Dacinostat

当 PROTAC 和分子胶凭借 “不可成药靶点” 的突破能力成为新药研发的顶流，一个核心难题始终横亘在科学家面前：我们如何精准捕捉 E3 连接酶与底物之间转瞬即逝的相互作用？如何看清药物诱导的泛素化全景，避免隐藏的脱靶风险？而临近依赖性生物素标记技术（Proximity-dependent Biotinylation）的出现，为我们打开了一扇观察细胞内动态蛋白相互作用的新窗口。它就像给 E3 连接酶装上了一个 “生物素喷漆枪”，能给周围 10-20 纳米范围内的所有蛋白打上独特的生物素标签，让那些原本看不见的瞬时相互作用无所遁形。近年来，为解决这些问题提供了强大工具。 一、降解药物研发的 “透视眼”：直击 PROTAC 与分子胶的作用本质 PROTAC 和分子胶的核心机制是诱导 E3 连接酶与靶蛋白形成三元复合物，进而介导靶蛋白的泛素化和降解。这个过程具有瞬时性、动态性和低丰度的特点，传统方法很难完整捕捉。临近标记技术通过在E3连接酶上融合生物素连接酶（如BirA、AirID、TurboID），当靶蛋白靠近E3连接酶时，会被生物素标记，从而实现对相互作用的捕获和鉴定。1. 新底物发现：挖掘分子胶的 “隐藏靶标” 分子胶的作用机制往往不依赖已知的蛋白 - 蛋白相互作用，其底物谱的发现一直是行业痛点。2022 年，日本科学家开发的AirID-CRBN 系统在多发性骨髓瘤细胞中进行筛选，不仅鉴定出了已知的 IKZF1/3 底物，还意外发现了一个全新的分子胶底物ZMYM2。 研究人员进一步证实，泊马度胺能诱导 ZMYM2 的泛素化和降解，并且这一机制在携带 ZMYM2-FGFR1 融合蛋白的急性髓系白血病中具有重要的治疗意义。这一发现充分展示了临近标记技术在无偏倚底物发现方面的强大能力。2. 泛素化位点精准定位：指导降解剂的理性设计 知道靶蛋白被泛素化还不够，具体哪个赖氨酸位点被修饰直接决定了降解的效率和特异性。2026 年最新发表的PrIUS 技术（Proximity-based Identification of Ubiquitin Sites）将临近标记与泛素残基（diGly）富集相结合，实现了在氨基酸水平上精准定位药物诱导的泛素化位点。 例如，在研究 NSD2 降解剂 UNC8732 时，PrIUS 技术精确鉴定出 PWWP1 结构域上的两个关键赖氨酸簇（K309/312/317 和 K341/343）是主要的泛素化位点。将这些位点突变为精氨酸后，UNC8732 对 NSD2 的降解效率下降了 70% 以上。这一信息为后续优化降解剂的结合模式和活性提供了直接的结构生物学依据。3. 区分 “泛素化” 与 “降解”：发现非降解型脱靶 一个被广泛忽视的事实是：泛素化不等于降解。许多 PROTAC 和分子胶会诱导靶蛋白的泛素化，但由于泛素链类型或其他因素，并不会导致蛋白降解。这种 “无效泛素化” 不仅会浪费细胞内的泛素资源，还可能带来未知的副作用。 2024 年哈佛大学开发的E-STUB 技术（E3 Substrate Tagging by Ubiquitin Biotinylation）成功解决了这个问题。研究人员在测试多激酶降解剂时发现，虽然大部分被泛素化的激酶都发生了降解，但仍有部分蛋白（如 VCL）被显著泛素化，但其蛋白水平却没有变化。这一发现提醒我们，仅通过总蛋白组学评估降解剂的脱靶效应是远远不够的。 二、 如何选择你的“标记利器”？ 目前应用最广泛的临近标记酶主要分为两大类：生物素连接酶类（BioID、TurboID、AirID）和过氧化物酶类（APEX2）。在此基础上，科学家们又开发出了专门针对泛素化研究的衍生技术。下面这张表帮你一次性理清它们的优缺点和适用场景： 场景化推荐指南 高通量化合物筛选：首选AirID。它对细胞生长几乎没有影响，标记结果稳定，假阳性率低，非常适合在稳定细胞系中进行大规模的化合物筛选和靶点验证。 快速动态过程研究：首选TurboID。它能在 10 分钟内完成标记，可以捕捉药物处理后短时间内发生的蛋白相互作用变化。 泛素化位点精细作图：首选PrIUS。它是目前唯一能在同一个实验中同时获得 E3 相互作用组和底物泛素化位点信息的技术。 生理 E3 连接酶底物谱绘制：首选BioE3或Ub-POD。它们通过使用低亲和力的生物素接受肽（BAP），极大地降低了背景信号，能特异性地富集 E3 直接催化的泛素化底物。三、超越泛素化：临近标记解锁蛋白修饰研究的全维度 临近标记技术的威力远不止于泛素化研究。它的核心思想 ——利用酶的邻近效应特异性标记底物，已经被成功推广到了几乎所有类型的蛋白翻译后修饰研究中，成为了破解 “修饰组学暗物质” 的利器。1. 泛素化底物识别：解决 E3 连接酶的 “孤儿” 问题 人类基因组编码超过 600 种 E3 泛素连接酶，但超过 70% 的 E3 连一个底物都没有被鉴定出来，被称为 “孤儿 E3”。临近标记技术的出现彻底改变了这一局面。 Ub-POD 技术：2024 年发表在《Science Advances》上的 Ub-POD 技术，成功鉴定出了 RAD18、TRAF6 和 CHIP 这三种重要 E3 连接酶的上百个新底物，揭示了它们在 DNA 损伤修复、免疫信号传导和蛋白质量控制中的新功能。 BioE3 技术：2023 年《Nature Communications》的研究表明，BioE3 不仅适用于可溶性的 RING 型 E3，还能有效鉴定线粒体膜蛋白 MARCH5 和功能未知的 RNF214 的底物，为研究细胞器特异性 E3 和孤儿 E3 提供了强大工具。 2. 降解药物脱靶鉴定：构建更安全的药物 脱靶效应是导致药物临床试验失败的首要原因。对于降解药物来说，脱靶不仅包括对非目标蛋白的降解，还包括对非目标蛋白的非降解型泛素化。 多 HDAC 降解剂的附带泛素化：E-STUB 技术研究发现，基于 dacinostat 的 HDAC 降解剂不仅泛素化 HDAC 家族蛋白，还广泛泛素化了 SMRT/NcoR、MIER、CoREST 等辅抑制复合物的成员。这种 “附带泛素化” 可能是导致 HDAC 降解剂毒性的重要原因。 PROTAC 的三元复合物脱靶：AirID 技术可以直接检测 PROTAC 诱导的 E3 连接酶与细胞内所有蛋白的相互作用变化，从而全面评估 PROTAC 的脱靶谱。相比传统的总蛋白组学，它能更早地发现潜在的安全隐患。3. 其他蛋白修饰：磷酸化、乙酰化等不再是难题 临近标记技术的模块化设计使其可以轻松移植到其他修饰酶的研究中： 磷酸化：将激酶与临近标记酶融合，可以特异性地标记激酶的底物。2022 年的研究表明，这种方法能有效鉴定出 MAPK、AKT 等关键激酶的新底物，其灵敏度远超传统的磷酸化蛋白质组学。 乙酰化：将去乙酰化酶（如 HDAC8）与 miniTurbo 融合，结合乙酰化肽段富集，可以系统地鉴定去乙酰化酶的底物。2024 年的一项研究利用这一策略，发现了 HDAC8 在调节细胞运动中的新机制。 SUMO 化、NEDD 化：类似于泛素化的研究策略，通过共表达标记的 SUMO 或 NEDD8，结合 BirA-E3 融合，可以特异性地鉴定这些类泛素修饰的底物。结语：临近标记技术引领下一代药物研发 从最初的 BioID 到如今百花齐放的各种衍生技术，临近标记技术在短短十几年间已经从一个基础研究工具，演变成了新药研发不可或缺的核心平台。它让我们第一次能够在活细胞内，以接近生理的状态，实时观察酶与底物之间的动态相互作用。 对于降解药物研发来说，临近标记技术正在重塑整个研发流程：从早期的靶点发现和 E3 选择，到中期的化合物优化和机制研究，再到后期的脱靶评估和安全性评价，它都在提供前所未有的深度和广度的信息。 未来，随着临近标记技术与单细胞测序、冷冻电镜、人工智能的深度融合，我们正迈向一个新时代：在分子层面精确绘制药物-靶标-效应器的三维作用网络。这不仅将加速PROTAC和分子胶药物的研发，还将推动靶向蛋白降解技术向神经系统疾病、自身免疫病等更广阔领域拓展。 参考文献 Yamanaka, S., Horiuchi, Y., Matsuoka, S., Kido, K., Nishino, K., Maeno, M., Shibata, N., Kosako, H., & Sawasaki, T. (2022). A proximity biotinylation-based approach to identify protein-E3 ligase interactions induced by PROTACs and molecular glues. Nature Communications, 13(1), 183. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27818-z Mukhopadhyay, U., Levantovsky, S., Carusone, T. M., Gharbi, S., Stein, F., Behrends, C., & Bhogaraju, S. (2024). A ubiquitin-specific, proximity-based labeling approach for the identification of ubiquitin ligase substrates. Science Advances, 10(32), eadp3000. https://doi.org/10.1126/sciadv.adp3000 Barroso-Gomila, O., Merino-Cacho, L., Muratore, V., Perez, C., Taibi, V., Maspero, E., Azkargorta, M., Iloro, I., Trulsson, F., Vertegaal, A. C. O., Mayor, U., Elortza, F., Polo, S., Barrio, R., & Sutherland, J. D. (2023). BioE3 identifies specific substrates of ubiquitin E3 ligases. Nature Communications, 14(1), 7656. https://doi.org/10.1038/s41467-023-43326-8 Tessier, T. M., Maitland, M. E. R., Kutera, M., Dybas, J. M., St-Germain, J., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D., Zhang, W., Raught, B., & Weitzman, M. D. (2026). Identification of E3 ligase substrates and PROTAC-induced ubiquitylation sites using proximity-based identification of ubiquitin sites (PrIUS). Communications Biology. Online publication. https://doi.org/10.1038/s42003-026-09964-6 Huang, H.-T., Lumpkin, R. J., Tsai, R. W., Su, S., Zhao, X., Xiong, Y., Chen, J., Magged, N., Donovan, K. A., Fischer, E. S., & Sellers, W. R. (2024). Ubiquitin-specific proximity labeling for the identification of E3 ligase substrates. Nature Chemical Biology. https://doi.org/10.1038/s41589-024-01590-9 一种细胞指示剂系统及其制备方法与应用：中国专利.