Folitixorin Calcium

引言 结核病（TB）是一种主要由结核分枝杆菌（MTB）引起的全球性传染病。近年来，每年全球有超过1000万新发结核病例，并导致超过160万人死亡，使MTB成为全球第二大致死传染性病原体，仅次于SARS-CoV-2，超过艾滋病病毒（HIV）。耐药结核的出现和持续增加，使全球结核疫情更加严峻。 MTB耐药的机制主要有两种：一是药物靶点相关基因突变导致药物失效，二是MTB药物外排泵的激活和过表达，降低了细菌内的有效药物浓度。多药外排泵A（Efflux pump A, EfpA）是首个在MTB中发现的药物外排泵，也是MTB生存所必需的。在多种临床耐药株中，EfpA过量表达使MTB对异烟肼、利福平、阿米卡星等多种药物的耐受性增加了几十甚至上百倍。最近报道的新型抗MTB抑制剂BRD-8000系列和BRD-9327，被证明能够特异性靶向EfpA。然而，目前我们对EfpA在MTB体内的功能及其抑制机制仍然了解有限。 2024年9月4日，南方科技大学廖茂富团队在Nature Communications 上发表题为Structures of the Mycobacterium tuberculosis efflux pump EfpA reveal the mechanisms of transport and inhibition的研究论文。该研究表明，EfpA可能作为脂质转运蛋白，在MTB细胞内促进脂质在磷脂双层之间的翻转，并揭示了新型抑制剂在EfpA上的作用位点及其抑制机制。 研究团队利用冷冻电镜解析了EfpA在向外开放构象下与内源性脂质或抑制剂结合的高分辨率结构。EfpA属于转运蛋白中的Major Facilitator Superfamily（MFS）超家族，但与经典的12条跨膜螺旋的MFS转运蛋白不同，EfpA除了NTD和CTD各6条跨膜螺旋外，还具有一个连接NTD和CTD的含有两条跨膜螺旋的铰链结构域（HD）。 图1. 结核分枝杆菌EfpA结构、脂质通道以及抑制剂结合位点(Credit: Nature Communications) 有趣的是，EfpA 内部存在一个从质膜磷脂双层内叶延伸至外叶的“阶梯”型通道，其中有三个脂质分子以头对头、尾对尾的方式依次结合（A、B和C位）。分子动力学模拟表明，这些脂质分子能够稳定地结合在该通道内。在该通道中间区域，两个脂质分子的亲水头部与周围螺旋结构共同形成了一个向外开放的带负电荷的口袋。这个口袋的大小和表面电荷与 EfpA 外排的亲水性底物 EtBr 和异烟肼相匹配。 在 EfpA 与抑制剂 BRD-8000.3 结合的结构中，BRD-8000.3 取代了 A 位脂质分子，占据了 EfpA 中脂质通道的内叶脂质结合位点。这与之前报道的几种 BRD-8000.3 耐受突变株的突变位点相一致。而 BRD-9327 耐受突变则位于脂质结合位点 B 周围。通过 AutoDock 分子对接分析，BRD-9327 可以结合到脂质结合位点 B，取代该位点的脂质。BRD-9327 和 BRD-8000.3 在 EfpA 中结合的位点不同，这解释了之前报道的两者联合使用时具有的协同抑制作用。 小分子占据 EfpA 中的脂质结合位点，进而抑制 MTB，这表明这些脂质与 EfpA 在 MTB 中的内在功能存在至关重要的联系。为了进一步探究 EfpA 的内在功能，研究者利用基因结构功能预测工具 COFACTOR 和 Dali 分别对数据库进行搜索，两种搜索结果一致地将 MFS 超家族中的溶血磷脂转运蛋白 MFSD2A 作为最佳匹配。尽管序列同源性较低（11%），EfpA 和 MFSD2A 在结构上表现出高度相似性。此外，B 和 C 两个脂质结合位点也彼此对应。这些发现表明，EfpA 很可能与 MFSD2A 类似，具有脂质转运蛋白的功能。 此外，研究者还比较了EfpA向外开放的冷冻电镜结构与 AlphaFold 预测的向内开放的EfpA结构，揭示了两者之间的构象变化以及脂质通道的改变。最后，他们提出了 EfpA 脂质转运的“阶梯翻转”模型，以及小分子抑制剂的作用机制。 综上所述，该研究解析了结核分枝杆菌多药外排泵 EfpA 的结构，表明 EfpA 在 MTB 中可能行使脂质转运蛋白的功能，确定了新型 MTB 抑制剂在 EfpA 内的结合位点。这些进展为靶向 EfpA 的抗结核新药研究和优化提供了结构基础，并推进了对 MFS 超家族脂质转运蛋白机制的理解。 图2. EfpA 的脂质转运模型以及小分子抑制机制(Credit: Nature Communications) 参考文献 https://www.nature.com/articles/s41467-024-51948-9 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

引言 核苷酸结合丰富亮氨酸重复序列(NLR)蛋白通过识别病原体效应在植物免疫中起关键作用。维持平衡的免疫反应是至关重要的，因为过度的NLR表达可能导致意外的自身免疫。与大多数NLR不同，植物细胞死亡所需的NLR 2 (NRC2)属于一个小NLR组，其特征是组成性高表达而不自我激活。NRC2自抑制和激活的机制尚不清楚。 2024年6月12日，西湖大学柴继杰、德国马克斯·普朗克植物育种研究所Paul Schulze-Lefert及湘湖实验室马守偲共同通讯在Nature 在线发表题为“Oligomerization-mediated autoinhibition and cofactor binding of a plant NLR”的研究论文，该研究展示Solanum lycopersicum (番茄)NRC2 (SlNRC2)在高浓度下形成二聚体和四聚体，以及高阶低聚物。Cryo-EM显示了这些低聚物中SlNRC2的非活性构象。二聚化和寡聚化不仅稳定了SlNRC2的非活性状态，而且使SlNRC2从的组装中分离到活性形式。 二聚体或二聚体间界面的突变增强了Nicotiana (N.) benthamiana中病原体诱导的细胞死亡和免疫。冷冻电镜结构出乎意料地揭示了肌醇六磷酸酯(IP6)或五磷酸酯(IP5)结合在SlNRC2的C端LRR结构域的内表面，经质谱证实。IP结合位点的突变损害了SlNRC2的肌醇磷酸结合和病原体诱导的SlNRC2介导的N.  benthamiana细胞死亡。总之，该研究揭示了NLR激活的一种新的负调控机制，并表明肌醇磷酸是NRCs的辅助因子。 植物已经发展出一种双层免疫系统来探测和应对环境中的潜在威胁。第一道防线被称为模式触发免疫(PTI)，当膜上的模式识别受体识别细胞表面上进化的保守的微生物衍生的分子模式时，就会启动。然而，一些病原体已经进化出可以抑制PTI的效应分子，从而促进感染。作为回应，植物进化出了抗性(R)蛋白，这种蛋白通常识别菌株特异性效应器，从而产生更强的防御反应，称为效应器触发免疫(ETI)。ETI通常会诱发超敏反应(hypersensitive response, HR)，这是一种受调控的宿主细胞死亡，局限于试图感染的部位。 大多数R蛋白是细胞内核苷酸结合丰富亮氨酸重复序列(NLR) 受体，在植物防御病原体入侵中起着至关重要的作用。NLR受体是多结构域蛋白，包括一个中央核苷酸结合结构域(NBD)和一个C末端富含亮氨酸重复结构域(LRR)。根据特定N端结构域(如CC 结构域)的存在，它们可以分为不同的亚家族。在健康植物中，NLR与ADP结合，并通过域内相互作用保持非活性。对病原体效应物的识别触发NLR的构象变化，并将ADP交换为ATP，将其转化为活性构象。这些分子事件最终导致NLR寡聚化并形成称为抵抗体的高阶蛋白质复合物。NLR抗性小体通过钙(Ca2+)-可渗透通道整合信号，触发下游防御机制。植物中许多NLR的高水平表达导致了在没有病原体的情况下的自身激活和HR细胞死亡。这表明NLR的激活可以通过NLR蛋白的积累来诱导，正如用拟南芥NLR RPS4观察到的浓度依赖性HR细胞死亡所证明的那样。因此，NLR的表达在植物中受到严格调控，以防止自身免疫和确保平衡的免疫反应。 SlNRC2寡聚化的结构机理（Credit: Nature） 负责检测效应器的NLR通常被称为“传感器”NLR。这些通常与下游信号NLR一起发挥作用，将识别转化为免疫激活，它们被称为“辅助”NLRs。在茄科植物中，辅助性CC-NLRs (CNLs)，具体称为细胞死亡所需的NLR (NRCs)，在激活众多传感器NLRs的功能中起关键作用。NRCs，包括NRC2、NRC3和NRC4，与大多数其他NLRs相比，属于在无病原体情况下高表达的一小部分核心NLRs。由特定传感器NLR触发的免疫反应可能依赖于一个或几个辅助NRCs。与一些CNLs的五聚体抗性体相反，SlNRC4抗性体最近被证明形成六聚体来触发ETI。 该研究发现SlNRC2在升高的浓度下形成二聚体和四聚体，以及高阶低聚物。利用冷冻电镜进行结构分析，发现SlNRC2在二聚体和低聚体状态下均为非活性构象。结构对比表明，SlNRC2的二聚化和寡聚化作用稳定了非活性的构象。SlNRC2二聚化和寡聚化的损伤增强了CP诱导的N. benthamiana细胞死亡，支持分子间相互作用对 SlNRC2激活的抑制作用。冷冻电镜结构出人意料地揭示了一个肌醇磷酸分子，主要是IP6或IP5 (IP6/5)，与C端LRR结构域结合，这是质谱(MS)证实的。IP6/5与该位点的结合是CP诱导的N. benthamiana细胞死亡所必需的，这表明磷酸肌醇在调节SlNRC2 信号传导中的辅助因子作用。总的来说，该研究结果提供了对植物NLR激活的复杂负调控的见解，并提出了关于肌醇磷酸酯在NLR免疫信号传导中的作用的有趣问题。 原文链接 https://www.nature.com/articles/s41586-024-07668-7 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“iNature” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述