IPL-344

缘起 最近这种令人感到有些压抑且排他、经费紧缩而内卷的学术环境，让我萌生了创业或者转行投资的想法。在研读芒格老头子的教诲时，他的错位竞争策略给了我很大启发: 要去到那些大象去不到的地方，如果现有的规则对你不利，就不要在规则里证明自己。 我是一个生物技术爱好者，在过去的十一年里，从HIV治愈研究到基因治疗，再到蛋白设计和抗体工程、AAV进化，我感觉自己做了海量的实验。虽然非常努力且享受这个过程，但不得不承认成果寥寥。 回顾以往，我最大的收获是发现自己并没有聚焦于关键的科学问题。所在问题的价值直接决定了成果的分量，商业竞争和药物研发亦是如此。 将现在的单抗、双抗、ADC、siRNA等平台技术应用于高度内卷的肿瘤、自免代谢领域，已经是大药企和资深创业者的游戏。我想对于初创者来说，将基因治疗用于介于罕见病和常见病之间的疾病，可能具备更好的错位竞争优势。 并且对于显著未满足的临床需求，临床入组速度快，患者支付意愿强，监管机构提供的FTD、BTD以及ODD等注册路径对创业者会更加有利。这样可以让个人创造力去对冲更高的药物研发风险，同时降低现实世界中的资源阻力。 于是我问 Gemini，如果从基因治疗的角度看，哪些疾病或靶点的竞争格局较好且有巨大的潜在市场？ 总体上它的看法和我相似，但是排在第一的神经退行性疾病，包括帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS），却有点让我意外。 全球 PD 患者超过 1000 万，目前缺乏有效延缓疾病的药物，患者极度痛苦且严重影响生活质量，潜在市场在数千亿美元，市场格局可以说是完美的。但其发病机理不清晰且缺乏潜在有效靶点，从药物开发的角度看，这已经超出了目前的技术范畴。 随后我查阅了 ALS 的资料，不查不知道，一查吓一跳，原来 ALS 就是我们常说的渐冻症。。 ALS 全球约有四五十万人，每年新发 12 到 14 万人。其中中国有 6 到 8 万人，新发约 2 到 2.5 万人/年；欧美有 8 到 10 万人，新发约 3 到 3.5 万人/年。ALS 诊断后平均寿命仅 2 到 5 年，存在显著的未满足临床需求。 当前市场规模在 10 亿美金左右，但显然潜在市场是跟疗效挂钩的，预计在 200 亿美金左右。虽然 ALS 的致病机理还不是非常明确，但似乎存在一些疾病表型和分子机理上的共性，这给药物开发留下了一些落脚点。下面我来讲讲 ALS 的致病机理、研发现状以及潜在的开发路径。 渐冻症致病机理 ALS 是一种罕见的进行性神经退行性疾病，主要影响运动神经元（Motor Neuron, MN）。患者会面临肌肉逐渐萎缩和无力以至瘫痪，似乎身体被逐渐冻住一般。从无法行走到无法说话、吞咽、呼吸，最终导致呼吸衰竭和死亡。 其最显著的特征是上运动神经元（Upper Motor Neuron, UMN）和下运动神经元（Lower Motor Neuron, LMN）的退化和死亡。UMN 连接大脑和脊髓，LMN 则连接脊柱中的 UMN 和身体的肌肉。 运动神经元是负责随意肌收缩的细胞，主要参与运动及吞咽、发声、呼吸等重要生理功能。二者的退化意味着所支配肌肉的进行性瘫痪。由于 MN 的进行性变性导致信号发送停滞，大脑丧失了启动和控制肌肉运动的能力，最终当肺部横膈膜肌萎缩瘫痪时，患者会因呼吸衰竭死亡。 约 10% 的 ALS 患者是家族性遗传原因，迄今为止发现的突变约占家族性病例的70%，其他患病原因则尚不明确。目前大多理论集中在基因和环境因素的复杂相互作用方面。涉及的 4 个主要基因包括 SOD1、TARDPB、FUS、C9orf72，以及约 15 个次要基因，如 ALS2、SETX、VAPB、FIG4、ERBB4、MATR3、ANG、OPTN、VCP、UBQLN2、CHMP2B、PFN1、hNRPA1 A2/B1、TUBA4A、NEK1。 图1. 渐冻症的发病机制及相关基因  (Péladeau, C. et al. (2021) Int J Mol Sci.; Morgan,S.et al. (2016) British MedicalBulletin) 尽管 家族性ALS 的遗传原因存在巨大的异质性，但家族性和散发性 ALS 在其病理和临床特征上具有相似性，这提示导致 MN 变性的细胞和分子机制是相似的。 通过研究病人的基因变化，大部分科学家认为 ALS 可能与轴突结构和动力学、细胞凋亡和坏死、线粒体功能障碍、谷氨酸兴奋毒性、炎症以及氧化应激有关。患者会表现出神经病理变化，如近端轴突神经丝状肿胀，神经丝（Neurofilament, NF）和外周蛋白在轴突和神经元胞体中聚集。 此外还包括具有磷酸化 NF 和泛素免疫反应性的核周包涵体。在一些家族性病例中，还存在 Cu/Zn 超氧化物歧化酶免疫反应性、路易小体样胞质神经元包涵体、高尔基体断裂、远端轴突口径减少、轴突华勒变性以及树突衰减等神经病理性改变。 从碎片拼图到药物研发思路 上面的病理过程其实十分的笼统和抽象，容易让人无从下手。 要找药物靶点，先要理解潜在的分子病理机理。下面我们就把一个一个的知识碎片拼凑起来，得到一个关于ALS的潜在分子机理，基于这个理解去选择靶点，开发药物。 首先，TDP-43异常聚集出现在几乎所有的 ALS 和约一半的额颞叶变性（FTLD）患者中。它还涉及边缘系统相关年龄依赖性 TDP-43 脑病（LATE）、阿尔茨海默症（AD）、慢性创伤性脑病（CTE）、亨廷顿舞蹈症（HD）等。说明TDP-43异常聚集跟一些共同的细胞机制有关。 TDP-43存在一个 mRNA-TDP-43 自反馈调控系统。TDP-43 的mRNA可以结合 TDP-43 蛋白，诱导自身mRNA 的降解。当细胞核感知 TDP-43 不足时，TDP-43的抑制解除，会大幅提高mRNA 的出核比例从而提高TDP-43蛋白的表达。 TDP-43 异常聚集存在4种折叠构象，ALS中主要为fold-B。聚集主要由 C 端低复杂性结构域（Low Complexity Domain, LCD）中间的疏水 β 折叠驱动。TDP-43 聚集体的不同折叠方式与大脑位置和疾病高度相关。 目前已知有 24 个疾病相关突变聚集于 TDP-43 纤维折叠区，说明 TDP-43 的异常折叠是 ALS 和 FTLD 的直接原因。 TDP-43 纤维化聚集体存在在脑组织裂解上清或沉淀中，沉淀中主要是 P280 酶切后的产物。Kumar 等人在 2023 年发表于《Nature Neuroscience》的研究指出，TDP-43 的酶切和淀粉样核心暴露是其病理传播所必需的。 最近发现环境应激或衰老会诱发 LCD 区域的异常翻译后修饰，如磷酸化和乙酰化，导致了同样的聚集结果。说明TDP-43 磷酸化和乙酰化修饰和蛋白酶切产生了高毒性的LCD蛋白聚集种子。 一个有意思的问题就是ALS 为什么会造成 MN 凋亡而不是其他神经元？ 因为 MN 代谢活跃且体积大，从大脑到肌肉就连接了两个神经元，UMN 直径可达 60 微米，需更高效地清除错误折叠蛋白，但自噬系统超负荷易引发损伤。 那神经元代谢跟蛋白异常折叠有什么直接关系呢？ 多种病理过程会导致TDP-43 的异常折叠，比如分子伴侣蛋白活性不足、核转运障碍导致的转录谱紊乱、下游代谢紊乱以及蛋白降解系统失衡。当细胞面临这些压力时会形成应激颗粒（Stress Granule, SG）用于保护 RNA。正常情况下压力消失后 SG 会解散，TDP-43 回到细胞核。 但在慢性压力或基因突变存在时，这种可逆过程会失控。TDP-43 会在 SG 中发生相变，即液-液相分离，逐渐变为不可溶的固体聚集体。胞质中的 TDP-43 聚集物具有类似朊病毒的性质，能诱导健康的蛋白也发生错误折叠。这会导致细胞核内该蛋白枯竭，进而引发关键 RNA 的错误剪接，如 STMN2 和UNC13A 的隐性外显子保留，直接破坏神经元完整性。 MN 对这种应激更敏感。体外实验证实，多种应激源如氧化应激、内质网应激等可诱导神经元过度应激，导致 TDP-43 从细胞核移位至细胞质并形成聚集体。 这种异常聚集似乎存在一个耐受区间。ALS患者大脑H&E 染色结果显示，MN 的TDP-43 纤维聚集体展现出明显的“有或无”两种状态，这是典型的酶促反应表现，说明纤维聚集体会在某些诱因触发下发生指数级增长。 图2. ALS前额叶皮层进行 TDP-43 抗体免疫组织（棕色）染色 (Diana A. et al., Nature 2021) 从蛋白折叠角度看，TDP-43 在正常生理条件下不会自发折叠，这是进化下的必然结果。而ALS中TDP-43的异常聚集说明TDP-43疏水 β 折叠核心的形成可能是在SG局部高浓度或其他辅助分子如 RNA 的作用下形成的。 最后，从基因-表型分析也可知，疾病相关突变基因C9ORF72、SOD1、TARDBP 等参与 RNA 代谢、细胞运输、自噬与降解等共同机制，最终都会出现不可逆的 TDP-43 毒性聚集体。这说明TDP-43纤维化聚集的形成存在“RNA 加工异常/代谢异常-细胞应激-TDP-43 纤维化聚集-运动神经元凋亡”这一隐含通路。 图3. 推测的TDP-43纤维形成机理 (Senthil T. K. et al., Nature Neuroscience 2023) 渐冻症临床研究现状 渐冻症已被发现 200 多年，但疗法和突破非常有限。近 30 年来，利鲁唑（Riluzole）、依达拉奉（Edaravone）、Relyvrio 以及托夫生（Tofersen）等药物逐步面世。尤其 Tofersen 获批用于治疗具有 SOD1 突变的患者，成为美国FDA批准的首款治疗遗传性 ALS 的ASO疗法，也是首款基于生物标志物加速批准的 ALS 疗法。 当下有近百款新药处于临床研究阶段，涵盖小分子、寡核苷酸、多肽、细胞和基因治疗药物等。目前探索的策略包括调节兴奋性、提供神经保护、抑制氧化应激、调节代谢以及降低致病基因表达等。 说实话，目前并没有看到特别明显的疗效，现有疗法依然无法完全阻止或逆转病变。 例如，尽管有数款药物获批，其疗效多基于生物标志物上的改善。例如 Ionis 获批的 SOD1 ASO 疗法可降低CSF中 60% 的神经丝轻链（Neurofilament Light chain, NfL），但在 28 周时未能显著改善 ALS 功能评分量表修订版（ALSFRS-R）。 尽管功能改善不明显，NfL 的显著下降至少说明下调聚集体可以降低神经元炎症和凋亡。同时，两个完全获批的药物 Riluzole 和 Edaravone 分别抗谷氨酸能过度激活和抗氧化应激，说明 MN 的应激反应是重要病理因素。此外，Neuvivo 开发的巨噬细胞炎症调节剂 NP001 在高 CRP 患者中有效，说明自免炎症反应也参与了ALS的进展。 就在近日，VectorY Therapeutics 一款 AAV-scFv（单链抗体）抗体疗法 VTx-002 获得 FDA 的FTD 资格，用于推进启动一项 PIONEER-ALS 1/2 期临床试验（NCT07287397），旨在治疗 TDP-43 病理改变的 ALS。由于这种病理改变覆盖了约 97% 的患者，其意义重大。 图4. VTx-002的作用原理 (ALS/MND poster) 其使用的 AAV5.2 载体是引进自 Shape Therapeutics 的深脑穿透型 AAV。这个单链抗体可以精准识别并清除细胞质中的错误折叠的 TDP-43 聚集物，并有望恢复 TDP-43 在细胞核的正常生理功能。 有意思的是，结合 TDP-43 不同位点的 scFv 可以恢复大部分 TDP-43 M337V 突变引起的 RNA 错误剪切，且靶向 C 末端的scFv 几乎不改变 RNA 的剪切模式。同时scFv 完全预防了 M337V 突变神经元在压力应激后的纤维化聚集，并恢复了下游基因表达。这个数据从细胞水平上证明了通过操控 TDP-43 来调控纤维化聚集的可能性。 图4. VTx-002可清除M337V突变神经元的TDP-43纤维聚合物 (ALS/MND poster) 最后，Immunity Pharma 的 IPL344 治疗 ALS 的 2a 期试验显示，与历史数据相比，其 ALSFRS-R 进展速度减缓了约 60%。IPL344 是一种生物活性肽，能直接激活受损的 Akt 通路。但需要注意，这里的对照是历史对照，数据说服力相对有限。 ALS 治疗的潜在开发路径 从上面分析可知，ALS 致病原因多样，但总体遵循“RNA 加工/代谢异常-细胞应激-应激颗粒形成-TDP-43 纤维化聚集-运动神经元凋亡”这一隐含通路。 从药物开发角度看，最好能找到通用的靶点或机制，尽量覆盖最多人群的同时获得疗效。因此，SG 形成和 TDP-43 纤维化聚集是理想的靶点。由于 TDP-43 在mRNA加工中的核心作用，我们需要干预纤维化聚集过程的同时维持其功能。 有多个潜在路径去实现这个目标。 第一条路是开发工程化的TDP-43*。它可以替换原来的 TDP-43 履行生理功能，但自身又不会产生应激后的纤维化聚集。这样高表达的工程化 TDP-43* 不仅可以完成功能替换，还能通过自反馈机制降解人类 自身的TDP-43 mRNA，从而终止纤维化聚集的恶性循环。我们或许可以从长寿物种中寻找抗纤维化 TDP-43* 序列，或者直接对 TDP-43 的疏水核心进行蛋白设计，破坏纤维聚集的疏水界面。 幸运的是TDP-43在功能是非常保守的，序列差异主要发生在LCD区，且哺乳动物细胞互相替换TDP-4后仍能准确完成大部分RNA剪切和调控。如我所想，作为长寿且体型巨大的鲸鱼，其 TDP-43 的LCD展现出了极佳的抗聚合能力。 第二条路是借鉴 VectorY 的思路去设计抗 TDP-43 纤维化分子，但VectorY的策略会干扰TDP-43的功能。因为TDP-43 纤维会在两端不断延伸，我们或许可以在纤维两端的结合面设计 Binder。这有点像人体内 DARPin（Designed Ankyrin Repeat Protein）蛋白两端的帽子样结构，用于中断纤维化的多米诺组装过程。可封闭纤维末端的Binder 理论上可以阻断纤维聚集，且不会像抗体那样产生对 RNA 剪切的干扰。 图5. TLR分子β折叠重复单元以及两端帽状结构 (Christmas, P. 2010 Nature Education) 图6. TDP-43 fold-B纤维核心和疏水界面 (Senthil T. K. et al., Nature Neuroscience 2023) 最后一种思路是借鉴其他物种的纤维裂解系统，比如酵母或微生物中的 Hsp104强效解聚酶。宾大的James Shorter 团队在这个方向已经做了很多年的工作。这种六聚体环状解聚酶在低等真核生物中存在更强力的活性。 但该策略存在几个挑战，首先ALS本身就是上游的代谢失调，提供额外的解聚酶大概率也解决不了系统代谢、供能等的问题。事实上临床上已经尝试过稳定HSP蛋白或提供营养因子治疗ALS，但效果一般。 其次，动物进化出了更高级的泛素降解系统，Hsp104 需要与酵母Hsp70 和Hsp40 系统协作来区分底物特异性。在人体内缺乏这种区分系统，因此不可避免地会遇到降解特异性和毒性的问题，成药概率较低。 综上所述，我觉得干扰 TDP-43纤维化聚集过程是更现实的路径。结合聚集干扰分子和 AAV 载体，可实现在长时间的抗聚集保护和抗凋亡。目前这个方向探索者极少，非常值得一试。 附表. 临床阶段ALS管线汇总