AMT-151

子宫内膜癌的生物标记物研究已从传统病理特征与单基因检测，全面迈入以分子分型、多组学整合及肿瘤微环境解析为核心的精准医学阶段。临床中，POLE 超突变型、MMRd/MSI‑H、p53 异常及 NSMP 等分子亚型已构成分层管理的基础框架，并持续指导个体化治疗策略的优化。 与此同时，研究重点正逐渐扩展至更具潜在临床价值的新兴生物标记物，包括 HER2、TROP2、FRα、PIK3CA、PTEN、CTNNB1 以及 KRAS 等关键信号通路基因。这些标记物不仅在靶向治疗与 ADC（抗体‑药物偶联物）开发中展现出强劲前景，也为免疫治疗敏感性预测、耐药机制解析与复发风险评估提供新的切入点。 子宫内膜癌分子分型：TCGA与ProMisE TCGA 和 ProMisE 是目前子宫内膜癌常用的两种分子分型方法。 TCGA 通过全外显子测序、RNA测序、甲基化芯片、蛋白质芯片将子宫内膜癌分为四类：POLE 超突变型、MSI 高突变型、拷贝数低型（MSS）和拷贝数高/p53 异常型，不同分型在突变特征和预后上差异明显。 相比之下，ProMisE 分型通过 IHC 和基因测序，以更简便的流程将患者分为 POLE EDM、MMR‑D、p53 野生型和 p53 异常型，结果与 TCGA 基本对应，更便于临床操作。简单来说，TCGA 提供深入的基因组分类，而 ProMisE 则把这些分类转化成临床更容易使用的检测流程。 各大指南（NCCN、ESMO、ESGO、CAP 等）均建议对子宫内膜癌进行统一的分子诊断流程。核心检测包括 POLE 突变、MMR/MSI 状态与 p53 表达，部分指南也推荐在适当情况下检测 TMB 与 NTRK 融合。NCCN 提供了清晰的步骤式路径：先评估 POLE 突变，再通过 MMR/IHC 判断是否为 MSI‑H/dMMR，其余病例再依据 p53 表达区分为拷贝数低或拷贝数高亚型。整体而言，指南共同目标是确保所有 EC 患者接受一致且可操作的分子分型，以指导预后评估与治疗选择。 在子宫内膜癌的多重分型处理中，若同一肿瘤同时具备多个分子特征，分型需遵循固定的优先级规则：POLEmut 的优先级最高，因此无论与 MMRd 或 p53abn 共同出现，都应归类为 POLEmut 型；当不存在 POLEmut，但出现 MMRd 与 p53abn 时，则以 MMRd 为主导分型。这一原则确保在多重突变共存的情况下，始终以最具预后和生物学意义的分型作为最终分类依据。FDA 批准的与 EC 相关生物标志物的伴随诊断（CDx） NTRK NTRK 融合虽在子宫内膜癌（EC）中较为罕见（全球真实世界研究中阳性率约 0.19%），但由于其对抗 TRK 靶向治疗高度敏感，因此被视为一类重要的泛肿瘤生物标志物。 当前，NTRK 融合检测可通过 NGS、PCR、FISH 或 IHC 完成，其中 NGS 是最常用且最能全面识别融合事件的方法。多个国际权威指南（NCCN、CAP、SGO、ESGO/ESTRO/ESP、ESMO、Pan‑Asian ESMO、JSMO/JSCO/JCA、Brazilian及ISGP）均将 NTRK 纳入建议检测项目，尽管检测优先级在不同指南中有所差异，但整体趋势是：在无法解释的进展性或晚期实体瘤中，应优先考虑 NTRK 融合检测。 在治疗层面，只要确诊存在 NTRK 融合，无论肿瘤来源为何，患者均可从 TRK 抑制剂中获益。目前获批用于 NTRK 融合阳性实体瘤的靶向治疗包括拉罗替尼（Larotrectinib）与恩曲替尼（Entrectinib），两者已在美国、欧洲、日本及中国等市场获批，适用于局部不可切除、转移性或经多线治疗失败的 NTRK 融合阳性患者。总体而言，尽管其在子宫内膜癌中的发生率极低，但 一旦检测到 NTRK 融合，靶向治疗即可成为高度有效且优先选择的治疗方案，因此国际指南均强调在合适人群中进行检测，以最大化精准治疗机会。 HER2 HER2 是子宫内膜癌（尤其是浆液性 EC 和 p53 异常亚型）中重要的新兴生物标志物，其异常表达通常与更高肿瘤侵袭性和较差预后相关。由于目前 EC 中尚无统一的 HER2 检测及判读标准，不同研究采用的 IHC 与 FISH 方法存在差异，从而导致 HER2 阳性率波动较大：文献报道FISH 扩增率约 4%–69%，IHC 过表达率约 18%–80%；在浆液性 EC 中多为25–28%，透明细胞癌约38%。尽管如此，HER2 仍被视为具有临床潜力的治疗靶点。 在治疗方面已有多种HER2靶向策略进入子宫内膜癌研究，如曲妥珠单抗±帕妥珠单抗联合化疗正用于 HER2 阳性浆液性 EC 的 II/III 期研究（NCT05256225），T‑DM1 已在 HER2 扩增实体瘤中展现活性（NCT02675829），而T‑DXd（Enhertu）则在多癌种 HER2 表达肿瘤中显示显著疗效，Destiny‑Pan Tumor02 的 EC 亚组 ORR 达 57.5%，被认为是最具潜力的 HER2 阳性 EC ADC。与此同时，新一代 ADC 或双特异抗体如 DB‑1303、BDC‑1001、Zanidatamab 等也处于多项 I/II 期试验阶段。此外，小分子 HER2 TKI 方面，吡咯替尼在 HER2 激活突变或扩增实体瘤（包括 EC）中表现出一定活性，并有 IV 期真实世界研究正在中国开展。HER2 ADC 类药物（如 T‑DXd）在早期研究中表现出令人鼓舞的疗效，使 HER2 成为未来子宫内膜癌精准治疗的重要方向。 p53 p53/TP53wt 正作为子宫内膜癌中的新兴生物标志物受到关注，尤其在多项研究中显示其可作为筛选潜在获益人群的依据；其中选择性核输出抑制剂塞利尼索Selinexor 在TP53wt患者中展现出显著且持久的无进展生存改善(PFS 可达 27.4 个月），并已在多国开展多项 II/III 期试验以验证其在复发或晚期 EC 中的疗效；整体来看，TP53wt可能成为未来EC精准治疗的重要分层指标，而塞利尼索是当前开发最深入、最具潜力的相关靶向药物。 p53 异常（TP53mut / p53abn）作为子宫内膜癌中高危生物标志物受到广泛关注，与更高的复发风险和更差预后相关。p53的异常包括过表达、完全缺失、细胞浆染色或亚克隆混合模式中的任何一种。 Keynote B21里面关于p53异常表达的定义 目前多项研究正围绕该人群探索更精准的治疗策略，包括 PARP 抑制剂在 p53abn EC 中的潜在敏感性、Adavosertib（WEE1 抑制剂）在多研究中展现的活性，以及正在进行的多项小分子抑制剂与免疫治疗联合方案（如 PC14586 针对 p53 Y220C 突变的小分子再激活剂联合 PD‑1 抑制剂），同时也有围绕 p53abn 的前瞻性 III 期试验正在开展；总体来看，TP53 异常 EC 正成为重要的靶向研究方向，相关新药研发在 2026–2030 年将陆续读出关键结果，有望为该高危亚型带来更明确的精准治疗选择。 TROP2 TROP2 是一种在多种实体瘤中高表达的跨膜糖蛋白，在子宫内膜癌（EC）中也普遍上调，并与更差的预后相关，因此被视为潜在的重要新兴靶点。研究显示，在一项包含 114 例的子宫内膜癌组织分析中，约 84% 患者呈现中至强阳性 TROP2 表达。由于 TROP2 可通过 IHC 稳定检测，也便于未来作为 ADC 的伴随诊断。 当前临床开发主要集中在 TROP2‑靶向抗体偶联药物（ADC）：其中 sacituzumab govitecan（SG）作为抗‑TROP2‑SN‑38 的 ADC，已在多项实体瘤研究中显示显著疗效，并在 EC 的早期研究中观察到客观缓解；另一款新兴 ADC——MK‑2870（SKB264）由科伦药业/ MSD 开发，已进入多个实体瘤（包括 EC）的 I/II 期试验，探索其在难治人群中的疗效和安全性。总体来看，TROP2 具有明确的生物学基础和较高的表达率，但在子宫内膜癌中的临床数据仍处早期，需要更多试验来验证其真实治疗价值。 FRα FRα（叶酸受体 α）是一种在多种肿瘤中高表达的跨膜蛋白，在子宫内膜癌中表达率较高（约 41–85%），尤其在浆液性及高分级类型中更为常见，且其在正常组织中表达有限，使其成为理想的靶点，便于通过 IHC 进行检测； 目前FRα靶向药物主要以ADC为主，如索米妥昔单抗已在卵巢癌中获批并积累大量经验，而其他FRα ADC或新型平台如ELU001、STRO‑002及 AMT‑151等也正在包括 EC 在内的实体瘤中进行早期临床研究，但整体开发尚处于初期阶段，EC 中的证据有限，有待进一步验证其真实治疗价值。 PIK3CA PIK3CA 是PI3K/AKT通路的关键致癌基因，在子宫内膜癌中突变率较高(约 12–39%），并与肿瘤生长、代谢及耐药相关，是最具生物学合理性的靶点之一；其检测可通过PCR或NGS完成，且已有在乳腺癌中获批的伴随诊断可参考。围绕该通路的治疗开发多集中于PI3K抑制剂、AKT/EP4/ER通路联合策略等，但目前在EC中仍以早期临床研究为主，包括 PI3K 抑制剂（如可泮利塞Copanlisib、塞拉贝利Serabelisib）、AKT 抑制剂联合方案（如Ipatasertib + 内分泌治疗），以及更广泛的 PIK3CA/AKT/PTEN 靶向组合探索。总体来看，PIK3CA 作为 EC 中重要的分子标志物具有明确机制基础，但有效靶向方案尚需更多临床数据支持。 ARID1A ARID1A 是 SWI/SNF 染色质重塑复合物的重要组分，突变会导致染色质开放与 DNA 损伤修复受损，在子宫内膜癌中突变率约 33–40%，多见于子宫内膜样EC，是具有明确生物学机制基础的潜在新兴标志物；ARID1A 可通过 IHC、PCR 或 NGS检测，目前尚无直接靶向 ARID1A 的获批药物，但基于其“合成致死”机制，多个早期研究正在探索 ATR/CHK1 抑制剂、EZH2抑制剂及免疫治疗联合方案在ARID1A缺失肿瘤中的潜在获益。总体而言，ARID1A具备良好的生物学合理性，但在子宫内膜癌中的临床转化仍处初级阶段，真实疗效有待进一步验证。 ER/PR ER/PR是经典的激素受体标志物，在子宫内膜癌中具有重要的生物学与临床意义，其中约 57% 为 ER+ 和/或 PR+；其表达不仅反映肿瘤对雌激素/孕激素依赖的程度，也与肿瘤分型及预后密切相关，因此常用于指导内分泌治疗的选择。通过 IHC 可检测ER/PR，且相关靶向方案在乳腺癌等领域已广泛应用；在子宫内膜癌中，内分泌治疗及其联合方案（如 CDK4/6 抑制剂、PI3K/AKT 通路抑制剂等）正在进行多项临床研究，但整体而言，ESR1/PGR 的临床转化已有较成熟经验，可作为识别激素敏感EC患者群的重要标志物。 PTEN PTEN 是子宫内膜癌中最常见的突变基因之一，突变率约 45%，作为关键的肿瘤抑制基因，其缺失会激活AKT‑mTOR 通路并参与肿瘤发生，被认为是 EC 中较早出现的基因事件并与良好预后相关；目前可通过IHC等方法进行检测。尽管PTEN 具有明确的生物学意义，但目前尚无直接靶向PTEN的药物，相关治疗研究主要集中在 PI3K/AKT通路抑制剂或免疫治疗等间接策略的早期临床探索阶段。 KRAS KRAS 是调控 MAPK 及 PI3K/AKT 通路的关键癌基因，在子宫内膜癌中的突变率约 10–30%，多见于子宫内膜样EC，且常与激素受体阳性及较好预后相关；检测可通过 PCR/NGS 完成，且已有多癌种通用的CDx可支持 KRAS 突变识别。尽管 KRAS 突变的生物学基础清晰，但目前可靶向的药物仍主要集中在 KRAS G12C 突变上，相关治疗在 EC 中仍处早期探索阶段，包括司美替尼Selumetinib 这类 MAPK/MEK 通路抑制剂、G12C靶向小分子（如Sotorasib、GDC‑6036、RMC‑6291 等）以及新一代突变特异性抑制剂 LY‑3537982等。总体来看，KRAS是EC中具有明确生物学意义但临床可及性仍有限的标志物，其靶向治疗仍在不断发展。 CTNNB1 CTNNB1是编码β‑catenin的关键基因，参与Wnt信号通路调控，其突变在子宫内膜样 EC 中较为常见，整体发生率约 34%，尤其在NSMP亚型中占比更高，被认为与肿瘤发生早期事件及复发风险增加相关；检测方式以 NGS/IHC为主。尽管其生物学基础明确，但目前仍缺乏直接靶向CTNNB1 的药物，相关临床研究主要集中在间接通路干预，如 DKN‑01（DKK‑1 抑制剂）联合PD‑1抑制剂，以及依维莫司+来曲唑+瑞博西利Ribociclib 等针对 mTOR/CDK 通路的探索，整体仍处早期阶段，疗效价值需进一步验证。 DKK‑1 DKK‑1 是 Wnt 信号通路的关键负调控因子，在子宫内膜癌中常呈高表达并与肿瘤进展、免疫抑制微环境以及较差预后相关，因此被视为潜在的新兴生物标志物；其检测可通过 ELISA、RNAscope或NGS完成。当前开发主要集中在 DKK‑1靶向抗体DKN‑01，已在子宫内膜癌、卵巢癌等多种实体瘤中开展 II 期研究，探索其与化疗或免疫治疗的联合价值，但目前仍缺乏成熟靶向药物及大规模临床证据。总体而言，DKK‑1 具有明确的生物学基础，但在 EC 中的临床转化仍处早期阶段。 B7H4 B7H4 是一种免疫抑制型的 B7 家族检查点分子，在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胆道癌等多种肿瘤中过度表达，在胃癌和子宫内膜癌（EC）中与较差预后相关，其表达与 MMR 状态无关并多见于 NSMP（p53 野生型）EC；在 833 例 EC 样本中阳性率约 71.5%，主要通过 IHC 检测。目前多个早期临床项目正在围绕 B7H4 开发，包括单抗（FPA150）、双抗（GEN1047、PF‑07206347）以及 ADC（SGN‑B7H4V、XMT‑1660、AZD8205），共同构成了该靶点正在加速推进的多元化研发管线。 ALCAM ALCAM（CD166）是一种与细胞黏附、迁移和免疫调控相关的黏附分子，在多种实体瘤中过表达并与更强的侵袭性及转移风险相关；在子宫内膜癌（EC）中阳性率达 76.2%，可通过IHC或PCR检测。当前唯一进入临床开发的靶向药物是CytomX的Praluzatamab ravtansine（CX‑2009），基于 Probody技术平台，在 I/II 期研究中展现抗肿瘤活性，并在部分 EC 患者中出现应答，研究于 2020 年完成。该靶点竞争格局空白、潜在差异化机会较大，但目前在 EC 中尚未实现明确的靶点外推，且 EC 不是 CytomX 的核心开发领域，因此相关推进较为有限。 小结 总的来说，子宫内膜癌的精准诊疗正从传统病理走向分子分型时代。TCGA 奠定了“基因组分型”的科学基础，ProMisE 则将其转化为真正可在临床落地的流程。随着 POLE、MMR/MSI、p53 成为标准必检项目，越来越多新兴靶点（如 NTRK、HER2、TROP2、FRα、PIK3CA 等）也在快速推进，为患者带来更多个体化治疗机会。未来，分子分型不仅将决定预后，更会直接影响治疗路径。对每位 EC 患者来说，规范、完整的分子检测，就是迈向精准治疗的第一步。 格物致知13：MSI‑H/dMMR 是如何改变肿瘤治疗路径的？一文读懂免疫新格局 格物致知12：免疫治疗时代，PD-L1能否成为子宫内膜癌的关键标志物？ 格物致知11：帕博利珠单抗在子宫内膜癌免疫治疗中的疗效评估 格物致知（10）：TNBC治疗，我们能期待什么？

摘要：本文将偶联策略分为三类：非特异性、位点特异性但非选择性以及完全位点特异性和选择性方法。总结了三类偶联策略的特点、优缺点、CMC潜力以及每种偶联策略的临床状态。位点特异性和选择性方法将产生更均匀的ADC，这可能会影响ADC的稳定性和药代动力学（PK）特征，然后影响最终的治疗结果。此外，还探讨了开发新型偶联策略的挑战和未来方向。本文介绍了最流行的偶联技术，为研究人员选择偶联技术和推进ADC开发提供了宝贵的资源。    文章是由中国药明合联（WuXi XDC）发现与开发部于2025年3月发表在Antibody Therapeutics的一篇综述。    与传统化疗不同，ADC选择性地靶向肿瘤细胞，同时保留正常细胞，使其成为癌症治疗的理想选择。截至2025年初本文调研准备期间，市场上有15种ADC（与强效毒性有效载荷偶联），已获得美国食品药品监督管理局（FDA）以及中国国家药品管理局和日本药品和医疗器械管理局药品监管机构的批准（表1）。目前已有70多种ADC处于临床II/III期试验中，还有更多ADC处于I期试验中，预计会有更多的ADC实现商业化，在未来几年使癌症患者受益。表1：临床批准的与有效载荷偶联的ADC的基本信息     ADC设计中的多种因素会影响其成功，包括抗体、接头、有效载荷选择、药物附着位点和药物抗体比（DAR），所有这些都起着重要作用。药物附着到抗体上的方法至关重要；药物的连接位置和方式会影响ADC的稳定性、疗效和药代动力学（PK）。这个过程具有挑战性，因为偶联方法受到所涉及的生物大分子脆弱性的限制。此外，反应必须在水溶液（使用最少的有机溶剂）中进行，并在有限的pH值和温度范围内进行。    本文将ADC偶联技术分为三类。     第一类是随机偶联（例如随机赖氨酸）。     第二类是位点特异性的和非位点选择性的，因为这些位点受所使用的偶联技术的限制。该类别包括酶标签、聚糖重塑、亲和肽偶联和“随机”链间半胱氨酸偶联（例如DAR4），因为尽管DAR分布异质，但所有偶联位点都仅限于四个链间半胱氨酸对。     第三类是位点特异性和位点选择性的，修饰氨基酸序列，如工程半胱氨酸或ncAAs，提供各种结合位点（图1A）。关于CMC，随机偶联和链间半胱氨酸偶联通常更简单。位点特异性和位点选择性偶联技术提供了更好的均一性，但可能会遇到更多的CMC挑战，包括蛋白质表达问题（例如非天然氨基酸）、去除杂质所需的额外纯化步骤（例如酶）以及额外的分析和质量控制挑战（例如DAR分布）。第一类：随机偶联1.随机赖氨酸偶联     赖氨酸偶联是一种成熟的生产ADC的技术，利用赖氨酸残基上大约40个溶剂可及的NH2基团，这些残基在中性溶液中具有高亲核性。亲电试剂主要靶向这些氨基，允许接头有效载荷连接而不改变抗体本身。     迄今为止，已有5种市售ADC证明了基于赖氨酸的偶联的功效。在此基础上研发人员开发了一系列广泛的连接剂来改进这一过程，包括N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）及其类似物、苯甲酰氟、异硫氰酸酯和角氨酸酯。    由于这些接头与杂原子具有高度反应性，因此它们也可以在水中淬灭。事实上，NHS酯的水解是影响赖氨酸偶联中LP当量的关键因素之一。此外，反应性较低的接头可以在温和的条件下与半胱氨酸的-SH残基反应，此时与赖氨酸的反应很慢。例如，磺酰可用作半胱氨酸的连接物，而磺酰丙烯酸酯可以与两个半胱氨酸残基反应，起桥连接剂的作用。     赖氨酸偶联接头的高反应性最初导致它们被表征为随机修饰。然而，Liu等对同一ADC的不同批次进行的比较发现，在稳定的制造条件下，偶联位点的分布是一致的。因此，当前赖氨酸偶联ADC的制造工艺可靠且可重复，这是其商业可用性的基石。     然而，不同的条件会产生不同的结果，例如高度异质的DAR，这与快速清除和毒性有关。例如，具有异质性DAR的Mylotarg®因其毒性和安全问题（包括大量早期死亡）于2010年退出市场。在重新定义患者群体以及较低的推荐剂量和不同的时间表后，它于2017年重新获得批准。同时，Mylotarg®的退出对新型赖氨酸偶联ADC产生了深远影响。没有使用不稳定的腙连接子和高效的卡利霉素，而是配备了具有更高稳健性和毒性更小的美登新类似物有效载荷的连接子。设计的变化使Kadcyla®和Elahere®能够实现比Mylotarg更高的剂量和更好的治疗窗口。     对于反应性较低的接头，在温和的偶联条件下，赖氨酸偶联也可以产生均匀的结果，偶联位点是蛋白质表面反应性最强的赖氨酸残基。例如，β-内酰胺或甲基砜已被用于偶联疏水口袋中的K99位点，而五氟苯酚酯已被用于使用K-lock™技术选择性偶联κ轻链的K188位点。它成功地将ADC用于A166、ZV0203和AMT-151等临床试验。磷酸-曼尼希反应可以选择性地改变曲妥珠单抗Fab的K183位置。值得注意的是，赖氨酸上的-NH2基团反应性受蛋白质表面局部化学环境的影响，包括反离子和溶剂化等因素。     总体而言，赖氨酸偶联仍然是ADC生产的可靠方法，可产生化学稳定且可重现的产品。此外，位点特异性偶联技术的发展不断增强其实现更好均一性的潜力。第二类：位点特异性但非位点选择性偶联1.链间半胱氨酸偶联    通常，IgG1抗体在溶剂暴露区域包含四对链间二硫键。使用还原剂如三（2-羧乙基）膦（TCEP）和DL-二硫苏糖醇（DTT）等还原剂后可获得8个游离硫醇。硫醇作为亲核试剂，与赖氨酸残基处的SN2反应相比，更柔软且更容易接受Michael加成。这一特性允许马来酰亚胺及其类似物用作连接器，从而能够形成干净且近乎定量的巯基-琥珀酰亚胺。这种生物正交化学是抗体修饰的理想选择，可产生具有0、2、4、6和8有效载荷的变体。由于巯基较少，半胱氨酸介导的ADC异质性远小于基于赖氨酸的方法。在半胱氨酸偶联技术中，主要方法涉及随机DAR4偶联。而其他偶联技术（包括DAR8、WuXiDAR4和二硫键再桥接）则展示了位点特异性偶联能力。本综述根据它们在硫醇基团参与中的机制相似性，将上述所有技术归类为链间半胱氨酸偶联。与其他偶联方法相比，马来酰亚胺偶联物具有简单、条件可控和高产量等特点（图1A）。迄今为止，马来酰亚胺与还原的链间二硫键偶联仍然是ADC构建的主要方法。在15种具有强效毒性有效载荷的商业化ADC中，有10种和大多数处于临床阶段的ADC都使用了马来酰亚胺偶联技术（表1）。图1：位点特异性偶联技术和链间半胱氨酸偶联过程的方案。（A）位点特异性偶联技术图示，突出关键反应机制和偶联位点。（B）链间半胱氨酸偶联过程与（i）半胱氨酸偶联、（ii）WuXiDAR4和（iii）再桥接的不同策略的图示。由于范围限制，本综述未对所有可用的生物偶联化学试剂进行全面综述。相反，它旨在展示临床ADC管线中最普遍使用的偶联技术，或者那些在更广泛的治疗窗口或更简化的CMC工艺方面具有巨大潜力的技术。我们的目标是帮助新研究人员选择满足其要求的偶联技术。     马来酰亚胺-硫醇偶联物容易发生反向Michael加成反应，导致通过血清蛋白相互作用过早释放有效载荷。这种反向迈克尔加成反应会影响ADC在血浆中的稳定性，并降低其有效性和安全性。为了解决这个问题，科学家们探索了几种策略，包括通过引入其他基团（如N-芳基和邻位氨基）来催化马来酰亚胺的水解，或者用开环马来酰亚胺甲酯取代马来酰亚胺，以避免反向迈克尔加成反应。此外，KTHIOL™、P5™和溴乙酰胺己酰等新型接头已显示出增强的硫醇选择性和对retro-Michael加成反应的耐受性。    此外，尽管可以通过优化还原试剂的量来很好地控制ADC产品的平均DAR，但通过部分还原和偶联实现的ADC的DAR分布仍然是异质的。第一三共的研究人员发现，在4°C下偶联可将DAR4物种的丰度提高到约55%，其中接头-有效载荷主要在Fab区域偶联。为了提高ADC的均一性，减少DAR0和DAR8等有害物质的影响，这两种物质都会显著影响ADC的疗效、PK和毒性，药明合联开发了WuXiDAR4™偶联平台来解决这个问题。    WuXi DAR4™采用“铰链屏蔽”机制，其中Zn等金属离子2+在还原步骤中添加，与IgG1抗体重链之间的链间二硫键结合。这种选择性结合确保只有轻链和重链之间的二硫键被减少，允许接头-有效载荷在这些位置偶联，从而获得具有更高同质性的ADC（超过70%的DAR4物种）。通过额外的柱色谱富集步骤，可以将均一性提高到95%以上。WuXi DAR4™ADCs在细胞来源的异种移植物（CDX）模型中显示出更高的疗效，在小鼠急性毒性试验中显示出更高的耐受性，表明其治疗窗口更广。使用这种方法的7个ADC已进入临床阶段。该工艺在天然人IgG1上运行，可靠且具有成本效益，商品成本与传统随机偶联相当。（图1B）。    获得均相产物的另一种方法是利用二硫键再桥接技术，完全还原四对二硫键并与接头-有效载荷偶联。二硫键再桥接涉及使用双巯基反应接头同时与一对半胱氨酸结合。有效载荷可以通过重新桥接二硫键直接引入，也可以在引入高反应性触发器后通过生物正交反应连接。这种方法保持抗体的形态并控制反应位点，通过改变接头上的有效载荷量，产物的DAR可调节到大约4、8或16。    二硫键再桥接技术中最成熟的试剂是二砜化合物。2014年，来自Abzena的Godwin小组使用二砜试剂合成了DAR4%为78%的ADC，显示出良好的血清稳定性和抗肿瘤活性。OBIPharmaInc.开发的OBI-999采用类似的原理，目前正在台湾和美国进行II期临床试验，已获得FDA治疗胰腺癌的孤儿药地位。除了二砜连接子外，还开发了各种其他再桥接连接子，例如新的马来酰亚胺连接子、哒嗪二酮连接子、IDconnect™、C-Lock™和CysLink。值得注意的是，9MW2821已进入Mabwell的IDconnect™的3期临床试验，STI-6129已进入SorrentoTherapeutics开发的C-Lock™的1/2期临床试验。    然而，通过再桥接方法产生的ADC通常会导致两种异构体的混合物：“全抗体”和“半抗体”物种（图1第3节）。与母体抗体相比，“半抗体”物种的存在可能会影响ADC的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性二硫键再桥接技术不断发展，旨在解决“半抗体”异构体问题，提高血清稳定性，并增强这些ADC的安全性和有效性。Chudasama的小组通过将还原剂TCEP与吡哒嗪二酮接头相结合来修饰接头-有效载荷的结构。这种一锅法制备的ADC显著减少了半抗体的形成。然而，该试剂表现出与TCEP相同的不稳定特性，稳定性差，存在储存挑战。该研究小组随后优化了反应序列，首先添加接头-有效载荷，然后添加TCEP，同时降低偶联温度，从而提高了全抗体种类的产量。    关于DAR8技术，DS-8201是第一个也是最著名的ADC获得FDA批准，具有8个在链间半年半胱氨酸中偶联的接头有效载荷。然而，完全减少链间二硫键是否会影响抗体的完整性和稳定性仍然存在争议。辉瑞的研究表明，具有高DAR的ADC会对生物物理特性和热稳定性产生负面影响。相比之下，Seagen的研究结果表明，尽管DAR8ADC完全还原并与PEG12-gluc-MMAE连接，但仍能保持结构和稳定性。此外，Baker和Chudasama报道，曲妥珠单抗的二硫化物完全还原和加帽显著影响CD16a动力学，这与NK细胞反应性有关。因此，全面的结构评估对于评估对ADC及其亲本抗体的任何负面影响至关重要。近年来，研究人员专注于连接子优化，以降低疏水性和聚集倾向，从而最大限度地减少DAR8ADC中的潜在性能权衡。例如，Profound Bio和Multitude Therapeutics已经开发了一系列具有亲水接头的exatecan衍生物。它们各自的ADC候选药物Rinatabart Sesutecan和AMT253已经成功克服了exatecan过度疏水性的挑战和对DAR8ADC的潜在聚集风险。2.酶标签偶联      酶偶联涉及利用识别特定氨基酸序列的酶将有效载荷直接连接到抗体上。该技术在ADC中提供了高均匀性，展示了其作为有效耦合方法的潜力。许多酶需要抗体等底物的序列工程和结构适应。临床上使用的酶包括分选酶A（SrtA），这是一种30kDa的转肽酶，可裂解LPXTG序列形成硫酯酰基酶中间体，使肽-LPXT能够转移到底物的N端。值得注意的例子包括NBE-002（SMAC-Technology™），目前处于1/2期试验中。另一个例子是甲酰甘氨酸生成酶，它附着在CXPXR序列上，将半胱氨酸转化为甲酰甘氨酸，如TRPH-222（SMARtag™）所示，目前处于1期。法尼基转移酶通过在CaaX标签内的半胱氨酸残基上添加类异戊二烯基团来修饰抗体，FS-1502（ConjuAll™）目前处于第3阶段。临床前阶段的酶包括肽天冬酰胺连接酶、微管蛋白-酪氨酸连接酶、胰蛋白酶、磷酸腺苷转移酶、SpyLigase和O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（或SNAP标签）。一些酶，如微生物谷氨酰胺转移酶（mTG），靶向抗体上的天然位点，如Q295位点，催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺与有效载荷的游离胺基之间形成酰胺键，代表性分子DP303目前处于III期。酶偶联物分子的成功开发需要解决与偶联物产物的PK以及制备方面相关的问题。     随着酶偶联技术的发展，研究发现，在抗体上放置修饰标签会极大地影响偶联效率和整体产品性能。一些研究表明，与轻链上标记的抗体相比，重链标记的抗体显示出更高的滴度和偶联效率，而其他研究表明，轻链标记的抗体可能提供有效性优势。目前，将ADC生物物理特性与功能结果联系起来的综合数据有限，并且没有选择酶或最佳偶联位点的标准化指南。此外，虽然抗体修饰可以简化偶联过程，但引入异源肽可能会增加免疫原性风险。通过使用通过实践或计算获得的低免疫原性标签，或者采用无标签酶偶联技术，可以减轻这种风险。（选择作为抗体天然结构的表位，或不需要额外的标签）。     研究人员通过增强转基因酶的功能和改进偶联过程来提高反应效率、降低反应可逆性和降低材料成本，从而推进酶偶联应用。例如，野生型SrtA的催化效率和可逆反应较差，需要大量过量的亲核寡甘氨酸修饰底物才能有效形成ADC。为了解决这个问题，研究人员对SrtA进行了改性以提高其催化效果。此外，从一步偶联过渡到两步偶联提高了酶活性并最大限度地减少了反应可逆性。由于降低了成本和有毒废物的产生，这种方法也有望扩大规模，提供了一种精制酶偶联的新方法。     酶偶联工艺通常比传统技术更复杂，需要更广泛的材料和更复杂的步骤，这会显著影响生产成本和成功的可能性。成分的选择（包括酶、工程抗体和小分子有效载荷）必须从一开始就严格遵守医疗产品质量管理规范标准。     此外，与传统偶联相比，酶偶联引入了额外的成分，例如偶联酶、辅因子和表达相关杂质，所有这些都具有潜在的免疫原性。需要采取其他措施来消除最终产品中的催化酶和污染物，例如偶联酶、辅因子、宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白。例如，需要额外的多机制色谱柱纯化方法和更复杂、更灵敏的检测系统来控制上述杂质的残留。此外，需要经验丰富的研究人员来评估最简单的生产工艺，以降低CMC阶段的成本。     总体而言，酶偶联是一种强大的位点特异性技术，在临床前和临床阶段取得了许多成功。新一代酶偶联技术可以通过技术更新和优化的CMC工艺来提高产品的均一性。通过协同多维策略，我们可以系统性地降低免疫原性，同时提高产品同质性，确保ADC等生物制剂的安全性和有效性。这实现了工艺稳定性和治疗安全性的双重突破。3.聚糖重塑偶联     近十年来，糖偶联引起了学术界和工业界的极大兴趣。虽然大多数乙二醇偶联方法仍然依赖酶来促进偶联过程，但它们不需要氨基酸序列工程。早期技术涉及使用高碘酸钠（NaIO4）氧化聚糖上的顺式二醇，从而产生醛基用于后续修饰。最近的策略强调游离寡糖重塑，其中天然游离寡糖（附着在N297位点上）被修饰或被新的游离寡糖取代，然后可以与功能性接头或接头-药物复合物连接。例如，Synaffix的GlycoConnect™技术使用内切糖苷酶来修剪天然聚糖亚型，然后添加叠氮基修饰的半乳糖残基和半乳糖基转移酶。然后，这种修饰的游离寡糖通过具有兼容手柄的点击化学连接到有效载荷。当与HydraSpace接头偶联使用时，该方法已在ADC开发中得到广泛采用，六个活跃的临床阶段项目证明了这一点，包括3期的IBI-343和临床前阶段的更多项目。然而，这个过程至少涉及两种酶和三个偶联步骤，这可能会使开发复杂化，降低产量，并增加CMC成本。在过去的几年里，出现了一种基于endoS2（或其变体）的有前途的聚糖重塑技术。这种酶可以去糖基并转移糖基，从而能够在一个偶联步骤中将靶分子连接到N297位点。Huang的小组和GeneQuantum的团队在ADC偶联之前将聚糖底物预先连接到接头-有效载荷上，一步使用单一酶。Wang的团队采用双阶段反应过程，最初以酶促方式掺入叠氮基团，然后通过点击化学连接接头-有效载荷，从而减少酶的使用和反应时间。虽然尚未得到临床验证，但endoS2方法因其降低的CMC成本而具有吸引力。表2：详细介绍了聚糖重塑的各种方法     聚糖重塑技术在临床前研究中显示出有希望的结果。例如，Synaffix的Verkade等人报道，他们的ADC（Brentuximab，DAR2-MMAE）在单剂量为1mg/kg的Karpas-299CDX模型中实现了7/7的完全缓解，而Adcetris（Brentuximab，DAR4-MMAE）在相同剂量下无效。N297-聚糖修饰的优势是显而易见的;然而，要实现最佳疗效，需要选择正确的游离寡糖类型、接头和DAR组合。Huang小组发现，在CDX模型中，在DAR2处具有修剪游离寡糖的ADC优于在DAR4处具有完整游离寡糖的ADC。他们推测，与具有较大尺寸全糖基的ADC相比，修剪后的糖基ADC中的疏水有效载荷更好地容纳在Fc腔内，从而显示出更好的PK。然而，Wang的研究并未显示CDX模型中对修剪聚糖形式与完整聚糖形式的明显偏好。    聚糖对抗体Fc功能的影响引起了人们的担忧。一般来说，重塑不会显著影响新生儿Fc受体的亲和力，这对IgGPK至关重要。Huang的小组指出，Fcγ亲和力在具有完整聚糖的ADC中得保留，但在修剪的ADC中得以保留。虽然Fcγ对免疫刺激ADC很重要，但对于内化和溶酶体有效载荷释放后的经典ADC的看法不同。一些开发人员更喜欢维持IgG效应器功能，例如ADCC、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用，以提高疗效，而另一些开发人员则认为这些功能对肿瘤抑制的影响最小，并可能导致脱靶毒性，这使得有意减弱效应器功能成为一种常见的方法。    游离寡糖重塑的工艺开发复杂程度各不相同。Synaffix的GlycoConnect使用两种酶——内切糖苷酶和半乳糖基转移酶——涉及三个反应步骤，这会使开发复杂化、降低产量并增加CMC成本。或者，endoS2（或其变体）结合了去糖基化和糖基转移，从而简化了该过程。4.亲和肽偶联    亲和定向偶联使用接头或接头-有效载荷，其亲和肽来源于蛋白A或G的IgG结合位点。该肽选择性地结合Fc区的特定位点，使其更接近某些赖氨酸残基，并提高接头和-NH2基团之间的反应速度。为防止与其他反应性-NH2基团发生副反应，应使用温和的接头。    典型的偶联位点位于Fc区的K248/K288或K337残基附近;虽然亲和肽的序列修饰可以将偶联位点转移到Fab区域，但这通常会导致偶联效率降低。     一些开创性的方法包括将接头连接到具有稳定共价键的亲和肽上，然后与抗体共价连接形成ADC。然而，非天然大肽可能通过阻碍FcRn结合来干扰Fc功能，从而可能减少ADC内化。Ishii-Watabe等人指出，这种携带肽的连接子可能会增强ADCC，但未评估PK。     为了最大限度地减少抗体的结构变化，已经开发了各种无痕亲和定向方法。味之素的AJICAP™技术包括两代：第一代使用二硫键，允许还原剂裂解肽，而第二代使用硫酯，在偶联过程中可以直接被赖氨酸取代。Abtis的AbClick™缩短了亲和肽序列，并利用硫酯进行切割，用N-叔丁基马来酰亚胺捕获释放的巯基以提高效率，并留下降冰片烯基团进行偶联。此外，GlycanLink将连接器从K8重新定位到K10，为大体积有效载荷的直接偶联提供更多空间。还开发了替代的无痕方法。Bode等人使用酰基三氟硼酸盐作为接头，在亲和肽上使用光可切割接头后将其去除。Lee等人使用醛肟将接头引导至K248位点。第三类：位点特异性和位点选择性偶联1.工程半胱氨酸     由于其巯基的高反应性，半胱氨酸残基多年来一直是蛋白质和肽修饰的基石。Junutula等开创了在半胱氨酸取代原始氨基酸的位置特异性引入药物的策略，从而产生了称为ThioMAb的半胱氨酸工程抗体。     半胱氨酸工程并非普遍适用，因为某些位置会导致意外形成二硫键而导致的错误折叠。以前的研究表明，溶剂暴露量最小且局部带正电荷的位置（例如曲妥珠单抗中的LC-V205C）会阻止马来酰亚胺交换，并通过快速马来酰亚胺水解产生更稳定的ADC。研究人员观察到，偶联位点极大地影响了ADC的疏水特性;例如，HC-S239C偶联物表现出非常缓慢的马来酰亚胺水解和增强的稳定性。Siddharth等开发了一种基于机制的THIOMAB™药物偶联物（TDC）PK/PD模型，以帮助阐明载药、偶联位点和随后的解偶联对PK和疗效的影响。模型结果表明，药物解离率、总抗体清除率和肿瘤杀伤率随着DAR的增加而增加，并且重链（HC-A114C）比这些TDC上使用的轻链（LC-V205C）位点更容易发生药物解离，这与体外和临床前理解一致。基因泰克的Ohri等[93]使用高通量筛选进行了广泛的研究，以评估用半胱氨酸替换抗HER2抗体（曲妥珠单抗）的每个位置后，由648种不同ThioMab产生的ADC的稳定性。他们分别使用MC-VC-PAB-MMAE和PDS-MMAE鉴定了马来酰亚胺和二硫键偶联物的38个稳定版本（在ELISA中稳定性超过80%）。此外，他们发现位点特异性ADC的体外血浆稳定性与体内稳定性相关。在使用多种不同抗体和不同接头有效载荷形成的ADC中也观察到了这种现象。另一种策略是用丝氨酸部分取代铰链区的半胱氨酸，从而减少可用于偶联的反应性半胱氨酸残基。表3详细介绍了临床阶段ADC中使用的工程半胱氨酸位点。表3：临床阶段工程半胱氨酸偶联技术总结     位点特异性ADC通常比非位点特异性ADC具有更好的临床前特征;然而，关于其临床优势的数据有限。Alex等报道，DCDS0780A的最大给药剂量（DAR2）（一种TDC）为4.8mg/kg，这至少是具有相同接头-有效载荷的非位点特异性ADC（MC-VC-PAB-MMAE）剂量的两倍，例如polatuzum abvedotin（DAR4）。有效性相当，TDC的客观缓解率为59%，非位点特异性ADC的客观缓解率为56%。然而，在TDC中更频繁地观察到眼部毒性（通常导致治疗中断）。已在MMAE以外的有效载荷中观察到眼部不良事件（AE），并且通常与具有稳定接头的ADC相关。Joyce等在另一项针对MUC16的TDCDMUC4064A中报告了类似的观察结果。DMUC4064A（DAR2）的推荐2期剂量确定为5.2mg/kg，而非位点特异性ADCDMUC5754A（DAR4）推荐剂量为2.4mg/kg。在抗MUC16ADC研究中，77例患者中有7例（9%）报告了客观确认的反应，在抗MUC16TDC研究中，65例患者中有16例（25%）报告了客观确认的反应。导致剂量调整的最常见AE包括视力模糊和周围神经病变。本研究中观察到的眼毒性可能归因于抗微管蛋白作用，可能是由眼睛上皮中的MUC16表达介导的，主要通过润滑和保湿滴眼液来控制。     工程半胱氨酸通常通过还原、再氧化和偶联步骤制备。在再氧化过程中，铰链区的大多数半胱氨酸氧化形成二硫键，而工程半胱氨酸仍可用于偶联。此过程有助于避免潜在问题，例如单克隆抗体或片段畸形。     ByondisB.V.的Ruud及其同事推出了2-（二苯基膦基）苯磺酸，这是一种选择性还原剂，靶向工程半胱氨酸，同时保留链间二硫化物。辉瑞公司的Renée报道了一种创新的制造方法，该方法利用中国仓鼠卵巢细胞中的半胱氨酸代谢工程和新型半胱氨酸加帽技术。这种方法可产生高质量的ADC，其特征是DAR均相、完整的天然铰链二硫化物和更少的片段。这些特征可能对治疗效果产生有益影响。     此外，正在努力确定生产无加帽单克隆抗体的最佳位点，这些抗体在整个细胞培养和纯化过程中保持游离半年半胱氨酸。此类位点的例子包括LC-Q124C和LC-Q166C。2.非经典氨基酸     除了与天然残基偶联外，抗体还可以借助生物正交反应进行位点特异性修饰，例如酮缩合和菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应（SPAAC）等。T遗传密码扩展（GCE）技术使ncAA与生物正交残基的共翻译掺入特定位点的抗体中.这是通过使用宿主-正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA对在预突变的无义密码子（通常是TAG终止密码子）处将相关的ncAA掺入靶蛋白来实现的。     在开创性和开创性工作的基础上，安博生物通过其专有的EuCODE表达平台使用ncAApAcF成功制备了含酮抗体。用这种方法制备抗HER2和抗PSMA抗体。在酸性条件下，通过将相应的ADC与羟胺封端的连接子-有效载荷偶联来分别制备，得到DAR约为2的ADC。这些ADC在临床前研究和临床试验中都显示出有希望的结果。此外，研究发现，与类似的异质ADC相比，这些通过酮缩合产生的ADC表现出更好的PK、药效学和安全性。这些ADC易于执行的偶联过程无疑是有利的，并且这些ADC成功开发的可能性似乎高于其他ADC。然而，重要的是要认识到，这种类型的ADC研究相对不足，Veraxa和Brickbio（最近成立的ADC生物技术公司）应该加大精力对这项技术的研究。     尽管药物前景广阔，但基于GCE技术的抗体的低表达是一个主要缺点。全长ncAA修饰的抗体需要有效的终止密码子抑制才能有效地与内源性释放因子竞争。由于内在的转录终止机制和外源ncAA对的潜在低效率，终止密码子的通读效率通常远低于天然氨基酸的理论100%通读效率。     为了解决这个问题，MedImmune的科学家们对表达系统进行了广泛的优化。在细胞系构建和细胞培养工艺开发程序中进行了详细的优化。在最佳表达条件下，瞬时系统的滴度为>100mg/L，稳定表达的滴度为1.5~2.5g/L。利用其复杂的表达技术，成功表达了含叠氮化物和二烯的mAb，从而能够通过SPAAC或Diels-Alder反应进行高效的ADC制备，并在中性pH值下改善了动力学。     Sutro Biopharma通过其复杂的无细胞表达平台XpressCF+，为高效表达携带ncAA的mAb提供了另一种潜在的解决方案。由多达8种ncAA修饰的抗体（尽管是无糖基化形式）在数小时内表达高达g/L。虽然ncAA的通读效率仍然存在，但原核生物无细胞系统的应用大大降低了整体表达成本。这些具有不同有效载荷的ADC经过制备和测试，它们显示出卓越的治疗效果，值得在各个阶段的临床试验中进一步评估。总结：     由于偶联技术对ADC特性的广泛影响，确定特异性抗体/接头-有效载荷组合的最佳偶联位点和化学试剂仍然是一项重大挑战。这些影响包括结合、内化、有效载荷释放、PK、效应器功能等。尽管较新的偶联技术通常显示出更好的疗效和安全性，但临床前研究和临床研究之间的可转化性经常存在差距。本文通过表4总结比较了各种偶联技术的优缺点。表4：偶联技术优缺点总结     此外，新的偶联技术可能会在CMC工艺中存在意想不到的挑战。一些开发人员更偏向使用经过临床验证的偶联技术，尤其是当管线已存在与新靶标和/或有效载荷作用机制相关的风险时。     尽管ADC开发最近取得了进展，但该领域的许多问题仍未解决。随着对ADC复杂性的理解加深，以及从更多采用先进偶联方法的ADC中积累临床数据，预计会出现新的、更合适的偶联技术。这些进步将解决未满足的临床需求。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。