Riboflavin 5'-Phosphate Sodium

董杰 1张实润 1张曦予 2王成凤 1刘夏 1刘佳艳 1李宗菊 3  1. 云南大学生命科学学院，昆明 650500； 2. 云南大学国际河流与生态安全研究院，昆明 650500； 3. 云南大学生态与环境学院，昆明 650500  摘 要 为了从药用真菌资源中挖掘新型抗癌活性成分，基于炭角菌科Xylariaceae的紫褐炭角菌（Xylaria brunneovinosa，C3C）、痂状炭角菌（Xylaria escharoidea，A11）和蚁巢漆树霉（Geniculisynnema termiticola，A3）的LC‑MS代谢物谱，结合多元统计分析与网络药理学方法，探究3种炭角菌的潜在抗癌活性成分。结果显示，3种炭角菌中共检测到1 093个物质，其中显著差异代谢物226个，无显著差异代谢物867个。从1 093个总代谢物中筛选出与癌症调控相关的21个药效成分，包括17个无显著差异成分和4个显著差异成分。本文重点分析了芒柄花素（FMN）、异牡荆素（IVI）、胡椒碱（PIP）及雷酚内酯（TPH）4个差异成分。FMN、IVI、PIP及TPH分别预测到105、77、35及19个药物作用靶点，这些靶点蛋白富集的信号通路主要与癌症、炎症、免疫系统等相关。分子对接分析表明，4个活性成分与核心靶点具有较强结合能力，FMN、IVI、PIP、TPH分别通过GLN147、SER17、LYS198、ARG82等位点与SRC、RAF1、CDK5、CHRM3等核心靶点结合，参与胃癌、乳腺癌、膀胱癌及神经退行性疾病的调控。CCK‑8测定结果表明，3种炭角菌水提物和FMN、IVI、PIP、TPH对结直肠癌细胞株HCT‑116均有显著抑制效果，A3菌株水提物的抑制活性相对最强（IC50值为44.80 μg/mL）。研究结果为今后从价格低廉的真菌资源中筛选及研发新型抗癌药物提供了重要的理论依据和实验基础。 关键词 炭角菌科；差异成分；LC‑MS；网络药理；抗癌活性成分 炭角菌科Xylariaceae隶属于子囊菌门Ascomycota、粪壳菌纲Sordariomycetes、炭角菌目Xylariales［1］。该科真菌广泛分布于全球多个地区。目前，在我国云南、四川、海南、贵州等地已发现多种炭角菌［2］。近年来研究发现，炭角菌科真菌能够产生多种生物活性次级代谢物质，目前已从该科分离出细胞松弛素类、多糖、萜类、醌类、酮类、生物碱类、脂肪酸类及甾醇类等多种天然产物［3-4］，具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗衰老、补气血、调节免疫、镇静安神等药理活性［5-8］。如分离自黄连的1株内生炭角菌的化合物4‑hydroxy‑17Ｒ‑methylincisterol，对结肠癌细胞株HT29具有显著抑制作用（IC50值为14.3 μmol/L）［9］；痂状炭角菌X. escharoidea（Berk.）Sacc.液体发酵产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌表现出良好的抑菌活性，并具有一定的抗氧化能力［10］；黑柄炭角菌X. nigripes（Kl．）Sacc.多糖可通过增强巨噬细胞的吞噬功能，发挥抑制肿瘤细胞EAC效用［11］；纵条纹炭角菌X. striata Pat. J. Bot.子实体具有改善睡眠和增强免疫力的作用［12-13］。此外，炭角菌子实体是一类名贵中药材，以黑柄炭角菌为例，其菌核呈黑色，俗称“乌灵参”，在失眠、心理及精神疾病的治疗中具有一定疗效［14］。 炭角菌作为近年受到关注的一类大型真菌，对其进行研究发现，该类真菌具有抗癌、抗菌及抗病毒等多种生物活性，可为临床开发新型高效药物提供新的资源。然而，炭角菌常生长于废弃蚁巢等特殊环境中，其地面生活史（子实体期）较短，通常仅5~10 d，野外难以发现与采集，导致可供研究的样品量极为有限，这为其物种分离与规模化培养带来一定难度。迄今，已实现规模化培养的炭角菌物种仍较为有限，进入临床应用阶段的仅有黑柄炭角菌的菌丝发酵产物［15］。总体来看，目前炭角菌的研究与开发仍面临物种来源单一、资源缺乏、研究深度不足以及应用范围有限等问题。 网络药理学作为新兴交叉学科，通过整合系统生物学与药物作用网络分析方法，能够系统识别药物作用的特定节点及模块间的相互作用关系，从而预测药物在机体内的作用机制，并为新药研发提供重要的理论指导［16-17］。近年来，随着一系列药物筛选、靶点预测及功能注释平台的建立与发展，如有机小分子生物活性数据库（PubChem）、靶点与生物活性数据库（ChEMBL）、相似性集成方法（SEA）、中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN‑TCM）、中药系统药理学（TCMSP）以及注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）［18-19］等网络药理学研究取得了显著进展。这些技术平台突破了传统基于“一个基因，一种药物，一种疾病”的药物设计理念［20］，深化了对药物发现理论、策略及其整体作用机制的系统性认识［21］。在药用资源的快速筛选与鉴定方面，网络药理学方法展现出重要价值，目前已在植物资源研究中获得较为广泛的应用。如昝立峰等［22］通过结合代谢组学和网络药理学手段，从君迁子Diospyros lotus L.果实中筛选出桑色素、柚皮素、芹菜素等10种具有潜在抗炎活性的黄酮类化合物；杨柯等［23］从五眼果Choerospondias axillaris中鉴定出15个可用于治疗肝癌与2型糖尿病等作用的有效成分；周沁阳等［24］从山豆根Sophora tonkinensis gagnep.中筛选出包括生物碱和黄酮类在内的15个具有潜在抗炎症作用的活性成分。然而，与植物资源相比，网络药理学在真菌类药用资源研究中的应用仍相对有限，有待进一步拓展和深化。 与动植物药用资源相比，炭角菌真菌具有生长周期短、繁殖成本低、药用活性显著等特点，可作为开发新型高效药物的潜在资源。借助当前较为成熟的代谢组学技术，能够快速获取物种的小分子活性物质信息。液相色谱-质谱联用（LC‑MS）技术是目前代谢组学分析的主流技术，其基于代谢组群的整体分析策略，能够对生物样本的代谢成分进行非靶向、系统性的全面检测，已广泛应用于动植物及真菌的研究中［25］。将LC‑MS技术与网络药理学相结合，有助于建立化学成分与生物功效之间的关联，筛选出差异代谢成分，并为药材质量差异与功能有效性提供科学、可量化的质量标志物（Q‑marker）。 本研究选取紫褐炭角菌（X. brunneovinosa，C3C）、痂状炭角菌（X. escharoidea，A11）及蚁巢漆树霉（G. termiticola，A3）3种炭角菌科真菌为研究对象。已有研究主要涉及该类物种的系统发育与鉴定［26］、液体发酵产物的抗氧化和抗菌作用［27-28］，以及发酵产物抗氧化能力与对结肠癌细胞的毒活性等方面，但尚未见有关上述3种炭角菌代谢物图谱的报道［29］。基于此，本研究首先采用LC‑MS技术对其代谢物进行了系统表征，并基于多元统计的化学模式识别和网络药理学方法筛选出4种潜在抗癌活性成分，同时预测其可能的作用靶点蛋白。进一步借助KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，构建了物质-靶点-通路网络，这为探明炭角菌活性抗癌物质在机体中的作用机理，为拓展及开发低成本真菌药物资源等提供了重要的理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试菌株 3种炭角菌菌株均从白蚁巢中分离纯化获得。2021年7月，于云南省楚雄市鸡鸣山采集3处生长有鸡枞菌的白蚁巢，挖取后分别置于圆柱形塑料容器中，并覆盖蚁巢周围土壤。次日，用无菌镊子夹取少量蚁巢接种于含有改良PDA培养基的平板中，每天观察生长情况。约3 d后，待平板上长出优势菌落时，挑取其菌丝尖端接种至新培养基中，对菌丝进行纯化及继代培养，经3~7代获得纯化菌株。依据形态特征及ITS序列鉴定菌株C3C为紫褐炭角菌、A11为痂状炭角菌和A3为蚁巢漆树霉。3种菌株的纯培养形态特征如图1所示。 图1   3种炭角菌在改良PDA培养基上的形态特征Fig. 1   Morphological characteristics of three species of Xylariaceae on modified PDA media 人结直肠癌细胞株HCT‑116由云南大学生物化学与分子生物学实验室提供。 1.2 试剂与仪器 甲醇、乙腈（色谱级，德国默克公司），甲酸（色谱级）、L‑2‑氯苯丙氨酸（分析级，Sigma‑Aldrich， USA），芒柄花素、异牡荆素、胡椒碱及雷酚内酯的标准品（色谱级，云南西力生物科技股份有限公司）；液相色谱-质谱联用仪（Waters， Thermo， Q Exactive），细胞培养箱（英国Thermo scientific公司），DMEM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，BI公司），Cell Counting Kit‑8（CCK‑8试剂盒，Beyotime Biotechnology公司）。 1.3 样品制备 收集实验室纯培养的3种炭角菌子实体样品，加入液氮后快速研磨成粉，分装于5 mL无菌冻存管中，置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻6 h以上。随后进行真空冷冻干燥处理48 h以上，直至样品完全脱水，获得冻干粉，将其置于加有干燥剂的密封袋中，于-80 ℃冰箱中备用。 分别称取冻干粉80 mg于1.5 mL离心管中，加入800 μL 80%甲醇，涡旋混匀30 s。随后4 ℃超声萃取2 h，再在4 ℃静置1 h。将样品在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min，取上清液200 μL，加入内标（140 μg/mL二氯苯丙氨酸）5 μL，用于LC‑MS分析。 1.4 数据采集 色谱条件。ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm × 100 mm × 1.8 μm）；柱温：40 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：A相为含0.05%甲酸的水溶液，B相为乙腈；洗脱程序：0~2 min 95%A，2~5 min 95%~30%A，5~14 min 30%~10%A，14~16 min 10%~0A，1~22 min保持0%A，22~22.1 min 0~95%A，27 min时停止运行。 质谱条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）；气帘气压力：40 arb；离子喷雾电压：5 500 V（正模式）、-4 500 V（负模式）；离子源温度：550 ℃；离子源气体：60 arb（Gas 1），60 arb（Gas 2）；去簇电压（DP）：80 V（正模式）、-80 V（负模式）；碰撞能量（CE）：35 V（正模式）、-35 V（负模式）。 1.5 数据处理及统计分析 LC‑MS原始数据首先通过Abf Converter.4.0软件转化为ABF格式，随后导入MS‑DIAL软件中进行峰提取、峰比对和峰过滤处理。补充缺失峰后，通过对代谢物质谱的精确相对分子质量与网络数据库MassBank（https：//massbank.jp/Index）中的信息进行代谢物鉴定，最终将数据标准化为Excel格式的二维数据矩阵。利用SIMCA软件对3种炭角菌的代谢谱进行主成分（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS‑DA），通过R2和Q2累积值以及置换检验（200次迭代），对所建立的具有2个潜在变量的模型进行7次交互验证。结合VIP>1和P<0.05的标准筛选3种炭角菌之间的差异代谢物。 1.6 差异成分的活性筛选 基于LC‑MS获取的代谢物特征信息，通过PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）检索并获取相应的SMILE结构式。进一步利用TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）对炭角菌中的差异代谢物进行活性差异成分筛选。 1.7 差异成分的靶点预测 将筛选获得的活性差异成分的SMILE结构分别导入SEA（https：//sea.bkslab.org）、SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）和ChEMBL（https：//www.ebi.ac.uk/chembl）平台进行靶点预测。同时，利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）获取靶点蛋白的基因名称。 1.8 通路分析及注释 利用DAVID数据库对靶点蛋白进行KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，并在KEGG数据库中对所获的通路进行注释［30］。 1.9 差异成分-靶点蛋白-通路网络构建 将炭角菌活性差异成分的预测结果导入Cytoscape v3.10.2软件，构建炭角菌差异成分-靶点蛋白-通路网络。该网络由差异成分、靶点蛋白及通路3个部分组成。利用网络分析模块计算度（Degree）值，分析网络拓扑参数，筛选出关键靶点蛋白［31］。 1.10 分子对接 为了进一步探索差异成分与核心靶点的结合能力。首先从Pubchem数据库获取差异成分的SDF格式文件。从PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb）获取核心靶点的3D结构，并利用Pymol软件对靶点进行优化处理，包括清除水分子和小分子配体等，以pdbqt格式保存。采用AutoDock Vina软件进行分子对接，计算差异成分（配体）与核心靶点（受体）的结合能，并利用Pymol软件将对接结果进行可视化处理。 1.11 体外细胞活性检测 根据上文“1.6”中从炭角菌中筛选得到的活性差异成分，结合标准品可获得性，选取芒柄花素、异牡荆素、胡椒碱及雷酚内酯进行体外细胞活性验证。基于炭角菌天然产物的抗结肠癌作用［29］，本研究以人结直肠癌细胞株HCT‑116为研究对象，利用CCK‑8（Cell Counting Kit‑8）法进行评估。将HCT‑116细胞铺入96孔板，待其生长至对数生长期时，吸弃孔中培养液，分别加入用2%DMEM培养基稀释至浓度为0，20，40，60，80 µmol/L的4种标准品溶液，同时设置空白对照组和细胞对照组，每个处理5个重复。于37 ℃培养箱培养48 h后吸弃药液并更换为DMEM，每孔加入10 µL CCK‑8溶液，于37 ℃条件下避光孵育45 min，使用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，计算各处理组细胞活性。 1.12 炭角菌水提物制备及细胞活性检测 为验证炭角菌总提物的抗结直肠癌活性，并与单体化合物活性进行初步比较，制备了炭角菌水提物并进行细胞活性检测。 称取炭角菌子实体冻干粉500 g，按照1∶1（m/v）比例加入无菌水，涡旋混匀90 s。在冰浴条件下，采用45 kHZ超声波辅助萃取1 h，随后高速离心10 min，取上清液。重复3次，抽提并合并滤液，旋蒸浓缩至8~10 mL，真空干燥后置于-80 ℃超低温冰箱中备用。进行细胞毒活性试验时，将炭角菌水提物以2%DMEM稀释成0，20，40，60，80 µg/mL，其余步骤同上文“1.11”。 2 结果与分析 2.1 3种炭角菌代谢组学数据的可靠性分析 色谱峰经NIST14数据库进行逐一检索和匹配，获得3种炭角菌的代谢谱数据。利用SIMCA‑P 14.1软件进行数据的可靠性验证。无监督的PCA模型中，3组样品的数据点在PCA得分图上区分明显，表明其代谢产物组成存在显著差异，且均置于95%置信区间内，无异常值存在，证明样本数据处理结果可信。为进一步提升模型解析能力及有效性，采用有监督的OPLS‑DA分析法，结果显示不同炭角菌两两组间均表现出显著的分离效果。模型经7次交叉验证，R2Y及Q2值均大于0.9，表明模型具有较高的稳定性和可靠性。随后通过200次置换检验对模型进行验证，结果显示Q2intercept<0，表明所建立的OPLS‑DA模型未出现过拟合，具有较好的预测能力。 2.2 代谢物谱分析与差异代谢物筛选 通过LC‑MS代谢组学分析，3种炭角菌样本（A3、A11、C3C）中共检测到1 093个化合物。A3、A11、C3C分别检测到888、946、981个化合物。其中，A3特有化合物21个，A11特有36个，C3C特有59个；3种炭角菌共有化合物745，且A3与A11共有55个，A3与C3C共有67个，A11与C3C共有110个（图2-A）。 图2   3种炭角菌的总代谢物及显著差异代谢物Fig. 2   Total metabolites and significant differential metabolites of three species of Xylariaceae A. 总代谢物的数量及分布情况 Numbers and distribution of the total metabolites； B. 11类代谢物的数量Numbers of 11 kinds of metabolites； C. 11类代谢物在3种炭角菌中的丰度The abundance of 11 kinds of metabolites in 3 kinds of Xylariaceae； D. 110个显著差异代谢物的含量Content of 110 significant differential metabolites；Ⅰ. 生物碱 Alkaloids；Ⅱ. 氨基酸和肽 Amino acids and peptide；Ⅲ. 类胡萝卜素 Carotenoids；Ⅳ. 萜类 Terpenoids；Ⅴ. 脂肪酸类 Fatty acids；Ⅵ. 黄酮 Flavonoids；Ⅶ. 异黄酮 Isoflavones；Ⅷ. 核苷类 Nucleosides；Ⅸ. 糖类 Carbohydrates；Ⅹ. 莽草酸和苯丙烷 Shikimic acid and phenylpropanoids；Ⅺ. 其他类 Others 对检测到的1 093个化合物进行分类统计，共划分为11大类（图2-B）：生物碱187个、氨基酸及肽类303个、类胡萝卜素8个、萜类152个、脂肪酸102个、类黄酮50个、异黄酮13个、核苷类34个、糖类17个、莽草酸及苯丙烷96个、其他类131个。11类物质在3种炭角菌样品中相对丰度如图2-C所示，氨基酸及肽类在各样本中占比最高，在C3C、A11、A3中分别占26.40%、28.01%、28.60%；其次是生物碱（分别占16.00%、17.01%、17.79%）和萜类（分别占14.88%、14.48%、13.85%）。 基于OPLS‑DA模型，以VIP>1和t检验P<0.05为标准，对两两组间的显著差异代谢物进行筛选。在1 093个总代谢物中，共筛选出226个显著差异代谢物，其中包括A3特有21个，A11特有36个，C3C特有59个，以及三者共有的显著差异代谢物110个，其余867个代谢物在各组间无显著差异。 由于同一代谢物可在不同组间表现出显著差异，因此，从977个共有代谢物中进一步筛选出110个在3种炭角菌中均存在显著差异的代谢物，这些显著差异代谢物在A3、A11和C3C 3种样本中的相对含量存在明显差异（图2-D）。 2.3 总代谢物的活性筛选 将3种炭角菌的1 093个总代谢物，通过PubChem数据库获取各化合物的SMILE结构，并以化合物名称或SMILE为输入源，依据生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）指标，利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选获得21个与多种癌症（如结直肠癌、膀胱癌等）相关的药效成分。其中，从867个无显著差异的总代谢物中筛选到17个药效成分，从226个显著差异代谢物中筛选到4个药效成分，分别是A3特有物质芒柄花素（Formononetin，FMN）、C3C特有物质异牡荆素（Isovitexin，IVI），以及A3、C3C和A11共有的显著差异代谢物胡椒碱（Piperine，PIP）和雷酚内酯（Triptophenolide，TPH），随后采用标准品法对4个药效成分进行LC‑MS鉴定，其质谱结果均一致。21个药效成分的相对含量如表1所示，其中有2个显著差异代谢物平均含量较高，且通过高分辨质谱结合数据库比对为PIP和TPH。 表1   总代谢物中筛选到的21个药效成分Table 1   21 pharmacodynamic components screened from the total metabolites 基于差异物质在一定程度上可作为合理反映药材质量差异和功能有效性的标志物，因此以4个显著差异代谢物为研究对象，分析其作用靶点及信号通路，为下一步探讨炭角菌药效成分的潜在功效及机理奠定方法基础。 2.4 4个药效成分的靶点预测 蛋白和基因靶点的预测通过在药物化学数据库（ChEMBL）、瑞士药物靶点预测平台（SwissTargetPrediction）和SEA数据库搜索化合物SMILE结构完成。从3个数据库中共获得273个靶点，除去重复值后，A3特有活性物质FMN有105个靶点，C3C特有活性物质IVI有77个靶点，而在110个共有显著差异代谢物中，PIP和TPH分别对应35个和19个靶点。最终，4种化合物共获得185个靶点，其中频数较高的靶点包括前列腺素E受体（PTGER4）、碳酸酐酶Ⅱ（CA2）、神经元乙酰胆碱受体亚单位α‑4（CHRNA4）和神经元乙酰胆碱受体亚单位β‑4（CHRNB4）等32个（表2）。 表2   　频数较高的前32个靶点蛋白信息Table 2   Information of the top 32 target proteins with high frequencies 2.5 靶点蛋白的GO功能富集和KEGG通路富集分析 将获得的185个靶点基因利用DAVID分析工具进行GO功能富集分析，涵盖生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）及KEGG通路分析。结果显示，GO富集分析中与BP相关的条目共459个，与CC相关的条目102个，与MF相关的条目186个；KEGG通路分析共富集到125条信号通路。 4种活性物质靶点基因在癌症相关通路中的富集情况如图3所示，包括10条KEGG信号通路及相关GO富集条目。KEGG通路分析显示，185个靶点基因富集的信号通路主要涉及癌症、炎症、免疫调节和神经系统等方面。FMN靶点主要富集于膀胱癌（Bladder cancer）、乳腺癌（Breast cancer）、酒精性肝病（Alcoholic liver disease）和人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）等通路（图3-A）。IVI靶点富集于膀胱癌、胃癌（Gastric cancer）、癌症通路、酒精性肝病和阿尔茨海默病（Alzheimer disease）等（图3-B）。PIP和TPH靶点主要富集于阿尔茨海默病、神经退行性病变的途径-多种疾病（Pathways of neurodegeneration⁃multiple diseases）、疟疾（Malaria）和病毒性心肌炎（Viral myocarditis）等（图3-C）。综上所述，炭角菌的4种活性物质可通过抗炎、免疫调节、神经调节和抗病毒等相关的蛋白及信号通路，发挥抗癌、神经保护等多种生物功效。 图3   潜在靶点蛋白的通路分析Fig. 3   Pathway analysis of potential target proteins A. FMN靶点蛋白的KEGG及GO富集通路KEGG and GO enrichment pathways of FMN target proteins； B. IVI靶点蛋白的KEGG及GO富集通路KEGG and GO enrichment pathways of IVI target proteins； C. PIP及TPH靶点蛋白的KEGG及GO富集通路KEGG and GO enrichment pathways of PIP and TPH target proteins GO功能富集分析结果表明，在生物学过程方面，FMN的靶点基因主要参与一碳代谢过程（One‑carbon metabolic process）、对外源性刺激的反应（Response to xenobiotic stimulus）、外源代谢过程（Xenobiotic metabolic process）、神经系统过程（Neurological system process）和电子传输链（Electron transport chain）等；IVI的靶点富集于细胞凋亡过程的负调控（Negative regulation of apoptotic process）、外源代谢过程、对外源性刺激的反应、碳水化合物代谢过程（Carbohydrate metabolic process）及视黄醇代谢过程（Retinol metabolic process）等；而PIP和TPH的靶点主要涉及化学性突触传递（Chemical synaptic transmission）、兴奋性突触后电位（Excitatory postsynaptic potential）、对缺氧的反应（Response to hypoxia）以及钙介导的信号传导（Calcium‑mediated signaling）等。在细胞组分方面，FMN的靶点主要定位于膜（Membrane）、质膜（Plasma membrane）和线粒体（Mitochondrion）等结构；IVI的靶点则分布于质膜、胞质溶胶（Cytosol）和细胞外泌体（Extracellular exosome）等组分；PIP和TPH的靶点主要富集在质膜、膜、突触后膜（Postsynaptic membrane）等区域。在分子功能方面，FMN的靶点主要涉及锌离子结合（Zinc ion binding）、碳酸盐脱水酶活性（Carbonate dehydratase activity）、氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）等；IVI的靶点同样富集于锌离子结合和氧化还原酶活性，此外还参与血红素结合（Heme binding）等过程；PIP和TPH的靶点涉及配体门控离子通道活性（Ligand‑gated ion channel activity）、G蛋白偶联血清素受体活性（G‑protein coupled serotonin receptor activity）及细胞外配体门控离子通道活性（Extracellular ligand‑gated ion channel activity）等功能。 2.6 活性成分-靶点蛋白-通路网络分析 为探究4种活性成分的潜在作用机制，将其与相关靶点蛋白及其富集分析所得的30条与癌症等疾病相关的通路相结合，构建差异成分-靶点-通路网络图。基于网络拓扑学分析，依据Degree值筛选出排名前十的核心靶点，绘制核心靶点网络图（图4）。网络拓扑属性分析结果显示，FMN的网络异质性值为0.933，IVI为0.479，PIP和TPH为0.378；网络中心度方面，FMN为0.533，IVI为0.322，PIP和TPH为0.154；特征路径长度上，FMN为2.294，IVI为2.105，PIP和TPH为2.052；平均相邻节点数目方面，FMN为2.471，IVI为4.500，PIP和TPH为4.667。上述结果表明，多数靶点蛋白之间均存在较为密切的相互作用关系。 图4   活性差异成分-靶点蛋白-信号通路网络关系Fig. 4   Network relationships of active differential components‑target proteins‑signaling pathways A. FMN网络药理学拓扑模型FMN network pharmacological topological model； B. IVI网络药理学拓扑模型IVI network pharmacological topological model； C. PIP及TPH网络药理学拓扑模型 PIP and TPH network pharmacological topological model；红色倒三角形节点分别代表FMN、IVI、PIP及TPH Red inverted triangle nodes represent FMN, IVI, PIP, and TPH respectively；绿色菱形节点代表核心靶点基因Green diamond nodes represent core target genes；蓝色圆形代表癌症相关的调控通路 Blue filled circles represent cancer‑related regulatory pathways；实心黑色线条代表三者之间的相互作用关系 The solid black lines represent the interaction among the three 在FMN网络图（图4-A）中，核心靶点RAF1（Serine/threonine‑protein kinase RAF）、SRC（Tyrosine⁃protein kinase）均参与膀胱癌等3条相关通路的调控；CYP1B1（Cytochrome P450 1B1）富集于化学致癌-受体激活等2条通路；GABRB3（Gamma‑aminobutyric acid receptor subunit beta‑3）则与吗啡成瘾1条通路相关。在IVI网络图（图4-B）中，HRAS（GTPase HRas）涉及胃癌等8条通路；VEGFA（Vascular endothelial growth factor A）富集于膀胱癌等5条通路；FGF2（Fibroblast growth factor 2）、IL6（Interleukin‑6）及SRC共同参与膀胱癌、阿尔茨海默病等4条通路；CALM1（Calmodulin‑1）富集于酗酒等3条通路；CREB1（Cyclic AMP‑responsive element‑binding protein 1）、CYP1A1（Cytochrome P450 1A1）和FGF1（Fibroblast growth factor 1）均富集于化学致癌-受体激活等2条通路；CBR1（Carbonyl reductase ［NADPH］ 1）则与化学致癌作用-活性氧通路相关。在PIP和TPH网络图（图4-C）中，GRIN2B（Glutamate receptor ionotropic， NMDA 2B）、GRIN2A（Glutamate receptor ionotropic， NMDA 2A）和GRIN1（Glutamate receptor ionotropic， NMDA 1）均富集于神经退行性变的途径-多种疾病等6条通路；CDK5（Cyclin‑dependent‑like kinase 5）参与阿尔茨海默病4条通路；MAOB（Monoamine oxidase B）富集于酗酒等3条通路；CHRM3（Muscarinic acetylcholine receptor M3）与DRD2（Dopamine D2 receptor）富集到酗酒等2条通路；CHRNA4（Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha‑4）则富集于化学致癌-受体激活等2条通路。 进一步分析发现，不同活性成分的核心靶点分别参与多种疾病相关通路：FMN的核心靶点RAF1参与乳腺癌通路，IVI的核心靶点HRAS涉及胃癌和阿尔茨海默病通路，PIP与TPH的核心靶点GRIN2A则富集于神经退行性疾病相关通路。此外，FMN与IVI共享核心靶点SRC，共同参与膀胱癌相关通路，FMN与PIP、TPH共享核心靶基因MAOB，提示其在多条通路中发挥作用。网络分析显示，1个活性成分可与多个靶点蛋白相互作用，多个成分可作用于相同靶点，多条通路间通过共同靶点联接，显示了“多成分、多靶点、多通路”协同作用的特点。4种活性差异成分在功能上具有一定相似性，可通过作用于相同靶点，共同参与癌症等同一类疾病的相关通路，发挥协同生物效应。 2.7 4个活性成分的分子对接验证 为验证活性成分与核心靶点之间的相互作用，进行了分子对接分析。化合物和靶点之间的结合能小于-20 920.0 J/mol时，表明二者具有较好的结合活性。对接结果显示，4个活性成分与各自核心靶点均表现出较强的结合能力。FMN通过氢键分别与SRC蛋白的GLN147残基及RAF1蛋白的SER17残基结合，结合能分别为-31 798.4，-27 196.0 J/mol。IVI与SRC蛋白的LYS198、GLN147、LYS155，FGF1蛋白的GLN77、GLN91、PRO41，FGF2蛋白的ARG82、LEU83、ARG40，HRAS蛋白的ALA18、SER17、GLY60以及VEGFA蛋白的GLU30、GLY59、CYS68、LEU56、ASP34结合，其与5个核心蛋白的结合能分别为-30 124.8，-27 196.0，-26 359.2，-35 982.4，-31 380.0 J/mol。此外，TPH与CHRM3蛋白的THR75结合，结合能为-31 798.4 J/mol。PIP与CDK5蛋白的结合能为-30 124.8 J/mol。综上所述，4个抗癌成分与核心靶点间均具有较强的亲和力和结合活性，进一步验证了网络药理学预测结果的可靠性。 2.8 4个药效成分及3个炭角菌水提物的体外活性检测 采用CCK‑8细胞计数法，以结直肠癌细胞株HCT‑116为模型，初步评估了4个药效成分（Formononetin‑FMN、Isovitexin‑IVI、Piperine‑PIP、Triptophenolide‑TPH）及3种炭角菌水提物的体外抗癌活性。 4个药效成分的浓度梯度设置为0，20，40，60，80 µmol/L，处理HCT‑116细胞后进行活力检测。结果显示，HCT‑116细胞活力随着FMN、IVI、PIP、TPH浓度梯度的增加呈下降趋势。FMN的IC50为46.59 µmol/L，IVI、PIP、TPH分别为62.49，30.86，29.82 µmol/L。表明4个药效成分均能有效抑制HCT‑116细胞增殖，其中PIP和TPH的抑制效果更为显著。 为进一步验证3种炭角菌的抑癌效果，设置其水提取物质量浓度为0，20，40，60，80 μg/mL，同样采用CCK‑8法进行检测。结果显示，炭角菌A3水提物的IC50为44.80 µg/mL，C3C为55.50 µg/mL，A11为51.73 µg/mL。表明3种炭角菌水提物对HCT‑116细胞增殖均具有显著抑制作用，其中A3的抑制活性相对最强。综上所述，4种药效成分及3种炭角菌水提物在体外均能显著抑制HCT‑116结直肠癌细胞的增殖，为其进一步的抗癌机制研究提供了实验依据。 3 讨 论 本文基于3种炭角菌的226个LC‑MS显著差异代谢物谱（包括A3特有21个、A11特有36个、C3C特有59个及三者共有110个），采用网络药理学方法，从中筛选出芒柄花素、异牡荆素、胡椒碱、雷酚内酯4种抗癌活性物质。 3.1 芒柄花素 芒柄花素（FMN）是一种具有抗癌活性的异黄酮类化合物。研究表明，FMN可通过诱导线粒体应激抑制非小细胞肺癌（NSCLC）［32］；同时，它还可通过miR‑1229/ZDHHC9分子轴抑制胶质瘤细胞增殖，并诱导其凋亡［33］。网络药理学分析结果表明，FMN的抗癌相关靶点有SRC和RAF1。KEGG通路分析结果显示，SRC参与膀胱癌相关通路，RAF1则与乳腺癌等通路的调控有关。已有研究证实，SRC作为类固醇受体共激活因子，其信号通路的抑制及蛋白水平的降低可阻碍膀胱癌5637细胞、前列腺癌DU145细胞及胃癌细胞的增殖与迁移［34-36］。RAF1是Ras信号通路中的主要效应因子，在炎症反应中可通过Ras/RAF1促进IL‑6等炎症介质的产生［37］；在神经系统中，RAF1及相关通路的上调有助于改善失眠症状［38］；而在癌症中，抑制RAF1表达对治疗胃癌、前列腺癌等具有重要作用［39-40］。 3.2 异牡荆素 异牡荆素（IVI）是一种具有多种药理活性的黄酮类天然产物。研究表明，IVI可通过上调miR‑107、抑制CCND1表达，从而抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导其凋亡［41］；同时，IVI还能通过抑制Wnt/β‑catenin信号通路，降低非小细胞肺癌细胞的活性与自我更新能力，促进细胞凋亡［42］。网络药理学分析结果显示，IVI的抗癌作用可能与VEGFA、HRAS、FGF2、SRC、FGF1等靶点有关。KEGG通路富集结果表明，VEGFA、HRAS和SRC参与膀胱癌相关通路，而HRAS、FGF2和FGF1则参与胃癌相关通路。VEGFA作为血管内皮生长因子A，是肿瘤免疫微环境中的关键因子。研究发现，VEGFA的过表达对B16肿瘤和MC38肿瘤具有不同程度的抑制作用［43］。HRAS是一种原癌基因，其编码蛋白第112位缬氨酸Val的突变可诱导肿瘤发生［44］。FGF2和FGF1属于成纤维细胞生长因子家族，参与前列腺细胞的增殖、凋亡、迁移和分化等生物学过程的调控［45］。 3.3 胡椒碱 胡椒碱（PIP）是一种活性广泛的酰胺类生物碱。研究表明，PIP可通过抑制STAT3磷酸化诱导胃癌细胞凋亡［46］；此外，它还能调控Caspase3/Bax/Bcl‑2凋亡信号通路，从而诱导人胰腺癌PANC‑1细胞凋亡［47］。网络药理学分析表明，PIP的抗癌相关靶点为CDK5。KEGG通路分析结果显示，CDK5参与阿尔茨海默病及神经退行性疾病相关通路。研究表明，CDK5是细胞周期蛋白激酶家族中的特殊成员，具有调控细胞周期与增殖等功能，其异常表达与前列腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展密切相关［48］。 3.4 雷酚内酯 雷酚内酯（TPH）是从雷公藤中分离得到的二萜类生物活性成分。研究发现，TPH具有较强的免疫抑制活性，并可缓解肺气管上皮细胞上皮间充质转化（EMT）进程以及饮食诱导的肥胖体重增加［49-51］。网络药理学分析表明，TPH的抗癌相关靶点为CHRM3。KEGG通路分析结果显示，CHRM3参与治疗阿尔茨海默病及神经退行性疾病相关通路。研究表明，CHRM3是编码胆碱能受体毒蕈碱的基因，胆碱能功能减退与阿尔茨海默病密切相关［52］；此外，CHRM3还参与调控前列腺癌相关信号通路的抑制过程［53］。 4 总 结 本研究基于代谢物图谱分析与化学模式识别，筛选并鉴定出炭角菌中FMN、IVI、PIP和TPH 4种核心差异活性代谢物，突破了以往炭角菌功效研究中成分不明确的局限，证实上述成分可作为炭角菌生物功效评价及质量差异判定的潜在标志物。首次结合网络药理学、分子对接及细胞实验，系统验证了其作用靶点与抗癌、神经退行性疾病防治等功效的高度关联性，为炭角菌的药用开发、精准质量评价体系构建及抗癌机制深度研究提供了全新思路与核心实验依据，也为天然药用真菌活性成分开发提供了可借鉴的整合研究模式。KEGG通路分析进一步揭示，各活性成分通过多条代谢通路发挥功效，区别于传统抗癌物质的单一作用机制，为后续依托动物模型、基因分析等手段深入挖掘精准抗癌策略开辟了全新的研究方向与理论支撑。 引用本文： 董杰，张实润，张曦予，等.基于网络药理学3种炭角菌科真菌代谢物谱的抗癌活性成分筛选［J］.菌物研究，2026，24（4）：304-317.  作者简介：董杰，男，硕士研究生，研究方向：真菌遗传。 通信作者：李宗菊，E-mail： zjlee@ynu.edu.cn 基金信息： 国家自然科学基金项目（31560575），云南省自然科学基金重点项目（2014FA020） 菌物研究     文  字｜董   杰    初  审｜殷伟琦  复  审｜王丽兰 终  审｜李艳双  长按二维码关注我们

Epioxa helps preserve vision by stabilizing the cornea and slowing or halting keratoconus LAGUNA HILLS, CA, UNITED STATES, July 10, 2026 / EINPresswire.com / -- Harvard Eye Associates is proud to announce the availability of Epioxa HD / Epioxa ("Epioxa"), the first and only FDA-approved epithelium-on, oxygen-enriched corneal crosslinking therapy for the treatment of keratoconus (KC).¹ Epioxa treatment is noninvasive because it does not remove the outer layer of the cornea, called the epithelium. Keratoconus is a rarely diagnosed but sight-threatening eye disease that affects young people in the prime of life. It is often first noticed in adolescence, with most of the damage to the cornea occurring between the ages of 10-30,² but the disease is lifelong. If left untreated, 1 out of 5 patients with KC will require a corneal transplant.³⁻⁶ Corneal cross-linking can stop KC from getting worse. In the past, undergoing this sight-saving treatment often meant dealing with pain or discomfort, blurry vision, and a long period of healing associated with the removal of the epithelium. "By leaving the outer layer of the cornea intact, Epioxa can improve patient comfort, streamline the treatment, and enable a faster recovery time," said John A. Hovanesian, MD . "With this advanced new therapy, we can potentially treat both eyes within a short period of time and halt progression so that our patients can focus on what's important—living their lives fully." Developed by Glaukos, Epioxa ensures that bioactivated drops and UV light penetrate the protective outer layer of the cornea. The safety of Epioxa treatment and its effectiveness in halting KC were proven in two clinical trials.¹ During these studies, a key indicator of corneal structural stability worsened in untreated patients, while it improved in the Epioxa-treated patients.¹ The treatment effect was nearly double in young patients aged 13-28. "Harvard Eye Associates is dedicated to providing our patients with the most advanced treatment options available," said John A. Hovanesian, MD. "Epioxa represents a significant development in how we can proactively address KC to protect our patients' vision, and we are proud to be among the first practices to make this therapy available." Patient assistance support programs, a co-pay assistance program to reduce financial barriers for eligible patients, and a patient assistance program for the uninsured are available. The most common side effect of Epioxa is eye redness. Other potential side effects include eye irritation, dry eye, light sensitivity, eyelid swelling, increased tearing, and others. Sources: 1. EPIOXA HD and EPIOXA Prescribing Information. 2. Ferdi AC, et al. Ophthalmology. 2019;126:935-945. 3. Deshmukh R, et al. Front Med (Lausanne). 2023;10:1212314. Published 2023 Jun 20. 4. McGhee CN, et al. Cornea. 2015;34(suppl 10):S16-S23. 5. McGhee CN. Clin Exp Ophthalmol. 2009;37(2):160-176. 6. Rabinowitz YS. Surv Ophthalmol. 1998;42(4):297-319. INDICATIONS AND USAGE EPIOXA HD (riboflavin 5'-phosphate ophthalmic solution) 0.239% and EPIOXA (riboflavin 5'-phosphate ophthalmic solution) 0.177% are photoenhancers indicated for use in epithelium-on corneal collagen cross-linking for the treatment of keratoconus in adults and pediatric patients aged 13 years and older, in conjunction with the O2n System and the Boost Goggles. IMPORTANT SAFETY INFORMATION Contraindications EPIOXA HD and EPIOXA are contraindicated in patients with known hypersensitivity to benzalkonium chloride (BAC) or any ingredients in EPIOXA HD and EPIOXA. Epithelium-on corneal collagen cross-linking is contraindicated in aphakic and pseudophakic patients without a UV-blocking intraocular lens. Warnings and Precautions Corneal collagen cross-linking should be used with caution in patients with a history of herpetic keratitis due to the potential for reactivation of herpes keratitis. Adverse Reactions The most common adverse reaction was conjunctival hyperaemia (31%). Other adverse reactions, occurring in 5% to 25% of eyes included: corneal opacity (haze), photophobia, punctate keratitis, eye pain, eye irritation, increased lacrimation, corneal epithelium defect, eyelid oedema, corneal striae, visual acuity reduced, dry eye, and anterior chamber flare. Dosage and Administration EPIOXA HD and EPIOXA are for topical ophthalmic use. NOT for injection or intraocular use. EPIOXA HD and EPIOXA are supplied in single-dose syringes. Discard opened syringes after use. EPIOXA HD and EPIOXA are for use with the O2n System and Boost Goggles only. Refer to the O2n System Operator's Manual and Boost Goggles User Guide for device instructions. Please see full Prescribing Information for EPIOXA HD and EPIOXA at www.Epioxa.com . You are encouraged to report all side effects to the FDA. Visit www.fda.gov/medwatch , or call 1-800-FDA-1088. You may also call Glaukos at 1-888-404-1644. Leanna Yip, Manager of Growth and Market Strategy Harvard Eye Associates +1 949-951-2020 marketing@harvardeye.com Legal Disclaimer: EIN Presswire provides this news content "as is" without warranty of any kind. We do not accept any responsibility or liability for the accuracy, content, images, videos, licenses, completeness, legality, or reliability of the information contained in this article. 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