Adenocarcinoma of Lung

*仅供医学专业人士阅读参考我们知道，免疫疗法的出现改变了癌症的治疗格局，但是应答率低也是一直存在的问题。近年来，有研究发现，与60岁以下的人群相比，60岁以上的老年人接受免疫检查点抑制剂（ICB）治疗的效果更好。这不禁让科学家们好奇，为什么老年人会对免疫治疗更敏感呢？近期，上海交通大学医学院附属仁济医院陈豪燕/洪洁团队、香港大学黄永瀚团队，以及徐州医科大学张有为团队联合发表了一篇文章，试图解开这个疑惑。他们在对4464例癌症患者的临床数据进行分析后发现，老年癌症患者对ICB治疗更敏感的原因可能与自身独特的肠道菌群有关。最终，他们在老年患者中识别出了一种与改善ICB疗效有关的衰老富集肠型（E/AE）。通过小鼠粪菌移植实验证实，E/AE肠型中的菌群能够增强小鼠对抗PD-1抗体治疗的敏感性，并重塑了小鼠的肿瘤微环境。研究发表在Cell Host & Microbe上[1]。论文首页截图为了观察年龄与ICB治疗反应之间的关系，研究人员汇总了25项有关ICB治疗的研究，共收集了4464例癌症患者的临床数据。经过分析，研究人员在黑色素瘤和非小细胞肺癌患者中发现，ICB治疗应答率和获得持久临床获益（DCB）的患者比例会随着年龄的增长而增加。老年患者往往比年轻患者有着更好的DCB和更高的ICB应答率。而且，即便是经倾向评分匹配平衡了性别、ICB治疗策略和癌症类型等其他临床因素后，老年患者与年轻患者之间在ICB治疗应答率和DCB上仍存在显著差异（p<0.001）。纳入患者情况鉴于衰老过程会引起免疫系统的重大变化，研究人员想知道，随着年龄的增长，老年人对ICB治疗更敏感是否与年龄相关的免疫转变有关。于是，研究人员整合了187例对ICB治疗有反应的肿瘤患者单细胞测序数据，涵盖了多个癌种以及不同年龄段（35-73岁）的患者。结果发现，老年患者的T细胞呈现出了更高的耗竭状态以及更高的细胞毒性评分。且这一发现也在接受抗PD-1抗体的结直肠癌小鼠模型中得到了进一步验证。由于肠道微生物群在免疫调节和治疗中发挥了关键作用，于是研究人员猜想，老年患者对ICB治疗更敏感的原因可能与肠道微生物有关。为了验证这一猜想，研究人员对上述小鼠模型的粪便进行了宏基组测序，结果发现老年小鼠与年轻小鼠的肠道微生物组成存在很大差异。小鼠模型建立与菌群差异进一步，研究人员收集了807例接受ICB治疗的肿瘤患者的临床样本和粪便的宏基组数据，并着重先分析了其中25例免疫治疗应答不佳的黑色素瘤患者，这些患者先接受了有免疫应答患者的粪菌移植，然后再进行抗PD-1抗体治疗。根据年龄进行分组后，研究人员发现了一个有趣的现象，就是无论接受粪菌移植的患者年龄如何，只要是接受了来自老年捐献者粪菌的患者，均表现了更高的ICB治疗反应率。这也侧面印证了老年患者对ICB治疗更敏感与肠道菌群有关。接下来，利用剩下782例肿瘤患者的宏基因组数据，研究人员识别出了一种随年龄增加而逐渐富集的肠型，并将其称为衰老富集肠型（Enterotype/Aging-enriched, E/AE），且存在该肠型的患者普遍有对ICB治疗有着更好的反应。肠型鉴定随后，研究人员在种属水平上确定了与E/AE肠型相关的特定细菌种类。总体上，E/AE肠型以拟杆菌属、双歧杆菌属和粪肠球菌属为主要特征。利用从25名肺腺癌患者收集来的肿瘤组织和粪便样本，研究人员观察了存在E/AE肠型的癌症患者肿瘤微环境中T细胞的变化情况。研究人员发现，与其他肠型相比，存在E/AE肠型的患者肿瘤微环境中的T细胞确实呈现出更高的耗竭状态以及更高的细胞毒性评分。以上结果表明，肠道菌群会通过影响T细胞在肿瘤微环境中的功能状态，进一步影响患者对ICB治疗的反应。最后，通过小鼠粪菌移植实验，研究人员证实，一些在E/AE肠型中的富集的菌群（如Bilophila wadsworthia，Bacteroides ovatus，Bacaeroides uniformis, Adlercreutzia equolifaciens和Akkermanisia muciniphila）能够增强小鼠对抗PD-1抗体治疗的敏感性并重塑了小鼠肿瘤微环境（表现为T细胞毒性的增强和TCR克隆的扩增）。研究流程图总之，该研究发现，老年癌症患者体内存在的独特肠菌可以提高免疫治疗的疗效。这也为未来根据个体的肠道微生物组特征来定制免疫治疗策略提供了新的方向。参考文献：Zhu X, Huang X, Hu M, Sun R, Li J, Wang H, Pan X, Ma Y, Ning L, Tong T, Zhou Y, Ding J, Zhao Y, Xuan B, Fang JY, Hong J, Hon Wong JW, Zhang Y, Chen H. A specific enterotype derived from gut microbiome of older individuals enables favorable responses to immune checkpoint blockade therapy. Cell Host Microbe. 2024 Mar 18:S1931-3128(24)00075-1. 本文作者｜张金旭

作者｜小麦奥希替尼是目前全球临床上使用最广泛的EGFR靶向药，将中位无进展生存期延长至18.9个月，2023年创下57.99亿美元的销售额，然而奥希替尼也面临严峻的耐药问题。为了克服奥希替尼耐药性，一些新策略如EGFR的PROTACs、双抗以及ADC等纷纷涌现，给后奥希替尼时代带来了曙光。   01  EGFR抑制剂耐药性机制EGFR是一种受体酪氨酸激酶（RTK），由28个外显子和27个内含子组成，包括细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域三个组成部分。EGFR在人上皮细胞的信号转导途径中起关键作用，它的异常与很多疾病相关，如在非小细胞肺癌（NSCLC）中约35%的患者由EGFR基因突变引起。已经有很多EGFR靶向药获批上市，如1-3代EGFR小分子抑制剂和EGFR/Met双抗等。目前获批上市的EGFR小分子靶向药中奥希替尼是最畅销的药物，2023年全球销售额达到57.99亿美元，然而很多患者在使用奥希替尼之后会出现耐药问题，为了克服奥希替尼耐药问题，很多公司开发新的药物。奥希替尼继发耐药机制包括EGFR靶向和非EGFR脱靶性两种（图1）[1]。1)靶向耐药: 在仍依靠 EGFR通路的情况下，肿瘤细胞发生奥希替尼耐药，如T790M缺失、C797x突变、奥希替尼18号外显子L718Q/V位点突变和G724S突变等。2)非EGFR脱靶性耐药:肿瘤细胞通过其它途径绕过 EGFR通路，持续增殖，如CCNE1扩增、MET扩增、HER2扩增、AKT/PTEN/PIK3CA突变、致癌基因融合（FGFR3、RET、NTRK）等。 图1. EGFR抑制剂耐药机制  02  靶向EGFR的PROTACsPROTAC因其可以降解整个蛋白而不是仅仅抑制蛋白酶活性而备受关注，尤其是针对易突变蛋白，PROTAC有望克服其耐药问题。全球有多家企业布局EGFR PROTACs。● 海思科HSK40118：全球首款，进入临床海思科自主研发的口服EGFR-PROTAC HSK40118的临床试验申请于2023年3月15日获得NMPA批准，用于治疗不可手术的、携带EGFR突变的晚期NSCLC患者，成为全球首款进入临床的EGFR PROTAC药物。●  CFT8919：变构 BiDAC™ 降解剂，进入临床CFT8919是由C4 Therapeutics研发的具有口服生物利用度的变构 BiDAC™ 降解剂，对携带EGFR L858R 突变具有良好的活性和选择性，同时，CFT8919对像T790M或C797S突变的EGFR继发耐药突变有效。2023年5月30日，贝达与C4 Therapeutics达成合作协议，贝达向C4支付3500万美元，包括1000万美元的首付款和贝达投资(香港)有限公司将一次性认购C4T 2500万美元股权，取得在中国（包括香港、澳门和台湾地区）开发、制造和商业化CFT8919的权利，并可获得前述区域以外约定比例的销售提成[2]。2023年12月5日，CFT8919的临床试验申请已获得NMPA批准开展，拟用于携带EGFR突变的局晚期或晚期NSCLC患者。除此之外，临床前也有很多在研的EGFR PROTACs，如百济的EGFR CDAC，它对多种EGFR突变都有抑制活性，在奥希替尼敏感或耐药肿瘤中都有很好的抑瘤活性（图2）。 图2. 百济的EGFR CDAC活性  02  靶向EGFR的双特异性抗体除了C797S突变，还有其它因素导致奥希替尼耐药，如MET扩增等，因此EGFR/Met双抗有望解决奥希替尼耐药问题。● 强生埃万妥单抗:EGFR/c-Met，一线疗法获批埃万妥单抗是强生研发的首款获批上市的靶向EGFR ex20ins（EGFR 20号外显子突变）突变的EGFR/c-Met双抗药物，EGFR ex20ins是EGFR第三大突变类型，于2021年5月获FDA加速批准用于二线治疗EGFR ex20ins患者。强生对埃万妥单抗寄予厚望，一方面探索埃万妥单抗单药或联合治疗EGFR 突变NSCLC患者一线疗法，另一方面探索埃万妥单抗对奥希替尼耐药患者的疗效。2023年8月，强生向FDA递交了埃万妥单抗的补充生物制品许可申请(sBLA)，与化疗联用一线治疗携带EGFR外显子20插入突变的局部晚期或转移性NSCLC患者。2024年3月1日，强生宣布FDA已批准埃万妥单抗联合化疗一线治疗EGFR外显子20插入突变的局部晚期或转移性NSCLC患者。结合奥希替尼耐药机制，埃万妥单抗联合三代EGFR抑制剂拉泽替尼方案获得广泛关注。2023年9月，埃万妥单抗联合拉泽替尼和化疗治疗奥希替尼耐药的一项3期MARIPOSA-2试验取得积极结果：与化疗相比，埃万妥单抗加化疗以及埃万妥单抗加拉泽替尼加化疗的无进展生存期（PFS）显著延长，疾病进展或死亡的风险比（HR）分别为0.48和0.44，中位PFS分别为6.3个月和8.3个月，化疗组为4.2个月（图3）[3]。通过研究者评估得到一致的 PFS 结果，埃万妥单抗加化疗以及埃万妥单抗加拉泽替尼加化疗的疾病进展或死亡的HR分别为0.41和0.38，中位PFS分别为8.2个月和8.3个月，化疗组为4.2个月。 图3. MARIPOSA-2试验结果2023年10月26日，埃万妥单抗在国内的上市申请获药监局受理。● 百利天恒SI-B001：EGFR/HER3，Ⅲ期临床除了埃万妥单抗之外，临床上还有很多在研的靶向EGFR的双抗药物，如百利天恒的Izalontamab（SI-B001）等。SI-B001是由百利天恒基于自主建立的SEBA平台独立研发的靶向 EGFR/HER3 的双抗药物，已在多个 II 期临床试验中表现了具备突破性疗效的有效性和良好的耐受性。HER3属于受体酪氨酸激酶EGFR家族。据估计，在EGFR TKI治疗后，约 83% 的原发性NSCLC和 90% 的晚期EGFR突变肿瘤会表达HER3。靶向EGFR/HER3 的双抗有望解决解决奥希替尼耐药问题。2023年6月，百利天恒在药物临床试验登记与信息公示平台登记了SI-B001的第一项3期临床试验，旨在评估SI-B001联合多西他赛对比多西他赛二线治疗局部晚期或转移性无驱动基因变异的非小细胞肺腺癌和肺鳞癌患者的有效性和安全性。SI-B001在结肠癌SW48异种移植、头颈部鳞状细胞癌FaDu异种移植和食管癌KYSE-150异种移植中显示明显的抗肿瘤功效（图4）[4]。 图4. SI-B001的抗肿瘤功效SI-B001在EGFR/ALK野生型非小细胞肺癌的肺鳞癌后线（中位四线）的初步临床试验显示积极的疗效：疾病控制率（DCR）为 87.50%（7/8），其中部分缓解（PR）为12.50%（1/8）；非小细胞肺癌二线化疗药物多西他赛的历史数据，DCR为48.54%（50/103），其中PR为5.82%（6/103）[5]。  03  第一三共：HER3-Dxd已申报上市在NSCLC中，HER3表达与晚期疾病、转移时间缩短和生存率降低有关。HER3的高表达也与EGFR TKIs耐药有关，所以人们寄希望于HER3靶向药能解决奥希替尼耐药问题。目前尚无靶向HER3疗法被获批上市，HER3-DXd（Patritumab deruxtecan）是由第一三共原研的一款靶向HER3的ADC药物，是目前研发进展最快的HER3 ADC药物，通过半胱氨酸定点偶联连接方式将马来酰亚胺-GGFG接头连接HER3单抗patritumab和拓扑异构酶I抑制剂deruxtecan而得。HER3-DXd（Patritumab deruxtecan）于 2021 年 12 月获FDA授予突破性疗法认定（BTD），用于治疗在第三代EGFR TKI和含铂化疗期间或之后疾病进展的EGFR突变局部晚期或转移性NSCLC患者。此前，Patritumab Deruxtecan在一项旨在评估其在使用EGFR TKI治疗和含铂化疗疾病进展后的EGFR突变局部晚期或转移性NSCLC患者中安全性和有效性的全球、多中心、开放标签、双臂2期HETHENA-Lung01（NCT04619004）试验取得积极结果。研究结果显示：截至 2023 年 5 月 18 日，中位研究持续时间为 18.9 个月（范围为 14.9-27.5 个月）。BICR确认的ORR为29.8%（95%CI，23.9至36.2）;中位缓解持续时间为 6.4个月；中位无进展生存期为5.5个月；中位总生存期为 11.9 个月。既往接受过奥希替尼和铂类化疗（PBC）患者亚组具有相似的结果（图5）[6]。 图5. HETHENA-Lung01试验抗肿瘤活性对30 名来自疗效人群的脑部转移患者颅内反应分析（通过 CNS BICR），这些患者既往未接受过脑部放疗。在这些患者中，有7例发现了目标病灶；其余只有非靶病灶。CNS ORR（根据 CNS BICR）为 33.3%，有9个中枢神经系统 CR（其中8 例为仅具有非目标病灶的患者）和1例PR。这些反应基于单独的CT成像（5个 CR和1个PR）、单独的 MRI（2个CR）或CT成像和MRI确认（2个CR）。疾病稳定（包括非CR/非进展性疾病）的最佳CNS反应[PD]）PD的发生率为43.3%（13/30）和13.3%（4/30）（图6）。 图6 . Patritumab Deruxtecan对脑转移NSCLC患者疗效Patritumab Deruxtecan在已知和未知的EGFR TKI耐药机制谱中都产生了抗肿瘤活性（图7）[7]。57例中有23例（不包括T790M）已知EGFR相关耐药机制患者，这些患者确诊的ORR为35%（CR/PR，8；SD，7；PD，5；NE，3）。57 例中有13例具有EGFR非依赖性耐药机制的患者，确认的ORR为46%（CR/PR，6；SD，4；PD，2；NE，1）。57例中有21例具有其他/未知耐药机制的患者，确诊的 ORR为 38%（CR/PR，8 例；SD，8；PD，2；NE，3）。 图7. Patritumab Deruxtecan对EGFR TKI耐药患者疗效2023年10月20日，默沙东与第一三共就包括Patritumab deruxtecan在内的三款ADC药物达成了高达220亿美元的合作协议。基于2期HERTHENA-Lung01积极结果，2023年12月22日，第一三共和默沙东共同宣布patritumab deruxtecan的BLA获FDA受理并予以优先审评，用于治疗既往至少接受过两种系统治疗的EGFRm局部晚期或转移性NSCLC， PDUFA日期为2024年6月26日, patritumab deruxtecan成为首款申报上市的HER3 ADC。  写在最后  EGFR是一个易突变的蛋白，奥希替尼是目前全球最畅销的EGFR抑制剂，但长期使用容易产生耐药问题，后奥希替尼时代已悄然来临。针对奥希替尼耐药问题，各大药企各显神通，第四代EGFR抑制剂、EGFR的PROTACs、双抗、ADC等纷纷上桌，多项试验传来了好消息，相信不久的将来奥希替尼耐药问题必将被克服。参考文献1.Yufeng Li et.al, Toward the next generation EGFR inhibitors: an overview of osimertinib resistance mediated by EGFR mutations in non‑small cell lung cancer, Cell Communication and Signaling (2023) 21:712.强强联手｜贝达药业与美国C4 Therapeutics达成合作引进CFT8919项目3.Amivantamab plus chemotherapy with and without lazertinib in EGFRmutant advanced NSCLC after disease progression on osimertinib: primary results from the phase III MARIPOSA-2 study4.Anti-tumor efficacy of SI-B001, a novel EGFR×HER3 bispecific antibody, against EGFR-driven epithelial tumors alone or in combination with paclitaxel and carboplatin5.医药魔方：全球首款！百利天恒HER3/EGFR双抗启动III期临床6.Helena A. Yu, MD et.al, HERTHENA-Lung01, a Phase II Trial of Patritumab Deruxtecan (HER3-DXd) in Epidermal Growth Factor Receptor–Mutated Non–Small-Cell Lung Cancer After Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy and Platinum-Based Chemotherapy, J Clin Oncol 41:5363-53757.Pasi A. Jänne et.al, Efficacy and Safety of Patritumab Deruxtecan (HER3-DXd) in EGFR Inhibitor– Resistant, EGFR-Mutated Non–Small Cell Lung Cancer, Cancer Discov 2022;12:74–89共建Biomedical创新生态圈！如何加入BiG会员？

在过去的十年中，随着光学和蛋白质分析方法的提高，组织成像变得更加丰富多彩，这使得对组织样本中的蛋白标记物进行多重成像成为可能。多重成像技术使单细胞甚至是亚细胞同时分辨40-50 个标记物成为可能。本文总结了多重蛋白质成像方法在肿瘤生物学研究中的应用，并将这些方法与其他空间组学相结合对阐述肿瘤生物学的意义。01 为什么需要多重蛋白质成像肿瘤的持续生长、扩散和治疗反应不仅取决于恶性细胞的特性，还取决于它们与其他细胞的相互作用。免疫细胞、基质细胞、血液和淋巴内皮细胞及脂肪细胞都可能具有环境相关的、促进肿瘤生长功能或抑制肿瘤生长功能。肿瘤的许多特征很可能直接或间接受到肿瘤细胞与其微环境相互作用的影响。如果要充分了解肿瘤如何发展、扩散和死亡，以及如何更好的治疗，我们必须了解肿瘤细胞与其他细胞的多向相互作用。肿瘤细胞具有异质性和非静态性，即使在同一个患者或瘤种内也是如此。肿瘤细胞的异质性和可塑性可使肿瘤逃避免疫系统，扩散到其他组织或器官，并对治疗产生耐药性。在疾病进展的每一步，肿瘤细胞可视为具有“自主学习的系统”，通过直接接触或与可溶性因子的结合，与微环境中的其他细胞类型进行连续、相互的通讯来处理信息。这种信息交换，以及营养物质、代谢物的梯度，形成肿瘤细胞特有的群落和环境，促使肿瘤细胞发生免疫逃逸或肿瘤细胞迁移。因此，必须了解肿瘤细胞存在哪些异质表型，以及肿瘤细胞如何与其他细胞进行物质、能量交换以及能量串联，以便更深入了解疾病的病因、进展以及治疗对策。02 可测量的肿瘤特征多重蛋白质成像技术能够靶向多种标记物，分析亚细胞位置、细胞表型、细胞内的活性信号传导或其他过程（状态）、细胞与细胞之间的相互作用或与细胞外基质（ECM）或更大规模的空间组织结构。因此，可以使用多重蛋白质成像技术研究肿瘤特征（图1a）。图1 使用多重蛋白质成像技术研究的肿瘤特征。03 肿瘤中的细胞表型、状态和功能要系统理解肿瘤生态系统，第一步是识别存在的细胞表型。单细胞多重成像（图1b）具有此功能，单细胞多重成像可以区分几十个标记物（通常是10-50个）。如此大的标记组为充分表征细胞表型提供条件，因为人们通常希望同时定义细胞类型（例如 CD3+ T 细胞、CD68+ 巨噬细胞、CD31+ 内皮细胞和肿瘤细胞）、亚型（例如 CD4+或 CD8+ T 细胞或叉头盒蛋白 P3 (FOXP3)+ 调节性 T (Treg) 细胞），以及功能状态。图2来自组织的成像质量细胞计数数据的性质的示例图像。在临床研究中，细胞表型和状态可以根据研究者感兴趣的特性而进行样本之间的比较。例如，原发肿瘤和转移瘤、具有不同基因组图谱的样本或者根据病原体感染或免疫浸润状态（图2）。细胞表型和状态（或其他成像特征）也可以与肿瘤分级、临床亚型、治疗反应和患者预后等临床特征相关。例如，患者生存率与肺腺癌中的 B 细胞频率、胶质母细胞瘤中的内皮细胞频率呈正相关，在非小细胞肺癌中与溶酶体相关膜糖蛋白 (LAMP)+ 树突状细胞和 CD66B+ 中性粒细胞的组合呈正相关。在对充分表征的临床队列研究中，通过多重蛋白质图像分析（例如细胞表型、相互作用或空间模式）量化的肿瘤微环境（TME）特征可以与性别或年龄等人口特征建立关联，并与临床诸如肿瘤细胞亚型、治疗反应或总体生存率等特征进行关联分析。具体描述见图2。图3多重蛋白成像在临床样本检测中的应用04 肿瘤细胞的空间成像目前大多数研究肿瘤及其周围免疫细胞的技术，往往都无法保留细胞的原位空间分布信息。这些位置信息，包含肿瘤和免疫细胞相互作用的重要关系。而基于原位的成像检测手段，通常只能检测1-2个蛋白表达,很难完全系统地研究肿瘤组织中的多种蛋白。为了突破这一技术障碍，斯坦福大学Garry Nolan lab在2014年开发了多路复用离子束成像技术。简单来说，就是利用不同的同位素标记不同的抗体，然后通过离子束激发，产生的对应的离子信号，来获得多个蛋白在单细胞水平上的信息。举例：CELL上发表的一篇论文，研究者利用肿瘤细胞空间成像技术，同时检测了三阴乳腺癌的肿瘤和免疫细胞中具有代表性的36个蛋白，系统地描述了肿瘤细胞和不同种类的免疫细胞在空间分布上的特征。研究人员发现，不同的病人的免疫细胞浸润程度大不相同，并且浸润的免疫细胞种类也不尽相同（图3）。多重肿瘤空间成像分析方法（图4）可以根据同时分析的细胞类型的数量进行广泛分类。图4通过多路复用离子束成像技术鉴定的36中肿瘤和免疫细胞相关蛋白图5多重蛋白质成像数据的空间分析方法概述。如图4（a）所示，每个样本的顶部一行是一阶分析，确定单个细胞类型（浅蓝色）的空间分布（左）或感兴趣的空间结构（例如，肿瘤间质边界，右）。二阶分析，确定了两种确定的细胞类型（蓝色和橙色）的空间分布（图4（b）），以及定义两种或两种以上细胞类型的空间模式的高阶分析（图4（c-f））。05 多重蛋白质成像方法多重单细胞蛋白成像或图谱分析方法根据所使用的探针可分为四类（图5）。具体的，可以通过质谱、荧光或显色成像、寡核苷酸的荧光成像或测序进行分析。图6单细胞多重蛋白成像方法的原理1）质谱读数：MIBI和IMC依赖质谱检测与抗体耦合的金属同位素，通过离子束（MIBI）或耦合到电离等离子体源（IMC）的激光实现电离（图5a）。该技术可针对40-50 个标记物的抗体同时染色，也与 RNA 和 DNA 检测兼容。IMC已通过连续切片成像扩展到三维。2）荧光读数：多重荧光方法大致可分为两类。多光谱成像采用一种计算光谱分离的方法来分离重叠的荧光团发射光谱，并已实现了高达20倍的成像。PhenoImager HT和 Orion 都可用于多重免疫荧光检测（图 5b）。3）染色体读出：经典 IHC 是一种成熟的临床病理学技术，以迭代模式用于实现多重蛋白质成像（图5b)。每种抗体均通过基于辣根过氧化物酶 (HRP) 的色原沉积和成像进行检测，然后用有机溶剂脱色。在单玻片上的多重免疫组化连续染色 (MCSSS) 中，有效的染色和脱色需要封闭先前的表位以对抗不完全脱色。多重 IHC 已应用于患者临床样本的检测。4）基于寡核苷酸标记抗体的荧光或测序：通过序贯检测的多重成像也已通过 CODEX 中的寡核苷酸标记抗体实现（图 5c），其原理是DNA由于其组合聚合物的性质，为设计分子标签提供了一个理想的底物。设计一种可索引标记系统，通过逐步枚举过程迭代显示标记。抗体（或其他基于亲和的探针）用独特设计的寡核苷酸双链标记，带有50个悬垂物，可以实现迭代的逐步可视化。06 空间多组学空间多组学方法可以在其天然组织背景下以亚细胞分辨率研究不同的分子分析物，通常空间组学测量还辅以相同或相邻组织切片的组织学染色，如H&E染色，从而与形态学注释相结合。空间多组学的方法示意见图6。空间ATAC&RNA-seq 和空间CUT&Tag-RNA-seq分别描述了在同一组织冷冻切片上同时无偏分析染色质可及性或特定组蛋白修饰和基因表达的可能性；或者，基于显微镜的方法可以通过以高达亚细胞分辨率直接成像单细胞内的DNA位点、染色体和核结构以及转录物，实现基因组或表观基因组信息以及基因表达的空间分析；目前，允许对转录组和蛋白质组进行平行空间询问的方法仍然有限，通常基于两种模式的系列表征，大多只允许对有限数量的蛋白质进行共同表征，并且通常缺乏单细胞分辨率。图7 空间多组学方法07 总结像所有的方法一样，多重蛋白质成像方法也有其固有的局限性，如果这些实验方法产生的结果有意义，就必须考虑到目前多重蛋白成像的限制。在使用多重蛋白质成像方法之前，我们需要考虑对肿瘤标记物的选择、抗体的验证、细胞分割的范围、选择细胞表型的意义、识别与临床相关的空间特征等因素。如果同时需要包含标记细胞外和细胞内的生物标志物，甚至可以绘制整个信号通路之间的关系。由于缺乏对肿瘤组织进行单细胞和深层表型分析的可靠方法，还需要对此项技术进行更深入的研究与探讨，尤其是对于人类样本的分析。我们期待单细胞分辨、多重蛋白质和多模态成像综合应用，可以让我们更深入的了解肿瘤发生、发展的机制，为提供更多的潜在治疗方法提供有力参考。关注我，更多资讯早知道↓↓↓