Vorasidenib

Basic Information 英文标题：Perioperative IDH inhibition in treatment-naive IDH-mutant glioma: a pilot trial 中文标题：未经治疗的IDH突变型胶质瘤围手术期IDH抑制治疗：一项初步试验 发表日期：21 August 2025 文章类型：Article 所属期刊：Nature Medicine 文章作者：Katharine J. Drummond | James R. Whittle 文章链接：https://www.nature.com/articles/s41591-025-03884-4AbstractPara_01 突变型异柠檬酸脱氢酶（mIDH）抑制剂显著改善了携带mIDH的WHO 2级胶质瘤患者的无进展生存期；然而，大部分患者仍会出现疾病进展，且对mIDH抑制的适应机制尚不明确。 通过术前和术后配对样本评估的围手术期研究有助于深入理解药物反应，并促进生物标志物的开发，但由于安全性和成本问题，此类研究在胶质瘤中较为罕见。 本研究开展了一项单臂、开放标签的可行性围手术期试验，纳入了未接受过放疗和化疗的mIDH1低级别胶质瘤患者，使用口服小分子mIDH1抑制剂safusidenib（AB-218/DS-1001b）进行治疗。 截至2024年11月8日，已有10名患者完成围手术期阶段，中位随访时间为14个月。 患者在术后继续接受safusidenib治疗，并持续进行安全性和有效性随访。 主要终点显示，开展两阶段围手术期试验具有可行性和可接受性。 一名患者出现与手术相关的严重不良事件，十名患者报告了与safusidenib相关的不良事件；大多数为1级，一例出现3级转氨酶升高。 肿瘤内2-羟基戊二酸的定量检测显示药物靶向作用明确，且与分化程序和神经兴奋性的改变相关，这些结果在事后分析中通过膜片钳电生理技术得到了功能验证。 综上所述，这些结果提供了关于mIDH抑制在胶质瘤中相关现象的详细研究。 本研究表明该围手术期研究方法的安全性和可行性，可在临床试验设计中广泛应用，为推动胶质瘤药物研发提供了概念验证。 ClinicalTrials.gov注册号：NCT05577416。MainPara_01 将突变型异柠檬酸脱氢酶（mIDH）抑制剂引入临床实践，用于治疗携带mIDH的低级别胶质瘤（LGG）患者，标志着精准医学的一项重要进展。 多项临床试验表明，这些疗法耐受性良好，可产生影像学应答，并延长无进展生存期。 mIDH1/2的获得性功能突变通过将α-酮戊二酸（α-KG）转化为致癌代谢物(R)-2-羟基戊二酸（2-HG），扰乱组蛋白过度甲基化、氧化还原稳态以及T细胞功能等表观遗传景观，从而驱动肿瘤发生。 尽管IDH突变发生在胶质瘤演化的早期阶段并持续存在，但大多数研究显示其益处主要体现在非强化的低级别肿瘤中，综合来看，提示在疾病早期、标准放化疗之前对mIDH进行靶向治疗可能最为有益。Para_02 围手术期研究为患者先进行活检，然后根据生物标志物信息接受新辅助治疗，最后进行手术切除，这为研究药物反应提供了独特的机会。 配对的未经治疗和经治疗后的组织样本可用于评估药代动力学（PK）和药效动力学（PD），确认靶点结合情况，并以内对照的方式明确预测性生物标志物，从而增强统计效力。 在胶质瘤中，这需要考虑安全性和经济成本因素。 因此，脑癌中开展的围手术期试验较少。Para_03 Safusidenib 是一种口服、可穿透血脑屏障的 IDH1-R132X 酶选择性抑制剂，在复发性 IDH1 突变胶质瘤中显示出良好的疗效，无论病灶是否增强。 我们报告了一项针对接受开放活检的 IDH1 突变型低级别胶质瘤患者的单臂围手术期临床试验（NCT05577416），在新辅助治疗使用 Safusidenib 后进行后续切除手术。 我们报告了该研究围手术期部分的终点指标，旨在评估 mIDH1 抑制对肿瘤及瘤周脑组织的生物学效应。 这项原理验证研究证实了围手术期试验结合配对样本的安全性、可行性以及患者的可接受性，并凸显了此类研究在揭示药物作用机制和指导未来联合治疗策略方面的潜力。ResultsClinical trial overview 临床试验概述Para_01 自2022年12月22日起，从一个中心招募了经影像学或病理学诊断为世界卫生组织（WHO）2级（G2）低级别胶质瘤（LGG）的患者。 符合条件的患者年龄须≥18岁，且无需紧急切除手术。 排除曾接受过放疗或化疗以及患有小脑或脑干病变的患者。 在A部分研究中，患者接受开颅手术、活检和腰椎穿刺获取脑脊液（CSF），并在开颅术前及最大安全切除术前服用safusidenib（每次250毫克，每日两次，持续22至36天），并在末次给药后5小时内重复进行腰椎穿刺（图1a）。 患者在继续进行的辅助治疗阶段（B部分）中继续使用safusidenib。 A部分的主要研究目标是评估开展两阶段外科研究的可行性和可接受性。 次要目标包括确定计划性活检继而手术的毒性和安全性，确认药物的生物学活性，并评估safusidenib的药代动力学（PK）及抗肿瘤活性。 探索性目标包括评估耐药机制和肿瘤体积的动态监测。 Fig. 1: Perioperative study safely delivers safusidenib to inhibit mIDH1. - 图片说明 ◉ a，临床试验方案。WGTS，全基因组转录测序。在A部分中，先前未经治疗的WHO 2级或3级（G2/3）mIDH1胶质瘤患者（n = 10）先进行活检，随后接受28天的safusidenib治疗，然后进行切除手术（术前5小时内给予safusidenib剂量）。下图显示了用于转化研究的材料。◉ b，描绘组织病理学、全基因组测序和甲基化情况的癌基因图谱（n = 7例星形细胞瘤，A-01至A-07；n = 3例少突胶质细胞瘤，O-01至O-03）。A-04的转化组织样本肿瘤纯度低（0%），被排除在后续转化探索性终点分析之外。NS，无显著性差异。◉ c，各参与者随时间变化的T2/FLAIR序列肿瘤体积（cm³）的容积分析。◉ d，完成调查的8名研究参与者的研究参与者感知调查（RPPS）结果。每个问题的回答选项已标示。◉ e，在safusidenib治疗后切除时间点，safusidenib在血浆（ng/ml）、脑脊液（ng/ml）和肿瘤组织（ng/g）中的浓度（n = 10）。◉ f，在safusidenib治疗后切除时间点，每名参与者体内肿瘤组织（ng/g）与血浆（ng/ml）中safusidenib浓度的比较（n = 10，t检验）。◉ g，按每位参与者配对分析safusidenib治疗前和治疗后肿瘤组织中2-HG含量的定量分析（n = 10）。图中显示safusidenib治疗后2-HG浓度的变化。星号表示A-04（肿瘤纯度低）取自非肿瘤组织（配对t检验）。◉ h，空间代谢组学检测参与者O-01在safusidenib治疗前和治疗后样本中内源性2-HG（质荷比：209.10；加合物：M + IsoProp + H）在10 µm像素分辨率下的信号强度（上图）。下方为信号强度的核密度图。◉ i，通过LC–MS非靶向分析检测衣康酸（n = 9名参与者，配对t检验）和柠檬酸（n = 9名参与者，配对t检验）。每个箱线图中的方框表示四分位距（IQR），中间线条为中位数，须线延伸至1.5 × IQR范围内的最远数据点。参与者图例同c图。◉ j，LC–MS/MS分析safusidenib治疗前与治疗后H3组蛋白经典甲基化和乙酰化水平的变化（n = 7名G2级患者）。◉ k，按每位参与者配对分析safusidenib治疗前和治疗后肿瘤组织中H3K9和H3K27单甲基化修饰的定量分析（n = 8）。每个箱线图中的方框表示四分位距（IQR），中间线条为中位数，须线延伸至1.5 × IQR范围内的最远数据点。◉ 图a使用BioRender.com绘制。源数据Para_02 报告时，共筛选了12名参与者，其中10名完成了A部分第18项（图1a、表1和补充表1）。 截至2024年11月8日数据截止时，研究仍在进行中，B部分的中位随访时间为14个月。 一名参与者在活检前撤回知情同意，另一名参与者活检显示胶质增生而被退出研究（图1a）。 所有参与者均根据世界卫生组织中枢神经系统第五版（CNS5）分类诊断为非强化型WHO 2级或3级胶质瘤，并伴有IDH1激活突变。 60%的参与者（6名）在首次诊断时入组，此前未接受过手术治疗（表1）。 7名参与者诊断为星形细胞瘤（A-01至A-07），3名诊断为少突胶质细胞瘤（O-01至O-03）（图1b和扩展数据图1a）。 采用神经肿瘤学中低级别胶质瘤疗效评估标准及容积分析显示，所有患者在接受一个周期的萨呋西尼布治疗后疾病稳定（图1c和扩展数据图1b–f）。 大多数患者接受了大体或接近全切除，限制了B部分的疗效评估；其中两名患者病情稳定，一名患者在13.4个月后病情进展并退出研究。 这些结果支持两阶段研究设计的可行性，并提示早期疾病控制效果，但需进一步随访以评估疗效及耐药机制。 Table 1 Patient demographics and baseline characteristics 表1 患者人口统计学和基线特征 Safety and feasibility of clinical trial 临床试验的安全性和可行性Para_01 为解决脑癌围手术期侵入性试验的担忧，我们纳入了一项经过验证的研究参与者感知调查。 十名参与者中有八名对向家人和朋友推荐该研究持积极态度，尽管研究过程较为繁重（图1d和扩展数据图1g）。 在A部分期间，萨伏西替尼耐受性良好。 七名参与者（70%）报告了与萨伏西替尼相关的不良事件，均为《不良事件通用术语标准》第5版1级。 截至2024年11月8日数据截止时，在研究期间（A部分和B部分）发生的所有不良事件均已报告，未发现新的安全性信号（表2和补充表2）。 有一例3级丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高，同时伴有2级天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高，原因是与合并用药发生药物相互作用所致。 在停药36天后，ALT和AST恢复至1级，随后以每日两次、每次125毫克的剂量重新开始使用萨伏西替尼。 之后35天，ALT和AST再次升高至2级，需停止用药，并开始使用皮质类固醇治疗，直至转氨酶水平恢复正常。 没有其他患者需要减量用药。 报告了1-2级关节痛，经简单镇痛治疗后症状缓解。 1级皮肤毒性较为常见，通过局部处理或口服抗组胺药可有效应对。 Table 2 Summary of common and treatment-related adverse events (TRAE) with respect to neurosurgical intervention and safusidenib 表2 神经外科干预和萨伏西尼布治疗相关的常见不良事件及治疗相关不良事件（TRAE）汇总 Para_02 神经外科相关的不良事件包括一例严重的术后偏瘫，由手术损伤引起，与治疗无关，在术后15个月时表现为上肢中度无力，下肢肌力正常。 其他事件包括腰椎穿刺后出现的低颅压性头痛，以及一名已知肿瘤相关性癫痫的患者在开始使用safusidenib之前发生的癫痫发作住院。 总体而言，研究达到了主要终点，围手术期设计安全、可行，且被受试者所接受。Pharmacokinetics and biomarker response post-safusidenib 萨伏西尼布给药后的药代动力学和生物标志物反应Para_01 在血浆和肿瘤中检测到治疗浓度的Safusidenib（图1e）。 Safusidenib的平均肿瘤浓度为每克2654纳克（3.3微摩尔），高于对R132H和R132C突变体的半数最大抑制浓度，且血浆浓度在时间上具有一致性，平均肿瘤与血浆浓度比为0.33（扩展数据图2a）。 血浆浓度与肿瘤浓度之间表现出直接相关性（图1f）。Para_02 使用液相和气相色谱-质谱法（LC-MS 和 GC-MS）定量2-HG，评估了safusidenib的靶向活性，结果显示，与用药前（平均80.9 μM；范围15.47–223.99 μM）相比，用药后2-HG减少了88%（7.85 μM，范围2.5–21.6 μM）（图1g）。 safusidenib的浓度变化趋势与2-HG的变化呈相关性（扩展数据图2b）。 样本A-04中未观察到2-HG的降低，基因组学分析显示其肿瘤纯度较低（图1b），提示该样本用于转化研究终点的组织可能为肿瘤周围组织。 因此，A-04被排除在转化研究终点分析之外。 与先前的研究一致，脑脊液（CSF）（0.037 ± 0.009 μM）和血浆（0.071 ± 0.018 μM）中均未检测到显著浓度的2-HG（扩展数据图2c,d）。 接下来，我们使用基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI-IMS）来确认safusidenib在切除肿瘤组织中的广泛渗透。 在一个较小的队列中（n = 3对配对样本），我们显示safusidenib用药后，2-HG（m/z = 209.10）的动态丰度有所降低（图1h和扩展数据图2e）。 在mIDH患者样本中的全代谢物评估此前仅发现少数代谢物发生改变；然而，尚未对配对患者样本进行过分析。 我们鉴定出一组在使用safusidenib后丰度发生改变的代谢物（图1i，扩展数据图2f和补充表3）。Para_03 尽管所有参与者的2-HG总体水平有所降低，但在六名参与者中仅检测到全局甲基化水平的轻微变化（此前已证明与mIDH相关），且未发现显著的局部甲基化改变（图1b）。 类似地，在异种移植模型和患者样本中，抑制mIDH后也观察到全局甲基化水平的轻度变化。 由于2-HG会抑制Jumonji-C结构域组蛋白去甲基化酶家族的活性，我们通过液相色谱-质谱法（LC–MS）研究了组蛋白修饰的变化。 我们发现，在使用safusidenib治疗后，赖氨酸甲基化水平降低，尤其是H3K9和H3K27的单甲基化修饰减少（图1j,k），同时伴随组蛋白乙酰化的增加（扩展数据图2g），提示在整体上，safusidenib治疗后转录活动增强。Safusidenib treatment induces differentiation in tumor cells Safusidenib治疗可诱导肿瘤细胞分化Para_01 在探索性分析中，为了研究safusidenib诱导的机制变化，我们对配对的肿瘤样本进行了单细胞核RNA测序（snRNA-seq）（图2a，扩展数据图3a–c以及补充表4）。 通过标志物表达、与单细胞RNA测序结果的比较以及推断的拷贝数变异，将恶性细胞与非恶性细胞区分开来（图2a和扩展数据图3d,e）。 聚类注释定义了恶性细胞状态为星形胶质细胞样（AC-like）、少突胶质细胞前体样（OPC-like）和祖细胞，非恶性细胞则包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、OPC、脉管系统、神经元和免疫细胞（图2a和扩展数据图3f）。 safusidenib改变了细胞类型和状态的比例（图2b和扩展数据图3g–j）。 使用基因集富集分析（GSEA）对用药前和用药后配对的肿瘤细胞进行比较，分析中包含定义肿瘤细胞状态、分化后的星形胶质细胞、少突胶质细胞和OPC的基因集（图2c和补充表5）。 重现已有的近期分析结果，我们鉴定出112个显著富集的基因集（86个在用药前，26个在用药后）（扩展数据图4a）。 用药后AC-like基因集显著富集，并且整体显示出高度一致性（扩展数据图4b）。 然而，在个体层面，这表现为九名参与者中有五名的所有肿瘤细胞中AC-like群体增加（扩展数据图3h）。 调整分析方法以明确考虑配对取样的设计后，我们观察到用药后OPC-like、少突胶质细胞和OPC基因集上调，但关键的是，AC-like基因集不再显示上调（用药前有34个富集，用药后有209个富集；图2c和补充表5）。 Fig. 2: Altered gene programs following safusidenib treatment. - 图片说明 ◉ a，UMAP图展示了通过snRNA-seq在9名参与者治疗前和治疗后使用safusidenib的匹配样本中识别出的158,487个细胞核。左上：safusidenib治疗前和治疗后条件；右上：由Numbat确定的非恶性与恶性细胞；下部：胶质瘤和正常细胞状态的注释UMAP聚类。◉ b，在治疗前和治疗后的safusidenib样本中每种细胞状态的比例（n = 9名参与者）。细胞类型图例同a。◉ c，使用GSEA对匹配的治疗前和治疗后safusidenib样本中所有肿瘤细胞进行比较。每个点代表一个基因集，颜色表示该基因集是否属于胶质瘤程序；上方标注了富集最显著的通路。x轴显示GSEA标准化富集评分，y轴显示调整后的P值。直线表示显著性阈值（调整后P = 0.05）。◉ d，点图展示了来自GSEA分析中每种细胞类型群体的显著基因集的关键语义术语摘要。每个点表示与该术语相关的显著通路比例，并用颜色编码表示富集方向——治疗前或治疗后。旁边的条形图展示了肿瘤区室中每个语义术语对应的显著基因集数量及其富集方向。◉ e，在AC样肿瘤细胞中，safusidenib治疗前相对于治疗后，AC样程序的log(FC)与IFN程序的log(FC)的比较（n = 9名参与者，t检验）。◉ f，未治疗患者（无治疗，仅手术）与参与者O-01在safusidenib治疗前和治疗后组织中首次手术和活检以及第二次手术的CD68代表性免疫组化染色。CD68+细胞百分比定量结果（无治疗组，n = 6对匹配样本；safusidenib组，n = 10对匹配样本）。均值±标准误（无治疗组：首次手术和活检为14.6 ± 3.1%，手术时为30.3 ± 2.6%；safusidenib组：首次手术和活检为12.3 ± 3.5%，手术时为21.6 ± 5.5%）。每个单独的点代表一对匹配的患者样本。参与者图例同e。◉ g，参与者A-05在使用safusidenib前后的血管系统示例（每种条件n = 3）。单细胞空间图（Voronoi）展示了CD69转录本的表达、细胞状态注释以及免疫荧光检测的蛋白表达（CD31、CD68、mIDH和GFAP），并标明其在组织中的位置（比例尺为1 mm；注释图例见a）。插图比例尺为100 µm。源数据Para_02 对使用沙弗西替尼前后的AC样和OPC样肿瘤细胞的分析支持了分化诱导，表现为少突胶质细胞和OPC基因集的上调（扩展数据图4c–f）。 使用沙弗西替尼后，肿瘤细胞上调了与嘧啶合成和炎症相关的通路及基因集，同时下调了与核糖体活性相关的基因集（图2c,d）。 与正常组织和增殖性更强的胶质母细胞瘤相比，mIDH胶质瘤中的核糖体生物合成上调，这表明mIDH抑制使基础核糖体活性恢复正常。Inflammatory response associated with safusidenib 与沙伏西尼相关的炎症反应Para_01 mIDH抑制后，恶性细胞在转录水平上调炎症反应相关基因，提示可能促进向类AC程序转变。 在此，类AC细胞群表现出与炎症相关的基因集最显著的上调（图2d），并在使用safusidenib治疗后显示出干扰素（IFN）信号变化与类AC基因集活性之间的强正相关性（图2e）。 类AC细胞群中增强的IFN信号似乎通过环状鸟苷酸-单磷酸腺苷合酶（cGAS）—干扰素基因刺激因子（STING）通路激活，并且与转录因子HIF-1α的表达呈正相关，提示所鉴定出的炎症程序是对细胞应激的一种适应性反应（扩展数据图4g）。 尽管mIDH与HIF-1α表达之间的关系尚存争议，但已有研究表明IFN可独立于mIDH促进HIF-1α的表达；因此，其直接作用机制尚不明确。 虽然safusidenib治疗后IFN信号的变化在全球范围内未显示出与免疫细胞数量增加或其活化状态的相关性，但我们观察到了局部变化（扩展数据图4h）。 通过CytoSpace结合单核RNA测序进行的空间转录组分析发现，在一名患者中，治疗后肿瘤细胞与免疫细胞共定位区域表现出更强的炎症反应（P < 0.001，Welch t检验；扩展数据图4i和图5a以及补充表6），进一步支持mIDH抑制剂可引起类AC肿瘤细胞的细胞应激反应，从而导致炎症反应及可能的局部免疫细胞活化。Para_02 在九名参与者中的七人中观察到使用safusidenib后免疫浸润的改变，表现为巨噬细胞和T细胞增加（扩展数据图3j），并通过CD68免疫染色得到验证（图2f）。 鉴于在三个接受safusidenib治疗后的匹配空间转录组样本中的两个样本中这些细胞类型位于血管周围，推测它们可能是浸润性的，该结果通过免疫荧光染色得到验证（图2g以及扩展数据图5b、c和图6）。 这些发现支持了之前一项关于突变型IDH抑制剂的新辅助研究，该研究发现CD8+ T细胞浸润增多，并且免疫细胞活化相关基因表达上调。 为了探讨免疫浸润是否由活检引起，我们整理了一个独立的低级别胶质瘤患者队列（补充表7），这些患者接受了两次手术且期间未接受任何治疗（平均间隔44天，范围为14至77天）。 值得注意的是，CD68+细胞在使用safusidenib后以及仅进行手术的队列中均有所增加（图2f、g以及扩展数据图6），提示单纯手术即可导致免疫浸润，可能通过伤口愈合反应介导。Progenitors show cellular adaptability post-safusidenib 祖细胞在使用沙福辛尼后表现出细胞适应性Para_01 我们探究了与肿瘤细胞状态相关的基因集是否始终受到safusidenib的调控。 这揭示了祖细胞群体的独特行为，其特征是缺乏G1期，并且TOP2A高表达，在药物处理后上调了少突前体细胞（OPC）和OPC样基因集，同时下调了分化星形胶质细胞基因集（图2d以及扩展数据图4e、f和7a、b）。 这一转变得到了safusidenib处理后祖细胞群中BMPER（P = 0.002）和MYRF（P = 0.002）显著上调的支持（扩展数据图7c）。 BMPER的表达在血管生成中起关键作用，可通过调节BMP4信号通路促进少突胶质细胞分化，并提高再髓鞘化速率。 MYRF编码一种在少突胶质细胞成熟过程中髓鞘形成所必需的转录因子。Para_02 safusidenib治疗后 OPC 样程序的显著上调促使我们使用 CytoTRACE2（参考文献41；图3a）分析祖细胞在用药前（n = 772）和用药后（n = 1,130）的分化潜能。 我们发现，活检时的祖细胞比AC样肿瘤细胞具有更高的分化潜能（P < 0.001），其行为更接近OPC样肿瘤细胞（P = 1；扩展数据图7d）。 safusidenib治疗后，祖细胞的分化潜能进一步增加（P < 0.001；图3a）。 我们还将祖细胞投射到二维蝴蝶图上，其中每个象限对应一种肿瘤细胞状态（图3b），结果显示safusidenib治疗后的祖细胞在肿瘤细胞状态上表现出更高的异质性（治疗前log2(entropy) = 1.83，治疗后log2(entropy) = 1.96，P < 0.001）。 综上所述，这表明祖细胞的细胞适应性增强，可能反映了对mIDH抑制的直接响应。 Fig. 3: Safusidenib alters transcriptional patterns in progenitor cells. - 图片说明 ◉ a，仅显示snRNA-seq肿瘤群体的UMAP图，根据使用CytoTRACE2计算的分化潜能评分进行着色（左图）。 accompanying密度图展示了在safusidenib治疗前和治疗后条件下祖细胞群内潜能评分的分布。◉ b，二维蝴蝶图可视化，每个象限对应一种肿瘤细胞状态：类间充质样（MES-like）、类神经前体样（NPC-like）、类星形细胞样（AC-like）和类少突胶质前体样（OPC-like），定义来自Neftel等人的研究。SC1和SC2代表Neftel等人定义的单细胞基因特征评分1和2。每个祖细胞核的位置反映了其在safusidenib治疗前和治疗后样本中的相对特征评分。细胞密度由等高线表示。◉ c，响应者（正值）与非响应者（负值）样本中祖细胞转录程序与肿瘤细胞状态的比对，数据来源于Spitzer等人的研究。◉ d，比较11个未经治疗的低级别胶质瘤（LGG）肿瘤中AC-like和OPC-like肿瘤细胞的三元图，展示转录代谢程序：三羧酸循环（K）、乳酸（L）和糖酵解（G）。◉ e，在空间代谢组学的100 × 100 µm区域内，对代谢物（α-KG（m/z: 254.08；加合物：M + ACN + Na）和葡萄糖（m/z: 203.05；加合物：M + Na））强度评分的定量分析，该区域的AC-like/OPC-like肿瘤细胞比例通过连续的空间转录组切片（样本A–E）计算得出（下方标注示例比例区域）。比例尺为10 μm。右侧上方为标注细胞类型的示例肿瘤区域，右侧下方为葡萄糖空间强度图。比例尺为100 μm。◉ f，基于空间转录组注释相对于空间代谢组学结果，比较AC-like与OPC-like肿瘤细胞状态中α-KG和葡萄糖含量的定量分析（Welch t检验）。均值±标准误。细胞类型图例同e图。◉ g，通路‘三羧酸循环障碍’和‘谷氨酰解与癌症’的条形图。显著性通过GSEA计算（n = 9名参与者，基于置换检验）。◉ h，柠檬酸循环和核苷酸合成的简化示意图。蓝色表示safusidenib治疗前丰度增加；橙色表示治疗后丰度增加。UMP：尿苷一磷酸；CIT：柠檬酸；OAA：草酰乙酸；MAL：苹果酸；FUM：延胡索酸；SUC：琥珀酸；ICIT：异柠檬酸；cis-ACO：顺式乌头酸；ND：未检测到。数据来自LC–MS非靶向分析（n = 9名参与者）。◉ i，比较响应者与非响应者样本中祖细胞在mIDH抑制剂治疗前和治疗后转录代谢程序的三元图，涉及三羧酸循环（K）、乳酸（L）和糖酵解（G）。Inh：抑制剂。Progenitor state shift associated with metabolic environment 与代谢环境相关的祖细胞状态转变Para_01 为了确定向少突前体细胞（OPC）样基因集的转变是否提示治疗反应，我们分析了一个已发表的队列数据29，该队列包含一名治疗有反应的少突胶质瘤患者和一名无反应的星形细胞瘤患者，这些患者在使用ivosidenib前后均具有单细胞转录组数据（扩展数据图7e）。 在前体细胞群体中，无反应患者的MYRF表达升高，而在有反应患者中基本保持不变（扩展数据图7f）。 此外，在前体细胞中，向OPC样基因程序的转变与无反应者的特征相关，而有反应者则表现为星形细胞样（AC-like）基因程序的上调（图3c）。 这表明细胞状态可能与mIDH抑制剂的治疗反应有关。 鉴于IDH通过三羧酸循环（Krebs cycle）促进代谢物活性，我们假设不同肿瘤细胞状态之间的能量消耗差异可能影响对mIDH抑制的反应。 为了进一步研究，我们建立了一个独立的低级别胶质瘤队列（n = 3例少突胶质瘤，n = 8例星形细胞瘤），进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（补充表8和扩展数据图7g），发现正常星形细胞和AC样细胞中糖酵解特征显著富集（P < 0.001，Welch t检验），而OPC样细胞则显著富集三羧酸循环（P < 0.001）和乳酸代谢（P < 0.001）相关基因程序（图3d和扩展数据图7h）。 为了验证转录水平推断的代谢特征，我们对连续切片样本进行了空间转录组学和代谢组学分析。 通过转录组数据将AC样富集和OPC样富集的像素划分为连续区间，并检测各区域内的代谢物丰度，我们验证了在AC样富集区域葡萄糖丰度较高，而在OPC样富集区域α-酮戊二酸（α-KG）丰度较高（图3e,f和扩展数据图8a）。 因此，代谢重编程可能参与了mIDH抑制剂疗效的作用机制。Para_02 为了进一步研究mIDH抑制的影响，我们比较了使用safusidenib前后中心碳代谢的变化。 与有氧代谢相关的代谢物在治疗后丰度发生改变（三羧酸循环障碍P = 0.002；谷氨酰胺分解及癌症P = 0.005；图3g，扩展数据图8b和补充表3），这与mIDH活性受到抑制的结果一致。 治疗前与还原性三羧酸循环相关的代谢物水平升高，在使用safusidenib后下降，同时氧化循环中的下游代谢物相应增加（图3h）。 这些数据表明，从机制上讲，safusidenib抑制了肿瘤中mIDH1的酶学功能。 为了从转录层面分析应答者与非应答者样本中的通路变化，我们比较了前体细胞中与三羧酸循环、糖酵解以及乳酸生成相关的基因表达情况（图3i）。 非应答者样本在mIDH抑制后显示出向三羧酸循环和乳酸相关基因特征转变的趋势，而应答者样本则基本保持不变。 与OPC样富集结果一致，经safusidenib处理的样本与ivosidenib非应答者样本相似，提示该队列患者总体获得持久应答的可能性有限（扩展数据图8c,d）。 鉴于这些发现来自临床试验的A部分，未来分析将结合生存结局进一步评估这些结果。Safusidenib treatment decreases synaptic signaling 萨富西尼布治疗会降低突触信号传导Para_01 在神经元中，与突触信号传导相关的基因集被下调，与此同时，在所有肿瘤细胞中，与神经活动和发育相关的基因集在使用safusidenib后出现上调（图2d）。 胶质瘤细胞利用突触电化学信号传导来驱动癌症的生长和侵袭。 使用safusidenib后突触信号传导的下调可能表明该药物存在此前未被识别的直接或间接作用机制。 先前的研究表明，在IDH突变型胶质瘤模型中，2-HG会增强神经元兴奋性，而在mIDH被抑制并伴随2-HG减少后，兴奋性降低。 我们发现突触信号传导减少，并得到神经调节物质腺苷水平降低的支持（图4a和扩展数据图9a）。 观察到类似的全局代谢物改变，包括cAMP信号通路的减弱（图4b），提示safusidenib治疗后可能发生了突触信号传导的减弱。 事实上，对safusidenib引起的代谢物变化进行通路分析揭示了神经炎症和谷氨酸能信号等突触相关通路（图4c），表明在safusidenib治疗后，神经活动在代谢层面发生了改变。 Fig. 4: Altered neuron signaling following safusidenib treatment. - 图片说明 ◉ a，空间代谢组学检测参与者O-01在使用safusidenib治疗前后的腺苷信号强度（上方）；下方：平滑强度的核密度图。◉ b，在LC–MS代谢组学数据中‘Adora2b介导的抗炎细胞因子产生’通路的条形图（基于GSEA置换检验，n = 9名参与者），以及使用safusidenib前后环磷酸腺苷（cyclic AMP）的归一化代谢物比例（n = 9名参与者，配对t检验）。每个箱线图中的方框表示四分位距（IQR），中心线为中位数，须线延伸至1.5倍IQR范围内的最远数据点。◉ c，在LC–MS代谢组学数据中‘神经炎症与谷氨酸能信号通路’的条形图（基于GSEA置换检验，n = 9名参与者）。◉ d，使用GraphSAGE计算得出的三名参与者在使用safusidenib治疗前后的转录微环境空间图。◉ e，基于转录特征的微环境细胞分配以归一化比例表示。柱状图显示各微环境中细胞所占比例。◉ f，参与者O-01在使用safusidenib治疗前后的样本中神经元（红色）的空间分布图，及其对应的密度等高线图（左侧）和关键神经元层标志物（右侧）。◉ g，通过CytoSPACE整合推断出的参与者O-01在T7微环境中神经元‘突触信号通路’在使用safusidenib治疗前后的平均log表达水平。插图：细胞类型注释，以及区域内神经元亚型比例的环形图。◉ h，匹配的治疗前后样本中，每种转录微环境中表达突触信号基因的神经元比例的点图。点的颜色代表标准化后的平均log表达水平。◉ i，一个填充了5-(和6)-甲基罗丹明生物胞素的第2/3层锥体神经元示例。插图：全细胞膜片钳记录下对电流阶跃注入（130 pA）的电压反应（代表性记录，n = 25个细胞，来自7名参与者）。比例尺：20 mV，200 ms。◉ j，来自单个患者在使用safusidenib治疗前后获得的锥体神经元的全细胞膜片钳记录示例（120 pA阶跃）。◉ k，神经元的放电频率（20 pA阶跃，1200 ms），左侧为j图中所示神经元及患者的数据，右侧为所有神经元的平均值（治疗前：n = 11个神经元，4名参与者；治疗后：n = 14个神经元，3名参与者），采用方差分析（ANOVA）。数据表示为均值±标准误。◉ l–n，分析使用safusidenib治疗前后组织中神经元的阈值电流（rheobase，t检验）（l）、膜电阻（t检验）（m）和静息膜电位（RMP，t检验）（n）。图l和图m显示均值±标准误。Para_02 为了克服微环境组成上的差异，我们对与突触信号相关的基因表达变化进行了空间上的研究。 我们通过在三名患者肿瘤组织治疗前后进行空间转录组分析，鉴定了具有相似转录动态的微环境区域（图4d和扩展数据图9b）。 这有助于识别出T7区域，在该区域神经元占所有细胞类型的25%以上，但肿瘤细胞仍然广泛存在（图4e和扩展数据图9c）。 对神经元层标志物表达的研究揭示了皮层样结构的形成，表明该微环境代表了肿瘤的前沿边缘（图4f和扩展数据图9d）。 在T7微环境中定位神经元后，便可对用药前后相似微环境中的变化进行比较分析。 与我们通过单核RNA测序获得的不同神经元群体数据一致（扩展数据图9e），在一名同时拥有治疗前后样本且均包含足够前沿组织的参与者中，利用CytoSPACE推断出的T7区域内神经元突触信号平均表达水平在用药前后均呈下调趋势（log(倍数变化(FC)) = −0.360；图4g）。 此外，我们还分析了空间转录组基因面板中包含的突触信号相关基因，结果显示，在T7区域的神经元中，这些基因的平均表达水平在使用safusidenib后有所下降（图4h）。Para_03 由于我们的研究结果提示突触信号传导减弱，我们进行了事后分析以评估沙伏西尼布对皮层神经元兴奋性的影响。 对沙伏西尼布治疗前样本（n = 11个神经元；4名参与者）和治疗后样本（n = 14个神经元；3名参与者；图4i和扩展数据图10）的离体组织切片中的锥体神经元进行了全细胞膜片钳记录。 使用沙伏西尼布后，神经元的整体兴奋性降低，诱发放电频率显著下降（P = 0.018；图4j,k）。 相应地，阈强度显著增加（100 ± 21 对比 163 ± 20 pA；P = 0.043；图4l），膜电阻显著降低（107 ± 14 对比 65 ± 7 MΩ；P = 0.009；图4m）。 沙伏西尼布对静息膜电位（−66.6 ± 1.2 对比 −67.5 ± 1.0 mV；P = 0.551；图4n）、动作电位宽度（1.4 ± 0.04 对比 1.6 ± 0.05；P = 0.124）或阈值（−42.4 ± 0.9 对比 −43.5 ± 0.5 mV；P = 0.199）无显著影响。 结合突触信号传导相关基因和代谢物的下调表现，治疗后神经元兴奋性的降低表明沙伏西尼布改变了肿瘤的电生理环境。DiscussionPara_01 通过在围手术期临床试验中对配对样本采用多组学技术，我们研究了mIDH抑制剂治疗mIDH1胶质瘤的直接药物作用机制。 证实了先前的研究结果，我们显示safusidenib具有良好的安全性和耐受性，并且围手术期研究设计是可行且安全的，达到了主要研究终点。 尽管目前对于上述标准治疗性手术操作的资金支持、后勤考虑和伦理合理性仍存在争议，本研究支持胶质瘤临床试验设计的范式转变，为评估药物在脑内的疗效提供了强有力的框架。 重要的是，该研究强调了重复组织取样虽然在神经肿瘤学中传统上受限，但只要优先保障安全性、受试者的参与度和体验，仍可为治疗开发提供重要信息。 这一理念将在GIANT试验（NCT06816927）中进一步评估，以检验其在新诊断胶质母细胞瘤中的可行性。Para_02 我们证实，mIDH抑制可导致2-HG水平降低、代谢改变、组蛋白单甲基化减少以及大多数肿瘤细胞状态中分化诱导，从而在星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤中均建立了生物学适应性。 对配对的参与者样本的研究使我们能够明确mIDH抑制对组蛋白修饰的影响，这可能导致了转录层面的变化，进而驱动不同肿瘤群体间的差异。 我们发现，前体细胞表现出独特的行为，包括去分化和异质性增加，提示在mIDH抑制后细胞适应性增强。Para_03 需要预测性生物标志物来识别可能对mIDH抑制产生反应的患者，并揭示耐药机制。 尽管本试验的生存结果数据尚不成熟，但对接受mIDH抑制剂治疗的有反应和无反应患者的重新分析揭示了肿瘤反应中主导细胞状态的重要性。 有反应表型显示出代谢程序的动态变化减少，并在前体细胞中表现出增强的AC样特征，这表明代谢对mIDH抑制的适应能力可能是反应不佳的指标，从而为INDIGO试验中观察到的少突胶质细胞瘤和星形细胞瘤患者反应差异提供了见解。 Krebs循环利用能力更强的适应性，可能与OPC样细胞富集增加相关，与无反应表型相关，提示反应可能独立于所有患者中观察到的2-HG水平降低。 2-HG是否可作为可靠的预后预测因子，将在试验B部分完成时得以确定。Para_04 尽管mIDH抑制剂已开始进入临床应用，但由于应答率较低且疾病进展几乎不可避免，因此需要开展合理的联合治疗研究。 基于降低2-HG可能恢复T细胞功能的研究发现，目前已启动与免疫检查点抑制剂的联合治疗研究（NCT05484622）。 本文证实，在手术和mIDH抑制的作用下，T细胞和巨噬细胞会向肿瘤内迁移；然而，手术操作本身的贡献以及是否足以启动对免疫检查点抑制剂的应答，仍有待验证。 利用mIDH抑制所诱导的代谢脆弱性的联合治疗研究代表了另一种策略，最近有证据表明mIDH肿瘤对从头嘧啶核苷酸合成存在高度依赖性。 在使用safusidenib治疗后，我们发现嘧啶代谢通路的补救途径中代谢物丰富，而嘌呤中间产物稀少；因此，与嘧啶抑制剂的联合使用需谨慎考虑。 这与谷氨酰胺酶抑制不同，后者具有协同作用。 这些研究结果还必须考虑正在浮现的耐药机制，包括在白血病和胆管癌中观察到的IDH1/2二次位点突变或亚型转换。 在接受safusidenib治疗后病情仍进展的患者中，2-HG水平持续偏低，提示胶质瘤中存在mIDH非依赖性耐药机制，凸显了探索其他耐药机制和联合治疗策略的必要性。Para_05 胶质瘤与神经元之间的相互作用代表了癌症的一个新特征。 我们发现，mIDH抑制可降低患者的神经元兴奋性，这可能有助于解释治疗后观察到的突触信号减少现象。 这可能反映了来自锥体神经元的突触驱动减弱，这些神经元与邻近细胞形成兴奋性连接。 有趣的是，mIDH抑制在肿瘤细胞中增加了相关通路的基因表达，同时却减少了神经元中的突触信号。 尽管尚需进一步研究，但我们提出这种上调可能是由于肿瘤细胞接收到的来自神经元的突触输入减少所致，其机制可能类似于稳态突触可塑性。 总体而言，这些发现揭示了mIDH抑制如何改变肿瘤微环境，并可能影响患者的癫痫发作风险。 事实上，已有研究发现2-HG能够促进mIDH突变型胶质瘤周围神经元的放电活动，而在体外使用mIDH抑制剂可消除这一效应，并在临床前模型中减少癫痫发作。 此外，体内液体中天然存在的L-2-HG浓度升高与L-2-羟基戊二酸尿症相关，该疾病会导致小脑功能障碍，包括癫痫发作。 这一机制联系得到了近期INDIGO研究结果的支持，该研究报道在接受vorasidenib治疗的患者中癫痫发作显著减少。Para_06 本研究受限于样本量较小，尽管通过使用匹配样本并在结果上与先前研究表现出高度一致性而减轻了这一局限。然而，仍需要进一步的长期临床结局数据来验证我们关于mIDH抑制后代谢转换所关联的耐药机制的假设。 虽然我们的发现未在体外模型中进行验证，而低级别mIDH胶质瘤在体外复制具有挑战性，但我们通过对匹配的受试者样本进行大量测量，在多个层面一致地支持了研究结果，从而部分弥补了这一不足。Para_07 总之，这些结果不仅揭示了mIDH抑制的直接和间接影响，而且还提供了概念验证，即围手术期方法可以为胶质瘤的药物开发提供参考。MethodsTrial design and oversight 试验设计与监督Para_01 这是一项单臂、单中心、开放标签的围手术期研究，旨在探讨萨伏西尼布在IDH1突变型低级别胶质瘤患者中的安全性、耐受性及生物学活性（ClinicalTrials.gov，NCT05577416）。 首位受试者于2022年12月21日入组，最后一位受试者于2024年4月9日完成切除手术。 临床数据截止日期为2024年11月8日。 本研究遵循国际人用药品注册技术协调会药物临床试验质量管理规范指南和《赫尔辛基宣言》原则，并获得皇家墨尔本医院人类研究伦理委员会（HREC 2022.003）的伦理批准。 所有受试者均签署了书面知情同意书。Participants 参与者Para_01 年龄≥18岁、东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态评分为0-1分，并经MRI证实为需要非紧急手术切除的低级别胶质瘤（aLGG）的成年患者符合入组条件。 仅接受过既往手术且已知携带IDH1突变的aLGG患者也被纳入。 主要排除标准包括具有高级别胶质瘤的影像学特征、既往接受过化疗或放疗，以及小脑或脑干肿瘤。 符合条件的患者需具备足够的肝肾功能，并且病灶可通过神经肿瘤学中低级别胶质瘤疗效评估标准进行评价。Treatment 治疗Para_01 手术第一阶段包括开颅活检和通过腰椎穿刺获取脑脊液样本。 该手术通过开颅进行，所选入路便于在后续再次打开以彻底切除肿瘤，从而在初次手术时即可进行充分的活检或部分切除。 所有手术均由四位具有神经肿瘤学专业背景的神经外科医生完成，并与神经外科主要研究者达成共识后实施。 肿瘤样本的选择依据是术中神经导航影像确认的肉眼可见异常组织。 送检的肿瘤样本体积至少为1立方厘米。 在第二次手术中，取用了靠近初次活检部位的肿瘤组织。Para_02 手术过程中，为了到达肿瘤并安全地实现广泛的切除边缘，会移除肿瘤周围的正常脑组织作为手术入路的一部分。 在标准治疗程序中，这些组织通常被丢弃，但可用于研究。 我们机构已通过伦理审批的组织库流程中， routinely 获得患者同意，以收集肿瘤周围脑组织。 该组织在肉眼和影像学上（神经导航成像）表现为正常，但紧邻肿瘤，因此已被肿瘤浸润。 用于电生理检查时，取包含皮层和白质的部分，避免电凝 artifact，并保留所有正常的解剖层次，立即置于冰冷的含碳合气溶液中，溶液成分（单位为 mM）包括：125 NaCl、25 NaHCO3、5 HEPES、1 CaCl2、6 MgCl2、3 KCl、1.25 NaH2PO4 和 10 葡萄糖。Para_03 在活检后恢复期（7至28天）并确认组织病理学和IDH1突变后，患者开始口服safusidenib，每次250毫克，每日两次（21至35天）。允许进行一次剂量减少，但不允许剂量递增。通过体格检查、生命体征、体重、功能状态、心电图以及包括血糖监测在内的实验室评估来监测安全性。Para_04 治疗后，患者通过腰椎穿刺进行脑脊液采样，并计划进行肿瘤切除。切除范围以及是否使用手术辅助手段（如术中磁共振或结合皮层定位的清醒手术）由主治神经外科医生与神经外科主要研究者协商后自行决定。Independent cohort 独立队列Para_01 选取了一个包含11名低级别胶质瘤（LGG）诊断患者的比较队列（补充表8），用于生成参考单核RNA测序、空间代谢组学和转录组学数据（n = 11）。 这些患者来自皇家墨尔本医院神经外科脑与脊柱组织库。Surgery-only cohort 仅手术队列Para_01 建立了一个诊断为低级别胶质瘤（LGG）的对照队列（补充表7），这些患者在3个月内接受了两次手术，期间未接受任何干预治疗，以确定单纯手术的影响。 这些患者来自皇家墨尔本医院神经外科脑与脊柱组织库。Research Participant Perception Survey 研究参与者感知调查Para_01 参与者在手术切除后至少3个月时完成了经过验证的25项研究参与者感知调查短表，以获取有关人口统计学、参与研究过程及与研究团队的体验、对整体研究经历的评价，以及关于参加、退出或继续留在研究中的各种原因的数据。Pharmacokinetics 药代动力学Para_01 在使用safusidenib前后采集了血液、脑脊液和肿瘤组织，用于药代动力学分析。 血液在第8、15和28天（±2天）纵向采集，采集时间点为给药前即刻，采集至含EDTA的试管中。 全血在4°C条件下以1500 × g离心10分钟，然后分离血浆层并立即在干冰上速冻。 脑脊液在4°C条件下以500 × g离心10分钟，之后将上清液立即在干冰上速冻。 组织样本也立即在干冰上速冻。Para_02 药代动力学分析在Frontage Labs进行。 对于脑组织样本，加入3毫升水以制备脑匀浆基质；然后取30微升匀浆，加入内标物（CANM-2895a，溶于DMSO/乙腈中）。 对于脑脊液样本，取30微升，用2% Tween 20稀释，并加入内标物。 对于血浆样本，取50微升，加入内标物。 使用乙腈（用于组织和脑脊液）或含1.25%乙酸的乙腈溶液（用于血浆）作为沉淀剂，加入上述样品中，混合物在1,000 rpm下涡旋震荡5分钟。 样品在6,000 × g下离心5分钟，然后取200微升上清液与200微升水混合，混合物在1,000 rpm下再次涡旋震荡5分钟，随后进行离心处理。Para_03 样品（10 μl脑脊液和组织，5 μl血浆）被注入配备Shimadzu Shim-pack Velox PFPP 2.1 × 50 mm、2.7 µm高效液相色谱柱的液相色谱串联质谱（LC–MS/MS）系统（Sciex Triple Quad 6500+，配Shimadzu HPLC泵LC-30AD和自动进样器SIL-30ACMP）中。 萨伏西替尼和CANM-2895a在LC–MS/MS中的离子跃迁分别为534.9至156.1和545.0至159.1 m/z。 梯度流动相由水中含0.02%乙酸与乙腈按不同比例混合组成，流速为0.6 ml/min。 每份样品的总运行时间为2.5分钟（脑脊液）、1.6分钟（组织）或2分钟（血浆）。Para_04 定量通过校准曲线进行（脑脊液和血浆：1–1,000 ng/ml；组织：5–5,000 ng/g）。 对定量下限的分析显示，相对误差在±20%以内，变异系数不超过20%。 质量控制样品的分析结果显示，相对误差在±15%以内，变异系数不超过15%。Immunohistochemistry 免疫组织化学Para_01 IDH1-R132H（Dianova IDA-H09；1:50稀释；抗原修复：CC1，100°C下32分钟）、KI67（Dako M7240；1:100稀释；抗原修复：CC1，100°C下32分钟）、ATRX（Sigma HPA001906；1:300稀释；抗原修复：柠檬酸缓冲液，HIER法，100°C下32分钟）、TP53（Leica Biosystems NCL-L-p53-DO7；1:50稀释；抗原修复：柠檬酸缓冲液，HIER法，100°C下32分钟）、GFAP（Cell Signaling Technologies 3670；1:200稀释；抗原修复：EDTA缓冲液，HIER法，100°C下32分钟）、CD68（DAKO PG-M1；1:200稀释；抗原修复：胰蛋白酶缓冲液，HIER法，100°C下32分钟）的免疫组织化学染色。苏木精和伊红染色切片及免疫组织化学切片使用3D Histech Brightfield（20倍）进行扫描，并通过CaseCentre在线软件进行处理。Immunofluorescence 免疫荧光Sample preparation 样品制备Para_01 切片使用二甲苯脱蜡，随后用梯度乙醇系列（100%–30%）进行洗涤；然后在Tris-EDTA缓冲液中于100°C进行32分钟的热诱导表位修复。 封闭液（用于胞质染色的含5%羊血清和0.1% Tween 20的溶液）在4°C下应用于切片，孵育1小时。 切片在4°C下与CD68（DAKO PG-M1，1:200稀释）、GFAP（Cell Signaling Technologies 3670，1:1,000稀释）、CD31（1:500，Abcam ab134168）、IDH1-R132H（Dianova IDA-H09，1:100稀释）、MAP2A（Thermo Fisher PA110005，1:1,000稀释）和Phalloidin（Thermo Fisher A22287，1:1,000稀释）抗体共同孵育过夜。Para_02 使用相应的二抗Alexa Fluor 594 抗兔抗体（Thermo Fisher A32740，稀释比例1:1,000）、Alexa Fluor 647 抗小鼠抗体（Thermo Fisher A32728，稀释比例1:1,000）、Alexa Fluor 488 抗鸡抗体（Thermo Fisher A11039，稀释比例1:1,000）和Alexa Fluor 488 抗小鼠抗体（Thermo Fisher A11004，稀释比例1:1,000）在室温下孵育1小时。随后将载玻片在室温下与DAPI孵育10分钟，用FluoroMount-G溶液（Thermo Fisher 00-4958-02）封片，并于4°C保存直至成像。Image acquisition and analysis 图像采集与分析Para_01 使用 Olympus Slideview VS200 玻片扫描仪在 ×20 放大倍数下进行全玻片扫描。 相邻切片通过 wsireg（v0.3.5）进行配准，配准图依次设置为刚性、仿射和相似性变换。 全玻片图像完成配准后，裁剪出感兴趣区域。Radiology analysis 放射学分析Volumetric analysis 体积分析Para_01 在活检前后以及切除术前后，使用液体衰减反转恢复（FLAIR）MRI序列对肿瘤进行半自动分割。通过Brainlab软件（Brainlab，iPlanNet v2.3.1.215.1）在各个时间点测量FLAIR高信号区域来计算体积。Nucleic acid extraction 核酸提取Para_01 在使用safusidenib治疗前后获取的肿瘤组织被置于RNAlater稳定溶液（Invitrogen）中，至少保存24小时，随后或储存于-80°C，或保留在冰箱中直至进行核酸提取。 组织通过研钵和研杵、液氮与QIAshredder（QIAGEN）或转子-定子匀浆器结合QIAshredder进行破碎和匀浆处理。 使用AllPrep DNA/RNA微型试剂盒（QIAGEN），按照制造商的说明，从匀浆后的组织中提取DNA和RNA。 通过QIAamp DNA血液微型试剂盒（QIAGEN），按照制造商的说明，从采集在EDTA采血管或无细胞DNA血液采集管（Streck）中的血液上层白膜层提取生殖系DNA。Whole-genome profiling 全基因组分析Para_01 使用赛呋西尼治疗前后的肿瘤样本基因组DNA以及匹配的种系DNA，进行全基因组测序的文库构建。采用200 ng的起始量，使用Illumina TruSeq DNA Nano试剂盒，在墨尔本大学癌症研究中心（澳大利亚墨尔本）的Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序，正常样本测序深度为40倍，肿瘤样本为80倍，并使用Illumina DRAGEN（v4.2版本）进行序列比对。 检测到的基因组变异根据临床意义，依据分子病理学协会、美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院指南，按证据等级进行分析和分类。Epigenetic analyses 表观遗传学分析Sample preparation for histone modification analysis by MS 用于组蛋白修饰质谱分析的样品制备Para_01 将等量（20 mg）的冷冻前和服用safusidenib后的脑肿瘤活检样本转移至组织研磨管（tissueTUBES，520001，Covaris），并与1 ml研磨管（miliTUBE，520130，Covaris）连接。 样品被反复敲击直至形成粉末状。 然后将组织研磨管倒置，使样品转入研磨管中。 加入500 µl预冷的匀浆缓冲液（60 mM KCl、15 mM NaCl、4 mM MgCl2、15 mM HEPES、0.5% Triton X-100、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、Roche蛋白酶混合物），并在10 °C条件下进行超声处理，持续6分钟，入射峰值功率为150 W，每爆发200个循环，占空比为10%（E220聚焦超声仪，Covaris）。 样品在4 °C、16,000 g条件下离心30分钟。 上清液储存于−20 °C，沉淀部分则进一步处理，加入75 µl 0.2 M H2SO4，并在4 °C、1,000 rpm条件下于台式恒温混匀仪中进行过夜酸性提取。 酸提取的组蛋白按照先前描述的SP3方法进行处理。 然而，MoleQlar Analytics GmbH开发的专有步骤已被添加，以调整该方法以适应组蛋白的特定性质。 在37 °C消化2小时后，通过加入5 µl 5%三氟乙酸（TFA）对样品进行酸化，并迅速涡旋混匀。 将磁珠置于磁力架上固定，通过将上清液转移至新管中回收肽段。 使用真空浓缩仪将样品干燥，并加入20 µl 0.1%甲酸（FA）重新溶解，使肽浓度达到约0.2 µg/µl。 准备用于质谱分析的样品储存在−20 °C。LC–MS analysis of histone modifications 组蛋白修饰的液相色谱-质谱分析Para_01 每个样品取200 ng肽段，在C18柱（Aurora Elite TS，15 cm × 75 μm内径，1.7 μm，IonOpticks）上进行分离，使用溶剂A（水含0.1%甲酸）和溶剂B（乙腈含0.1%甲酸）的梯度从5% B升至25% B，流速为300 nl/min，梯度时间为49分钟（Vanquish Neo UHPLC系统，Thermo Fisher），随后直接喷入Exploris 240质谱仪（Thermo Fisher Scientific） 质谱仪采用全扫描模式，用于鉴定和定量人组蛋白H3.1和组蛋白H4的N端肽段的特异性碎片离子 全扫描MS谱图（m/z 250至1,600）在m/z 400处分辨率为60,000（自动增益控制目标为3 × 10⁶） 典型的质谱条件如下：喷雾电压1.9 kV；无鞘气和辅助气体流速；毛细管加热温度300 °CQuantification of histone modifications 组蛋白修饰的定量分析Para_01 使用Skyline（v23.1.0.455）对双电荷和三电荷肽段质量进行提取离子色谱分析，数据处理由此完成。 峰的选取由人工完成。 使用重标记精氨酸的内标肽段（13C6；15N4）来确认正确的保留时间，并用于信号归一化，因为所有重标内标物在所有样品中的添加浓度均相同。 采用积分峰面积值（MS1总峰面积）进行后续计算。 内源性翻译后修饰信号根据加入的重标内标物信号的变化进行归一化，并采用中位数归一化方法。 每种修饰在同一肽段中的百分比，是通过该结构修饰肽段与所有同位素相似肽段总和的比值计算得出。 因此，使用MS1总峰面积值来计算所观察到的修饰肽段相对于整个肽段总量的相对丰度百分比。 组蛋白H3.1未修饰肽段（氨基酸41–49）被用作总组蛋白H3.1的指示指标。 对于共洗脱的同量异位修饰，采用三个特异性的MS2碎片离子进行定量。 这些离子的平均积分值用于计算它们各自对同量异位MS1峰的贡献（例如H3K36me3和H3K27me2K36me1）。Visualization 可视化Para_01 为了检测每种组蛋白单甲基化修饰，我们创建了一个热图，展示用药前和用药后样本之间相对丰度（中位数标准化）的log2(FC)值。 此外，我们还创建了箱形图，以可视化每位参与者组蛋白修饰的相对丰度，从而比较用药前和用药后的状态。 采用配对t检验和Wilcoxon检验对翻译后修饰的相对丰度进行统计分析，并使用Benjamini–Hochberg方法（基于中位数标准化数据的多重检验校正程序）进行显著性判断。Single-nuclei RNA expression profiling 单核RNA表达谱分析Experimental procedure 实验步骤Para_01 给药前和给药后组织置于干冰上速冻，并在−80 °C保存直至进行细胞核分离。 所有细胞核分离操作均使用预冷缓冲液并在预设为4 °C的离心机中进行。 将组织转移至含有匀浆缓冲液（250 mM蔗糖、25 mM KCl、5 mM MgCl₂、10 mM Tris pH 8.0、1 mM DTT、0.2 U/μl RNasin核糖核酸酶抑制剂和0.1% Triton X-100）的Dounce匀浆器中，匀浆前孵育1分钟。 根据具体组织样本，使用松配合或紧配合的研杵以及1 ml移液枪头对组织进行匀浆处理。 匀浆液通过30 μm滤网过滤后，在500 × g条件下离心5分钟。 弃去上清液，将沉淀物重悬于洗涤和重悬缓冲液（含1%牛血清白蛋白、1 mM DTT和0.2 U/μl RNasin核糖核酸酶抑制剂的杜氏磷酸盐缓冲液（PBS））中。 根据沉淀物大小，再进行一次或两次额外的洗涤步骤。 使用台盼蓝染色和血细胞计数板对细胞核进行计数。 对于新鲜细胞核的单核RNA测序（snRNA-seq），在Chromium控制器上每样本设定目标获取10,000个细胞核，随后按照制造商说明使用Chromium Next GEM单细胞5’试剂盒v2（双索引）进行文库构建。 对于固定细胞核的snRNA-seq（独立LGG队列），根据制造商说明，使用Chromium Next GEM单细胞固定RNA样本制备试剂盒（10x Genomics）对细胞核进行约20小时的固定处理。 在Chromium控制器上每样本同样设定目标获取10,000个细胞核，随后根据制造商说明使用人类转录组Chromium Fixed RNA试剂盒（4反应×4条形码）进行文库构建，其中探针杂交时间约为19小时。 文库在NextSeq 2000或NovaSeq X（Illumina）平台上进行测序，目标为每个细胞核获得20,000条读段。 在临床队列中，我们平均每细胞核获得30,558条读段。 在独立LGG队列中，我们平均每细胞核获得44,932条读段。Para_02 所有图表均使用ggplot2（v3.5.1）创建，所有计算分析方法均使用默认参数运行，除非另有说明。Preprocessing 预处理Para_01 数据首先使用Cell Ranger（10x Genomics，v7.1.0）进行处理，以将FASTQ格式文件比对到hg38参考基因组，并进行唯一分子标识符计数。 对每个样本应用CellBender（v0.3.0）来估计并去除环境RNA。 经过CellBender过滤后的输出文件进一步使用R（v4.4）进行处理。 为了识别并去除双细胞（doublets），我们使用Scrublet（v0.2.3），根据多重率设置估计阈值，上限截断值设为0.25。 我们使用scater（v1.28.0）计算细胞核的线粒体基因表达百分比，并采用中位绝对偏差（MAD）方法动态设定最低唯一分子标识符计数和最低检测基因数的阈值。 我们根据计算出的阈值对细胞核进行过滤，并剔除线粒体基因表达百分比大于10%的细胞核（见补充表4）。 总体而言，共有158,487个细胞核通过了质量控制，平均每个细胞核检测到2,416个基因。 随后，我们使用scater结合SingleCellExperiment（v1.22.0）对原始基因表达矩阵进行对数归一化处理。 我们使用scran（v1.33.1）对基因方差进行建模，以鉴定出前5,000个高变基因。 我们利用多维尺度分析图全面探究了可能影响整体基因表达的潜在混杂因素。 所考察的混杂因素包括年龄、性别、IDH突变、诊断结果、采样距离上次给药的时间、肿瘤位置以及活检前、活检后或肿瘤体积的变化。 所有被考察的混杂因素均未表现出导致明显的聚类现象。Sample integration 示例集成Para_01 我们将所有过滤后的数据集合并，并再次采用MAD方法进行样本范围的过滤，以设定最低计数的通用阈值。我们进一步过滤了总检测计数低于1,000的低质量细胞核。经过质量过滤后，合并的数据集包含178,567个细胞核。Para_02 为了在不同样本间进行数据整合，我们使用了scVI（版本1.1.5）工具包中的变分自编码器。 简而言之，scVI模型创建了一个低维度的共享潜在空间来表示细胞核。 我们使用默认参数生成潜在空间表示，并采用X_scVI潜在空间表示进行后续处理。 接下来，基于scVI降维后的结果，我们生成了均匀流形近似与投影（UMAP）嵌入，其中spread设置为3，mindist设置为0.1，最近邻数（n_neighbors）为15。 需要注意的是，该低维度共享潜在空间表示仅用于细胞类型注释，而不用于差异基因表达分析。Cell type annotation 细胞类型注释Para_01 基于scVI降维后的数据，使用bluster（v1.10.0）中实现的Leiden聚类算法并采用默认参数对细胞核进行聚类。对整个数据集的聚类产生了36个细胞簇。 使用SingleR（v2.2.0）对细胞核进行自动注释，所使用的参考数据集包括：一个经下采样处理的胶质母细胞瘤（GBM）整合数据集、一个模拟正常神经发育层次结构的GBM肿瘤数据集，以及一个涵盖从胎儿期到成年期正常人类前额叶皮层的发育数据集。Para_02 根据SingleR预测的细胞类型标签和标记基因表达，首先对手动注释了各个簇。 鉴定出的正常细胞类型包括血管、免疫、神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和OPC，肿瘤细胞类型包括AC样、OPC样和前体细胞（血管：IGFBP7，COL4A2；免疫：PTPRC，CD68；神经元：C1QL3，NPTXR；少突胶质细胞：MBP，ERMN；星形胶质细胞：NTRK2，MGST1；OPC：CNP，CSPG4；AC样：AQP4，APOE；OPC样：APOD，OLIG1/2；前体细胞：TOP2A）。 对免疫和神经元类群中的细胞核按照上述流程进行了重新聚类。 根据预测的标签和已知的标记基因对免疫细胞的各个簇进行了注释。 在免疫类群中，鉴定出了包括巨噬细胞在内的髓系细胞类型，以及由T细胞组成的淋巴样类群，同时也鉴定了小胶质细胞（巨噬细胞：CD163，CD6；T细胞：CD4，CD8A，FOXP3；小胶质细胞：P2RY12，CX3CR1）。Para_03 对包含11个LGG样本的独立队列进行了预处理、整合和注释，其流程与赛伏西尼布治疗前后的样本相同，最终质量控制步骤采用MAD过滤，并额外保留了细胞核数量少于1000的样本。最终得到分布在77个簇中的75,963个细胞核，在初步人工注释后，这些细胞核被进一步聚类并以较小的子集进行注释。鉴定出一个低质量的细胞群，其特征是线粒体reads水平较高，该群体已被排除在后续分析之外。CNV analysis CNV分析Para_01 为了单独评估每个样本中的体细胞拷贝数变异（CNV），我们采用了Numbat66（v1.4.0）。 该算法通过标准化测序深度并划分基因组来检测拷贝数与预期值的偏差，从而识别拷贝数变异。 实施拷贝数变异分析有助于区分恶性细胞（存在异常拷贝数变异）与非恶性细胞核，从而帮助验证所分配的细胞类型注释。Para_02 我们通过Numbat识别出一个模糊的群体（n = 10,691个细胞核），该群体检测到的基因数量较多，但未检测到拷贝数变异（CNVs）。因此，我们将该群体排除在后续分析之外。 与我们使用其他技术获得的结果一致，参与者A-04在服用safusidenib前后的样本中均被检测出肿瘤纯度较低，因此也被排除。 最终，在合并和处理后的数据集中，我们共保留了158,487个细胞核。Cell cycle analysis 细胞周期分析Para_01 我们使用 Seurat（v5.1.0）中的 CellCycleScoring 函数，基于 G2M 和 S 基因集为细胞分配 G1、G2M 和 S 期的细胞周期评分。Differentiation potential analysis 分化潜能分析Para_01 我们使用CytoTRACE2（v1.0.0）来推断恶性细胞核的分化潜能。CytoTRACE2是一种可解释的深度学习框架，用于表征细胞潜能并描绘单细胞分化图谱。 我们采用成对t检验来评估在用药前和用药后条件下肿瘤群体之间分化潜能评分的显著性差异。Para_02 此外，针对治疗前和治疗后萨伏西替尼样本中的祖细胞肿瘤群体，构建了二维元模块蝴蝶图。 用于构建元模块图的肿瘤基因集来自 Neftel 等人的研究。 使用熵值计算工具（entropy v1.3.1）根据祖细胞元模块分配比例计算香农对数2熵值分数。 我们采用置换检验（1000次置换）来评估不同治疗条件下祖细胞群体异质性之间的差异。Correlation plots 相关性图Para_01 我们进行了相关性检验，以研究AC样肿瘤群体中IFN与AC样程序之间的关联。 该分析使用了来自snRNA-seq数据的每位参与者治疗前后样本之间每个基因模块平均对数表达差异。 AC样和IFN基因程序的筛选方法如前所述（‘基因集获取’部分）。 通过使用stats软件（v4.4.1版）进行线性回归来评估显著性。 我们同样对IFN程序与STING/HIF1-α程序之间，以及IFN程序与治疗前后免疫细胞比例变化之间的相关性进行了检验。Ternary plots 三元相图Para_01 我们使用三元图评估了细胞状态群体对糖酵解、 Krebs 循环和乳酸代谢模块的代谢偏好。这三个代谢基因集的获取方法如（‘基因集获取’）部分所述。 对于来自11个LGG样本独立队列中AC样和OPC样肿瘤群体的每个细胞核，我们计算了每个模块的平均对数表达值。 三个模块的得分被归一化，使每个细胞核的三项得分之和为1。 这些归一化后的得分随后使用ggtern（v3.5.0）在三元图中进行可视化，并按细胞类型着色。Para_02 我们还创建了一个箱线图，以可视化独立LGG队列中每个细胞类型在不同供体间糖酵解基因模块的平均log表达水平。 为了评估糖酵解模块在不同供体间的平均log表达水平的富集情况，我们采用Welch t检验，将AC样和星形胶质细胞类型分别与其他所有细胞群进行比较，但排除当前正在分析的细胞类型。 接下来，我们使用成对t检验评估了OPC样肿瘤细胞与AC样肿瘤细胞相比在三羧酸循环和乳酸代谢模块上的富集情况。 P值通过Benjamini-Hochberg方法进行校正，以纠正多重检验问题。Differentially expressed gene analysis 差异表达基因分析Para_01 使用limma（v3.61.9）和edgeR（v4.3.11）对每个细胞群分别进行差异表达基因（DEG）分析。 在分析之前，排除了在少于1%的细胞核中表达的基因，以减少数据中的噪声。 随后将计数和元数据汇总，以创建伪批量（pseudobulk）分析谱，从而实现治疗前与治疗后safusidenib样本之间的比较。 为确保统计的稳健性，仅保留包含至少10个细胞核的汇总样本。 我们使用'pseudoBulkDGE'进行差异表达基因分析，以建模处理条件对基因表达的影响，同时考虑个体间的变异。 设计矩阵中包含了样本处理状态（治疗前和治疗后）以及个体作为协变量的项，关注的系数为与处理状态相关的差异表达。 显著性通过低于0.05的错误发现率（FDR）阈值来确定。 此外，我们还对肿瘤区室（包括恶性细胞类型：AC样、OPC样和前体细胞）进行了差异表达基因分析。 此外，使用RRHO2（v1.0）图评估当个体患者从分析中剔除时结果的敏感性。 这证实了所有患者之间结果具有广泛的共识性。Gene set acquisition 基因集获取Para_01 我们基于对先前已发表研究的广泛回顾，整理了与恶性细胞状态相关的基因集。 反映胶质瘤细胞发育层次的恶性基因集包括AC样、OPC样、NPC样和MES样程序。 同时，我们从多种来源汇总了反映正常大脑发育的基因集，此处标记为星形胶质细胞、OPC、少突胶质细胞以及G1/S和G2/M程序。GSEA GSEAPara_01 我们最初从差异表达基因分析结果生成的排序基因列表中进行了GSEA。对于每种细胞类型注释，我们使用−log10(P值)并结合log(FC)的方向对基因进行排序。然后使用fgsea（v1.30.0）进行GSEA分析，共纳入10,520个基因集：包括来自mSigDB（v10.0.2）的10,461个Gene Ontology基因集和50个特征基因集，以及4个恶性基因集和5个非恶性基因集（“基因集获取”）。此外，我们再次利用差异表达基因分析结果对肿瘤组分中的基因进行排序，并进行了GSEA分析。Para_02 针对每种细胞类型群体，以及肿瘤区室整体，我们根据GSEA结果生成了火山图。在这些图中，x轴表示标准化富集分数，y轴表示−log10（校正后的P值）。Para_03 显著富集的基因集根据生物学相关性以无监督的方式被归类到不同的语义术语中。 我们将这些信息汇总为一个点图，显示每种细胞类型群体中每个语义术语所包含的显著基因集的比例，并按富集方向进行着色。Para_04 对于每个肿瘤细胞群体，我们还根据基因是否包含在恶性AC样、OPC样、NPC样和MES样基因集中，对排序的基因列表进行了注释。然后，我们计算了每个排序列表中与特定胶质瘤状态相关的基因比例，使用30个基因的重叠窗口，并沿-log10(P值)到log(FC)方向以0.10的增量移动。Para_05 我们还按照Spitzer等人所述的方法进行了基因集富集分析（GSEA）。 简而言之，对于每种细胞类型注释，我们使用每个参与者治疗前和治疗后safusidenib样本的log(counts)数据 individually构建了bulk基因表达谱。 然后，我们计算了在治疗前和治疗后条件下，这些bulk表达谱中每个基因的平均表达水平。 为了准备GSEA分析，我们通过将治疗后safusidenib样本的平均表达减去治疗前样本的平均表达，计算log10(ratio)，从而生成了一个基因的排序列表。 随后，我们如前所述使用fgsea工具进行GSEA分析。 同样地，针对肿瘤组分，我们将恶性细胞类型（包括AC样、OPC样以及前体细胞合并）的表达数据生成bulk表达谱，并以相同方式进行了GSEA分析。Spitzer comparison 斯皮策比较Para_01 接下来，我们努力将这些GSEA结果与Spitzer等人发表的结果进行比较。 我们进行了秩-秩超几何重叠检验，利用RRHO2方法评估了两项研究中考虑所有细胞类型时排序列表的一致性。Para_02 为了比较细胞类型注释，我们使用Spitzer等人提供的匹配的少突胶质瘤数据集，通过SingleR对我们的单细胞数据集进行了自动注释。 我们还使用Jaccard指数来量化该比较中相似性的程度。Para_03 接下来，我们比较了一名有反应的患者（少突胶质细胞瘤）和一名无反应的患者（星形细胞瘤）在使用mIDH抑制剂前后的匹配祖细胞区室（每个病例n=1）。 我们首先计算了两名患者在用药前后样本中每个基因的log(FC)值。 然后通过将有反应患者的log(FC)值减去无反应患者的log(FC)值，生成了一个排序的基因列表。 最后，我们评估了该排序基因列表中与特定胶质瘤状态相关的基因所占比例，方法如前所述（‘GSEA’）。Para_04 我们还使用先前描述的类似方法（“三元图”），对来自应答者和非应答者样本的前体细胞生成了三元图，并根据治疗暴露状态对其进行着色。此外，我们绘制了每个条件下不同患者在代谢程序上的总体平均得分。Metabolomics 代谢组学Sample preparation 样品制备Para_01 在肝素采血管中的全血于4°C条件下以1500 × g离心15分钟，随后分离血浆层并用干冰速冻。 脑脊液在4°C条件下以500 × g离心10分钟，之后将上清液用干冰速冻。 用于整体代谢组学的组织样本用液氮冷冻。 用于空间代谢组学的组织样本则在液氮冷却的异戊烷浴中快速冷冻，然后储存于-80°C直至进行冷冻切片。 另有一个未处理的样本也按照相同的规格进行了处理。Bulk LC–MS 批量液相色谱-质谱Para_01 每个20毫克的组织样品通过Precellys 24组织匀浆仪（配备Cryolys冷却系统，Bertin Technologies）在500微升甲醇与Milli-Q水比例为3:1的溶液（含内标）中进行匀浆提取，用于LC-MS分析。 提取物在恒温混匀仪中涡旋并混合10分钟，以确保代谢物完全提取，随后在4°C条件下以18,213 × g离心10分钟，去除组织沉淀。Para_02 采用Orbitrap ID-X Tribrid质谱仪（Thermo Scientific）与Vanquish Horizon UHPLC系统（Thermo Scientific）联用，对样品中的极性分析物进行分析。 极性代谢物的分离在Merck SeQuant ZIC‐pHILIC色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm粒径）上进行，柱温维持在25 °C，流动相为溶剂A：20 mM碳酸铵（pH 9.0；Sigma-Aldrich）和溶剂B：100%乙腈。 梯度洗脱程序如下：时间（t）= 0.0 min，80% B；t = 0.5 min，80% B；t = 15.5 min，50% B；t = 17.5 min，30% B；t = 18.5 min，5% B；t = 21.0 min，5% B；t = 23–33 min，80% B，流速为300 μl/min。Bulk GC–MS 批量气相色谱-质谱法Para_01 对于GC–MS极性分析，将2 × 50 µl的组织裂解液和汇集的生物学质量控制样品转移至玻璃插件中，在旋转真空浓缩仪（RVC 2–33, CDplus）中20 °C条件下完全干燥，并用50 μl甲醇洗涤以确保彻底去除残留水分。 随后通过自动进样机器人（PAL RTC）进行两步在线衍生化处理：第一步为甲氧胺化反应，加入25 μl甲氧基胺盐酸盐（溶于吡啶，浓度为30 mg ml−1，Sigma），在37 °C下反应2小时；第二步为三甲基硅烷化反应，加入25 μl含三甲基氯硅烷的N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA + 1% TMCS），在37 °C下持续混合反应1小时。 衍生化后的样品在室温下平衡1小时，然后进样1 µl（分流比1:10），进入气相色谱–三重四极杆–质谱仪（GC–QqQ–MS）进行分析。Para_02 采用配备DB-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm，1 μm膜厚；Agilent Technologies）的GC-TQ8050NX（Shimadzu）进行极性代谢物分析。进样口温度保持在280 °C，载气为氦气（柱流量=1 ml/min）。气相色谱炉温从100 °C开始，保持4分钟，以10 °C/min升至320 °C，然后在320 °C保持11分钟。传输线和离子源温度分别为280 °C和200 °C。使用氩气作为碰撞诱导解离气体。Para_03 Shimadzu GCMSsolution实时分析软件（版本5.34）通过使用Shimadzu智能代谢物数据库（版本3）实现目标代谢物的检测，该数据库包含多达629种目标化合物，并提供多反应监测转换信息，包括前体离子、产物离子、碰撞能量、保留指数和保留时间，采集方法中最小驻留时间为2毫秒。 数据采用Shimadzu LabSolutions InSight软件（版本3.6）进行分析，通过对代谢物数据库中的定量离子和定性离子的多反应监测信号进行峰面积积分及对齐完成数据分析。Quantification of 2-HG 2-HG的定量分析Para_01 为了定量检测2-HG，使用同位素标记的代谢物（13C-2-HG）在生物基质中绘制标准曲线，以确定其生理范围。 确定生理范围后，将13C-2-HG加入提取溶剂中，并向所有研究样本中添加0.5 μM的13C-2-HG。Para_02 对于液相色谱-质谱分析，使用TraceFinder软件（版本4.1，Thermo Scientific）对同位素标记的代谢物和内源性代谢物区域进行靶向峰提取。 峰面积采用ICIS检测算法在默认设置下测定，平滑参数设置为9。 内源性代谢物浓度通过计算12C与13C的比值，并乘以加入的同位素标记代谢物浓度得到（即12C峰面积/13C峰面积 × 0.5 μM）。Para_03 对于气相色谱-质谱联用仪（GC–MS），使用岛津LabSolutions InSight软件获得12C和13C代谢物的峰面积。 代谢物的内源性浓度测定方法如上所述。 在GC–MS上，组织中2-HG的线性动态范围低于液相色谱-质谱联用仪（LC–MS），且在超过30 μM时观察到响应因子下降。 这可能是由于复杂的生物基质影响了衍生化效率，从而导致结果受到干扰。Statistical analysis of LC and GC metabolomics data LC和GC代谢组学数据的统计分析Para_01 数据分析在El Maven软件（v0.12.1）中进行。根据代谢物标准倡议，一级代谢物鉴定基于将精确质量和保留时间与Metabolomics Australia内部库中的550种真实标准品相匹配。 使用limma::removeBatchEffect函数消除批次效应。Para_02 我们使用多维尺度分析图全面研究了可能影响代谢物丰度的混杂因素。研究的混杂因素包括年龄、性别、IDH突变、诊断结果、末次给药到采样的时间间隔、肿瘤位置以及活检前、活检后或肿瘤体积的变化。所研究的混杂因素均未表现出导致聚类现象。Para_03 对于批量LC–和GC–MS数据中代谢物的差异分析，我们使用R基础包中的scale函数对每种代谢物的原始丰度计数进行逐行标准化。 随后，进行配对t检验以评估用药前与用药后样本之间差异表达代谢物的显著性。 为了评估代谢物的log(FC)，我们计算了用药后样本相对于用药前样本的平均标准化丰度比值的对数。 P值通过Benjamini–Hochberg方法进行多重检验校正，显著性阈值设定为0.1。Para_04 我们基于每个代谢物的log(FC)生成了表达量排序列表。 通路数据库是利用代谢组学通路关系数据库（RaMP-DB，v2.0）构建的，用于获取指定通路中的代谢元件。 对于每条通路，使用fgsea::fgsea函数计算富集得分，并进行2000次置换以获得经验P值。Spatial metabolomics 空间代谢组学Para_01 将冷冻组织直接切片至厚度为10 µm，贴附于镀有氧化铟锡的玻璃载玻片上（表面电阻为70–100 Ω）。 冷冻切片在冻干机（MODULYOD，Thermo Electron Corporation）中干燥30分钟，随后在施加基质前，使用MALDI-TOF质谱成像仪（iMScope QT）内置的光学显微镜采集光学图像。Para_02 使用iMLayer AERO（Shimadzu）进行α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA，P# C2020，Sigma-Aldrich）基质喷涂，以实现重结晶并获得细小的基质晶体，从而实现高灵敏度和高空间分辨率（在250°C时为0.7 µm）。 对于CHCA基质喷涂，采用乙腈/水（50:50，v/v）中含0.1%三氟乙酸溶液的10 mg ml−1 CHCA溶液，共喷涂8层。 喷雾过程中，载物台移动速度保持在70 mm s−1，喷嘴距离为5 cm，干燥时间为1秒，泵压分别恒定在0.1 MPa和0.2 MPa。Para_03 所有质谱成像实验均使用iMScope QT仪器（Shimadzu）进行。该仪器配备有激光二极管激发的Nd:YAG激光器和常压MALDI。数据采集时，激光强度设置为60，空间分辨率为10 µm，检测器电压设为2.36 kV，激光重复频率设为2000 Hz，去溶剂化线温度维持在250 °C，每个像素点累积50次激光照射。Para_04 数据被导入R语言中，并使用Cardinal（v2.6.5）进行分析，包括通过总离子流进行归一化、谱图平滑、基线校正、峰提取、对齐和过滤。 请注意，那些在仅含基质的样本制备（无组织）中检测到的峰，若在至少5%的像素中达到最低检测频率，则也被去除。 接下来，对处理后的谱图进行分箱，以获得最终的谱图信息。 采用k近邻方法将峰与人类代谢组数据库（v5.0）进行匹配。 对于每个峰，从生成的人类代谢组数据库峰列表中找出30个最近邻的匹配项，其质量偏差小于50 ppm。Para_05 为了有效可视化任何峰的强度，我们使用了高斯核密度估计。 核密度估计的计算是使用 stats::density 函数完成的。Alignment of spatial metabolomics and transcriptomics 空间代谢组学与转录组学的对齐Para_01 根据 Kriel 等人建立的原则，对未经处理的样本 A–E 的连续切片（补充表 7），分别进行空间代谢组学（MALDI-TOF）和转录组学（Xenium）数据的配准。 简而言之，使用 Python（v3.11）包 STalign（v1.0.1）将细胞中心坐标的 numpy 数组作为源数据集，代谢物坐标作为目标数据集进行处理。 预配准脚本先将数据集调整至相似的角度，随后将细胞中心位置进行光栅化，并手动确定用于配准的标志点。 然后，细胞中心坐标通过 Stalign 函数进行大变形微分同胚度量映射。 在将映射应用于代谢物坐标之前，先完成大变形微分同胚度量映射。 通过计算每个细胞周围 20 微米范围内网格点上各代谢物的平均表达量，将代谢物表达量与单个细胞对齐。Association of cell state and metabolite profile 细胞状态与代谢物谱的关联Para_01 为了可靠地捕获肿瘤核心区域内的细胞状态和代谢物谱型，我们从组织学上区分了肿瘤核心和前沿边缘。 将肿瘤核心区域划分为互不重叠的100 × 100 μm²网格。 计算每个网格中类似AC细胞与类似OPC细胞群体的比例。 仅将类似AC和类似OPC细胞合计占总细胞数50%以上的网格纳入后续分析。 利用空间定位信息，确定每个网格的平均代谢物丰度。 接着，我们拟合了代谢物丰度与该比例之间的线性回归，通过t检验对回归系数进行显著性分析，以确定其是否存在显著关联。DNA methylation profiling DNA甲基化谱分析Experimental procedure 实验步骤Para_01 使用从10例配对的沙伏西尼治疗前和治疗后肿瘤样本中获得的基因组DNA，在澳大利亚基因组研究设施进行了Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip检测（Illumina）Preprocessing 预处理Para_01 使用minfi（v1.50.0）提供的功能获取并预处理了原始DNA甲基化谱数据。 所有样本的探针平均检测P值均低于0.05，确保其被纳入分析。 我们进行了功能标准化，并根据检测P值过滤掉在一个或多个样本中失败的探针。 位于性染色体上、常见单核苷酸多态性位点10个碱基对范围内或被识别为可能交叉反应的探针也被移除。 共有813,133个CpG位点通过了质量控制。Global methylation 全局甲基化Para_01 我们计算了β密度值，以表征每个样本的CpG位点强度。 为了评估整体甲基化水平的显著变化，我们采用单侧Kolmogorov-Smirnov检验。Spatial transcriptomics 空间转录组学Para_01 在三个匹配的治疗前和治疗后safusidenib样本上进行了单细胞分辨率的10x Xenium空间转录组分析。 另一个未治疗且具有对应空间代谢组学数据的样本也按照相同流程进行了处理。 数据经过预处理，包括细胞核分割和标准化，并筛选保留了数据质量可靠的细胞核。 细胞核的注释采用结合手动与自动注释的分层策略进行。Gene panel design 基因 panel 设计Para_01 Xenium原位技术使用靶向面板来检测基因表达。 共选择了339个用于细胞类型鉴定的基因（见补充表6）。 探针包含两个与目标RNA互补结合的序列，以及一个编码基因特异性条形码的第三区域。 这种设计通过防止非特异性信号来确保高特异性。 当探针结合到目标RNA上后，成对的末端连接形成一个环状DNA探针。Experimental procedure 实验步骤Para_01 我们首先将一个10微米的福尔马林固定石蜡包埋组织切片置于Xenium载玻片（12 × 24毫米）上，随后进行脱蜡和通透处理，以使mRNA可被检测。 基因探针与两个阴性对照基因的杂交在50°C下过夜进行，探针浓度为10纳摩尔。 随后进行严谨性洗脱以去除未杂交的探针，并在37°C下进行另一轮探针连接及滚环扩增引物的退火，持续2小时。 生成的环化探针随后在4°C下酶促扩增1小时，接着在37°C下继续扩增2小时。 洗涤后，通过化学方法淬灭背景荧光。Para_02 然后使用全自动Xenium Analyzer仪器对组织切片进行成像。在Xenium Analyzer上，图像采集分为15个循环，包括试剂循环、孵育、荧光探针杂交、成像和探针去除。 在每个循环中，荧光标记的寡核苷酸与扩增的条形码结合，并测量Xenium四个荧光通道中每一个通道的荧光强度，用于识别目标基因。 仅保留质量值大于20的转录本。 在整个组织厚度范围内以0.75微米的步长采集z轴堆叠图像，并将这些图像拼接起来，从而生成组织内转录本的空间分布图。Nuclei segmentation 细胞核分割Para_01 为了将mRNA分配到细胞核中，从而进行下游分析，使用了10x Genomics提供的神经网络算法对DAPI图像进行细胞核检测。 仅出于可视化目的，使用了Xenium Analyzer（v3）提供的细胞分割结果。Post-staining 染色后Para_01 对于Xenium染色后的切片，无需额外的固定或通透处理。 切片在阻断缓冲液（含5%山羊血清和0.1% Tween 20的1× PBS）中于4°C孵育1小时。 切片用PBS-T洗涤三次后，加入1:1,000稀释的GFAP一抗（Thermo Fisher Scientific，PA1-10004）和1:500稀释的Alexa Fluor 647标记的鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，A22287），并于4°C过夜孵育。 然后将切片用冷的PBS-T洗涤三次，再加入二抗。 使用Alexa Fluor 488标记的抗鸡抗体（Thermo Fisher，A11039；稀释度1:1,000）在室温下孵育1小时进行染色。 随后切片在室温下与DAPI孵育10分钟，并用FluoroMount封片液封片。 切片于4°C保存，直至成像。Image acquisition 图像采集Para_01 在阶段校准后，使用×10放大倍数对整个样本区域进行低分辨率拼接扫描（256 × 256像素），并根据样本区域的每个部分相应绘制出感兴趣区域。 为了确保所有图像块均在合适的焦距下捕获，根据各部分的大小在其上添加了10至20个支持点。 添加支持点后，物镜切换为×25油浸镜头，并确定了405、488和647激光线的适当强度。 随后，手动校准每个支持点的z轴位置。 最终的图像块扫描以3,852 × 3,852像素的图像块尺寸、6的扫描速度在双向模式下进行，每个图像块采集5或6层的小型z轴堆栈。 拼接图像的正交投影和拼接工作通过ZEN Blue软件（v3.8）完成。Preprocessing 预处理Para_01 接下来，我们通过计算分割算法分配给每个细胞的核结合区域（到细胞核的距离等于零）内每个基因的分子数量，生成了单细胞表达矩阵。 我们去除了细胞核内总转录本少于20个的任何细胞（补充表4）。 然后，我们使用scater结合SingleCellExperiment对原始基因表达矩阵进行对数归一化处理。Cell type annotation 细胞类型注释Para_01 使用主成分分析（PCA）降低数据维度，并通过基于翻译泊松混合模型方法的全局最大似然法确定保留的主成分数量，该方法在intrinsicDimension（v1.2.0）中实现了20个最近邻。该方法已被证明对识别具有挑战性的亚群分离特别敏感。 我们还基于PCA生成了UMAP嵌入，设置spread为1，mindist为0.1，并使用15个最近邻（n_neighbors）。 随后通过bluster中实现的Leiden聚类方法对细胞进行基于PCA的聚类。 使用SingleR对每个样本的细胞分别进行自动注释，参考数据集包括一个经下采样处理的GBM整合数据集、一个模拟正常神经发育层次结构的GBM肿瘤数据集，以及一个涵盖从胎儿期到成年期正常人类前额叶皮层的数据集。 簇注释流程如前所述用于snRNA-seq数据，并额外识别出NPC样肿瘤群体和中性粒细胞免疫群体（NPC样：HES6、SOX11；中性粒细胞：ITGAX、SLC11A1）。Co-localization analysis 共定位分析Para_01 为了评估我们Xenium样本中与免疫细胞共定位的肿瘤细胞的炎症反应，我们使用了sf软件包（v1.0-17）提供的功能。 我们首先利用CytoSPACE36（“多组学整合”）推断出的整合空间转录组和单核RNA测序数据，通过sf_point创建了一个空间点几何对象。 接着，我们使用st_buffer在每个免疫细胞周围生成一个30微米的缓冲区，并将位于任何免疫细胞缓冲区内的肿瘤细胞归类为共定位。 采用Welch’s t检验比较与免疫细胞共定位的肿瘤细胞和未共定位的肿瘤细胞之间炎症反应模块的平均对数表达水平。Para_02 为了量化Xenium样本中免疫细胞类型（T细胞和巨噬细胞）与血管系统的共定位关系，我们使用了Statial（v1.7.0）提供的Kontextual分析框架。 简而言之，Kontextual是一种用于表征细胞类型之间空间定位关系的方法。 该程序通过引入第三类父代细胞群体的空间行为来对这些关系进行背景化分析，其方法基于L函数。 我们使用kontextCurve来估计每种目标免疫细胞类型相对于血管系统的定位关系，其中父代群体设定为所有免疫细胞。 Kontextual的分析范围从10 µm到250 µm，以20 µm为间隔（rs），并设置inhom为true。 为了生成图表，我们使用了kontextPlot。Transcript niches 转录生态位Para_01 为了识别基于转录本的微环境，我们采用了Vannan等人提出的深度学习框架，该框架使用GraphSAGE（v1）这种两跳图神经网络。 简而言之，为了推断数据中的结构，我们将所有检测到的细胞核转录本作为节点（忽略细胞分割），并根据欧氏距离构建节点之间的边，从而识别基于转录本的微环境。 在构建样本图之前，我们去除了质量较差的转录本（质量值qv < 20），并仅保留与细胞核结合的转录本（细胞核距离 < 0）。 对每个样本构建图后，再进行子采样以减少内存占用。 所有子图被聚合为一个联合图用于模型训练（共包含4,586,495个节点和113,592,432条边）。 图构建和训练所使用的其他参数均保持与先前报道一致。 我们在合并后的图上训练模型，共训练10个epoch，最终达到0.82的训练准确率。Para_02 我们使用训练好的模型提取了九个样本中所有转录节点的嵌入表示。随后，利用 PyCave（v3.2.1）库中的高斯混合模型（k = 8）对所有样本节点（总计 102,129,436 个节点）进行了聚类Para_03 对于每个样本，使用hexbin（v1.28.3）将转录本整合为六边形箱图，并通过ggplot2进行可视化。 采用统一的70宽度的箱体，以确保各样本之间的箱体大小一致。 每个箱体根据其所包含转录本中占主导地位的节点标签进行明确标注和颜色编码。 包含少于10个转录本的箱体被排除在分析之外。 通过计算每个细胞中心点到最近六边形箱体中心点的欧氏距离，确定细胞被分配到基于转录本的微环境。 我们采用简单的卡方检验方法，计算了各样本中每个基于转录本的微环境中细胞类型的富集得分。 我们还计算了分配到每个转录本微环境中的细胞比例，该比例在微环境之间以及细胞类型之间均进行了归一化处理。Para_04 对于每位参与者，我们系统地总结了基于转录本的微环境中共定位的关键突触信号基因在使用艾伏尼布前和使用后的表达情况。我们对这些计算出的比例进行了标准化处理，并排除了包含少于20个数据点的组合，以确保数据的可靠性。Multi-omics integration 多组学整合Para_01 对于每个样本，我们使用CytoSPACE36（v1.1.0）将空间转录组数据与其相应的单核RNA测序数据进行整合。 简而言之，CytoSPACE采用最短增广路径优化算法，将单细胞转录组与原位空间转录组数据进行比对。 因此，它提供了全局最优的细胞到空间中心点的分配结果，以及一个推断出的基因表达矩阵。 来自CytoSPACE的原始基因表达矩阵通过scater软件包进行了对数归一化处理。 这种整合使我们能够可视化此前由于Xenium数据集中有限的基因面板而无法检测到的基因模块。 为了生成推断基因模块表达的汇总图，我们使用了细胞的六边形分箱分配结果（转录微环境）。 我们首先利用CytoSPACE推断出的矩阵计算每个细胞中目标基因集的平均表达水平，然后将在同一六边形分箱内的细胞进行聚合，以计算每个分箱的平均表达水平。 在针对T7微环境的特定分析中，我们采用了相同的方法，仅单独聚焦于该微环境。Whole-cell patch-clamp recordings 全细胞膜片钳记录Slice preparation 切片制备Para_01 所有操作均经皇家墨尔本医院HREC批准（HREC编号为2001:85和2020:214）。 切除后（平均在手术后不到4小时），组织立即放入含以下成分的碳酸化溶液中（单位为mM）：125 NaCl、25 NaHCO3、5 HEPES、1 CaCl2、6 MgCl2、3 KCl、1.25 NaH2PO4和10葡萄糖。 样本被迅速置于冰上运输至实验室（用时少于10分钟），并在含有以下成分的冰冷碳酸化溶液中使用振动组织切片机（Leica Microsystems）立即切成300微米厚的切片（单位为mM）：110氯化胆碱、26 NaHCO3、11.6抗坏血酸钠、7 MgCl2、3.1丙酮酸钠、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、0.5 CaCl2和10葡萄糖。 切片在含有以下成分的碳酸化溶液中（单位为mM）：125 NaCl、25 NaHCO3、5 HEPES、1 CaCl2、6 MgCl2、3 KCl、1.25 NaH2PO4和10葡萄糖，于35°C孵育30分钟，之后在室温下保存直至使用。 记录实验在人工脑脊液中进行，其成分为（单位为mM）：125 NaCl、25 NaHCO3、3 KCl、1.2 CaCl2、0.7 MgCl2、1.25 NaH2PO4和10葡萄糖。Electrophysiology 电生理学Para_01 使用配备荧光成像系统的奥林巴斯BX51 WI显微镜，对锥体神经元胞体进行全细胞膜片钳记录。 脑片在生理温度（33–36 °C）下持续灌流含碳合气的人工脑脊液（2 ml/min）。 记录电极采用硼硅酸盐玻璃毛细管（4–6 MΩ），内充以下成分（单位为mM）的细胞内液：130 K-葡萄糖酸盐、10 KCl、10 HEPES、4 Mg²⁺-ATP、0.3 Na₂-GTP和10 Na₂-磷酸肌酸（用KOH调节pH至7.25，渗透压为285 mOsmol/l）。 细胞内液中还包含0.02%的5-(和-6)-甲基罗丹明生物胞素（Thermo Fisher Scientific），用于后续可视化及细胞身份确认。 形成全细胞模式后，使用安装在奥林巴斯BX51 WI显微镜上的QImaging Rega ELECTRO CCD相机（530 nm LED激发）确认神经元形态。 在可能的情况下，还使用共聚焦显微镜（Zeiss 900；544 nm激发，571 nm发射）详细记录神经元形态。 使用Multiclamp 700B放大器以电流钳模式进行电压记录。 信号在10 kHz下滤波，并使用Digidata 1440A（Axon Instruments）以50 kHz采样率采集，未进行液结电位校正。 分别使用pClamp和Clampfit软件（Axon Instruments）进行数据采集和分析。 为了表征所记录神经元的兴奋性，通过记录电极注入持续1200毫秒的阶梯电流，步长为20 pA。 阈电流定义为首次引发动作电位所需的最小电流强度；膜电阻通过小幅度超极化电流脉冲（−10 pA，1200 ms）引起的反应来测定；静息膜电位则在破膜后、电流注入前200毫秒内测量。 动作电位宽度定义为半高全宽。 使用Minitab软件（v22.1）采用线性混合模型方法进行数据分析。Statistical analysis 统计分析Para_01 统计细节可在图注中找到。P值使用GraphPad Prism（v10.0.0）或R（v4.4）计算，代表学生t检验、带多重比较的单因素方差分析或线性回归检验的结果。Reporting summary 报告摘要Para_01 有关研究设计的更多信息可在与本文相关的《自然》系列期刊报告摘要中获取。Data availabilityPara_01 本研究的临床和空间数据将在合理请求下向通讯作者提供，供合格的医学或科研专业人员用于申请中明确的具体目的，并可能包括去标识化的个体参与者数据（申请将在四周内进行评估）。 在签署数据访问协议后，相关数据将予以提供。 更多转化数据可在dbGAP中获取，登录编号为phs003976，需提供机构审查委员会（IRB）伦理批准文件。 独立低级别胶质瘤队列的单核RNA测序数据可在GEO数据库中获取，登录编号为GSE292732。 来自同一低级别胶质瘤肿瘤连续切片的匹配空间转录组学和代谢组学数据可通过BioImage Archive获取，网址为https://doi.org/10.6019/S-BIAD1426。 Spitzer等人公开的数据可在GEO数据库中获取，登录编号为GSE26099，使用需遵守数据提供方规定的条款和条件。 单细胞测序读段使用GRCh38人类参考基因组（2020-A）进行比对和定量分析，该预构建参考包由10x Genomics提供（GENCODEv32/Ensembl98）。 该参考包可在以下网址获取：https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest/release-notes/cr-reference-release-notes#2020-a。 全基因组测序读段使用Illumina DRAGEN平台提供的hg38参考基因组进行比对，相关信息可在https://sapac.support.illumina.com/downloads/dragen-reference-genomes-hg38.html获取。 本论文提供了源数据。Code availabilityPara_01 所有原始代码均在 GitHub 上公开提供，地址为 https://github.com/MontanaSpiteri/AnHeart。任何用于重新分析本文报告数据所需的额外信息，均可通过向通讯作者申请获取。