Mibefradil Hydrochloride

7000亿美元并购市场的隐形防线：一份来自Takeda专家的PV尽职调查实操手册与红旗清单。 医药行业的并购与许可交易（In-licensing/Acquisition）持续活跃，2023年相关投资额高达7000亿美元。在这些高风险的商业活动中，标的资产是否“安全”，直接决定了交易的成败及未来的商业价值。 然而，行业内长期缺乏一套标准化的框架来指导药物警戒（PV）团队如何参与尽职调查（Due Diligence, DD）。近期发表在 Drug Safety 上的一篇重磅文章填补了这一空白。来自Global MNC的专家基于丰富的实战经验，提出了一套PV尽职调查的“实操手册”和风险评估体系。 这是一份让PV从“后台合规”走向“前台决策”的指南。PV尽职调查的三大核心领域 PV在尽职调查中的工作远不止于查看不良事件列表，应当聚焦于以下三个核心维度： 1. PV合规与体系稳健性评估这主要针对被收购公司或合作伙伴的体系现状。考察点包括PV体系是否符合FDA、EMA及ICH等法规要求，是否有经过验证的安全数据库，以及SOP是否完善。特别需要留意过往的监管检查结果，例如FDA的483表格或MHRA的严重违规报告，这些往往是体系脆弱性的直接证据。 2. 产品的安全性特征与风险全景这是技术评估的核心。PV专家需要整合非临床、临床及上市后的所有数据，构建完整的安全性叙事。目的是识别可能阻碍审批或上市的风险，如非临床毒性发现、临床药理学缺陷（如缺乏预测性的人体PK模型），以及难以管理的上市后事件（如进行性多灶性白质脑病PML集群）。 3. 获益-风险评估与缓解计划基于上述发现，对资产进行定性和定量的风险评估。关键在于判断现有的安全性问题是否可以通过额外的研究、标签策略（Labeling）或风险管理计划（RMP/REMS）来缓解，以及这些措施对商业价值的潜在影响。警惕！尽职调查中的“红旗”信号 文中列举了药物开发不同阶段可能出现的典型安全隐患，这些都是PV专家在DD过程中需要敏锐捕捉的“红旗”。 非临床阶段的陷阱： • 结构警示： 分子中存在芳香胺、硝基等基团可能预示遗传毒性或致癌风险。 • 靶点选择性缺失： 如果药物在心脏、脑或肺等关键器官有非预期的受体结合，可能埋下安全隐患。例如，西地那非（Viagra）因对视网膜PDE6的非选择性抑制导致视觉异常；雷帕库铵（Raplon）因脱靶激活肺部M2受体导致支气管痉挛而退市。 • 动物模型的局限性： 动物模型对人类安全性的预测能力有限。数据显示，致癌性研究的预测价值仅约为18%。依赖高剂量动物数据可能会产生虚假的安全感。 临床药理与DDI风险： • 药物相互作用（DDI）： 缺乏全面的DDI评估是重大隐患，特别是对于治疗窗狭窄的药物。米贝地尔（Posicor）因强效抑制CYP3A4和CYP2D6导致严重相互作用而退市就是前车之鉴。 • 代谢物风险： 若代谢物占总暴露量超过10%却未被定性，可能导致监管机构拒绝批准（如Ozanimod的早期监管挫折）。 临床试验阶段的信号： • 心肝毒性： 这是导致药物退市最常见的两个原因。例如符合“海氏法则（Hy’s Law）”的肝损伤病例，或QT间期延长引发的尖端扭转室速（TdP）风险。 • 免疫相关反应： 对于生物制剂，输注反应和过敏反应是审查重点。Peginesatide因上市后迅速出现严重过敏反应而退市。 • 遗传相关不良反应： 如卡马西平与HLA-B*1502等位基因相关的严重皮肤反应。虽然可以通过基因筛查缓解风险，但这会显著改变产品的目标人群和市场准入策略。实用的工具箱：Playbook与检查清单 文章最有价值的部分在于作者提供了一套结构化的工具（见原文补充材料），帮助PV团队将碎片化的评估转化为可重复的科学流程。1. PV DD Playbook（实操剧本） Playbook将尽职调查分为四个阶段，不仅明确了PV的职责，还强调了跨部门协作的重要性： • 准备阶段： 尽早指派PV代表加入DD团队，参与Kick-off会议，并利用检查清单向对方索取关键文件。 • 初步评估： 审查Data Room中的现有资料，并进行外部调研补充信息。此时需参与关于目标产品概况（TPP）和成功概率（POS）的战略讨论。 • 详细合规与功能审查： 对监管合规性、数据管理、信号检测方法、沟通渠道及文档记录进行深度审查。 • 审查与持续改进： 整合反馈，确保持续优化评估流程。2. 风险分级检查清单（Checklist） 这是一个带有“红黄绿”风险编码的评估工具，覆盖了从研究方案、PSUR/PADER报告、信号检测SOP到监管互动记录的全方位内容。 • 🔴 红色（高危）： 可能导致重大患者伤害、监管拒绝或市场退出的关键缺陷。例如：确认的Hy’s Law病例、数据造假、缺失必要的上市后管控（REMS）、缺乏验证的PV数据库或严重的监管违规（如FDA 483未解决项）。 • 🟡 黄色（中危）： 可能延迟审批或限制标签范围的问题。例如：早期临床数据的QT延长趋势、未充分说明的人体相关性的动物致癌性发现、待解决的监管查询或过时的PV协议。 • 🟢 绿色（低危）： 可控或预期的安全问题。例如：轻微且可逆的肝酶升高、已知的类效应警告（如单抗的输注反应）、或是标准化的上市后监测计划。总结 1. PV职能的战略前移：传统的PV工作往往集中在临床运营支持或上市后监测。但这篇文献表明，PV的专业能力在资产引入阶段（Deal-making）具有不可替代的商业价值。通过早期识别“红旗”，PV能直接帮助公司避免数十亿美元的错误投资，或者在谈判中争取更有利的条款。 2. 跨学科整合能力：尽职调查要求PV人员跳出单一的“个例处理”思维，需要与毒理学、临床药理、CMC及注册部门深度协作。例如，不了解动物毒理数据，就无法准确预判首次人体试验的起始剂量风险；不了解杂质谱，就难以解释临床试验中的某些异常信号。 3. 监管环境的敏感度：FDA与EMA在获益-风险评估上的不一致日益明显。PV专家在DD中需要具备全球视野，预判同一套安全性数据在不同监管体系下可能面临的差异化挑战。给PV人与PV Team的Takeaways For PV Professionals (个人): • 拓宽知识边界：不要局限于ICSR处理。尝试去理解非临床毒理学报告、药代动力学（PK）数据以及CMC质量属性。当你能看懂动物致癌性数据或DDI预测模型时，你在项目组中的话语权将截然不同。 • 培养商业思维：在评估风险时，多想一步,这个风险是否会导致黑框警告？是否需要REMS？这些管控措施会如何影响患者的使用意愿和产品的市场潜力？ For PV Teams (团队): • 建立DD标准作业程序：可以参考文中的Playbook，建立部门内部的尽职调查SOP和检查清单。不要让DD变成一次性的“临时抱佛脚”，而应成为标准化的科学评估流程。 • 风险可视化：在向高层汇报DD结果时，尝试使用“红黄绿”风险分级系统。高管们需要的是基于证据的、清晰的决策辅助，而不是模棱两可的医学描述。 • 建立历史对照库：积累同类药物的安全性数据和监管先例。在评估新资产时，同类药物的“前车之鉴”往往是最有力的参照系。 参考文献：Youssef A, Hammad TA. Pharmacovigilance Due Diligence in Drug Development: A Practical Playbook for Risk Identification, Compliance Assessment, and Strategic Decision Making. Drug Saf. 2025. 觉得文章对您有帮助的，别忘了点赞👍、在看👀、分享↗️，让更多PV同道受益。您的支持，就是前进的动力！关注仙八AI，我们一起在PV+AI的道路上不断精进！需要更快速的增进PV技能，了解前沿的PV资讯/资料，一天不到一块钱，就可以加入仙八AI VIP陪伴群。 仙八做了个PV guideline AI查询助手，点击公众号里服务的PV指南，即可体验CDE，CDR，US FDA，EMA，ICH，CIOMS等guideline快速查询，让你不必一页一页的翻找PDF。 推荐阅读： 双旦福利 | 2XX元锁定全年成长，更送“1对1”私人咨询！ 药物警戒人终极灵魂拷问：哪个安全数据库最好用？（建议收藏） 查药物警戒指南还在翻PDF？1分钟精准定位！ 吐血整理PV干货-药物警戒资料去哪找？这一篇就够了！ 吐血整理PV干货2-药物警戒医学资料去哪找？这一篇就够了（附可复制书签） 除了合规，药物警戒部门到底还有什么价值?（建议收藏）

一、引言 在药物发现中，体外模型通过提供明确的实验系统来研究细胞对药物的反应，发挥着关键作用。人类细胞系历来是药物发现的主力，因其操作简便、成本低廉且在研究实验室中易于获取。细胞系通常源自肿瘤，已适应在二维塑料表面生长，因此无法重现组织架构，也不包含单个器官的功能性细胞群。这促使人们探索更具生理性的三维培养系统（如类器官），以更精准地模拟体内微环境。 与动物实验相比，类器官更具成本效益，可实现高通量筛选（HTS），同时避免了动物实验相关的物种差异和伦理问题。Mina Bissell及其团队通过使用基质胶（一种类似细胞外基质的水凝胶），在上皮细胞三维培养领域做出了开创性贡献。在三维基质胶培养体系中，细胞能发生更具生理性的细胞间和细胞 - 基质相互作用。比塞尔团队证实，源自乳腺的上皮细胞可在基质胶中形成三维腺体结构，这些类器官甚至能被诱导分泌乳汁 。 多能干细胞（PS 细胞）类器官技术的发展源于 20 世纪 80 年代胚胎干细胞（ES 细胞）的发现。胚胎干细胞天然存在于囊胚期胚胎中，可在特定条件下长期培养，理论上能在合适的生长因子条件下分化为任何细胞类型（如神经元或心肌细胞）。但人类胚胎干细胞的广泛应用受限于后勤与伦理挑战 —— 其源自人类早期胚胎，提取过程会导致胚胎破坏。2006 年，Shinya Yamanaka通过转染四种转录因子，将成体组织的体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPS 细胞），大幅解决了这一问题。 多能干细胞研究最初主要采用二维培养方法。当科学家开始探索球形诱导多能干细胞聚集等三维培养技术时，发现多能干细胞可自发形成更复杂的结构。Yoshiki Sasai团队率先开发出多能干细胞来源的类器官模型，成功构建出类似视网膜和中枢神经系统其他部位的结构。这些结构能自我组织，重现真实器官的关键特征（包括细胞类型多样性和空间组织）。目前，代表人类多种组织的多能干细胞类器官标准化生成方案正快速发展。这些方案通常需数周或数月，从少量诱导多能干细胞团块开始，通过优化营养供应并模拟阶段性发育信号环境，引导多能干细胞向目标组织分化（图 1a）。常见的多能干细胞衍生类器官可模拟脑 、视网膜 、肺 、肾 、肝和肠道组织。 图1a和图1b 除心肌、肾小球和中枢神经系统大部分区域外，几乎所有器官都能通过组织干细胞（TSCs）的作用替换受损或衰老细胞。骨髓中的造血干细胞是首个被发现的组织干细胞，随后在皮肤、角膜和肠黏膜等组织中也鉴定出上皮组织干细胞。2009 年，研究证实，单个源自肠上皮的组织干细胞可生成不断扩增的上皮类器官，包含所有相关肠道细胞类型，彰显了组织干细胞及其子代细胞固有的自我组织能力。与多能干细胞衍生类器官类似，特定生长因子和细胞外基质成分对引导组织干细胞扩增和分化为目标细胞类型至关重要（图 1b）。二者的主要区别在于，组织干细胞类器官源自活检样本或其他原代组织（而非多能干细胞培养物），无需体外定向分化为目标组织。 过去十年间，类器官相关研究迅速增长，该技术已逐渐开始兑现其在药物研发中的多种潜力 。人类类器官可作为体外实验模型，补充传统二维人类细胞系和动物模型的不足（表 1）。如前所述，细胞系难以代表其起源组织 —— 它们几乎都经历了某种恶性转化（要么源自癌症，要么经长期适应二维塑料表面生长）。事实上，细胞系移植后通常会形成肿瘤，而类器官移植后能生成健康的功能性组织 。 与细胞系相比，动物模型的优势在于能在完整生物体背景下重现生物学现象，但也存在局限性：由于固有的物种差异，许多人类疾病难以在动物中复制；动物与人类的生理差异也限制了药物安全性和疗效的准确预测。此外，出于伦理考虑，动物实验的监管日益严格。2022 年，美国国会通过《FDA 现代化法案 2.0》，随后又出台《3.0 版本》，明确了药物研发中动物模型的使用要求。最近，FDA 宣布计划在单克隆抗体疗法和其他药物的研发中逐步淘汰动物实验 。因此，监管机构正积极探索替代方法 。 本综述将概述类器官的生成与维持方法，重点介绍其在疾病建模、治疗筛选以及药物药理学和毒性评价中的应用，探讨其在个性化医疗中的潜力（类器官可源自患者自身细胞，实现个体化药物测试），最后分析类器官平台成为药物研发常用工具所需解决的监管问题和挑战。 二、疾病建模 类器官已应用于多种疾病领域，包括遗传性疾病、癌症和感染性疾病（图 2）。 （一）遗传性疾病 人类类器官特别适合模拟遗传性疾病，可直接源自患者患病器官的活检样本（患者来源类器官，PDOs），或通过 CRISPR 介导的基因编辑技术改造健康人来源的类器官获得。 囊性纤维化（CF）是由 CFTR 基因功能缺失突变引起的常染色体隐性遗传病 。该基因编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（一种氯 / 碳酸氢盐通道），对肺和肠道等多种上皮组织的离子和液体稳态至关重要 。目前已开发出多种 CFTR 调节剂 ，例如由依伐卡托和鲁玛卡托组成的奥凯姆比（Orkambi），专门用于 CFTR纯合突变患者，约占囊性纤维化患者总数的 50%。即使携带相同基因突变，患者对该药物的反应也存在差异，因为 CFTR 调节剂的活性受细胞和遗传背景影响 。值得注意的是，人类与现有小鼠模型的囊性纤维化遗传基础和症状表现差异显著。CFTR 突变（包括 CFTR）小鼠不会出现囊性纤维化患者的严重气道疾病（如黏液堆积、气道阻塞或慢性肺部感染。囊性纤维化是首个通过患者来源类器官实现个性化医疗的疾病。 CFTR 通道可被环磷酸腺苷（cAMP）激活。在健康肠道或气道类器官中，加入毛喉素（一种通过刺激腺苷酸环化酶将 ATP 转化为 cAMP 来升高 cAMP 水平的化合物）会引发 CFTR 介导的水向管腔流入，导致类器官快速肿胀。相比之下，囊性纤维化患者来源的类器官对毛喉素无肿胀反应。这种肿胀缺陷可通过 CRISPR 介导的 CFTR 突变校正或有效 CFTR 调节剂治疗得以恢复。重要的是，该肿胀实验测得的药物反应与患者临床结局（如一秒用力呼气容积预测百分比和痰细胞计数）高度相关。类器官肿胀检测方法简便，适用于药物高通量筛选。 原发性纤毛运动障碍（PCD）是另一种影响气道的遗传性疾病，由与纤毛结构相关的基因（如 DNAH5/11、DNAI1 和 CCDC39/40）突变引起，可通过原发性纤毛运动障碍患者的鼻气道类器官进行研究。这些类器官可通过电子显微镜成像直接观察纤毛摆动和结构变化。通过先导编辑校正 DNAH11 基因的突变，该类器官模型已证实了基因治疗的潜力。表面活性蛋白缺乏症由 SFTPB（编码肺表面活性物质相关蛋白 B）和 SFTPC 等基因突变引起，会导致家族性肺纤维化。肺泡 2 型（AT2）细胞产生的表面活性蛋白可降低肺泡气液界面的表面张力，防止呼吸过程中肺泡塌陷，促进肺扩张和高效气体交换。最近有研究报道了源自胎儿肺的 AT2 细胞类器官，而 SFTPB 缺陷患者的诱导多能干细胞来源肺类器官重现了特征性的异常板层小体形成，通过重新表达野生型 SFTPB 可恢复正常表型。 肾脏疾病也可通过类器官建模。多囊肾病（PKD）是最常见的遗传性肾脏疾病，研究人员已利用携带 PKD1 或 PKD2 基因突变（分别编码多囊蛋白 1 和多囊蛋白 2）的患者肾脏类器官开展研究。这些类器官重现了常染色体显性多囊肾病的标志性特征 —— 囊肿形成，同时表达常染色体显性多囊肾病基因特征。利用可规模化的常染色体显性多囊肾病类器官进行高通量筛选，已鉴定出多种有望减少囊肿生长的化合物，包括潜在的核因子 -κB（NF-κB）通路调节剂喹唑啉。最近，研究人员利用携带 PKHD1 基因突变（编码纤维囊泡蛋白）的诱导多能干细胞来源肾脏类器官，构建了芯片类器官平台（专栏 1 和图 3a）。该系统模拟了天然组织微环境的流体流动，重现了常染色体隐性多囊肾病患者的囊肿形成过程，为药物测试提供了具有临床相关性的表型。 遗传性肝脏疾病中，α1 - 抗胰蛋白酶缺乏症（AATD）是由 SERPINA1 基因突变引起的单基因遗传病，会导致 α1 - 抗胰蛋白酶（A1AT）水平降低。α1 - 抗胰蛋白酶主要在肝脏产生，作为丝氨酸蛋白酶抑制剂，保护肺组织免受中性粒细胞弹性蛋白酶介导的损伤。α1 - 抗胰蛋白酶缺乏症患者的肺和肝损伤风险增加，而患者来源的肝脏类器官能模拟疾病特征，包括 α1 - 抗胰蛋白酶聚集、蛋白质分泌减少和弹性蛋白酶抑制功能受损。该模型为探索基因治疗和其他旨在防止肝细胞内 α1 - 抗胰蛋白酶聚合和聚集的策略提供了机会。 JAG1 突变型阿拉杰里综合征患者来源的类器官表现出导管细胞分化延迟和管腔凋亡增加，反映了体内胆道系统的异常。威尔逊病（由 ATP7B 基因突变编码铜转运 ATP 酶 β 引起）患者的胆管细胞类器官对铜处理的敏感性增加，原因是铜转运缺陷导致细胞内毒性积累。尽管 Atp7b 敲除小鼠模型能捕捉到该疾病的某些肝脏特征（如铜过载、炎症和纤维化），但无法重现患者出现的神经和精神症状。胆道闭锁患者来源的肝脏类器官表现出异常形态（多个空泡、增殖能力降低、顶 - 基底结构紊乱和 CFTR 蛋白水平低），这些表型与患者的梗阻性胆管疾病一致，转录组分析还发现胆管周围淀粉样 β（Aβ）沉积是一种新的病理和诊断特征。 中枢神经系统遗传性疾病中，帕金森病（PD）的特征是中脑多巴胺神经元丢失，导致运动和非运动症状。由于诱导多能干细胞来源的多巴胺能神经元处于胎儿成熟阶段，类器官难以模拟帕金森病的症状性神经退行性表型及其他通常发病较晚的中枢神经系统疾病。因此，大多数研究致力于利用携带疾病相关突变的类器官重现早期病理过程，以揭示突变特异性疾病机制。例如，携带早发性帕金森病相关 DNAJC6 基因功能缺失突变的人类胚胎干细胞来源中脑类器官，因 WNT-LMX1A 信号通路受损，表现出多巴胺神经元发育障碍、病理性 α- 突触核蛋白聚集、神经元固有放电频率增加以及线粒体和溶酶体功能障碍。值得注意的是，Dnajc6 敲除小鼠无法重现帕金森病相关表型。类似地，携带帕金森病相关富亮氨酸重复丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 2（LRRK2）G2019S 突变的诱导多能干细胞来源中脑类器官，重现了患者的标志性特征，包括 α- 突触核蛋白聚集增加和清除功能受损，进一步分析鉴定出 TXNIP 是 LRRK2 相关帕金森病的关键因子。 在另一种常见神经退行性疾病中，载脂蛋白 E 变体 APOE4 是阿尔茨海默病（AD）最强的遗传风险因子。携带 APOE4 变体的诱导多能干细胞来源大脑类器官表现出阿尔茨海默病病理增强，包括 Aβ 和磷酸化 tau 水平升高、细胞凋亡和突触完整性降低。值得注意的是，除了 APOE4 变体对神经元的直接影响，包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的共培养类器官模型还揭示了小胶质细胞 APOE4 通过诱导神经元炎症在阿尔茨海默病病理中的作用。进一步的转录组分析鉴定出与 APOE4 变体相关的细胞类型特异性变化，包括神经元突触功能受损、星形胶质细胞 Aβ 摄取减少和胆固醇积累，以及小胶质细胞样细胞形态改变和 Aβ 吞噬作用降低。家族性阿尔茨海默病患者（携带淀粉样前体蛋白 APP 重复、早老素 1 或早老素 2 突变）的诱导多能干细胞来源类器官会自发出现病理变化（如淀粉样蛋白聚集、tau 过度磷酸化和内体异常），这些变化可通过 β 和 γ 分泌酶抑制剂挽救。 尽管 tau 过度磷酸化是阿尔茨海默病的标志性特征，但编码 tau 的 MAPT 基因突变可导致额颞叶痴呆（FTD）—— 一种以 tau 积累和谷氨酸能皮质神经元丢失为特征的异质性疾病。携带 MAPT 突变（R406W）的诱导多能干细胞来源大脑类器官已用于研究 tau 病理的特定机制。R406W 突变通过微管不稳定导致 tau 定位异常和轴索营养不良，还会破坏突变神经元的线粒体运输。突变 tau 蛋白的磷酸化水平降低，更易发生钙蛋白酶介导的切割和片段化。类似地，携带另一种 MAPT 突变（V337M）的类器官已用于研究早发性额颞叶痴呆的发病机制。研究人员在多个时间点对这些类器官进行表型评估，以鉴定额颞叶痴呆 - tau 病理发展的各个阶段。在晚期（4 个月后）可观察到额颞叶痴呆的标志性特征，包括神经元丢失、tau 进行性积累和对谷氨酸毒性的敏感性增加。tau 积累主要源于自噬 - 溶酶体通路破坏导致的蛋白水解活性缺陷，而非 tau 表达增加。进一步的基因富集分析显示，剪接调节基因 ELAVL4（编码神经元 RNA 结合蛋白）表达增加，导致剪接失调和兴奋性神经元功能受损。兴奋性神经元发育失调会引发兴奋性毒性 —— 兴奋性神经递质（主要是谷氨酸）过度刺激导致钙离子大量流入神经元，引起细胞功能障碍并最终导致死亡，在发育晚期还会出现凋亡。此外，脂质激酶抑制剂阿匹莫德可通过阻止谷氨酸受体回收至细胞膜，减少谷氨酸诱导的兴奋性毒性，从而挽救突变 tau 类器官中谷氨酸能神经元的丢失。另一种方法是通过腺相关病毒（AAV）将突变 tau（P301L）注射到诱导多能干细胞来源的前脑类器官中，也能诱导产生含有 tau 原纤维的显著 tau 聚集物。除 MAPT 突变外，额颞叶痴呆还有其他多种遗传原因，包括导致颗粒体蛋白（progranulin）单倍体不足的 GRN 突变和 C9ORF72 基因的 GGGGCC 重复扩增。源自诱导多能干细胞的大脑类器官切片模型重现了皮质结构，并显示出 C9ORF72 相关额颞叶痴呆的早期分子病理。在这些类器官中，星形胶质细胞的自噬相关蛋白 P62 水平升高，而深层神经元积累二肽重复蛋白多聚（GA）、出现 DNA 损伤并发生核固缩，GSK2606414 药物治疗可挽救这些表型。携带 C9ORF72 扩增的诱导多能干细胞来源额颞叶痴呆类器官还表现出 TDP43 功能障碍加剧（急性损伤的关键驱动因素）。基于额颞叶痴呆类器官的 CRISPR 干扰（CRISPRi）筛选已鉴定出抑制 KCNJ2 是缓解神经退行性过程的潜在治疗靶点。 类器官还可用于模拟神经发育障碍。脆性 X 综合征（FXS）由脆性 X 智力低下蛋白（FMRP）缺失引起，该蛋白是一种 RNA 结合蛋白，调控参与突触发育和可塑性的特定 mRNA 翻译，包括脑源性神经营养因子（BDNF）、代谢型谷氨酸受体（mGluRs）、钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（CaMKII）和突触后密度蛋白 95（PSD95）。脆性 X 综合征患者前脑来源的类器官中，FMRP 缺失会导致神经发生、神经元成熟和兴奋性失调。这些缺陷可通过抑制磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）通路挽救，但 mGluR5 拮抗剂无效。值得注意的是，mGluR5 靶向治疗在临床试验中效果有限，但在动物模型中显示出良好前景。对这些脆性 X 综合征类器官的转录组分析进一步揭示了人类 FMRP 的 mRNA 靶点（如 CDH2），为脆性 X 综合征的治疗开发提供了机制见解和潜在药物靶点。该模型的一个显著局限性是脆性 X 综合征类器官中 γ- 氨基丁酸能抑制性神经元数量大幅减少。因此，进一步研究 FMRP 缺失在 γ- 氨基丁酸能神经元发育中的作用，需要另一种富含 γ- 氨基丁酸能神经元的模型系统（如腹侧前脑类器官）。此外，该脆性 X 综合征类器官模型无法完全捕捉细胞类型的多样性及其复杂相互作用，尤其是星形胶质细胞（据报道星形胶质细胞可介导人类脆性 X 综合征神经元异常放电的非细胞自主性校正）。最近的一项研究表明，FMRP 可通过含 YTH 结构域的家族蛋白 1（YTHDF1）抑制神经元翻译。在诱导多能干细胞来源的前脑类器官模型中，靶向 YTHDF1 的小分子抑制剂可逆转与 FMRP 缺乏相关的发育缺陷。 （二）代谢性疾病 代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）由肝细胞内脂质积累引发慢性炎症和纤维化，影响约 5% 的全球成年人口。其风险因素包括营养过剩，极少数情况下也包括遗传性脂质疾病。目前广泛使用的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎动物模型分为两类：一类由遗传改变驱动（瘦素或瘦素受体突变，或 Apoa5、Nr1h4、Pparg、Cebpa 等脂质代谢相关基因敲除），另一类由饮食因素驱动（高脂饮食、西式饮食或过量糖摄入）。但这些动物模型不适合大规模药物筛选，且物种差异使研究结果难以转化为人类生理学数据。 肝细胞类器官重现了肝脏组织的三维结构，以及原代肝细胞的基因表达谱和细胞功能。源自患者或通过代谢物刺激诱导 的代谢功能障碍相关脂肪性肝炎类器官捕捉了疾病的关键特征，包括促炎通路和肿瘤相关标志物上调、脂质积累增加和凋亡敏感性升高。例如，一种经游离脂肪酸（FFA）处理后会出现脂质积累的肝脏类器官系统，已用于研究二甲双胍和 L - 肉碱（均用于治疗 2 型糖尿病）的作用。沃尔曼病（由溶酶体酸性脂肪酶（LAL）遗传功能障碍导致甘油三酯水解受损）患者来源的肝脏类器官表现出大量脂质积累和严重脂肪性肝炎，而成纤维细胞生长因子 19（FGF19）治疗可激活法尼醇 X 受体（FXR），降低脂质储存诱导的活性氧（ROS）活性，从而挽救这些表型。其他化合物也已在肝脏相关类器官模型中进行评估，结果各异。镁虽被报道可改善 2 型糖尿病和肝脏代谢紊乱，但在三维类器官模型中无法逆转疾病表型。相比之下，索拉非尼（一种临床上用于治疗肝癌和肾癌的广谱酪氨酸激酶抑制剂）在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的三维共培养模型中显示出减少脂肪变性诱导的纤维化的潜力。 值得注意的是，代谢功能障碍相关脂肪性肝炎中炎症变化与纤维化进展的相互作用涉及库普弗细胞（KCs）和肝星状细胞（HSCs）。源自诱导多能干细胞的多细胞类型肝脏类器官已用于研究代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的发病机制并促进药物筛选。在该系统中，游离脂肪酸会刺激前胶原产生。长期暴露于脂肪酸会导致库普弗细胞中炎症细胞因子表达增加、肝星状细胞激活和类器官硬度升高⁸³。这些发现强调了生成多谱系相互作用模型对改进代谢功能障碍相关脂肪性肝炎建模的重要性。 类器官不仅用于模拟代谢性疾病，还促进了新疗法的发现。家族性高胆固醇血症患者的诱导多能干细胞来源肝细胞揭示了强心苷类药物在减少载脂蛋白 B 产生中的作用。线粒体 DNA 耗竭综合征患者来源的肝细胞证实，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）治疗可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α（PGC1α）恢复 ATP 水平，从而改善线粒体功能。肝细胞类器官可用于筛选小分子抑制剂，或在临床前代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎的背景下开展 CRISPR 介导的功能研究。研究人员利用胎儿肝细胞类器官，在遗传性脂肪变性（APOB⁻/⁻或 MTTP 基因突变，分别编码载脂蛋白 B 和微粒体甘油三酯转移蛋白）或游离脂肪酸过量的背景下，模拟了代谢功能障碍相关脂肪性肝病的早期发病过程。作为概念验证，可在这些代谢功能障碍相关脂肪性肝病类器官中进行常规药物筛选和 CRISPR 介导的功能缺失筛选，结果表明脂肪酸去饱和酶 2（FADS2）是肝脂肪变性的决定因素之一。 （三）慢性炎症性疾病 模拟炎症性肠病（IBD）或乳糜泻（CeD）等免疫介导疾病，需要将类器官与适当的免疫细胞（专栏 1）和 / 或炎症介质结合。 通过对炎症性肠病患者的基因组和转录组分析，已鉴定出众多风险因素。但在动物模型中，阐明这些因素的主要细胞靶点和潜在机制面临挑战。源自炎症性肠病患者 或暴露于促炎细胞因子的类器官可简化相关研究。例如，对 IL-22 刺激的结肠类器官的分析显示，与 C-X-C 趋化因子受体 2（CXCR2）⁺中性粒细胞募集相关的基因上调。值得注意的是，源自炎症性肠病炎症黏膜的类器官保留了炎症组织的转录特征，而儿童炎症性肠病患者的疾病特异性表观遗传改变在类器官中即使去除炎症环境后仍可持续存在。 研究炎症性肠病发病机制的一种生理相关方法是类器官 - 免疫细胞共培养系统。例如，克罗恩病患者的自体黏膜 T 细胞可浸润类器官并直接诱导上皮细胞死亡。这种浸润和细胞毒性依赖于 T 细胞通过 CD103（介导 T 细胞与上皮细胞黏附的整合素）和 NKG2D（结合上皮细胞上应激诱导配体的激活受体）的识别。针对 CD103 和 NKG2D 的封闭抗体可靶向免疫细胞 - 上皮细胞相互作用，减少 T 细胞浸润和上皮损伤⁹⁸。 乳糜泻是一种由麸质触发的自身免疫性疾病，与特定 HLA-DQ 单倍型相关。小鼠天然不具有这些人类 HLA 单倍型，尽管已开发出表达人类 HLA 分子的转基因小鼠，但它们无法完全重现乳糜泻的免疫反应或疾病病理 ，或需要人工诱导或遗传修饰，无法完全模拟自然疾病过程 。乳糜泻患者的十二指肠活检样本可在气液界面系统中直接培养（图 3a），该系统保留了肠道上皮和多种组织驻留免疫群体，从而重现麸质依赖性病理 。利用该共培养系统进行的功能研究已鉴定出 IL-7 是一种麸质诱导的致病调节剂，在乳糜泻发病机制中对诱导上皮破坏既是必要的也是充分的 。 甲状腺是器官特异性自身免疫的常见靶点：甲状腺功能亢进（格雷夫斯病）和甲状腺功能减退（桥本甲状腺炎）是特征为激素产生异常的自身免疫性疾病 。可轻松生成含有产激素滤泡细胞的组织来源甲状腺类器官 。暴露于格雷夫斯病自身抗体（已知可激活促甲状腺激素受体 TSHR）的甲状腺类器官表现出细胞增殖增加和激素分泌增多，重现了疾病的关键特征 。桥本甲状腺炎患者来源的类器官显示趋化因子 CCL2 和 CCL3 水平升高，这些趋化因子可能在桥本甲状腺炎发病机制中对免疫细胞募集起关键作用 。 慢性阻塞性肺疾病（COPD）主要由肺泡和气道损伤引起，导致气流减少、黏液分泌增加和炎症，共同导致呼吸困难。慢性阻塞性肺疾病患者的支气管类器官证实存在杯状细胞增生和纤毛摆动频率降低 。研究人员通过将人类肺类器官暴露于香烟烟雾提取物，研究了吸烟相关慢性阻塞性肺疾病，结果显示与健康气道类器官相比，肺泡类器官的形成受到抑制，且对香烟烟雾的敏感性增加 。 （四）感染性疾病 隐孢子虫（一种引起腹泻的原生动物寄生虫）具有复杂的无性 - 有性生命周期，难以在实验室中培养。人类肠道类器官（尤其是分化的肠上皮细胞）支持隐孢子虫生命周期的无性和有性阶段，并产生具有二次感染能力的卵囊，其感染能力与源自感染宿主动物的卵囊相当 。 类似地，人类肠道类器官首次提供了体外人类诺如病毒（HuNoV）培养平台，鉴定出肠上皮细胞是复制靶点 。人类诺如病毒感染是全球急性胃肠炎的主要原因，但传统细胞系无法支持人类诺如病毒感染和复制，且由于病毒受体和免疫反应的物种特异性差异，小鼠对感染具有天然抵抗力 。此外，鼠诺如病毒模型在病毒结构、受体使用和致病性方面与人类诺如病毒不同，限制了研究结果向人类疾病的直接转化 。肠道类器官克服了这些障碍，显示出人类诺如病毒对组织血型抗原的菌株依赖性结合特异性，这与动物和人类研究结果一致 。除人类诺如病毒外，肠道类器官还已应用于模拟其他肠道病毒感染，包括轮状病毒 、柯萨奇 B 病毒 和肠道病毒 。 2016 年，世界卫生组织宣布寨卡病毒（ZIKV）感染与巴西新生儿小头畸形和其他神经障碍集群相关，构成国际关注的突发公共卫生事件 。由于无法获取受感染的人类胎儿组织，限制了对寨卡病毒在发育中中枢神经系统发病机制的理解。小头畸形表型需要三维结构模型，只能通过感染大脑类器官重现 。利用人类诱导多能干细胞来源大脑类器官的实验表明，寨卡病毒感染会破坏大脑皮质层，减少细胞增殖并降低功能性神经元数量 。在旋转生物反应器中培养的区域特异性大脑类器官证实，亚洲和非洲寨卡病毒株均优先且高效感染神经前体细胞，触发过早分化和细胞死亡增加，与人类胎儿中的感染模式一致 。脑室区和室下区的前体细胞可能受到影响，支持了人类神经发育过程中增殖的前体细胞是该疾病关键靶点的假设 。基于这些类器官模型的机制研究揭示，寨卡病毒蛋白 NS2A 损害人类前脑类器官中放射状胶质细胞的增殖，并破坏神经干细胞的顶端连接形成。寨卡病毒蛋白 NS4A 和 NS4B 通过抑制 AKT-mTOR 信号通路阻断神经发生并促进自噬 。寨卡病毒蛋白 NS5 特异性靶向人类（而非小鼠）的 STAT2，抑制 I 型干扰素信号传导 ，且寨卡病毒可激活 Toll 样受体 3（TLR3）介导的先天免疫反应，导致参与神经发生、轴突导向和凋亡的基因失调 。人类前脑类器官也已用于药物筛选，鉴定出氢溴酸石蒜碱可清除受感染人类神经前体细胞中的寨卡病毒，并挽救寨卡病毒诱导的小头畸形表型 。另一项药物重定位筛选发现，泛半胱天冬酶抑制剂埃米卡桑可抑制寨卡病毒诱导的半胱天冬酶 3 活性，保护类器官培养中的人类皮质神经前体细胞，而 FDA 批准的 B 类驱虫药氯硝柳胺可阻断寨卡病毒复制 。此外，寨卡病毒感染通过病毒 NS3 蛋白与 CaMKII 的相互作用，增加宿主细胞中瞬时受体电位通道 4（TRPC4）的表达，从而增强 TRPC4 介导的钙离子内流。在诱导多能干细胞来源的大脑类器官中，药物抑制 CaMKII 或 TRPC4 可能减少癫痫发作并阻断寨卡病毒传播 。 呼吸道感染方面，呼吸道是病原体的主要靶点，2019 冠状病毒病（COVID-19）大流行引发了对体外模型的前所未有的需求。分化气道类器官中表达血管紧张素转换酶 2（ACE2）和跨膜蛋白酶丝氨酸 2（TMPRSS2）的气道纤毛细胞是初始感染的主要细胞靶点 。由于 ACE2 和 TMPRSS2 在多种上皮组织中表达，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）在呼吸道初始感染后可扩散至其他器官。含有表达 ACE2 的肠上皮细胞的人类肠道类器官支持严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 的高效感染和复制 。后续研究利用 CRISPR 介导的基因工程类器官生物库证实，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）均特异性利用 TMPRSS2，该蛋白酶可水解激活刺突蛋白，使病毒包膜与宿主细胞膜直接融合。因此，这些病毒无需内吞作用即可感染宿主细胞，使 TMPRSS2 成为泛冠状病毒治疗的潜在靶点 。值得注意的是，最初基于细胞系研究提出并广泛用于治疗 2019 冠状病毒病患者的内吞作用抑制剂（羟）氯喹，在类器官模型中无法抑制病毒繁殖 。这一发现与（羟）氯喹对严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 无效的临床观察一致 ，凸显了类器官作为更准确的新型药物筛选转化平台的潜力。 更广泛地说，气道类器官可用于研究甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）或人类鼻病毒 C（HRV-C）等呼吸道病毒的感染动态和人畜共患病溢出潜力。它们表达 TMPRSS2 和 TMPRSS4，介导甲型流感病毒表面血凝素的切割，从而实现病毒 - 宿主细胞膜融合 。分化的二维类器官（专栏 1，另见图 3a）可区分人类感染性甲型流感病毒与人类感染性较弱的禽类和猪亚型的复制能力 ，并已用于评估近期禽类 H5N6 和 H5N8 毒株的溢出风险 。可长期扩增的人类气道类器官还重现了呼吸道合胞病毒感染的关键特征，包括由病毒非结构蛋白 NS2 驱动的细胞运动性增加，以及共培养期间中性粒细胞的优先募集。类似地，它们可支持人类鼻病毒 C 的可重复增殖，为研究病毒 - 宿主相互作用提供了见解 。人类鼻病毒 C 感染后，气道类器官比鼻类器官产生更强的先天免疫反应，且 α-CDHR3 和抗病毒药物治疗可显著减少病毒增殖 ，表明其作为抗病毒药物开发平台的潜力。 （五）癌症 许多癌症类型（如胰腺癌、肝癌和乳腺癌）不会在动物模型中自发发生。即使通过引入特定癌症突变（通常需要相当长的时间）实验性诱导肿瘤，也无法捕捉人类癌症的复杂性和异质性（包括遗传多样性和免疫环境）。过去十年间，患者来源肿瘤类器官（PDTOs）的出现极大地扩展了临床前癌症模型的范围 。这些培养物可轻松源自几乎所有癌种，以活检或手术切除材料作为起始组织。它们具有可扩展性，能密切重现原始肿瘤的组织学、遗传和转录组特征 ，并可一致地异种移植到小鼠中进行体内表征 ¹⁴¹。携带特定遗传突变的患者来源肿瘤类器官可在不依赖通过突变激活的致癌通路传导信号的生长因子的情况下生长。例如，携带 KRASᴳ¹²ᵛ突变的类器官可在缺乏表皮生长因子（EGF）的情况下生长，而表皮生长因子对健康类器官的生长至关重要 ，这种方法常用于区分肿瘤来源的增殖与正常组织生长 。肿瘤类器官的实用性已在药物测试研究中得到进一步证实，这些研究显示出突变特异性细胞毒性作用。例如，不可逆的 ERBB 家族受体酪氨酸激酶抑制剂阿法替尼的敏感性与乳腺癌类器官中的 HER2 表达水平相关。类似地，携带突变 BRCA1/2 特征的类器官对聚（ADP - 核糖）聚合酶（PARP）抑制剂更敏感，导致肿瘤细胞死亡 。此外，可通过对野生型类器官进行序贯 CRISPR 致癌突变工程改造，创建明确的癌症模型 。这种人工创建的癌症类器官在异种移植后会产生预期的组织学特征 。 患者来源肿瘤类器官及其匹配的健康类器官已在多种肿瘤类型中广泛生成并储存在生物库中（总结于表 2 和补充表 1）。这些患者来源肿瘤类器官反映了肿瘤间和肿瘤内的异质性，可用于研究肿瘤进化和进展、测试治疗反应的变异性、理解耐药机制和鉴定新型治疗靶点 。例如，双特异性抗体 MCLA-158（petosemtamab）靶向表皮生长因子受体（EGFR）和富含亮氨酸重复序列 G 蛋白偶联受体 5（LGR5），其开发完全基于结直肠癌患者来源肿瘤类器官系（专栏 2）。重要的是，患者来源肿瘤类器官对 antitumor 疗法的敏感性与其亲本肿瘤组织相当，突显了患者来源肿瘤类器官在药物筛选中的可靠性。值得注意的是，在 “原始状态” 下，患者来源肿瘤类器官系不包含免疫细胞、肿瘤基质或血管，但通过共培养，在微流控系统和生物工程技术（如芯片类器官和三维生物打印）的支持下，这些成分可轻松加入（专栏 1，另见图 3b）。 尽管具有这些优势，类器官仍是一种高度简化的实验平台，尽管检测结果通常稳健且可重复，但在将类器官常规应用于药物开发之前，必须根据现有的体外平台、动物研究和临床试验数据进行广泛验证。患者来源肿瘤类器官有望在多种癌种中推进个性化医疗，在胰腺癌 、胃肠道癌和乳腺癌 中，类器官药物反应与临床结局存在相关性。然而，其更广泛的可翻译性仍需确凿证明，目前正在进行多项随机临床试验 ，以评估其预测价值，尤其是在放疗和化疗场景中。重要的是，在肿瘤学之外，转化证据仍然稀缺，且缺乏受控的临床验证。此外，阴性预测数据很少被报道，限制了我们对基于类器官预测边界的理解。在神经系统疾病和其他复杂全身性疾病中，类器官还面临模拟多细胞相互作用和全身性药代动力学的挑战，这限制了其预测效用。 三、转化安全性应用 尽管大多数研究聚焦于类器官在药物疗效和疾病建模中的应用，但制药行业目前正将其应用扩展到评估多种器官的药物安全性（表 3）。 （一）肝毒性 肝脏在药物代谢中起核心作用，肝毒性是药物淘汰、撤市和批准后限制使用的主要原因 。药物诱导的肝损伤（DILI）是与治疗相关的发病率和死亡率的重要原因，仍然难以预测和缓解 。源自组织干细胞或多能干细胞的肝脏类器官为预测药物诱导的肝毒性提供了良好机会。 来自多能干细胞的功能成熟人类肝脏类器官（HLOs）可重现曲格列酮（因肝毒性撤市的抗糖尿病药物）、对乙酰氨基酚（广泛使用的止痛药）以及抗生素曲伐沙星和左氧氟沙星的已知肝毒性，在临床相关浓度下比二维肝细胞更敏感。类似地，组织干细胞来源的肝脏类器官在模拟药物诱导的磷脂沉积症（与多种药物相关的严重不良反应）方面优于传统肝癌来源的 HepG2 细胞，凸显了其评估代谢物介导的肝毒性的能力 。此外，多能干细胞来源的肝脏类器官已用于建立大规模化合物筛选的高通量检测方法，通过多重检测结果准确注释 238 种药物的药物诱导肝损伤潜力，并展示了其模拟个体供体对波生坦（一种可能导致胆汁淤积性肝损伤的内皮素受体拮抗剂）的基因型特异性敏感性的能力 。基于这些进展，肝脏类器官可模拟一系列与药物诱导肝损伤相关的表型，包括脂肪变性、纤维化和免疫反应，与对乙酰氨基酚和 TAK-875（一种原开发用于 2 型糖尿病但因肝毒性停用的 G 蛋白偶联受体 40 激动剂）等化合物的临床数据高度一致 。肝脏类器官的应用不断扩展，肝内胆管细胞类器官已用于研究氯丙嗪诱导的胆管损伤，并证实该模型能有效重现药物诱导的胆道毒性 。最近，肝脏类器官已适配用于评估腺相关病毒（AAV）载体（广泛用于基因治疗，尤其是肝脏靶向治疗），为评估基因治疗开发中的载体性能和靶向肝毒性提供了新平台 。 （二）肾毒性 人类多能干细胞来源的肾脏类器官尽管仍缺乏几种关键转运蛋白和肾小管滤过功能，但可模拟药物诱导的急性肾损伤（药物开发中的主要安全问题）。这些类器官包含肾单位、集合管、肾间质和内皮细胞，并可自组织成肾单位样结构（包括足细胞、近端小管、髓袢和远端小管），进一步重现体内肾单位组织 。它们已显示出对顺铂和庆大霉素等肾毒性药物的差异性凋亡反应，肾损伤标志物肾损伤分子 1（KIM1）呈剂量依赖性上调，确立了其在肾毒性测试中的效用 。后续研究进一步优化了肾脏类器官模型，以更好地重现肾毒性反应。顺铂和多柔比星诱导的损伤 （包括剂量依赖性凋亡 ）已在传统类器官中重现，悬浮培养的微型类器官和生物打印肾脏类器官已证实多柔比星和氨基糖苷类抗生素的毒性 。一种包含灌注外周血单个核细胞（PBMCs）的免疫活性血管化芯片肾脏类器官系统，进一步实现了对免疫介导毒性的评估，例如靶向 HLA-A2 呈递的 WT1 肽的 T 细胞双特异性抗体（TCB）对表达 WT1 的细胞的选择性杀伤 。这凸显了该系统在动态微环境中评估化学和免疫介导毒性的能力。 （三）胃肠道毒性 利用类器官模型更好地预测小分子和大分子的胃肠道毒性，可显著改善临床前风险 - 获益评估，并减少药物开发过程中的淘汰率。 一项开创性研究使用人类回肠组织干细胞来源的类器官模拟药物诱导的腹泻，建立了一种基于类器官的检测方法，并通过 31 种参考药物进行验证。该检测方法预测药物诱导腹泻的临床发生率的准确率达 90%。在此基础上，研究人员利用组织干细胞来源的小肠和结肠类器官探索了胃肠道毒性的分子决定因素，研究了多柔比星和吉非替尼诱导的副作用机制 ¹⁷⁸¹⁷⁹。已开发出一种经济高效的肠道类器官培养方法，可实现小分子的表型高通量筛选，有助于简化临床前工作流程 。利用该平台，未分化的人类类器官可准确区分具有细胞毒性或非细胞毒性潜力的化合物。此外，比较人类、大鼠和犬类器官中的化合物反应，发现了与临床前研究结果一致的物种特异性敏感性差异，展示了类器官在早期安全性评估中的效用 。肠道类器官平台的预测能力还扩展到评估蛋白质类生物制剂（如 T 细胞双特异性抗体）的 “靶向肿瘤外” 效应，包括缺乏临床前交叉反应物种的情况。补充了免疫细胞的肠道患者来源类器官和肿瘤类器官显示出 T 细胞双特异性抗体的组织特异性肿瘤外毒性，成功捕捉了传统缺乏这些免疫成分的组织模型无法预测的临床不良反应 。进一步扩展这一方法，通过将上皮类器官与自体组织驻留记忆（TRM）T 细胞整合，生成了人类肠道免疫类器官，并已用于研究癌症患者中观察到的 T 细胞双特异性抗体诱导的肠道炎症 。 （四）中枢神经系统毒性 药物诱导的神经毒性是候选药物开发终止的主要原因，据报道，中枢神经系统不良反应导致 7%-34% 的早期和晚期项目终止 。类器官为揭示传统方法可能无法检测到的毒性机制提供了强大模型。二维细胞培养等简单系统可能忽略依赖于中枢神经系统微环境中复杂细胞相互作用的独特毒性机制，而尽管小鼠模型确实重现了中枢神经系统的某些复杂性和多样性，但可能无法准确代表人类对毒素的特异性反应。例如，由于缺乏类似人类脑组织的体外模型，长春新碱神经毒性的机制研究历来集中在周围神经元上。最近，诱导多能干细胞来源的大脑类器官揭示了长春新碱对大脑发育的神经毒性作用，鉴定出细胞外基质介导的信号传导，并强调了基质金属蛋白酶在这一过程中的功能 。 这些发现凸显了使用复杂的三维大脑类器官系统探索可能涉及发育中的人类脑组织结构和细胞复杂性的毒性机制的重要性。大脑类器官可长期培养以实现功能成熟。成熟的大脑类器官已用于研究治疗难治性抑郁症的药物苯乙肼对大脑发育的影响，通过转录抑制 BHC110/LSD1 靶向基因和组蛋白 H3 赖氨酸 4 去甲基化，鉴定出对神经元和星形胶质细胞的剂量依赖性脑损伤 。最近，诱导多能干细胞来源的大脑类器官已用于评估化疗诱导的神经毒性（尤其是紫杉醇），展示了类器官在评估小分子诱导的神经毒性中的效用 。 （五）心脏毒性 尽管已开发并实施了预测性临床前检测，但心脏毒性仍然是药物开发失败和上市后撤市的主要原因 。由干细胞来源的心肌细胞和支持细胞类型组成的人类心脏类器官，应能重现心脏组织架构、收缩功能和电生理的关键方面，为预测药物的心脏反应提供替代方法。 多柔比星诱导的心脏毒性已在心脏类器官中建模。暴露于多柔比星会降低类器官活力，升高乳酸脱氢酶（LDH）和脑钠肽（BNP）水平，并诱导凋亡、纤维化和线粒体功能障碍 。在无细胞外基质模型中，多柔比星治疗会导致类器官缩小、节律受损、胶原蛋白沉积、成纤维细胞激活和内皮 - 间质转化的早期迹象 。在模拟缺血后组织的心脏梗死类器官模型中，多柔比星加剧了缺氧敏感性损伤，破坏了协调收缩所需的钙循环，并促进梗死核心区纤维化的出现 。心脏类器官平台已用于筛选一系列临床相关药物。一项评估 FDA 撤市化合物（阿司咪唑、西沙必利、米贝拉地尔、培高利特、特罗地林、罗非昔布、伐地昔布、溴芬酸、 tienilic acid 和曲格列酮）的研究表明，与二维单层相比，类器官能更有效地检测剂量依赖性 ATP 耗竭和搏动紊乱 。额外的高通量筛选还鉴定出靶向 GSK3、转化生长因子 β（TGFβ）和甲羟戊酸途径的促增殖化合物 ，这些化合物可刺激心肌细胞增殖，但同时会导致收缩时间延长或力降低，表明尽管具有再生潜力，但存在功能副作用。空间组织化的心脏类器官已用于模拟发育毒性。暴露于沙利度胺会减少心脏组织形成并损害功能，较大的结构显示出更稳定的搏动特征，而较小的结构显示出延迟舒张和形态变异性 。最后，多器官平台强调了其他组织中的代谢如何驱动心脏毒性。在肝 - 心共培养中，肝细胞通过细胞色素 P450 酶将氯米帕明转化为去甲氯米帕明，导致心脏类器官搏动减少、钙通量紊乱和细胞死亡，而在缺乏肝脏类器官的情况下未观察到这些效应，表明肝细胞是观察到的毒性的原因 。一个六组织平台类似地证实，肝脏对卡培他滨和异环磷酰胺的代谢会在下游诱导心脏毒性反应，凸显了器官间串扰在心脏毒性中的作用 。 （六）基于类器官的临床前安全性平台 传统类器官预测现有药物安全性的能力目前正在探索中，但新一代具有更高复杂性的生物工程类器官平台已显示出进一步改善药物安全性测试的能力（图 3b）。此类模型整合了血管和免疫成分，能够研究药物对组织微环境和全身反应的影响 ，或内置生物传感器实时检测 ATP 与 ADP 比率以评估药物诱导的肾毒性 。此外，结合肝脏、心脏、肺、血管、睾丸、结肠和大脑的多类器官系统已用于 “芯片人体” 平台，能够筛选 FDA 撤市药物并深入了解多器官毒性和全身相互作用。类似地，肝脏和胰岛类器官的微工程组装体已应用于测量二甲双胍活性。 最近，生物工程二维类器官（如芯片微型结肠和微型肠道平台）通过维持类器官分化和顶 - 基底极性，同时通过流体流动促进管腔接触，进一步扩展了药物安全性评估能力（图 3a）。在这种设置中，三维类器官被 “打开”，其外部或基底表面放置在二维基质上。类器官的内部 / 管腔 / 顶端表面可从上方自由接触。这已被证明对测试针对干细胞的癌症化疗药物（如阿糖胞苷和 idasanutlin）特别有效。这些结合类器官生物学与生物工程方法的先进平台，为应对具有日益复杂作用机制的治疗药物带来的转化安全性挑战提供了新选择。此外，基于 Transwell 的类器官单层还能利用跨上皮电阻（TEER）测量定量评估上皮屏障完整性，为组织极化和紧密连接功能提供无创动态检测 。值得注意的是，作为 TEER 测量的替代方案，利用荧光染料跨组织屏障扩散的基于图像的检测方法也已用于确定体外完整肠道类器官的屏障完整性，要么将荧光染料添加到培养基中并在屏障降解时跟踪其内化 ，要么直接将染料微注射到类器官的管腔空间并量化上皮屏障渗漏 。 四、基于类器官的吸收和代谢检测 预测药物吸收、分布和代谢的能力是药物开发的关键，直接影响药代动力学，进而影响治疗候选药物的预测疗效、安全性和剂量。了解这些参数对于优化药物制剂、减轻不良反应和确保临床成功至关重要。肝脏、肠道和肾脏是负责药物吸收、代谢和清除的主要器官 ，因此是制药行业关注的主要体外器官模型 。 （一）用于药物代谢的肝脏类器官 肝脏是药物代谢的主要器官，负责三个关键过程：某些药物向肝脏的主动摄取、生物转化为代谢物，以及药物和代谢物向胆汁的分泌。目前最先进的体外模型（如短期悬浮培养的冷冻保存原代肝细胞或肝细胞共培养系统）可用于确定内在清除率和药物主动摄取。但这些模型面临诸多限制，例如无法完全重现肝脏代谢和转运表型（原代人类肝细胞在培养中迅速退化）、影响代谢和转运过程可测量性的次优细胞与培养基比率，以及评估胆汁分泌的能力有限。肝细胞系表达的药物代谢酶和转运蛋白水平不理想，限制了其预测人类药代动力学的能力 。为解决这一问题，已开发出一种组织干细胞来源的肝脏类器官系统，该系统表达多种 I 相药物代谢酶（如细胞色素 P450 酶 CYP3A4 和 CYP2D6，可对药物进行化学修饰）、II 相酶（如尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶和磺基转移酶，可结合这些代谢物以促进其排泄）和药物转运蛋白（包括阴离子转运蛋白 OATP1B3、ATP 依赖性转运蛋白 ABCB1（也称为 MDR1）和 MRP3）。该系统与微流控芯片整合，已应用于研究咪达唑仑的代谢和生物利用度，以及香豆素和二甲双胍在结合肠道和肾脏类器官的多器官平台中的排泄 。此外，肝内胆管细胞类器官（ICOs）已用于评估对乙酰氨基酚、羟基咪达唑仑和 7 - 羟基香豆素葡萄糖醛酸苷的代谢物形成。尽管肝内胆管细胞类器官成功模拟了代谢物产生，但它们的 CYP 酶表达水平低于原代人类肝细胞，凸显了进一步优化以匹配原代组织功能的必要性 。 （二）用于药物代谢和转运的肠道类器官 早期概念验证研究已阐明肠道类器官系统如何帮助更好地理解和预测肠道吸收和代谢。地塞米松、β- 萘黄酮和组成型雄甾烷受体激动剂 TCPOBOP 可成功诱导组织干细胞来源的肠道和肝脏类器官中的 CYP 酶活性，为药物代谢研究提供了可能 。事实上，小鼠来源的隐窝类器官已用于研究肠道药物代谢酶（DMEs），显示出前药 CPT-11 向其毒性代谢物 SN-38 的转化 。人类十二指肠类器官已应用于研究肽类药物转运，证实了头孢羟氨苄、β- 内酰胺类抗生素和环六肽的摄取。此外，基于 Transwell 的二维单层系统有助于双向（顶端 / 基底）转运研究（图 3a）。如前所述，这种二维设置始于三维类器官，将其打开并放置在二维基质上。与三维类器官中需要将化合物注射到类器官管腔以递送至上皮细胞顶端侧不同，二维 Transwell 设置允许轻松接触上皮结构的顶端和基底侧（图 3a）。因此，富含肠上皮细胞的极化人类十二指肠类器官单层成功区分了高通透性和低通透性化合物，显示出主要外排转运蛋白（包括 MDR1 和 BCRP）的功能活性。此外，三维十二指肠和结肠类器官表现出 I 相和 II 相药物代谢酶的代谢活性，其节段特异性差异与已知的药物代谢酶表达谱一致 。为了直接接触顶端表面，已生成具有反向上皮极性的多能干细胞来源肠道类器官，这有助于研究转运蛋白和酶活性。这些 “内外倒置” 的类器官（图 3a）在暴露于利福平、骨化三醇后显示出 CYP3A4 和 MDR1 的功能诱导，并可被维拉帕米和依伐卡托抑制 。 （三）用于药物转运和清除的肾脏类器官 尽管复杂的芯片肾脏系统（参见参考文献 218 的综述）、生物打印肾脏模型 和血管化芯片类器官平台 取得了进展，但肾脏类器官在药物转运和清除研究中的实际应用仍然有限，缺乏令人信服的用例。一种源自类器官的近端小管上皮细胞芯片模型显示出关键转运蛋白（包括有机阳离子转运蛋白 2（OCT2）、有机阴离子转运蛋白 1（OAT1）和 OAT3）的重要上调。这种增强的转运蛋白表达导致药物摄取改善，优于使用永生化近端小管上皮细胞的对照芯片 。类似地，基于尿液来源肾脏类器官的管状类器官芯片平台在微流控系统中重现了功能性肾小管屏障。利用荧光罗丹明 123，该模型证实了 OCT1 和 OCT2 介导的转运，凸显了该平台在研究 P - 糖蛋白活性和跨上皮药物转运中的效用 。 （四）类器官在药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）中的应用 类器官在药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）领域的应用仍然有限。主要挑战包括肝脏和肾脏类器官分化的相对不成熟。此外，尽管存在可翻译性问题，但在动物中进行小型药代动力学研究的相对简便性，往往超过了基于类器官平台预测的感知益处。解决药物的药物吸收、分布、代谢和排泄参数需要一个平台，其酶活性代表体内情况，屏障功能重现人类的生理功能，并且具有足够的组织量（数百万个细胞）来催化药物的生物转化。尽管如此，类器官已开始被探索用于解决与药物吸收、分布、代谢和排泄相关的问题。尽管存在技术挑战，但类器官有望满足药物吸收、分布、代谢和排泄测试需求，并解决行业在跨模式预测药物代谢方面的关键障碍。对于小分子，其主要优势在于重现相关的转运、屏障功能和生理代谢活性。具有功能性肝胆结构的肝脏类器官的最新进展有助于解决药物胆汁清除评估中的关键空白，而肾脏类器官的开发进展 可用于加强药物肾脏分泌的临床前评估。类器官忠实重现组织靶点表达的能力，对于评估大分子结合、靶点评估和靶点介导的药物处置特别有吸引力。流体连接的类器官组织和血管类器官的组合，有望通过实现重复采样和精确评估药物代谢及向靶组织的递送，解决药代动力学和组织分布挑战 。 五、当前挑战的潜在解决方案 如前所述，类器官技术仍面临阻碍其在药物开发中广泛应用的障碍。其中一个障碍是，尽管类器官比细胞系复杂得多，但它们仍然是一种简化模型，缺乏真实组织的基本元素。大多数类器官缺乏血管，这限制了营养物质和氧气的递送，进而影响生长、成熟和功能（尤其是较大的类器官）。由于大多数药物是静脉内递送的，类器官模型中缺乏血管化对准确的药物评估构成挑战。类器官培养通常不包含免疫细胞，因此难以分析免疫反应、炎症或免疫疗法相互作用。类器官还缺乏其他复杂组织成分（如细胞外基质、基质细胞和神经元），影响其功能和疾病建模能力。类器官无法模拟激素信号传导或多器官串扰等全身性相互作用。原代组织会经历生物力学力（如剪切应力、拉伸和压力），这些在类器官培养中难以重现。另一个主要障碍是类器官培养的变异性，这可能导致重现性困难：实验室间协议的差异（如细胞来源、培养基组成和生长条件的不同）会导致类器官发育的不一致；来自不同患者供体的细胞的遗传多样性会导致类器官批次间的变异性；实现均匀和受控的分化或功能仍然具有挑战性，导致类器官批次内和批次间的异质性；数据分析通常需要复杂和定制的分析工具，这也增加了研究过程和结论的复杂性。这些限制进而使类器官难以作为高通量筛选和大规模药物测试的标准化模型。同样，可扩展性仍然是药物开发面临的挑战。克服这些挑战需要改进培养方案、整合微流控技术和提升模型复杂性，共同使类器官能够充分发挥其作为个性化医疗和药物发现可靠工具的潜力。 基于类器官的药物筛选的常规流程包括将类器官包埋在基质中，接种到多孔板中，并在顶部添加培养基。自动化机器人和液体处理系统可以简化这一过程（图 4a）。该方法已用于乳腺癌 和结直肠癌（CRCs）患者来源肿瘤类器官的药物筛选。然而，该方法缺乏对接种类器官的数量和空间分布的精确控制，限制了高通量筛选检测的重现性。 生物工程微流控设备能够快速生成大量复制的类器官，这些类器官包埋在少量细胞外基质（如基质胶）中。基质胶是一种来自恩格尔布雷思 - 霍姆 - 斯旺小鼠肉瘤的可溶性基底膜提取物，富含细胞外基质蛋白（层粘连蛋白 111、IV 型胶原蛋白和纤连蛋白），支持极性和存活。这些设备将类器官接种到多孔板、微孔 / 微阵列或微柱芯片中（图 4a-d），能够精确控制类器官的形状、大小和细胞数量，从而大大提高了均一性和重现性（图 4b）。此类系统非常适合高通量筛选，因为检测需要简单且稳健。理想情况下，生成的类器官应位于均匀的水平和垂直平面，以便于基于成像的表型分析。例如，嵌入多孔板的微工程水凝胶膜可以同时生成数千个均匀的类器官，这些类器官被困在同一焦平面上的微腔阵列中，能够对数千个经抗癌药物处理的单个结直肠癌类器官进行实时自动化成像 。利用微流控技术高通量打印包埋在基质胶中的类器官液滴，可确保类器官间的均一性，同时保留组织异质性，提供与患者结局一致的稳健药物反应预测 。小液滴格式具有大的表面积与体积比，还能实现高效的病毒感染和 T 细胞穿透，并已应用于严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 的药物测试和快速嵌合抗原受体（CAR）-T 效力检测 。微孔阵列（图 4c）已用于分析肺癌类器官，可在一周内预测药物反应，而在 384 微柱板中生长的三维培养神经干细胞（图 4d）已实现对大型化学库的神经毒性筛选。 这些三维高通量平台通常使用生物相容性涂层基质（如聚二甲基硅氧烷 、聚甲基丙烯酸甲酯 、水凝胶  或基质胶 ）来维持类器官的三维结构并支持细胞生长。无基质悬浮培养使用带有转子装置的超低吸附板，可应用于某些类器官类型，如大脑类器官和肝脏组装体 。这些悬浮培养也可整合到微流控系统中，生成大小可控的均匀类器官，用于高通量筛选检测。 （一）自动化方法 自动化技术的早期发展进一步改善了类器官与基于微流控的高通量筛选平台的整合（图 4e）。例如，Mimetas OrganoPlate 能够实现自动化培养基更换、精确控制环境条件，甚至在最少人为干预的情况下进行药物筛选。该平台已用于测试肝脏类器官的肝毒性 和肺类器官的呼吸道疾病建模 ，展示了自动化在药物筛选和疾病建模中的潜力。Emulate 公司推出了另一种早期芯片类器官方法 。轨道振荡器平台提供自动化类器官培养，并维持恒定、温和的搅拌，这对于三维类器官培养的最佳生长和均一性至关重要 。此类系统可与多孔板整合以实现规模化。类器官研究中自动化的另一个显著例子涉及使用高通量自动化平台培养和筛选源自结直肠癌、胰腺癌和其他癌症的患者来源肿瘤类器官，该平台整合了机器人液体处理，用于自动化培养基更换、药物添加和化合物筛选，能够快速测试大型药物库 。 为了从类器官提供的组织复杂性中提取信息，基于图像的技术和高内涵筛选系统已整合到类器官自动化中，以提供稳健的数据采集和分析。荧光显微镜和自动化成像平台（如 CellInsight CX7）能够实时监测类器官生长、形态变化和药物反应。这些系统使用计算机视觉和图像分析算法来量化细胞活力、结构完整性、基因表达和药物疗效等参数 。例如，在阿尔茨海默病研究中，已使用自动化显微镜系统筛选针对淀粉样斑块或 tau 缠结的候选药物对大脑类器官的影响 。 至于自动高通量筛选检测的读数，最简单和最可靠的方法涉及量化荧光或吸光度信号（图 4f），例如广泛使用的基于 CellTiter Glo或 MTT 的细胞活力检测。酶标仪生成的数据可以数字化量化，并使用标准化统计方法直接处理。这些原理可以扩展用于设计疾病特异性读数。例如，关键疾病蛋白的表达或活性（如 α1 - 抗胰蛋白酶缺乏症中的 A1AT 产生）可以与催化的化学反应或酶联免疫吸附测定（ELISA）相关联。疾病相关表型（如脂肪肝疾病中的脂质积累）可以使用荧光指示剂进行可视化，并通过表型成像进行分析。某些遗传性疾病可以使用功能检测进行分析（如 CFTR 功能介导的肿胀检测）。感染性疾病相关的药物筛选可能依赖于荧光标记的病原体或病原体相关 RNA 或蛋白质的检测 。 图4 此外，先进的组织技术（一种在诊断和毒理学病理学中使用的高度标准化方法，结合显微镜和基质辅助激光解吸 / 电离（MALDI）成像）已应用于类器官系统 。 六、监管挑战与机遇 尽管类器官具有相当大的优势，但在其能够无缝整合到药物开发流程之前，监管认可仍然是一个主要障碍。应对这些挑战可以加强药物安全性评估，开发更有效的疗法，并减少对动物实验的依赖。 （一）类器官在药物安全性测试中的应用 类器官在药物安全性测试中应用的主要挑战仍然是模型鉴定、重现性、临床转化、成本效益优化和监管认可。为支持首次人体临床试验，临床前测试通常结合体内和体外模型，以最大限度地提高临床预测性，同时最大限度地减少动物使用。当需要功能性和生理相关终点时，类器官可以补充传统的二维细胞培养检测，特别是用于解决机制问题，但目前监管文件中更倾向于使用复杂性低、通量高和成本低的体外工具。要实现更广泛的应用，必须证明其相对于传统方法的明显优势（如在特定使用场景下的卓越预测能力）。此外，在各种使用场景和治疗模式中扩大鉴定工作，对于提高人们对类器官相对于简单传统体外方法的预测价值的信心至关重要。重要的是，尽管类器官作为预测毒性的转化模型显示出潜力，但本文介绍的大多数研究代表了临床前概念验证工作，并且相对于体内和患者数据的验证仍然有限。需要额外的正向和反向转化研究来确立类器官作为转化标准。 类器官在临床前药物开发中的应用通常分为两类：内部决策（如筛选和机制研究）和纳入监管申报文件。制药公司已在特定使用场景中使用类器官进行探索性和机制研究，但这些研究很少对临床试验的安全性判定起关键作用 。 类器官的复杂性也带来了实际障碍。其构建和维持需要大量时间、资源和技术专业知识，通常需要先进的成像和数据分析流程。对于资源有限或使用案例零散的组织，在内部维持这种专业知识可能不切实际。外包给拥有大量基于类器官的项目并维持稳健商业模式的专业合同研究组织，是内部努力的可行替代方案。此外，标准化和自动化协议以及简化工作流程的努力，对于释放类器官的更广泛效用并确保其整合到药物开发流程中至关重要。 （二）类器官在药物开发中应用的监管框架 首次人体临床试验前的非临床研究的目标是评估产品的药理活性，并确保 I 期临床试验中健康志愿者或患者的安全性。对于人类药物开发，FDA 法规不规定用于支持拟进行临床研究的药物在人类中可能具有合理安全性的研究类型或设计（无论是体内、体外还是计算机模拟）。尽管动物毒性研究已被证明对识别潜在人类风险至关重要，但寻找减少动物使用和开发有效替代方法的方法是一项重要工作 。监管环境中对更具人类预测性的转化平台和技术（如类器官）的需求巨大，这些平台和技术被定义为新方法学（NAMs）。美国国会于 2022 年通过了《FDA 现代化法案 2.0》，随后于 2023 年通过了《3.0 版本》，明确了药物开发中动物实验的使用要求。这要求 FDA 建立一个途径，允许相关实体申请批准将非临床测试方法用于特定使用场景。为此，FDA 启动了 “替代方法计划”，首先扩大替代方法用于监管目的的鉴定流程；其次为开发替代方法的外部利益相关者提供明确指导；第三通过应用研究填补信息空白，以推进新政策和指导文件的制定 。最近，FDA 宣布计划在单克隆抗体疗法和其他药物的开发中，用实验室环境中的一系列方法替代动物实验，包括基于人工智能的毒性计算模型、细胞系和类器官毒性测试 。 然而，要成功将类器官整合到临床前测试流程中，需要对其进行适当的表征、验证和鉴定，以向最终用户和卫生当局证明其适用于特定用途或使用场景 （专栏 3）。经济合作与发展组织（OECD）详细描述了验证原则，为如何评估特定使用场景下的类器官提供了有用指导 。此类评估是监管环境中使用的方法的标准 。跨行业联盟和卫生当局目前正在共同推进包括类器官在内的新方法学的监管认可工作，重点是制定标准和培训利益相关者 。理想情况下，由生物工程师、生物学家、毒理学家和病理学家组成的多元化科学家团队应协作开发类器官模型，并共同评估其使用场景 。 （三）监管展望 目前，经合组织测试指南中仅描述了少数基于细胞的测试方法。大多数毒性测试仍属于非指南方法类别 。最近，FDA 和 EMA 均提出了推进药物开发中新方法学监管认可的路线图，例如，EMA 的自愿数据提交程序（也称为安全港方法）旨在允许生成、汇编和审查数据，以帮助定义新方法学的使用场景 。此外，EMA 评估特定使用场景下新方法学的监管认可准备情况和局限性。该流程旨在建立对新方法学的信心，并可能支持基于定义的使用场景起草鉴定标准，进而指导模型开发者如何鉴定用于监管应用的新型模型 。FDA 的路线图侧重于在几年内取代单克隆抗体和其他药物的动物实验 。 因此，逐步将类器官作为新方法学纳入监管申报文件，以替代、减少和优化动物模型，具有一定潜力。但这不应损害药物评估所需的既定标准。必须保持谨慎的平衡 —— 既要拥抱这些创新方法（包括类器官），又要维护欧洲药品监管网络的严格标准。 参考文献：Human organoids as 3D in vitro platforms for drug discovery: opportunities and challenges. nature reviews drug discovery.