SG-2000

药时代：拥抱创新！拥抱未来！作者｜文心小分子细胞毒素作为 ADC 的“弹头”，是其杀伤肿瘤细胞的关键组成部分。虽然有大量的来自于天然产物和化学合成的毒素存在，然而仅有少部分可以被用于 ADC 的细胞毒素使用。原因是 ADC 对毒素的要求较高，通常须同时满足几个要求：（1）细胞毒素的杀伤效力必须极高，往往需要有效浓度在皮摩尔级别或者纳摩尔级别。研究表明，ADC 在进入人体后由于抗体的肿瘤穿透力，抗原的表达数量，内化效率及连接子问题的影响最终到达每克肿瘤组织的剂量仅为0.0003%～0.08%。因此，需要在极低浓度下也能杀死肿瘤细胞的高效毒素；（2）细胞毒素的作用机制明确。目前，大多数 ADC 的设计策略是内化后释放毒素，因此毒素分子的靶点最好位于细胞内；（3）细胞毒素的分子量必须较小，从而减少免疫原性。此外，应有适当的水溶性便于与抗体在缓冲液中进行偶联反应。最后，考虑到ADC 在循环系统中的长半衰期，细胞毒素在血浆中应具有足够的稳定性。 早期ADC 主要采用常规化疗药物来作为细胞毒素，如甲氨蝶呤、多柔比星、长春花碱、紫杉烷及其衍生物等。然而这类 ADC 在临床中活性较低，并没有表现出预期的抗肿瘤效果而遭遇失败。如今，一些比传统化疗药物抑制活性高100～1000倍的毒素不断被发现，使 ADC 的治疗效果带来大幅度提升。目前，ADC 采用的细胞毒素按作用机制可分为两大类：即微管蛋白抑制剂和 DNA损伤剂。下面对其详细介绍。  01  微管蛋白抑制剂1.1 澳瑞他汀类化合物20 世纪 60 年代中期至 80 年代末，Pettit 教授研究小组从印度洋海兔（Dolabella auricularia）中分离出一系列抗肿瘤化合物家族，即海兔毒素 1～15。这其中，海兔毒素 10 是当时最有效的化合物，对人癌细胞系具有最高的抗增殖活性（见图）。通过深入研究发现，这些海兔毒素起效的作用机制是与微管蛋白牢固结合抑制微管的形成和聚合，同时阻碍微管蛋白依赖的三磷酸鸟苷水解，使细胞有丝分裂停滞最终导致细胞凋亡。20世纪90年代，对于海兔毒素10的多项临床试验开始展开。然而，在进展到Ⅱ期临床时，由于伴严重的副作用如中性粒细胞减少和40%患者发生中度周围神经病变，使其不得不退出临床研究。尽管如此，鉴于海兔毒素在临床前模型中的高效力及治疗指数，科学家们便将其作为先导化合物，开发出水溶性的海兔毒素类似物，即澳瑞他汀类毒素。 图注：澳瑞他汀类细胞毒素结构1.1.1 澳瑞他汀 PE澳瑞他汀 PE 是海兔毒素 10 的第一个合成类似物。其结构差异为去除了海兔毒素 10 分子中的噻唑环（见图）。澳瑞他汀 PE 也进入到Ⅱ期临床研究，但是在患有晚期非小细胞肺癌及转移性软组织肉瘤的受试者中未能确认有效，因此并没有后续的临床报道。1.1.2 新型澳瑞他汀衍生物，即MMAE和MMAF在进一步改善药物体内疗效过程中，开发出两种新型澳瑞他汀衍生物，即MMAE和MMAF（见图）。迄今为止，大多数含澳瑞他汀衍生物的 ADC均采用MMAE和MMAF作为细胞毒素。由于这两种衍生物C末端的结构差异，使其具有不同的理化性质。MMAF 与微管蛋白的高分辨率共晶体结构表明，MMAF C 末端羧基可以与微管蛋白的氨基酸形成更多氢键作用，因此对微管蛋白结合能力优于 MMAE。但是由羧基组成的 C 末端苯丙氨酸结构使 MMAF具有膜不通透性，因此对癌细胞的体外抑制活性比 MMAE弱 100倍左右。并且以MMAF 为毒素的 ADC 往往不能发挥出旁观者效应。MMAF 的N 端在与不可裂解型连接子相连后，所形成的连接子-毒素复合物往往与MMAF具有相近的细胞毒性，因此常作为不可裂解型ADC的毒素使用。另外，以MMAF 作为毒素的ADC 在具有多重耐药性（Multiple Drug Resistance，MDR）的细胞系中表现出抑制活性。这表明，与海兔毒素 10 和其他在C 端具有疏水基团的澳瑞他汀类衍生物不同的是，MMAF 不是 P-糖蛋白的底物，使细胞外排泵的敏感性降低。因此，对于靶向已知具有MDR表型的肿瘤，以MMAF为毒素的ADC 可能具有特殊的应用价值。 目前，使用澳瑞他汀类毒素最具代表性的 ADC 为已上市的 Brentuximab Vedotin（商品名，Adcetris），同时有超过一半的临床在研 ADC 使用该类毒素。一些有潜力的ADC 正处于临床试验阶段，包括 Enfortumab Vedotin（EV-201），Tisotumab Vedotin（GEN701），Ladiratuzumab Vedotin（SGN-LIV1A），Denintuzumab Mafodotin（SGN-CD19A），  Polatuzumab Vedotin（DCDS4501A，RG7596），Glembatumumab Vedotin（CDX-011），Depatuxizumab Mafodotin（ABT-414），抗-PSMA ADC 和AGS-16C3F 等。1.2 美登素类化合物美登素是1972 年由Kupchan和他的同事从埃塞俄比亚灌木 Maytenus ovatus树皮中分离出来的一种十九元大环内酰胺结构（见图）。在结构上与格尔德霉素、利福霉素和枝三烯菌素一类细胞毒素相似。美登素可在亚纳摩尔浓度水平下对大多数癌细胞系产生明显的抗增殖效果，ED50值在 10-5～10-4 μg·mL-1之间，抑制活性比阿霉素等化疗药物高 1000 倍左右。这使美登素成为十分有潜力的临床候选药物，并被尝试用于多项与癌症治疗相关的临床试验。然而不幸的是，由于缺乏特异性，美登素使患者产生多种副作用，如恶心，呕吐，腹泻及神经毒性等。高毒性造成的低治疗指数使其在可耐受剂量下并没有显示出明显的治疗效果，最终不得不退出临床试验。直至 20世纪80年代初 ADC 的概念出现后，鉴于美登素对肿瘤细胞的高毒性完全符合作为 ADC 毒素的条件，因此被再次加入到开发和研究的过程中。 图注：美登素类细胞毒素结构由于美登素不具有与抗体偶联的官能团，因此需进行一些结构修饰便于与抗体连接。对美登素的构效关系研究表明，美登素 C-9 位的羟基和酰胺、C-11 和C-13位的双键均为活性所必需的官能团，不能进行结构改造。同时，环氧部分的消失也会导致其活性降低。因此，只能通过对 C-3位酯侧链进行修饰来产生多种美登素类衍生物。DM1和DM4是美登素 C-3位被改造的硫代衍生物，是当前ADC 常用的美登素类小分子细胞毒素（见图）。美登素及其衍生物均为强力的微管组装抑制剂，产生细胞毒性的作用机制与长春碱相似，通过与长春花生物碱或相近的微管蛋白结合位点结合，引起细胞在 G2/M 期生长阻滞，最终诱导细胞凋亡。目前 FDA批准的Trastuzumab Emtansine（商品名，Kadcyla）细胞毒素就是DM1，现已成为美登素类ADC的引领者，为开发出更多针对不同适应症的新美登素类ADC奠定了基础。同时，一些相关的ADC也正处于临床研究阶段，例如用于治疗FOLR1+卵巢癌的Mirvetuximab Soravtansine（IMGN853）等。  02  DNA损伤剂2.1喜树碱类化合物喜树碱是从我国特有的珙桐科植物喜树中分离得到的一种五环结构的植物生物碱（见图）。喜树碱及其衍生物能够选择性地作用于 DNA 拓扑异构酶Ⅰ（Topoisomerase Ⅰ，Topo Ⅰ），通过稳定 DNA-Topo Ⅰ 形成的复合物使断裂的DNA链不能重新接合，阻滞 DNA的复制和转录，最终导致肿瘤细胞凋亡。然而，由于喜树碱较差的水溶性及内酯环容易开环等缺点，降低了该药在体内的生物利用度，限制了其临床应用。 图注：喜树碱类细胞毒素结构为了使喜树碱水溶性得到改善，开发了带有哌嗪环前药的水溶性喜树碱衍生物 — 伊立替康（见图）。该药在体内可以以两种形式存在，一种为闭环的内酯形式，另一种为开环的羧酸盐形式。目前被批准用于治疗大多数转移性大肠癌，但对肺癌、胰腺癌、乳腺癌等也具有一定疗效。 SN-38是伊立替康代谢产物，也是其主要的抗肿瘤成分，抑制活性比伊立替康强2到3个数量级。但由于其较差的溶解度和毒性问题，使其只能以前药的形式给药。SN-38 C-20位的羟基具有降低内酯环体内降解速率的作用，同时还可以与连接子相连用于 ADC的开发（见图）。Labetuzumab Govitecan（IMMU-130）、Sacituzumab Govitecan-hziy（IMMU-132）均为以 SN-38 为毒素的极具治疗潜力的ADC。这两个 ADC 具有相同的连接子和毒素，唯一的差别在于所使用的抗体不同，因此被用于不同的适应症。IMMU-130 所选择的抗体为人源化抗CEACAM5 抗体，hMN-14。目前正在进行 II 期临床研究用于治疗复发或难治型结直肠癌。IMMU-132 所使用的抗体为靶向 Trop-2 抗原的人源化抗体 hRS7，可用于转移性三阴乳腺癌的治疗。该药在II期临床试验中的总缓解率可达34%，其中有3%的患者完全缓解（Complete Response，CR）。达到客观缓解（Objective Response，OR）且病情稳定超过 6 个月的临床获益率为 45%。患者中位缓解时间、中位无进展生存期以及中位总生存期（Overall Survival，OS）基于统计计算后所获得的结果分别显示为 7.6 个月、5.5 个月和 12.7 个月。2023 年 2 月 3 日，美国食品药品监督管理局（FDA）批准戈沙妥珠单抗（SG，Sacituzumab Govitecan）用于既往接受过内分泌治疗且 ≥2 线系统治疗（针对转移性疾病）的激素受体（HR）阳性、人表皮生长因子受体 2（HER2）阴性（IHC 0、1+或 2+/ISH -）的不可切除的局部晚期或转移性乳腺癌患者。2.2 卡奇霉素类化合物卡奇霉素类是 20 世纪 80 年代美国 Lederle 实验室的科学家从稀有放线茵小单孢菌中得到的发酵产物，是一类作用于 DNA的强效抗肿瘤抗生素。经鉴定属于典型的烯二炔类化合物，其结构及立体化学构造较为复杂，由含双环[7,3,1] 十三碳-9-烯-2,6-二炔母核、不稳定的甲基三硫基及芳基四糖链组成（见图）。芳基四糖尾部结构域使卡奇霉素成为一种高度位点特异性的 DNA 裂解剂，其可优先嵌入到 DNA 双螺旋小沟的 TCCT-AGGA 位点上，随后，烯二炔结构通过Bergman 反应成环芳构化，产生活性的苯基双自由基，从 DNA 脱氧核糖骨架的相反链上夺取H 原子，导致 DNA链断裂。除 TCCT 位点外，其它位点如 TTTT，GCCT，TCTC，TCCC，TCCC 等也可以以相同的方式裂解。 图注：卡奇霉素类细胞毒素的结构卡奇霉素 γ1I是目前研究最广泛的一类卡奇霉素，与其它从发酵液中分离出来的 6 个类似物（α2I，α3I，β1I，β1Br，γ1Br，δ1I）相比细胞毒性最强，在 0.15 μg·kg-1剂量下即可对多种肿瘤细胞起到杀伤效果。虽然具有积极的初期实验结果，但是在后续临床肿瘤学模型的评价中发现其治疗窗狭窄，导致无法在临床中应用。然而，由于卡奇霉素较强的细胞毒性，使其在新兴的 ADC 领域成为一种极具潜力的细胞毒素。 在早期的 ADC 研究中，Lederle 实验室的科学家在卡奇霉素 γ1I的乙氨基糖结构上进行了乙酰化，同时为实现与酰胺型或腙键型连接子连接，将其三硫键结构改造成二硫键，设计出一种卡奇霉素 γ1I的衍生物，即N-乙酰-γ1I卡奇霉素（见图）。通过研究发现该衍生物的 ADC 与卡奇霉素 γ1I的 ADC 相比具有明显的治疗优势，因此被广泛作为 ADC 的经典毒素使用。目前 FDA 批准上市的Gemtuzumab Ozogamicin（商品名Mylotarg）和Inotuzumab Ozogamicin（商品名Besponsa）使用的毒素均为N-乙酰-γ1I卡奇霉素。2.3 安曲霉素类衍生物-PBD19 世纪 60 年代，Leimgruber 等人从链霉菌属 Streptomyces refuineus 中提取分离得到一种抗肿瘤抗生素安曲霉素，随后越来越多具有相同功能的结构类似物吡咯并苯并二氮杂䓬（Pyrrolobenzodiazepine，PBD）家族分子从链霉菌属和微球菌属中提取出来，例如tomaymycin, DC-81, sibiromycin和neothramycins等。这些类似物具有相同的结构骨架，均是由芳环、二氮杂䓬环和吡咯环合并组成（见图）。该结构骨架可与 DNA小沟嵌合，通过二氮杂䓬环内 N-10/C-11 位亲电性亚胺基团与DNA小沟鸟嘌呤C-2位氨基形成共价键，固定DNA的螺旋结构，阻断细胞分裂过程，进而起到杀死肿瘤细胞的作用。 图注：安曲霉素类细胞毒素的结构随着对PBD 类似物构效关系的阐明，科学家们发现 PBD通过 C-8位彼此相连所组成的 PBD 二聚体形式，如 DSB-120 和 SJG-136，与 DNA 的作用面积更大，可与鸟嘌呤形成两个共价键将 DNA 固定的更加牢固（见图）。这使得PDB 二聚体形式的毒素拥有更强的细胞毒性，对多种肿瘤细胞的有效抑制浓度可达皮摩尔级别。同时，对一些具有 MDR 特性的肿瘤细胞也有杀伤效果。自2013年以来，鉴于高效作用于 DNA的特性，PBD逐渐被用作新型ADC 的弹头分子，使其成为地位仅次于澳瑞他汀类毒素和美登素后的第三个新兴毒素。目前已有10多个相关 ADC 进入临床研究。总结：现阶段，ADC 细胞毒素依然面临着种类少且作用机制单一的问题。同时有研究表明，被大多数 ADC 使用的微管蛋白抑制剂类细胞毒素 MMAE，DM1等，通常只对处于分裂期的肿瘤细胞起作用，而对静息期的肿瘤细胞则没有明显的杀伤作用，这可导致药物的治疗效果降低以及产生肿瘤耐药等问题。因此，发展具有新作用机制的细胞毒素是迫切需要的。相信通过科学家们的不断努力，未来的小分子细胞毒素会朝着更加多样化的方向发展，从而为 ADC 提供越来越多强力有效的“弹头”分子。  03  毒素全景布局图通过对已上市以及在研活跃超过500余种ADC药物管线的深度分析，现整理出毒素的全景布局图。目前已公布毒素种类超过130余种。表一：各个临床阶段毒素种类与管线数量 来源：2022.2《ADC药物毒素和连接子的全景布局图》表二：临床前阶段毒素种类与管线数量 来源：2022.2《ADC药物毒素和连接子的全景布局图》表三：ADC药物处在不同临床阶段中的毒素情况分析 来源：2022.2《ADC药物毒素和连接子的全景布局图》表四：ADC药物领域中TOP20毒素竞争格局和数量来源：2022.2《ADC药物毒素和连接子的全景布局图》  04  常见毒素的IC50要想解决ADC疗效不够的问题，通过注入更高剂量的药物显然是不可取的，使用毒性更强的Payload这条路尚且值得一试。随着更多高效的毒素出现，ADC也开始升级换代，依靠着毒性更强的毒素，ADC的疗效也有了显著提升。第二代Payload主要是微管蛋白抑制剂，微管蛋白抑制剂能够干扰有丝分裂，肿瘤细胞分裂速度比大多数正常细胞更快，也使得微管蛋白抑制剂药物对癌细胞杀伤更为有效。微管蛋白抑制剂可以分为两种，一种可促进微管蛋白聚合，使微管生长不受调控，如海兔毒素类衍生物MMAE、MMAF；另一种能有效抑制微管组装，诱导细胞的有丝分裂停止，如美登素类衍生物DM1、DM4。微管蛋白抑制剂是目前使用最为成熟的Payload，相比传统的化疗药物的毒性强了许多，但也存在一些问题，比如微管蛋白抑制剂只能杀死处于细胞分裂期的肿瘤细胞，而对非分裂和静态细胞的癌细胞无效，也较易产生耐药性。相比之下，能作用于整个细胞周期的DNA抑制剂，不仅对非分裂期的癌细胞有杀伤作用，还能杀伤对经典微管蛋白抑制剂耐药的癌细胞。作为第三代Payload的DNA抑制剂可通过双链断链、烷基化、嵌合、交联、抑制拓扑异构酶I（TOPO1）等方式破坏DNA结构与功能，促进癌细胞的死亡。与微管抑制剂中观察到的纳摩尔IC50（半数最大抑制浓度）范围相比，DNA损伤剂的IC50值能够达到皮摩尔水平，因此与DNA损伤剂结合的ADC有时更有效，并且可能独立于细胞周期（与主要作用于有丝分裂期的微管蛋白抑制剂相比），它们甚至可能用于那些抗原表达低的细胞。常见毒素的IC50见下表。表五: 常见毒素种类的IC50范围值来源：2018, The Latest Research and Development into the Antibody–Drug Conjugate, [fam-] Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201a), for HER2 Cancer Therapy表六：具体毒素分子的活性（IC50）来源：2022, Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy资料来源：[1] 2022, Zhiwen Fu, Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy[2] 2018,Takashi Nakada, The Latest Research and Development into the Antibody–Drug Conjugate, [fam-] Trastuzumab Deruxtecan (DS-8201a), for HER2 Cancer Therapy[3] 2022, 郭祖浩、王思涵, ADC药物开发之Payload梳理[4] 2023,刘文超; 李鸿峰; 胡朝红, 抗体偶联药物的技术现状和展望[5]2022, 凯莱英药闻, ADC药物毒素和连接子的全景布局图封面图来源：123rf精彩推荐乘风破浪，聚力同行！——「博腾药物开发者论坛」成功举办！GLP-1赛道爆火！2023年都发生了哪些大事？面临的挑战有哪些？OCA跌倒后，这个靶点有望诞生首个NASH新药，其火热程度值得中国BD密切关注！端午节，FDA一批一拒！首款DMD基因疗法诞生，定价320万美元；Intercept奥贝胆酸被拒，出局首款NASH新药竞赛点击阅读原文，与药时代一起快乐学习！