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本
文
目
录
1、浅谈小核酸药物杂质分析难点
2、ADC药物质量分析的难点探讨
3、抗体偶联药物ADC的临床生物分析难点与策略
4、一根肽链，几十种杂质多肽药物有关物质分析，为什么这么难?
一、浅谈小核酸药物杂质分析难点
（原创 B.bridge 佑嘉医药）
小核酸药物指长度在30nt以下的核酸片段，主要包括MicroRNA、saRNA、siRNA等。本文以siRNA为例，简单探讨下小核酸药物杂质分析的难点问题。siRNA一般指长为19~23个核苷酸序列的双链RNA，通过与目标mRNA互补结合，特异性地实现mRNA降解，采用化学合成是最直接最可靠的获得siRNA的方法。此文仅针对合成工艺路线产生的，与行使功能的siRNA性质较为接近的杂质色谱分析条件进行探索。
一、文献报道
1)Thermo选用1、5、10、15、20位错配序列作为杂质进行研究。
如图所示，其出峰时间与错配位点之间并无明确规律，尤其是20位错配与目的序列之间保留时间极其接近。因此想要摸出其规律以便下一步分析，要以实验积累为基础，从具体核酸序列上再做探索。
2)Agilent选用离子对反向色谱对不同长度的寡核苷酸片段进行分析。
如图所示，可见不同长度序列的色谱峰极其接近，以n=20与n=21两片段为例，两样品峰并未完全分离，且色谱峰响应值低，如增加核酸浓度用于杂质分析，则相邻色谱峰之间分离度可能小于1.5，这为siRNA的杂质分析带来了极大的挑战。
二、色谱条件的选择
1)mp的选择
采用以下条件进行实验：
mpA
0.1M TEAA 3%CH3CN（pH7.0）
mpB
CH3CN
V
0.8ml/min
λ
260nm
以mpA:mpB不同比例进行色谱分析，当85:15时杂质间分离完全，峰形良好；当95:5时，有机相比例过低，洗脱1h未见色谱峰，由此可见该比例有机相含量已达到色谱分析极限。
结合上文所述目标序列与异构体之间色谱行为十分接近，流动相比例可优化范围又极窄，更增大了杂质与目标序列分离的难度。
2)离子对试剂选择
由于siRNA具有强烈负电性，需在流动相中添加离子对试剂以提高其在该色谱条件下的保留。液相色谱分析中常采用TEAA，此外HFIP、HAA等也常被应用于寡核苷酸的反向色谱分析中。
①TEAA：强离子对试剂如季铵盐会使寡核苷酸产生强保留，但同时会削弱不同碱基疏水性差异对保留的影响，并不利于杂质分离。作为较弱的阳离子体系，TEAA则显示出其优势。
②HFIP：为了使siRNA更好的发挥作用，人们常会对siRNA做一定的修饰，以增加siRNA的稳定性，其中硫代氧原子是众多修饰手法中最为常用的一个。但这种修饰中，由于“S”原子取代了“O”原子，使硫代寡核苷酸形成对映异构体，最终造成峰形展宽。将HFIP引入色谱系统中，通过系列条件优化，使最终条件下的系统适用性更优。
③HAA：由于TEAA体系的变性性质，其可能促进RNA双链之间的解链作用，因此为RNA双链的分析带来了一定的局限性。我们采用HAA体系用于siRNA的液相色谱分析中，降低RNA解链风险，且分离度及色谱峰响应值有所提高。
以上三种离子对试剂在siRNA杂质分析上的应用各有优劣，具体离子对试剂的选择还是应根据不同核酸序列的性质来确定，并不能一概而论。
3)pH值的影响
当mp-pH为3.0、7.0和10.0时进行了对比考察。
pH为3.0时色谱图：
pH为10.0时色谱图：
如图，结果显示当pH为7.0时系统适应性最好（见“mp的选择”项下色谱图），更有助于siRNA的色谱分析。若对色谱梯度做进一步调整，色谱行为可能会有所改善。
综上所述，因siRNA带电荷及其合成工艺的特殊性，如合成的过程中某位碱基发生错配而产生的核酸片段、siRNA双链末端缺失1或2位碱基的双链RNA、部分RNA单链杂质，其色谱行为并不像普通小分子化药具有规律性，接下来佑嘉生物药物分析团队将利用CMC平台 根据药物及杂质的理化性质、化学结构、杂质的控制要求，采用不同原理的检测器进行对比研究，期待与大家共同探讨小核酸药物的分析方法。
参考文献：
[1]siRNA的化学合成及其在医学研究中的应用初探。张仁礼，中山大学临床医学院。
[2]Reversed-phase ion-pair liquid chromatography analysis and purifification of small interfering RNA。Sean M. McCarthy *, Martin Gilar, John Gebler
[3]反相离子对色谱法对寡核苷酸药物分析的进展 杨洪淼，范慧红
[4]Evaluation of Different Ion-Pairing Reagents for LC/UV and LC/MS Analysis of Oligonucleotides。Gerd Vanhoenacker, Cindy Lecluyse, Griet Debyser
[5]DNAPac系列色谱柱的寡核苷酸分析应用 赛默飞
二、ADC药物质量分析的难点探讨
（原创 北斗七星 智药公会）
在精准医疗与靶向治疗快速发展的今天，抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）凭借其“精准制导、高效杀伤”的独特优势，已成为肿瘤治疗领域的前沿热点。从首个产品获批到如今多款国产ADC陆续上市，这一技术正以前所未有的速度推动着生物医药的创新进程。然而，在临床价值背后，ADC药物的质量控制体系面临着远超传统生物药或化学药的复杂挑战。其由抗体、连接子和高毒性小分子三部分构成的复合结构，导致分子异质性高、降解路径多样、分析难度大，任何一个环节的微小偏差都可能影响最终的安全性与有效性。因此，建立科学、系统、可追溯的质量分析体系，不仅是保障患者用药安全的核心，也是推动ADC药物从研发走向产业化的重要基石。
结构异质性带来的分析挑战
ADC药物最显著的特征是其高度的结构异质性，这主要源于偶联过程的非定点性和抗体本身的微变异。目前主流的偶联技术依赖于抗体表面赖氨酸或半胱氨酸残基的化学反应，由于这些位点在空间分布和反应活性上的差异，导致每个抗体分子所携带的药物数量和位置各不相同，形成一系列不同载药量（DAR）的分子混合物。
这种载药量分布直接影响ADC的药效学与药代动力学行为。DAR过低可能导致肿瘤杀伤力不足，而DAR过高则会增加分子疏水性，加速清除，甚至引发聚集和免疫原性风险。因此，准确测定平均DAR值及其分布，成为质量分析的首要任务，也是工艺开发与生产放行的关键控制点。
为应对这一挑战，行业已发展出多种分析手段。紫外-可见光谱法（UV-Vis）操作简便，适用于早期快速筛选，但无法提供DAR分布信息。疏水相互作用色谱（HIC-HPLC）可在非变性条件下按疏水性分离不同DAR组分，直观呈现分布曲线，是当前GMP生产中最常用的方法。而液相色谱-质谱联用（LC-MS）则能从分子质量层面直接解析DAR分布，提供最精确的结构信息，尽管成本较高，但在关键批次确认和深入表征中不可或缺。
游离药物控制的紧迫性
游离药物（Free Payload）是ADC质量控制中最为敏感的安全性指标。其来源主要包括生产过程中未完全去除的残留毒素、制剂储存期间的化学降解以及体内循环中的提前释放。由于有效载荷通常为高毒性小分子（如MMAE、DM1等），即使极微量的游离药物进入体循环，也可能对正常组织造成严重损伤，导致骨髓抑制、肝毒性等不良反应。
因此，建立高灵敏、高选择性的游离药物检测方法至关重要。目前，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）因其极低的检测限（可达pg/mL级）和优异的选择性，成为该领域的金标准。方法开发需重点评估基质效应、提取回收率和线性范围，确保在复杂生物基质中仍能实现准确定量。
此外，游离药物的控制不仅是放行检测的要求，更应贯穿于整个产品生命周期。在稳定性研究中，必须动态监测游离药物随时间的变化趋势，评估其在货架期内的安全性风险。同时，还需关注连接子的稳定性，尤其是可裂解连接子在酸性或酶环境下的水解行为，这些都可能成为游离药物生成的潜在途径。
分子与电荷变异体对药代与安全性的影响
ADC药物在生产和储存过程中易产生多种分子变异体，其中聚集体和片段是最受关注的两类。由于偶联了疏水性的小分子药物，ADC分子表面疏水性增强，更易发生非特异性聚集。聚集体不仅可能降低药效，还可能激活免疫系统，引发抗药抗体（ADA）反应，影响药物的安全性和有效性。
体积排阻色谱（SEC-HPLC）是检测聚集体的常规方法，但在分析ADC时存在局限：载荷的存在可能改变分子的流体力学体积，导致保留时间偏移，影响定量准确性。因此，常需结合多角度激光散射（SEC-MALS）技术，通过绝对分子量测定来提高结果的可靠性。
片段化问题同样不容忽视，可能源于生产过程中的剪切力或储存期间的蛋白酶降解。还原与非还原毛细管电泳（CE-SDS）可有效检测抗体链的断裂情况，并评估偶联状态的一致性。此外，电荷变异体（如酸性峰、碱性峰）也需关注，其成因包括去唾液酸化、氧化、脱酰胺等修饰，以及偶联反应本身对赖氨酸正电荷的中和。离子交换色谱（IEX）和成像毛细管等电聚焦（iCIEF）是常用分析工具，可用于监控产品一致性和偶联效率。
分析方法整合与生命周期管理的重要性
面对ADC复杂的质量属性，单一分析方法难以全面覆盖其质量特征。必须构建一个多维度、互补性的分析平台，涵盖结构、纯度、效价、杂质等多个方面，并在产品开发的不同阶段动态调整策略。早期研发可采用高通量方法进行快速筛选，进入临床阶段后则需建立经过验证的GMP级方法，确保数据的可靠性与可比性。
在商业化生产中，分析方法不仅要满足放行检测的要求，还需具备良好的稳健性和耐用性，能够应对不同批次、不同操作者和设备间的变异。同时，应建立方法生命周期管理机制，根据工艺变更、稳定性数据和监管要求持续优化分析策略，确保其始终处于受控状态。
此外，药代动力学（PK）分析也是ADC质量评价的重要组成部分。传统方法多关注总抗体或偶联抗体浓度，但近年来监管机构强调需同时监测游离药物及活性代谢物的暴露水平，以更全面评估药物的安全性与有效性。这要求建立融合配体结合法（LBA）与LC-MS技术的多平台PK检测体系，实现对多种分析物的同时追踪。
向更精准、更智能的分析未来迈进
随着定点偶联技术（如工程化半胱氨酸、非天然氨基酸、酶催化偶联等）的发展，ADC的结构均一性显著提升，DAR分布趋于集中（如DAR4为主），这为质量分析带来了新的机遇。结构更均一意味着分析图谱更清晰，方法开发更易标准化，也为建立更精确的质量-疗效关系（QTPP）提供了可能。
然而，新技术也带来新挑战。新型连接子、新型载荷以及更复杂的偶联化学，要求分析方法不断创新。质谱成像、氢氘交换质谱（HDX-MS）、表面等离子共振（SPR）等前沿技术，正在被用于深入解析ADC的构象变化、稳定性及与靶标的相互作用机制。
未来，ADC质量分析将朝着更高分辨率、更高灵敏度、更高通量的方向发展。人工智能与大数据分析的引入，有望在复杂图谱解析、质量趋势预测和异常信号识别中发挥重要作用，推动质量控制从“被动检测”向“主动预警”转变。唯有持续创新分析技术，构建科学严谨的质量体系，才能确保ADC这一“生物导弹”真正实现精准打击，在提升疗效的同时最大限度保障患者安全。
参考资料：
[1] FDA. Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates: Guidance for Industry (Draft), 2022.
[2] Beck A, et al. Strategies and challenges for the next generation of antibody–drug conjugates. Nat Rev Drug Discov. 2017;16(5):315-337.
[3] Sun X, et al. Antibody–drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2022;12(4):1640-1660.
三、抗体偶联药物ADC的临床生物分析难点与策略
（原创 谭玉萌，王雪芳 药明康德测试事业部）
1. 抗体偶联药物ADC介绍
1.1抗体偶联药物ADC
癌症已成为全球第二大健康威胁，截至到2020年，约有1000万人死于癌症[1]。几十年来，基于细胞毒性药物的化学疗法一直是治疗癌症的主要手段[2]。这些细胞毒性药物包括DNA碱基类似物(5-氟尿嘧啶和8-氮鸟嘌呤)、DNA相互作用药物(顺铂和放线菌素D)、抗代谢药物(氨蝶呤和甲氨蝶呤)和微管蛋白抑制剂(紫杉醇和长春新碱衍生物)等[3-7]。然而，大多数化学治疗药物的治疗指数较低，并且由于非特异性药物暴露于靶组织而产生严重的副作用[8]。为了解决这一问题，科学家们一直致力于开发具有更高质量的新型癌症治疗方法。
通过精准靶向肿瘤表面抗原，单克隆抗体的出现改变了癌症治疗的模式，然而，单独使用单克隆抗体的治疗往往是不够的，潜在的原因是与化学疗法相比，单克隆抗体对癌细胞的致死率较低[8]。因此，抗体偶联药物( antibody-drug conjugate，ADC)应运而生[9]。ADC药物是一种将小分子细胞毒素（payload）通过连接子（linker）与抗体偶联形成的药物。与传统的小分子化学治疗以及抗肿瘤单克隆抗体相比，ADC药物不仅可以提高化学治疗的疗效和抗肿瘤细胞的特异性，还可以降低或减弱系统毒性以及非靶向细胞毒性[10]。
图1.抗体偶联药物ADC结构，图片引自[11]
2000年，美国食品药品管理局(FDA)首次批准了用于治疗成人急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的ADC药物Mylotarg®(gemtuzumab ozogamicin)[12]，标志着该药物的癌症靶向治疗ADC时代的开始。截止到2023年1月13日，全球共有15款ADC药物获监管部门批准上市。此外，目前有超过100种ADC候选药物处于不同的临床试验阶段[11]。
表1.全球已获批上市ADC药物
表格引自药智数据、生物谷等公开资料
1.2 ADC药物组成与作用机制
ADC类药物包含三种成分:第一部分是高特异性和高亲和力的抗体， 抗体可以是嵌合抗体，也可以是抗体片段或双特异性抗体；第二部分是高稳定性的连接子，可分为可裂解型或不可裂解型，可裂解性的连接子利用体循环和肿瘤细胞之间的环境差异，准确释放游离的payload，进一步分为化学裂解连接子(腙键和二硫键)和酶裂解连接子(葡萄糖醛酸键和肽键)[11]；不可裂解型的连接子通过降解抗体来释放payload；第三部分是小分子细胞毒素，通常分为两类，分别是靶向DNA的细胞毒素药或者微管抑制剂[11]。常见的靶向DNA的细胞毒素药有吡咯苯二氮杂卓（PBD）、杜卡霉素（Ducamycin）和喜数碱类（Camptothecin, CPT）、卡奇霉素(Cachimycin)等;常见的微管抑制剂有金盏花素（MMAE，MMAF）、美登素衍生物（DM2，DM4）、微管溶素（Tubulysins）和隐粘菌素（Cryptomycins, CR）等。
ADC药物的作用机制：首先通过单克隆抗体的靶向作用特异性的识别肿瘤表面抗原，通过内吞作用内化到达细胞，经内吞小体进入溶酶体，溶酶体的酸性环境和蛋白水解酶会致使ADC降解，释放的效应分子（payload）随后进入细胞质中，然后通过DNA插入或抑制微管合成等方式诱导肿瘤细胞凋亡[13]。
图2.抗体偶联药物ADC作用机制，图片引自[13]
1.3抗体偶联药物ADC生物分析难点
ADC药物的临床生物分析包含PK药代动力学、ADA抗药抗体以及Nab中和抗体分析。ADC进入体内后，payload可通过酶解或者化学反应从主体结构上逐渐解离，主要包括ADC、总抗体、游离的小分子payload以及payload相关的代谢产物等,他们在体内的浓度变化对解读ADC的PK药代动力学特点至关重要。ADC为抗体或抗体片段至少结合一个payload（抗体偶联比（Drug to antibodyratio，DAR）≥1）；总抗体为未偶联和偶联至少一个payload分子的抗体的总和（DAR≥0）；Payload为ADC裂解或被分解代谢后形成的游离的payload[15]。由于ADC自身所具有的特殊结构和复杂的组分多样性，其生物分析方法的建立具有很大的挑战性。
首先，由于ADC药物为各种组分混合物，且不同采集时间的ADC形态和组分可能不同，因此标准品很难完全代表不同PK采样点的样品。
其次，不同药物DAR值的ADC与捕获试剂或者检测抗体的结合能力可能不同，影响总抗体和ADC浓度的准确度测定。
最后，由于ADC结构的特殊性，偶联引入了新的抗原表位，对确证为阳性的样本免疫原性分析需要开展结构域特异性评价。
2. 抗体偶联药物ADC指导原则
2.1 PK药代动力学指导原则
2013年美国药学家协会（American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS）发表了“Bioanalysis of antibody–drug conjugates: American Association of Pharmaceutical Scientists Antibody–Drug Conjugate Working Group position paper”白皮书[14]。在“ADC药物应该测定哪些生物分析物”的相关章节指出，对于ADC药物的PK分析，应该测定多种生物分析物用于评估ADC暴露量，表一总结了ADC生物分析通常需要测定的生物分析物以及相应的方法。2022年2月FDA发布了 “Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指导原则草案[15]。在生物分析相关章节指出，对ADC的药代动力学评估应该对体内的总抗体、ADC以及小分子部分payload进行分析。此外，ADC药物的PK方法学验证应按照FDA指南“Bioanalytical Method Validation”[16]， 欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）指南“Guideline on bioanalytical method validation”[17]，ICH M10“Bioanalytical method validation and study sample analysis”[18]和中国药典《生物样品定量分析方法验证指导原则》[19]等进行验证和报告。
表2.通常用于抗体偶联药物ADC生物分析的分析物，表格来自[14]
2.2 ADA抗药抗体指导原则
对于ADC的免疫原性分析，FDA发布的“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指导原则草案的免疫原性相关章节指出，ADC的任何组成部分都可能产生免疫应答，包括抗体、payload或由连接子产生的表位[15]。同时该指导原则草案[15]指出对于免疫原性的评估，应按照FDA指南“Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection” (2019年1月)[20]中概述的方法进行免疫原性评估，包括检测ADC抗药抗体(ADAs)的确认性评估。此外，应开发多种检测方法来测量对ADC组成部分的免疫反应，例如偶联产生的额外表位或结构域。对于多结构域蛋白的抗药抗体生物分析，2019年美国FDA发表的“Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection”和2021年国家药品监督管理局发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》[21]均明确指出“对于多结构域治疗性蛋白药物，如聚乙二醇化蛋白、多特异性抗体，建议针对整个治疗性蛋白药物进行初步筛选试验和确证试验，基于风险或产品特征，对确证为阳性的样本进一步开展域特异性评价。”
2.3 Nab 中和抗体分析指导原则
对于Nab中和抗体的检测，其指导原则与常规的大分子的指导原则类似，有基于细胞的中和抗体检测方法(cell-based analysis)和非基于细胞的中和抗体检测方法(non-cell-base analysis)，可以根据具体的大分子药物的作用机制、选择性、灵敏度、精度和稳健性等选择分析方法。一般来说，2019年美国FDA发表的“Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products —Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection”[20]建议使用基于细胞的生物测定法进行中和试验。
3. 抗体偶联药物ADC的生物分析策略
3.1 ADC 药物PK药代动力学生物分析
由于ADC兼具大分子和小分子治疗药物的分子特征，因此大分子或小分子两种药物典型的生物分析方法都是必要的分析手段。药明康德大分子生物分析实验室通常采用ELISA或MSD平台来检测总抗体以及ADC药物的PK药代动力学。对于总抗体的PK检测，多利用包被抗原或抗ID(idiotype)抗体捕获总抗体，再选择合适的酶标检测抗体（如抗Fc抗体或者抗ID(idiotype)抗体）作为检测抗体进行定量检测。对于ADC药物的PK检测，利用抗payload药物抗体捕获ADC，再选择合适的酶标检测抗体（如抗Fc抗体或者抗ID(idiotype)抗体）作为检测抗体进行定量检测。对于payload相关的PK分析，通常采用LC-MS平台进行检测。药明康德生物分析实验室开展了多项ADC检测项目，我们会对ADC的结构、体内转化以及稳定性等做充分了解，制定相应的分析策略和优化措施，成功帮助客户实现总抗体、ADC以及payload的浓度准确性测定。
图3.ADC药物PK药代动力学生物分析方法[22]
3.2 ADC药物ADA抗药抗体生物分析
ADC药物ADA的分析方法主要是基于MSD平台的桥联法，生物素（Biotin）标记的ADC药物作为捕获试剂，地高辛（Dig）或者钌标的ADC药物作为检测试剂，实现对ADA的检测（图4）。
ADC药物的ADA样品分析的主要流程是，首先对样品进行初筛分析，初筛阳性的样品会进行确证分析，确证阳性的样品会进行中和抗体分析和滴度分析。由于ADC药物自身的不同结构域都可能产生ADA，抗原表位可以是抗体部分、连接子或payload 部分，也可以是复合物整体。因此，药明康德大分子生物分析实验室对ADC药物的免疫原性测定时，会对ADC 药物确证为阳性的样本进一步开展域特异性评价。
图4. ADC药物ADA抗药抗体生物分析
3.3 ADC药物Nab中和抗体分析
对于ADA抗药抗体阳性的样本，通常需要分析Nab中和抗体。对于中和抗体的测定，我们根据法规要求，更推荐Cell-based基于细胞的体外功能性试验，它更反应体内的真实情况，难点是需要寻找合适的细胞系，基质效应明显，干扰大。在难以获得相关细胞系，或者基质效应无法解决的情况下，可以使用Non-cell based方法。我们根据客户检测的药物的特性，成功帮助客户设计并完成多个针对肿瘤易感基因受体并带有细胞毒性分子的ADC药物的cell-base Nab检测。
4. 药明康德生物分析部ADC药物的生物分析经验
药明康德测试事业部生物分析部拥有丰富的ADC药物的生物分析经验，已开发并验证符合GLP法规要求的多种生物分析方法，经验包含Her2、Her3、Trop-2、Claudin 18.2、PSMA、CD38和CDH3等单双抗靶点，MMAE、MMAF、DM1、DM4、SN38、DXD、Camptothecin(喜数碱)等payload，充分满足检测需求。通过不断发展的生物分析技术，深入全面地阐明ADC药物的药物代谢、药效以及免疫原性特征，对于推动研发出更加低毒高效的ADC药物至关重要，助力药物的IND、NDA和 ANDA等申报。
参考文献（滑动查看）：
[1] Sung, H. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71,209–249 (2021).
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[3] Gilman, A. & Philips, F. S. The biological actions and therapeutic applications of the B-chloroethyl amines and sulfides. Science 103, 409–436 (1946).
[4] Heidelberger, C. et al. Fluorinated pyrimidines, a new class of tumour-inhibitory compounds. Nature 179, 663–666 (1957).
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[6] Rosenberg, B., Van Camp, L. & Krigas, T. Inhibition of cell division in Escherichia coli by electrolysis products from a platinum electrode. Nature 205, 698–699 (1965).
[7] Rowinsky, E. K. & Donehower, R. C. Paclitaxel (taxol). N. Engl. J. Med. 332,1004–1014 (1995).
[8] Shefet-Carasso, L. & Benhar, I. Antibody-targeted drugs and drug resistance—challenges and solutions. Drug Resist. Updat. 18, 36–46 (2015).
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[17] European Medicines Agency (EMA), Guideline on bioanalytical method validation, EMEA/CHMP/EWP/192217/2009，21 July 2021.
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[19] 中国药典2020年版，生物样品定量分析方法验证指导原则
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[21] 国家药品监督管理局,药物免疫原性研究技术指导原则, 2021.
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四、一根肽链，几十种杂质多肽药物有关物质分析，为什么这么难?
（原创 土狗2号 集你肽美）如果你做过多肽分析，大概率有过这样的体验：
👉 同样是 HPLC，放到多肽身上，方法突然就“不听话”了
👉 梯度稍微一动，保留时间就乱跑
👉 峰形拖尾、肩峰、双峰，怎么调都不完美
问题不在你，而在多肽本身。
今天土狗就和大家系统聊一聊：多肽药物中，多肽相关杂质到底该怎么分析？一、为什么多肽药物“天生难分析”？
多肽，介于小分子化学药与生物大分子药物之间，看似“中间态”，但在分析上，却集齐了两边的“难点”。1️⃣ 分子量大，对色谱极度敏感
以明星药物索马鲁多肽为例，分子量约4114 Da。
这意味着：
对B%（有机相比例）异常敏感
即便 0.1% 的变化，也可能导致保留时间大幅漂移
在流动相中扩散慢，柱效下降、峰变宽
👉 小分子能“凑合”的条件，在多肽这里往往直接失效。
2️⃣ 有结构，不是“一根直线”
多肽不是一条软绳，而是会形成：
α 螺旋
β 折叠
稳定的三级结构
结果是：并不是整条肽链都能和固定相接触，
真正参与相互作用的，往往只是“暴露在外”的残基。
👉 同序列、不同构象，也可能带来不同保留行为。
3️⃣ 酰胺键的“顺反异构”是个坑
多肽由大量酰胺键连接，而酰胺键具有部分双键特性。
这会带来一个在小分子中不常见的问题：
顺 / 反异构体共存
在色谱上常见表现就是：
峰形异常
双峰、肩峰
温度一变，峰型就跟着变4️⃣ 两亲性 + 等电点 = pH 敏感体质
多肽同时含有：
酸性羧基
碱性氨基
因此存在明确的等电点（pI）。
而在pH 接近等电点时：
溶解度最低
易聚集
峰形最差
👉 pH 选错，多肽会“直接摆烂”。
5️⃣ 杂质像“复制粘贴”
多肽合成过程中，会产生大量结构高度相似的杂质：
缺失一个氨基酸
外消旋杂质
氧化、脱酰胺降解产物
结构差异极小，但色谱行为几乎一致，
这也是多肽有关物质分离最难的地方。
二、多肽有关物质分析，核心思路是什么？
一句话总结：
不要指望“一种模式打天下”
多肽分析，通常需要多种色谱模式协同使用：
反相色谱（RP）——主力
离子交换色谱（IEC）——补充选择性
尺寸排阻色谱（SEC）——盯聚合物三、反相色谱（RP）：多肽分析的主战场▶ 色谱柱，怎么选才不踩坑？
硅胶基质仍然是首选，原因很现实：
机械强度高
技术成熟
对多肽这种“扩散慢”的分子更友好
由于多肽主要只进入颗粒表层，
反而减少了内部扩散导致的谱带展宽。
经验建议：
小粒径柱：对多肽利大于弊
窄内径柱：可减少纵向扩散
孔径 10–12 nm：可满足绝大多数多肽分析
▶ 固定相不止 C18
虽然C18 是默认选项，但并非万能：
苯基柱：
对含酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族残基的多肽，
往往能提供截然不同的选择性
不同封端方式
嵌入极性基团
不同表面修饰
👉 方法开发阶段，一定要多试几种“性格不同”的柱子▶ 流动相：TFA 不是唯一答案
三氟乙酸（TFA）
磷酸盐缓冲液
pH 筛选极其重要▶ 有机相与梯度：慢，就是快
乙腈优于醇类（低粘度、低 UV 吸收、峰形好）
可少量加入甲醇、异丙醇调选择性
梯度一定要“慢慢爬”
👉 对多肽来说，
快梯度 = 自找麻烦▶ 其他关键参数
柱温
检测波长四、离子交换色谱（IEC）：解决“RP 分不开”的问题
当你发现：
RP 怎么调都分不开杂质死死贴着主峰
这时候，IEC 往往能救命。▶ IEC 的核心是：pH + 抗衡离子
流动相 pH 一般控制在等电点 ±1
阳离子交换：pH 至少低于 pI 1 个单位
阴离子交换：pH 至少高于 pI 1 个单位
常用抗衡离子包括：
Cl⁻、ClO₄⁻、SO₄²⁻
Na⁺ 等碱金属离子
👉 改变抗衡离子类型和浓度，
往往比“死磕柱子”更有效。▶ IEC 固定相类型速览
强阴离子交换：–N(CH₃)₃⁺
强阳离子交换：–SO₃⁻
弱阴离子交换：–NH₂
弱阳离子交换：–COOH
柱规格和其他参数，基本可参考 RP 的经验。五、尺寸排阻色谱（SEC）：专盯“聚合物杂质”
SEC 并不是用来“精细分离”的，
它的任务只有一个：
把“大块头”揪出来▶ SEC 关键点
常用二醇基修饰硅胶柱，减少非特异吸附
孔径通常12 nm即可
流速可适当降低，提高柱效
流动相中可加入较高浓度缓冲盐，降低电荷效应
👉 SEC 是聚合物杂质研究中的“定海神针”。
六、写在最后：多肽分析，是一场耐力赛
多肽药物的分析方法开发，从来不是“调两天就完事”。
它往往意味着：多种分离模式反复切换；固定相、pH、梯度不断试错；随着杂质认识加深，方法持续迭代。正如很多分析人总结的那样：
多肽分析，拼的不只是技术，更是耐心。
如果你正在被多肽有关物质“折磨”，
那不是你不行，
而是你正在挑战分析化学里最难的一类分子之一。
end
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