Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles (Direct Biologics)

欢迎加入“艺药荟”知识星球，持续尊享学习资源! 经典阅读： 细胞外囊泡与其母细胞共享脂质-蛋白质膜，能够将生物活性物质靶向转移至受体细胞以进行功能调节。这些生物学特性使细胞外囊泡既能作为内源性治疗剂，又能作为用于靶向分子运输的工程化递送载体。近年来，基于细胞外囊泡的疗法作为一种针对创伤性疾病以及退行性、急性和难治性疾病的新型治疗方法，展现出了巨大潜力。随着细胞外囊泡工程技术的不断发展，预计未来会有更多创新药物获得监管机构的研究性新药批准和上市批准。然而，在作用机制理解、工程改造、生产工艺、质量控制和非临床研究等方面仍存在诸多挑战，目前尚无药物监管机构发布针对基于细胞外囊泡药物的具体技术评估指南，这些都阻碍了此类药物的临床转化。在本文中，我们主要聚焦于源自哺乳动物细胞的细胞外囊泡，总结了基于细胞外囊泡药物的临床转化及工艺开发研究现状，并提出了开发过程中质量控制策略和非临床评价的一般考虑因素及关键要点。本综述旨在为基于细胞外囊泡产品的开发和评价提供有价值的参考，加速临床转化进程，并尽快使患者受益。 【NO.1】引言 创新治疗产品，如抗体药物偶联物、基因疗法、干细胞、免疫细胞治疗产品，为许多难以治疗的疾病提供了新的选择和希望。随着细胞外囊泡作为天然治疗剂或递送工具的发展，基于EV的药物研发已成为一个热门研究领域。EV药物通过具有ADCs的靶向递送特性、作为基因治疗的载体以及继承源细胞的功能，与这些创新治疗产品具有共同特性。此外，它们还具有独特的特点，如致瘤性和栓塞风险低、免疫原性低、生物相容性好以及生物活性靶点丰富。因此，EV药物作为创新治疗产品具有巨大潜力。 EVs具有磷脂双分子层质膜结构，由细胞释放但不能复制。据信，由微泡和外泌体组成的EVs由所有活细胞产生。微泡是细胞内物质直接被细胞膜包裹后形成并释放的，直径范围为30至150 nm。外泌体通过内吞作用形成，其中物质被质膜包裹在内体中形成膜性颗粒。内体与细胞膜融合并释放膜结合颗粒，其大小范围为100至1000 nm。微泡和外泌体在结构和组成上非常相似，EVs的异质性使其分类具有挑战性。由于几乎无法确定EVs是微泡还是外泌体，这与细胞外囊泡国际协会的最新命名规则一致，本文中涉及的所有外泌体或微泡均称为EVs。 细胞外囊泡的脂质双分子层膜结构与其母细胞相似，其中包含鞘脂、胆固醇、磷脂和膜蛋白。EVs富含蛋白质、RNA和DNA，并且可以通过其质膜特性靶向特定细胞。然后，EVs将活性分子转移到靶细胞以调节其生物学功能。这些生物学特性对于EVs在治疗难治性疾病中的两个重要应用不可或缺：作为天然治疗药物和作为药物递送工具。作为治疗药物，EVs本身可以具有治疗作用，更重要的是，可以对其进行改造以有效负载关键分子并改善药物递送，从而提高其治疗效果。作为药物递送工具，基于EVs的药物工程可以使药物更有效地穿透靶细胞，从而发挥最佳疗效，并减少递送至非靶细胞的药物引起的副作用，因此提高治疗的安全性。目前，尽管天然治疗性EV产品已朝着临床转化发展，但工程化的EV治疗药物可能具有更大的临床应用潜力。 徐等人的研究表明，尽管天然治疗性EV产品已朝着临床转化发展，但工程化的EV治疗药物可能具有更大的临床应用潜力。 表1. EVs（微泡和外泌体）参数的异质性 查加夫和韦斯特发现血液中的一部分颗粒，现在被认为是细胞外囊泡。 努涅斯和迈克尔等人提出的多泡体概念以及对细胞外囊泡释放的推测。 拉波索和格兹等人发现免疫细胞来源的细胞外囊泡的抗原呈递作用。 拉塔伊扎克等人发现细胞外囊泡介导的RNA/蛋白质转移用于细胞间通讯。 诺贝尔生理学或医学奖授予发现调节囊泡运输机制的科学家。 Aegle Therapeutics公司的AGLE-102用于烧伤治疗，首个未经处理的细胞外囊泡药物，获得美国食品药品监督管理局的研究性新药申请批准。 Direct Biologics公司的ExoFlo作为再生医学先进疗法用于急性呼吸窘迫综合征，获得FDA批准进入III期临床试验。 图1 基于细胞外囊泡药物开发中的关键里程碑。该图展示了一个按时间顺序排列的时间线，突出了1946年至2023年细胞外囊泡药物开发中的重要里程碑或事件。每个标记的年份代表一个关键进展。 作为潜在的治疗产品，许多公司正在开发基于细胞外囊泡的药物。目前全球有100多项临床研究在评估天然和工程化细胞外囊泡药物用于治疗呼吸系统疾病、神经系统疾病、严重急性炎症和肿瘤。然而，这些治疗面临技术挑战，如确定作用的分子机制、不成熟的大规模生产技术以及难以进行工程改造。 此外，在监管科学方面存在相当大的挑战，包括产品定义和分类不明确以及缺乏与产品研发相关的技术指南，这在不同程度上限制了细胞外囊泡药物的临床开发。在本文中，我们回顾了细胞外囊泡作为治疗药物或药物递送载体的发展。此外，基于细胞外囊泡药物的基础研究和临床转化以及与其生产相关的技术进展，我们提出了与其生产过程、质量控制以及支持其开发的非临床研究相关的一般和具体考虑因素，旨在促进细胞外囊泡药物的开发。 【NO.2】细胞外囊泡药物研发进展 细胞外囊泡于20世纪50年代首次被发现，几十年来，它们最初被视为细胞代谢物的“垃圾桶”。20世纪90年代后期，研究人员发现细胞外囊泡膜嵌入跨膜蛋白，富含蛋白质、脂质和核酸，这导致相关生理功能逐渐被发现。诺贝尔生理学或医学奖授予詹姆斯·E·罗斯曼、兰迪·W·谢克曼和托马斯·C·聚德霍夫，以表彰他们在发现和阐明细胞外囊泡运输及调节机制方面的贡献，这使细胞外囊泡作为一种在细胞间自由穿梭的“信使”重新被世人所知。细胞外囊泡的发现及其功能的重新定义改变了我们对细胞间通讯的理解，并在细胞生物学、分子生物学和医学研究中开辟了新的领域。从最初的“代谢垃圾桶”到目前先进的药物，细胞外囊泡的研发经历了漫长的过程。 表2. 用于治疗应用的天然细胞外囊泡的分类与总结 Xu等人的探索（图1）。在此，我们首先回顾细胞外囊泡药物的发展，包括从天然细胞外囊泡到工程化细胞外囊泡的进展，以及从基础研究到药物开发的转变。 2.1 天然细胞外囊泡 理论上，生物体的所有细胞都会分泌天然细胞外囊泡。在体内生理条件下，特定类型细胞释放的天然细胞外囊泡可被邻近细胞直接吸收，或通过体液循环被远处细胞吸收，从而在靶细胞中发挥其生物学功能。研究试图揭示天然细胞外囊泡在体内调节微环境的机制和作用。例如，体内肿瘤细胞释放的天然细胞外囊泡被证明可通过调节肿瘤微环境介导免疫抑制、免疫逃逸和耐药性。在这类研究中，很难将天然细胞外囊泡转化用于疾病治疗。因此，本文讨论的天然细胞外囊泡主要指从细胞培养液、生物体液或植物组织裂解物中分离纯化且未作进一步修饰的细胞外囊泡。目前，各种细胞培养物、生物体液和植物组织都被用于制备细胞外囊泡。在此，我们讨论用于疾病治疗研究的主要天然细胞外囊泡类型，包括哺乳动物细胞衍生的细胞外囊泡、乳汁衍生的细胞外囊泡和植物衍生的细胞外囊泡，并考虑它们大规模生产和临床应用的前景（表2）。 哺乳动物细胞衍生的细胞外囊泡。在本综述中，哺乳动物细胞衍生的细胞外囊泡指体外从哺乳动物细胞培养上清液中分离纯化得到的细胞外囊泡。哺乳动物细胞衍生的细胞外囊泡是使用最广泛且研究最深入的细胞外囊泡类型。包括人类和各种哺乳动物动物模型在内的多种哺乳动物细胞通常用于生产用于研究的细胞外囊泡。在此，为关注最终的临床应用，我们提供来自人类细胞的细胞外囊泡的研究综述。 间充质干细胞衍生的细胞外囊泡：间充质干细胞是具有多向分化潜能和出色免疫调节能力的间充质细胞，为组织修复和再生创造适宜的微环境。间充质干细胞广泛用于细胞治疗，可从包括人类脂肪、骨髓、脐带、胎盘、牙髓和其他组织在内的多种来源分离培养。研究人员逐渐认为，间充质干细胞在治疗各种疾病中的作用可能主要通过旁分泌信号由细胞外囊泡介导。最近的研究表明，间充质干细胞衍生的细胞外囊泡与其亲本细胞具有相同的治疗效果，包括抗炎、免疫调节和组织修复作用，表现为多种功能，包括抑制促炎巨噬细胞的极化和促进抗炎巨噬细胞的极化、调节辅助性T细胞的增殖和分化、促进靶细胞的增殖、介导抗凋亡作用以及促进上皮-间质转化和血管生成。因此，人间充质干细胞衍生的细胞外囊泡已直接应用于各种组织和器官损伤以及炎症和衰老相关疾病的基础研究和临床治疗。间充质干细胞衍生的细胞外囊泡是最重要的天然细胞外囊泡药物类型之一，具有相对较高的生产能力、多样的功能和广泛的临床应用。基于间充质干细胞衍生的细胞外囊泡的细胞外囊泡药物最接近实现临床转化和工业化生产。 神经干细胞衍生的细胞外囊泡：神经干细胞在神经系统中分化为不同类型的神经细胞，在神经系统发育和神经损伤修复中发挥着至关重要的作用。神经干细胞衍生的细胞外囊泡富含多种特定的微小RNA，它们参与多种神经生理和病理过程，包括神经发生、神经再生、神经炎症、神经保护以及血脑屏障维持。基于NSC-EV的疗法主要用于治疗神经损伤和退行性疾病，包括中风、脊髓损伤、阿尔茨海默病和帕金森病。具体的治疗机制可能涉及调节组织微环境中各种类型细胞的激活和凋亡，这些细胞包括内源性神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞。由于NSC-EVs来源于神经细胞，在治疗神经疾病方面，它们可能比间充质干细胞衍生的细胞外囊泡具有治疗优势，尽管目前尚无直接证据表明NSC-EVs比从其他组织获得的MSC-EVs更有效。在临床应用方面，人类神经干细胞可能存在局限性。目前人类神经干细胞主要来源于流产胎儿的神经组织或诱导多能干细胞分化而来，这两种来源在工业生产中都面临巨大挑战。 内皮祖细胞衍生的细胞外囊泡：内皮祖细胞是一种主要起源于骨髓的干细胞。EPCs从骨髓通过循环血液迁移到由创伤、缺血或缺氧引起的损伤部位，在那里参与组织修复和再生。内皮祖细胞衍生的细胞外囊泡继承了EPCs的生物学功能，包括抑制炎症、促进细胞增殖和血管生成以及抑制细胞凋亡。EPC-EVs已在动物模型中用作缺血性中风、心肌梗死、糖尿病和急性肾损伤的治疗药物，以及神经和骨修复的药物递送工具。EPC-EVs在促进血管生成方面可能比MSC-EVs具有优势，因为EPC-EVs表达某些EPC特异性标志物（如CD31、CD34和VEGFR2），并且富含EPCs中发现的与血管生成相关的mRNA和微小RNA。然而，由于其来源和生产能力，EPC-EVs的临床转化可能受到限制。人类EPCs主要直接从人外周血和脐血中分离培养，需要开发EPC-EVs的大规模培养技术以支持其临床应用。 免疫细胞衍生的细胞外囊泡：免疫细胞种类多样且具有多种功能。体内免疫细胞衍生的细胞外囊泡通常兼具免疫激活和免疫抑制作用，其具体功能取决于它们所源自的细胞类型以及靶细胞的生理状态。例如，细胞外囊泡可以诱导树突状细胞的免疫抑制以抑制细胞凋亡，并诱导DCs针对病毒的免疫激活。基于它们在体内的生物学作用，众多研究使用了源自各种免疫细胞的细胞外囊泡进行肿瘤治疗，包括DCs、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。免疫细胞衍生的细胞外囊泡可以作用于它们所源自的同类型细胞以及其他类型的免疫细胞和肿瘤细胞，从而激活抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。一般来说，免疫细胞衍生的细胞外囊泡通过抗原呈递细胞促进肿瘤抗原呈递，增强辅助性T细胞的反应，并促进T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。免疫细胞衍生的细胞外囊泡在肿瘤治疗中有应用潜力，但在其临床转化中存在许多限制因素。例如，免疫细胞主要从健康供体获取。因此，只能收集少量细胞，后续大规模培养困难。此外，免疫细胞衍生的细胞外囊泡表面富含多种与免疫功能相关的分子；因此，在临床应用中应特别关注这些细胞外囊泡以确保免疫安全性。 源自牛奶的细胞外囊泡。源自牛奶的细胞外囊泡是所有体液来源中研究最广泛且临床应用最广泛的细胞外囊泡。根据目前已发表的研究，MI-EVs的来源是各种哺乳动物的生乳或乳制品，包括人类、牛、猪、羊和马，其中牛乳占绝大多数。MI-EVs由乳腺中的各种类型细胞分泌，包括脂肪细胞、上皮细胞、干细胞和免疫细胞。与体外培养的单一类型细胞衍生的细胞外囊泡相比，MI-EVs在蛋白质、核酸和生物活性分子方面可能更为丰富。因此，近年来MI-EVs作为疾病治疗的潜在治疗产品受到了广泛研究。 源自牛奶的细胞外囊泡具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗纤维化和组织再生作用。牛奶来源的细胞外囊泡已被证明可降低肿瘤细胞增殖并增加对化疗药物的反应性。牛奶来源的细胞外囊泡的抗炎和抗氧化作用体现在它们对肠道炎症性疾病的保护作用上，如坏死性小肠结肠炎和炎症性肠病。通过抑制肝星状细胞的增殖并通过促进血管生成减轻心脏纤维化，牛奶来源的细胞外囊泡在肝损伤恢复过程中抑制纤维化。在皮肤、毛发和骨损伤相关疾病中，细胞外囊泡主要通过增加靶细胞增殖促进组织再生和修复。工程化的MI-EVs已被研究用于治疗多种癌症，包括肺癌、肠癌、乳腺癌、口腔癌和卵巢癌。 与源自哺乳动物细胞培养的细胞外囊泡相比，MI-EVs有几个独特的优势，但也有应用局限性。MI-EVs的来源非常丰富，不需要大规模细胞培养。MI-EVs起源于多种细胞类型，富含生物活性蛋白质和核酸。此外，MI-EVs具有高稳定性，能够在低pH值和高温下耐受蛋白酶，这表明MI-EVs可以作为口服药物递送。然而，MI-EV应用的临床转化受到从动物乳中收集细胞外囊泡所需大规模工艺的限制，并且因为在药物生产过程中必须严格控制动物成分的使用。此外，基于动物乳细胞外囊泡的内源性负载实现基因工程很困难。 植物来源的细胞外囊泡。植物来源的细胞外囊泡通常从可食用植物的组织裂解物中提取，如水果和蔬菜。P-EVs在植物的生理和病理过程中发挥作用，如促进细胞增殖和分化、重塑细胞壁和抵抗病原体。P-EVs含有生物活性脂质、蛋白质、核酸和其他生物大分子以及多种具有药理活性的天然植物化学物质，如类胡萝卜素和姜黄素。由于其天然生物学特性，P-EVs已被广泛用于药物研究。 作为生物活性药物，P-EVs对多种人类疾病具有治疗作用。临床前研究表明，P-EVs具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和组织再生活性。P-EVs被证明可直接抑制肿瘤细胞周期进程和肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡；这是通过诱导活性氧产生和促炎因子释放以及激活凋亡诱导配体途径来实现的。P-EVs还可以与化疗药物联合使用以降低肿瘤细胞耐药性。由于其抗炎、抗氧化和促进组织修复的作用，P-EVs已在肝损伤、皮肤损伤、胃肠道炎症等疾病中显示出良好的治疗效果。P-EVs也已被用作疾病治疗的药物递送载体。例如，负载miR-184和阿霉素的卷心菜来源的细胞外囊泡用于肿瘤治疗，负载姜辣素的生姜来源的细胞外囊泡用于治疗溃疡性结肠炎，橙子来源的细胞外囊泡用于SARS-CoV-2 mRNA疫苗研究。 与源自培养哺乳动物细胞的细胞外囊泡相比，植物细胞外囊泡既有优点也有缺点。其优点包括来源更丰富、无需上游细胞生产、上游生产过程不那么复杂、成本更低、无细胞毒性以及免疫原性更低。P-EVs富含多种天然植物代谢产物，并且可以更有效地进行改造以维持外部分子的稳定性，在体内具有更高效的释放和更好的药物生物利用度。然而，P-EVs也有缺点，包括以下几点：必须验证其在体内对组织细胞的靶向特异性；下游分离过程复杂且成本高昂；并且类似于动物乳细胞外囊泡，在内源负载的基础上难以实现基因工程。总体而言，尽管目前对P-EVs的研究远不如对哺乳动物细胞外囊泡的研究先进，但P-EVs正受到越来越多的关注。 2.2 工程化细胞外囊泡 尽管天然细胞外囊泡有作为新药的潜力，但它们也有局限性，例如特定分子的负载不佳和靶向不足。工程化细胞外囊泡是指通过对来源细胞或天然细胞外囊泡进行工程改造而获得的细胞外囊泡。工程化细胞外囊泡旨在通过基因、物理或化学手段提高天然细胞外囊泡负载所需治疗药物的能力并改善其靶向特性。工程化细胞外囊泡直接作为治疗药物或作为药物递送载体。一些优秀的综述介绍了工程化细胞外囊泡药物的最新进展。我们简要总结工程化细胞外囊泡的研发情况，其主要集中在负载货物和负载策略方面（表3）。 工程化细胞外囊泡负载 天然细胞外囊泡可以进行改造以实现或增强其在治疗特定疾病方面的功效。细胞外囊泡的工程改造主要取决于它们所携带的负载类型。基于其生物学特性，工程化细胞外囊泡可以负载小分子药物、蛋白质、核酸和脂质等成分。 细胞外囊泡可以负载特定疾病靶向药物：负载小分子药物的细胞外囊泡主要用于肿瘤治疗。研究表明，姜黄素、紫杉醇和阿霉素等小分子药物封装在细胞外囊泡中时对肿瘤的抑制作用比游离药物更强。许多研究集中在负载核酸分子的细胞外囊泡上。基于RNA的基因治疗已广泛应用于感染性、免疫性、遗传性和炎症相关疾病以及癌症。负载在细胞外囊泡中的RNA分子可分为两类。第一类包括调节基因表达的小RNA分子，如小干扰RNA、反义寡核苷酸以及可招募内源性RNA编辑酶的寡核苷酸。这些微小RNA相对容易负载到细胞外囊泡中，并且可以在特定残基处进行化学修饰合成以改变其稳定性、药代动力学和引发免疫系统反应的潜力。第二类由分子量相对较大的治疗性mRNA组成，其可以翻译成具有治疗活性的蛋白质或翻译成诱导对抗或预防疾病的免疫反应的抗原。与基于脂质体的纳米颗粒相比，工程化细胞外囊泡可以将mRNA递送至特定部位，避免被免疫系统识别和早期降解，克服生物屏障，并在特定外部刺激下控制药物释放。 徐等人发现特定的外部刺激。蛋白质也可以被装载到细胞外囊泡中。通过对CD24的一系列研究获得了代表性结果，CD24与损伤相关分子模式结合，以抑制由NF-κB途径激活介导的炎症反应。装载有CD24的细胞外囊泡在包括败血症、过敏性哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化在内的各种肺部疾病的小鼠模型中已显示出安全性和有效性，并且一系列临床研究已证实其在治疗与COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征中的安全性和有效性。 天然细胞外囊泡可进行修饰以增强组织和细胞靶向性，并装载特定药物以增强其治疗效果：天然EVs富含各种生物活性分子，这些分子在被组织和细胞吸收后可调节细胞行为。尽管它们具有治疗各种疾病的潜力，但其靶向身体的能力不足；因此，其治疗效果有限。天然EVs的蛋白质和多肽修饰可大大提高其靶向性和治疗能力。通过将具有靶向功能的肽与EV膜表面蛋白融合，以及通过将特定疾病的药物分子装载到EVs中，可以构建具有增强功能和靶向能力的EVs。工程化的EVs已用于临床前研究以治疗各种疾病。例如，将半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸肽装载到EVs表面，构建出通过CREKA肽靶向纤维蛋白-纤连蛋白复合物的工程化EVs，这增加了EVs在大鼠股骨缺损部位的滞留，并增强了大鼠股骨缺损模型中的骨修复。慢性髓性白血病细胞中高表达的白细胞介素-3受体可作为药物靶点。将IL3与EV支架蛋白LAMP2B融合构建工程化的LAMP2B-IL3 EVs，并同时装载靶向CML细胞癌基因的小干扰RNA和化疗药物伊马替尼，以生成靶向CML细胞、抑制癌细胞生长并减小肿瘤大小的工程化EVs。狂犬病病毒糖蛋白肽选择性地与神经细胞上的乙酰胆碱受体结合。已将RVG肽与EV支架蛋白LAMP2B融合构建工程化的LAMP2B-RVG EVs，并与具有神经保护作用的miRNA-124一起装载到EVs中。工程化的EVs穿透血脑屏障和皮质缺血区域并促进神经发生。 工程化EV装载方法 药物可通过外源性或内源性方式装载到EVs中。外源性药物装载也称为后装载，即从细胞培养物或其他生物流体中分离和纯化EVs，然后通过物理或化学方法将功能分子装载到EVs的表面或内部。内源性药物装载也称为预装载，即对供体细胞进行生物工程改造以产生含有特定药物的EVs。 EVs的外源性药物装载：EVs的外源性药物装载涉及将药物直接引入EVs中。常见方法如下：（i）电穿孔，通过高压脉冲在EV膜上形成临时孔，使药物能够穿透，适用于装载小分子和RNA，但高压脉冲可能导致siRNA沉淀和EV聚集；（ii）孵育，在特定条件下将EVs与药物混合，使药物在浓度梯度驱动下进入EVs；（iii）超声处理，药物通过声波作用进入；这适用于装载小RNA分子，且不会导致RNA聚集或降解；（iv）冻融循环，通过反复冷冻和解冻破坏EV膜，使药物进入囊泡，但可能破坏膜结构；（v）挤压，使用特殊设备使EVs通过狭窄通道以增加膜通透性，使药物进入；以及（vi）化学转染，常用于通过化学或电方法装载核酸。外源性药物装载的最佳方法取决于EV来源、货物和预期应用，有关这些方法的更详细介绍可在一些近期综述中找到。 表3. 工程化细胞外囊泡总结：负载内容物和负载方法 工程化细胞外囊泡内容物 工程化细胞外囊泡负载方法 与内源性负载相比，外源性负载有其优缺点。外源性负载的主要优点是药物负载效率明显高于内源性负载。外源性负载的缺点主要包括细胞外囊泡物理化学因素的改变甚至破坏、药物处理后再纯化导致的EVs损失，以及外源性物质的存在导致的EV药物纯度降低。更重要的是，通过基因工程能够实现的对EVs的精确修饰无法通过外源性负载达成。 EVs的内源性药物负载：EVs的内源性药物负载主要基于基因工程技术，其中功能性核酸和蛋白质分子在源细胞中表达，并被装载到细胞产生的EVs中。因此，从细胞培养上清液中收获的EVs已经装载了表达的分子。基因可以通过非病毒瞬时转染或基于病毒的长期转导引入受体细胞。非病毒转染通常导致高瞬时表达，但细胞不能传代培养以持续获得载药EVs，而病毒转染导致低瞬时表达，但细胞可以持续产生载药EVs。这两种方法各有优缺点，因此有特定的应用场景。 外源性负载的EVs比内源性负载的EVs具有更高的药物负载效率，但后者可以进行更多详细和精确的修饰。一些研究充分利用基因工程的优势，生产出具有高药物负载效率的工程化EVs，作为靶向、多功能药物。以下，我们总结几种用于EVs的主要基因工程技术。 A. 特定蛋白质与EV成分蛋白的融合表达以促进蛋白质负载 为了解决所需蛋白质负载效率低的问题，可以构建一种包含目标蛋白质和EV成分蛋白或支架蛋白的融合蛋白，其中融合蛋白在成分蛋白的引导下进入EV，以提高药物负载效率和EV靶向性。除了富含在EVs中作为标志物的膜蛋白（如LAMP2B和CD63）外，其他EV支架蛋白也可用于融合蛋白中，如通过蛋白质组学分析新鉴定出的PTGFRN和BASP1。研究表明，特定蛋白质，如细胞因子、抗体片段、RNA结合蛋白、疫苗抗原和Cas9蛋白，可以通过与PTGFRN融合有效地装载到EVs表面，或通过与BASP1融合进入EVs内腔。 B. 引导肽的表达促进EVs的组织和细胞靶向 一旦与EV表面蛋白融合的引导肽表达，引导肽就可以将EVs递送到体内特定的组织和细胞。LAMP2B是一个经典的引导肽例子，LAMP2B-IL3 EV靶向慢性粒细胞白血病细胞，LAMP2B-RVG EV靶向神经细胞，LAMP2B-iRGDEVs靶向乳腺癌细胞，LAMP2B-tLyP-1EVs靶向非小细胞肺癌细胞，LAMP2B-CAPEVs靶向软骨细胞。这些基因修饰的EVs与特定药物分子结合，在疾病动物模型中显示出强大的治疗效果。 C. 通过EXO基序将功能性miRNA选择性装载到EVs中 来自不同细胞来源的细胞外囊泡含有不同的内源性微小RNA。天然EVs中存在的miRNAs会被主动包裹，其生物学过程受到精细调控。先前的研究表明，miRNAs通过细胞定位基序和细胞外囊泡定位基序定位于不同细胞类型的EVs中。最近的研究表明，细胞类型特异性的EXO和CELL基序，以及RNA结合蛋白Alyref和Fus，参与了miRNAs的选择性装载。这些基序充当miRNAs的分选密码，解析这些密码是实现对EV衍生的miRNAs进行微调调控的关键。例如，在肝细胞中，EV-miRNAs中丰富的常见miRNA分选序列（GGCU，一种EXO基序）与RNA结合蛋白SYNCRIP结合，并控制这些miRNAs分选到EVs中。将EXO基序嵌入miRNAs中可增强这些miRNAs装载到肝细胞衍生的EVs中的能力。对这种精细调控的装载模式的理解仍处于起步阶段，进一步的研究对于将miRNAs选择性装载到EVs中以用于未来应用至关重要。 D. 细胞外囊泡修饰的表观遗传方法 新出现的证据强调，表观遗传调控是一种有前景的替代基因工程的方法，可用于定制细胞外囊泡。通过改变供体细胞的表观遗传学，可以动态地重新编程细胞外囊泡的货物组成和功能，而没有基因组整合的风险。例如，通过增强组蛋白去乙酰化酶抑制，肿瘤抑制性miRNAs在细胞外囊泡中富集，从而提高细胞外囊泡的抗肿瘤功效。表观遗传修饰也可以是可逆的，并实现刺激响应控制，在缺氧或药物治疗等条件下对细胞外囊泡的释放进行时空控制。虽然表观遗传效应可能不如基因修饰持久，但表观遗传策略通过防止永久性基因组改变，可能是临床转化的更安全途径。 基于材料的细胞外囊泡工程 未经任何表面修饰的载药细胞外囊泡在体内的分布与天然细胞外囊泡相似。然而，对细胞外囊泡进行特定的表面修饰可以提高它们靶向特定组织和细胞的能力。除了基因工程，基于细胞外囊泡的物理和化学特性，已经开发了多种材料，这些材料促进细胞外囊泡的靶向性并增强其治疗效果。然而，尽管有靶向性，但由于免疫系统的防御机制以及肝脏和肾脏的过滤作用，细胞外囊泡在到达靶组织之前可能会被迅速清除。此外，细胞外囊泡的天然特性导致它们在体内迅速被吸收；因此，细胞外囊泡很难在局部组织中积累并持续存在。为了解决这些问题并增强细胞外囊泡的治疗效果，研究人员已经开发了基于材料的细胞外囊泡工程技术，这些技术增强组织和细胞靶向性、提供细胞外囊泡的持续和可控释放，并提高药物递送效率。 基于细胞外囊泡表面的材料工程：细胞外囊泡表面共价化学修饰：细胞外囊泡表面的跨膜蛋白和细胞外蛋白带有丰富的羧基、氨基和巯基基团。因此，可以通过缩合反应在细胞外囊泡表面添加叠氮基或烷基，以创建活性化学位点，这些位点可以在不同的缓冲液中通过点击化学进一步偶联各种靶向结构。这种方法非常适合将小分子、大分子和聚合物共价连接到细胞外囊泡表面。与传统化学反应相比，点击化学更高效，并且能够对结合位点进行更强的控制，这有助于将特定结构和治疗药物连接到细胞外囊泡上，并且已被证明可以增强对中枢神经系统损伤和急性肝衰竭的组织和细胞靶向性。 细胞外囊泡表面的非共价物理修饰：这些方法主要利用静电和疏水相互作用将货物装载到细胞外囊泡表面。静电修饰利用不同电荷之间的吸引原理。例如，阳离子脂质的融合，如通过葡聚糖大分子对其进行包封，可使细胞外囊泡表面带正电，并提高细胞外囊泡细胞间摄取和细胞内释放的效率。疏水相互作用可以有效地将亲脂性物质自发整合到细胞外囊泡膜中。例如，环状RGD与1,2-二油酰甘油-3-磷酸乙醇胺和聚乙二醇的共轭物末端相连，当与细胞外囊泡一起孵育时，会自动插入细胞外囊泡膜中。这些修饰后的细胞外囊泡对肿瘤细胞的结合特异性显著增加。 细胞外囊泡表面的磁性修饰：通过用磁性纳米颗粒修饰细胞外囊泡也可以实现组织靶向递送。研究表明，锚定有超顺磁性氧化铁纳米颗粒和肿瘤坏死因子的细胞外囊泡在外部磁场作用下均能实现肿瘤靶向并抑制肿瘤生长。一些研究人员将磁性纳米颗粒装载到含有阿霉素的细胞外囊泡表面，通过外部磁场将细胞外囊泡引导至肿瘤部位，然后用近红外辐射诱导局部热疗，触发细胞外囊泡释放其药物货物，为肿瘤的精准治疗提供了一种新方法。 基于支架的细胞外囊泡工程：将细胞外囊泡整合到支架系统中可实现靶向和位点特异性递送，延长细胞外囊泡的半衰期，并降低降解速率，从而提高细胞外囊泡的治疗持久性和生物活性。研究表明，支架介导的细胞外囊泡递送有效地促进了组织重塑、伤口愈合、骨再生、免疫调节和血管生成；因此，它是组织工程研究中越来越受欢迎的焦点。在支架系统中使用细胞外囊泡有几种方法，如下所述。 基于水凝胶的工程：水凝胶是亲水性三维网络凝胶，能够吸收其重量数倍的水而不破坏其结构。使用水凝胶的优点包括生物相容性、可降解性和膨胀性。水凝胶可在组织修复和再生过程中用作细胞支持材料，并作为药物递送的有效载体。研究表明，水凝胶-细胞外囊泡生物复合物可以保护细胞外囊泡在体内免受免疫清除并减缓其释放，增加组织对药物的暴露时间，并改善细胞外囊泡在各种类型组织损伤中的愈合效果。 基于纳米颗粒和微球的工程：基于微球的生物材料已被用作可注射微支架来递送EVs。开发了一种能够将具有缓释动力学的细胞外囊泡有效递送至不规则形状缺损骨的平台。该平台基于一种简单的吸附技术，其中将聚多巴胺涂覆在可注射的多孔聚乳酸-乙醇酸共聚物微球上以形成PMS-PDA微球，并且细胞外囊泡被有效地吸附到微球上。PMS-PDA微球在大鼠颅骨缺损中保持高活性并诱导血管化骨再生。 微针辅助递送：微针递送是一种先进的药物递送技术，它使用微针贴片作为载体将细胞外囊泡有效地递送至靶位点。与传统注射系统相比，微针贴片递送无痛，并允许将细胞外囊泡有效地局部递送至靶位点以实现所需的治疗效果。目前，基于微针的细胞外囊泡递送系统已被开发用于毛发再生、皮肤伤口愈合、脊髓损伤和浆细胞瘤。微针还可作为细胞外囊泡的长期储存方法。在一项研究中，透明质酸微针中的细胞外囊泡在4°C下储存了6个月。 2.3 细胞外囊泡药物的基础研究和临床研究概述 与传统药物相比，细胞外囊泡药物具有多种优势。EV具有多种功能，因为它们可以被设计成携带多种不同的治疗分子，以增强其治疗效果并提高整体治疗功效。EV可以通过跨越生物屏障来克服传统给药系统的局限性，从而到达传统药物难以到达的病变部位。EV通过靶细胞上的特定表面分子表现出增强的靶向性，从而将治疗分子准确地递送至靶组织，这有助于将治疗效果集中在靶位点，同时减少对正常组织的脱靶效应。EV药物相对于细胞治疗产品也具有优势。EV不能自我复制，这消除了异常细胞分化、免疫排斥或肿瘤形成的风险。此外，EV相对较小，结构简单，因此相对易于大规模生产和储存，这便于临床应用。因此，EV药物已在基础研究和临床阶段用于治疗多种疾病（图2）。以下总结了针对主要疾病的EV药物的基础和临床研究。 呼吸系统疾病 呼吸系统疾病每年在全球导致数百万人死亡。尽管我们对呼吸系统疾病发病机制的理解有所进展，现代医学和药物设计也有所进步，但现有的主要治疗方法仍然仅限于缓解症状或延缓疾病进展。大多数现有药物主要是限制疾病进展或预防并发症。最近的研究表明，基于EV的疗法，特别是间充质干细胞衍生的EV，有望为治疗呼吸系统疾病提供新策略。 骨髓、脂肪组织、人月经血和脐带是MSC的主要来源。MSC-EV对呼吸系统疾病的治疗作用包括减轻炎症、细胞死亡和氧化应激，并防止上皮-间质转化。MSC-EV主要通过递送靶向靶细胞中特定信号通路的调节性微小RNA来影响细胞行为和疾病进展。MSC-EV携带40多种不同的miRNA种类，在不同呼吸系统疾病的动物模型中产生了良好的治疗效果，这些疾病包括急性肺损伤、肺缺血/再灌注损伤、特发性肺纤维化、放射性肺损伤、脓毒症诱导的急性肺损伤、高氧诱导的肺损伤以及其他疾病，如矽肺纤维化、哮喘和冠状病毒病。例如，MSC衍生的EV通过miR-125b-5p下调信号转导和转录激活因子3，从而抑制巨噬细胞焦亡并减轻脓毒症相关的ALI。EV将miR-let-7转移到MLE-12细胞中，以抑制Sp3的表达，减弱Sp3对组蛋白去乙酰化酶2的募集，解除HDAC2对核因子E2相关因子2的去乙酰化限制，并增强Nrf2途径的激活，这减少了细胞中的铁死亡信号，并延缓了IPF模型中肺上皮细胞氧化损伤和凋亡的病理过程。已证明MSC-EV通过多种其他miRNA调节经典信号通路，如磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B、核因子κB、Nrf2、磷酸酶和张力蛋白同源物、Wnt、丝裂原活化蛋白激酶、Toll样受体和腺苷酸活化蛋白激酶途径，以减少氧化应激、调节免疫反应、降低炎症细胞因子的表达并促进组织修复。 神经系统疾病 神经系统的创伤性和退行性疾病，如中风、脊髓损伤、阿尔茨海默病和帕金森病，继续给现代医学带来巨大挑战。这些疾病的主要致病机制是由损伤或有毒分子诱导的功能性神经元死亡，并伴有神经系统炎症，这逐渐导致患者出现运动或认知功能障碍。目前，有效的临床治疗方法非常有限。越来越多的研究使用EV药物来治疗神经系统疾病，并且已经证明了它们在神经保护和修复方面的有效性。EV药物的神经保护和修复作用体现在三个层面：在组织层面，EV促进神经再生并减少神经相关的肌肉萎缩；在细胞层面，EV促进神经元存活并减少炎症性星形胶质细胞和小胶质细胞的激活；在分子层面，EV减少促炎因子，增加神经营养因子，并减少神经元中毒性蛋白质颗粒的沉积。 图2 来自各种系统的细胞外囊泡在疾病治疗中的应用。该图总结了基于细胞外囊泡疗法的多种临床应用，按给药途径、靶疾病和作用机制进行了分类。虚线表示给药途径和靶疾病的作用机制。本图中的代表性示意图由BioRender.com创建 早期关于基础中风的研究表明，血小板衍生的细胞外囊泡以剂量依赖的方式增加缺血性脑中神经干细胞的增殖、神经发生和血管生成，并且单核细胞衍生的细胞外囊泡具有神经保护作用。最近的研究使用天然或工程化的间充质干细胞衍生的细胞外囊泡来治疗中风。例如，来自骨髓和脂肪间充质干细胞的天然细胞外囊泡可减轻炎症和神经元死亡，并促进神经再生、血管生成和突触重塑，从而改善中风模型动物的神经功能。过表达包括miR-133b、miR-17-92和miR-181b-5p在内的微小RNA的工程化间充质干细胞衍生的细胞外囊泡显著增强了中风后的脑可塑性并促进了神经功能恢复。RVG肽-LAMP2B-微小RNA-124工程化间充质干细胞衍生的细胞外囊泡有效地将细胞外囊泡递送至缺血性脑区域，通过将微小RNA-124递送至细胞以促进神经祖细胞分化来特异性减少脑损伤。 淀粉样蛋白β沉积是阿尔茨海默病的主要致病因素。来自神经元细胞的天然细胞外囊泡加速了阿尔茨海默病小鼠模型中Aβ的清除，这降低了突触神经毒性和炎症因子水平，并改善了小鼠的学习和记忆能力。过表达Fe65并负载有育亨宾碱B的工程化神经元细胞靶向表达Aβ的神经元以诱导自噬，从而减轻阿尔茨海默病的病理进展。同样，天然和工程化的间充质干细胞衍生的细胞外囊泡降低了Aβ水平和促炎因子，并促进神经发生，这改善了阿尔茨海默病患者的认知功能。使用类似的治疗机制，细胞外囊泡也正在被广泛研究用于其他神经系统疾病，如肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病、多发性硬化症和脊髓损伤。 严重急性炎症性疾病。严重急性炎症相关疾病，如急性肝衰竭、严重急性胰腺炎和脓毒症，其特征为急性炎症、累积性多器官损伤和高死亡率。减轻炎症和组织损伤并促进组织修复是成功治疗这些疾病的关键。基于其天然的抗炎和组织修复作用，越来越多的临床前研究探索了间充质干细胞衍生的细胞外囊泡在这些疾病中的治疗潜力。 来自各种组织的间充质干细胞衍生的细胞外囊泡已被证明可通过特定分子的作用有效治疗急性肝衰竭。例如，脂肪间充质干细胞衍生的细胞外囊泡通过长链非编码RNA H19作用于肝细胞，这降低了肝损伤和炎症水平，并提高了急性肝衰竭模型大鼠的存活率。脂肪间充质干细胞衍生的细胞外囊泡还被证明通过miR-17对炎性巨噬细胞的作用抑制TXNIP/NLRP3介导的炎性小体激活，这减轻了急性肝衰竭模型小鼠的症状。骨髓和脐带间充质干细胞衍生的细胞外囊泡均通过发挥抗凋亡作用保护急性肝衰竭肝细胞。设计用于特异性靶向肝脏的工程化胎盘间充质干细胞衍生的细胞外囊泡在急性肝衰竭模型中表现出高效性。 先前的研究表明，使用来自SAP患者的间充质干细胞外泌体通过代谢物保护胰腺腺泡细胞。例如，缺氧诱导的脐带间充质干细胞外泌体传递功能活跃的线粒体，而肿瘤坏死因子-α诱导的脐带间充质干细胞外泌体传递功能性代谢物，如二羟基苯乙二醇。这些活性代谢物抑制胰腺腺泡细胞损伤并减轻组织炎症，从而缓解SAP进展。间充质干细胞外泌体还通过不同机制减轻SAP诱导的心肌损伤：骨髓间充质干细胞外泌体下调高迁移率族蛋白B1/Toll样受体4/蛋白激酶B信号轴，而人诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞外泌体激活心肌中的Akt/核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1信号轴。 多项临床前研究已证明来自不同组织的间充质干细胞外泌体对治疗败血症的疗效，包括脂肪、骨髓和脐带胎盘。间充质干细胞外泌体治疗败血症的疗效体现在三个指标上：提高生存率；减少组织损伤，如在肺、肝、肾和心脏；以及降低促炎因子水平，如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6。基于对间充质干细胞外泌体功能的广泛了解，研究也集中在探索其治疗败血症的疗效，而未详细阐述具体的分子机制。很少有研究评估微小RNA，如miR-223和miR-146，在间充质干细胞外泌体介导的败血症免疫抑制中的应用。 肿瘤 外泌体在肿瘤中发挥双重治疗作用。作为具有天然肿瘤靶向能力的内在治疗剂，免疫细胞衍生的外泌体——如来自树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和T/B细胞的外泌体——已被广泛探索用于肿瘤治疗，因为它们可以靶向其亲本细胞和其他免疫/肿瘤细胞，触发抗肿瘤反应并抑制肿瘤生长。作为具有工程化肿瘤靶向能力的药物载体，外泌体可以将各种抗肿瘤药物，包括小干扰RNA、微小RNA、CRISPR-Cas9系统、化疗药物、前体药物和单克隆抗体，单独或联合递送至肿瘤细胞，直接诱导细胞凋亡或抑制增殖。 在基础研究中，如前所述，包裹小分子药物的外泌体比相应的游离药物显示出更强的肿瘤抑制作用。此外，具有膜表面修饰的工程化外泌体可以在体内诱导免疫细胞靶向肿瘤细胞进行细胞杀伤。通过工程化外泌体进行抗肿瘤药物递送可提高药物靶向性，减少副作用，并能够递送药物组合，从而提高治疗效果。LAMP2B-IL3工程化外泌体同时装载了针对癌基因的小干扰RNA和化疗药物伊马替尼，从而通过IL3受体靶向慢性粒细胞白血病细胞并抑制其增殖。装载CRISPR-Cas9复合物的工程化外泌体实现了对肝癌细胞的精确基因编辑并有效抑制肿瘤生长。外泌体，如能有效将程序性死亡受体1配体阻断抗体递送至肝癌细胞的工程化外泌体，可显著增强T细胞对肝癌细胞的识别和杀伤，从而提高肿瘤免疫原性，也已用于肿瘤免疫治疗。 邀您加入“艺药荟社群”交流学习! 备注：姓名+单位+方向 版权说明：本文欢迎个人转发至朋友圈，谢绝媒体或机构未经授权以任何形式转载至其他平台。转载授权或其他合作需求，请联系梓树ZiShu（微信：Z07302256）。 免责声明：本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表“艺药荟”立场，亦不代表“艺药荟”支持或反对文中观点。本文不作为治疗方案推荐。如需治疗指导，请前往正规医院就诊。