 吴强, 张航, 等. 静注巨细胞病毒人免疫球蛋白（pH4）体外药效学研究 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(2): 61-64.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20220628-00036