Retosiban

摘要：利用药物拼合原理合成了 30 个含不同取代基的四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类衍生物。通过 MTT 法测试了目标化 合物对三种肿瘤细胞株(LLC、A-549、NCI-H1666)增殖的抑制活性。结果显示：大多数化合物对这三种肿瘤细胞株 表现出了中等至良好的抑制活性，且多数化合物的 IC50 值低于 20 μM。其中，所得的目标化合物对 A549 细胞系表 现出良好的抑制活性，特别是化合物 6o 和 6y 对 A549 细胞表现出优异的抑制活性，且 IC50 值均低于 10 μM。整体 来说，化合物 6o、6p、6y 和化合物 6z 对 LLC、A549 和 NCI-H1666 细胞系表现出良好的抑制活性，且 IC50 值均低 于 20 μM，具有潜在的抗肿瘤研究价值。分子对接结果表明，化合物 6o 和化合物 6p 与 VEGFR-2(PDB:4AGD)的多 个氨基酸残基之间存在良好的相互作用。同时，分子动力学模拟结果表明，化合物 6p 与 4AGD 之间能保持二者的 结合稳定性和构象一致性。     在过去的几十年里，因癌症死亡的人数呈上升趋势。从 1990 年到 2025 年，所有癌症的总发病率增加了 128.9%，总死亡率增加了 74.8%。目前癌症的治疗方法多样，比如，手术仍是早期癌症的重要治疗手段、精准治 疗法即靶向治疗可精准锁定癌细胞弱点等等。尽管，抗癌药物的开发和研究取得了诸多的进展，但目前的抗癌药 物会引起一些不必要的副作用，且许多患者对其已产生耐药性，因此仍需要开发更有效和更安全的抗癌药物。     天然产物因其结构多样性、低毒副作用及多靶点作用的优势，已成为抗癌药物研发的重要源泉，目前已有紫杉醇、喜树碱等多个源于天然产物的药物用于临床。四氢-β-咔啉是天然产物和药物中的重要结构单元，也 被用于药物开发。研究显示其具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗真菌、抗寄生虫、抗缺血、抗炎以及其它 活性。骆驼蓬生物碱含有各种咔啉类化合物，包括去氢骆驼蓬碱和大麻酚等等。    目前，现有的研究报道中四氢-β-咔啉生物碱可作用于 VEGFR-2、CDK4、HDAC6、ABCG2以及 KSP等靶点来表现其抗肿瘤作用。其中，VEGFR-2 是一种酪氨酸激酶受体，它可以促进肿瘤血管的生成，已成为抗血管生成治疗的主要靶点。目前靶向 VEGFR-2 信号通路的多种治疗药物已成功实现临床转化，例如阿帕替尼 (Apatinib)、安罗替尼(Anlotinib)、伏罗尼布(Vorolanib)和呋喹替尼(Fruquintinib)(图 1)。由于 VEGFR-2 在 肿瘤血管生成中的关键调控作用，该受体已成为抗肿瘤治疗的重要靶标蛋白分子。 图 1 靶向 VEGFR-2 的抗肿瘤药物 图 2 含二酮哌嗪支架的药物 二酮哌嗪类衍生物(DKP)是一类在药物化学中非常重要的化合物，它们广泛存在于许多药物分子中，并且 具有多样的生物活性和药理作用。许多含有 DKP 支架的天然产物具有抗病毒、抗真菌、抗菌和抗肿瘤等多种药 理活性。二酮哌嗪类衍生物由于其特殊的结构，可以被修改和优化，这种特殊结构使药物化学家可以设计和合成一 系列具有潜在抗癌活性的化合物。研究表明，许多二酮哌嗪类衍生物在临床研究中表现出良好的抗癌性，能够很 好地干扰癌细胞的生长和增殖。例如，普那布林(Plinabulin)是一种合成型微管蛋白抑制剂的药物，主要用于肿 瘤的治疗和 CIN(化疗相关中性微粒细胞减少症)的预防；雷托西班(Retosiban)是一种催产素受体拮抗剂，用于孕妇 推迟早产的宫缩抑制剂；Epelasiban(GSK557296)是一种具有选择性，可口服的催产素受体拮抗剂，用于治疗子宫 腺肌病；Brevianamide F 是一种具有良好抗菌活性的药物，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌及白色念珠菌等其他细菌有抑制作用（图2）。 图 3 本文目标化合物的设计思路 图式 1 化合物 5a～5e 的合成路线 目标化合物 5a～5e，6b～6z 的合成路线如 图式 1 所示 表 1 化合物 5a～5e 对 3 种癌细胞系的体外抗肿瘤活性 表 2 化合物 6b～6z 对 3 种癌细胞系的体外抗肿瘤活性 采用 MTT 法测试了 30 个目标化合物对 3 种癌细胞系的体外抗肿瘤活性，包括小鼠 Lewis 肺癌细胞（LLC）、 人肺腺癌细胞（A-549）、人肺支气管癌细胞（NCI-H1666），以顺铂组为阳性对照组。比较 N4-取代-四氢-β-咔啉并 二酮哌嗪化合物 5a～5e(表 1)和 N9-取代-N4-取代-四氢-β-咔啉并二酮哌嗪化合物 6b～6z(表 2)，其结果表明，在 N9 位引入对氟苄基和对三氟苄基以及在 N4 位引入对氟苄基有利于提高对多种癌细胞系的抑制作用。上表是 30 个目标 化合物对 3 种癌细胞系的抗肿瘤活性的结果。 图 4 舒尼替尼与 VEGFR-2 (PDB:4AGD)的分子对接研究 舒尼替尼分子对接研究结果分析如下：舒尼替尼通过与 VEGFR-2 疏水口袋(VAL80、LEU121、VAL131 等氨 基酸)形成广泛疏水相互作用，与 LYS100A、GLU117A 形成两条强氢键(H-A 距离分别为 3.19 Å、2.20 Å)，并以 LYS100A 的 π-阳离子作用，稳定结合于 ATP 活性口袋，其结合模式与共晶结构高度一致(图 4)。 图 5 化合物 6o 与 VEGFR-2 (PDB:4AGD)的分子对接研究 化合物 6o 与 VEGFR-2 具有良好的结合亲和力和特异性，可增强四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的抗肿瘤活性(图 5)。 图 6 化合物 6p 与 VEGFR-2 (PDB:4AGD)的分子对接研究 化 合物 6p 与 VEGFR-2 具有良好的结合亲和力和特异性，可增强四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的抗肿瘤活性(图 6)。 表 3 舒尼替尼、化合物 6o 化合物 6p 与 4AGD 分子对接模式异同表 基于以上三者的分子对接结果，舒尼替尼、化合物 6o 与化合物 6p 与 VEGFR-2 的结合模式异同分析如下：三 者在结合模式上具有高度一致性，均通过疏水包裹与极性相互作用的经典方式结合于 ATP 活性口袋，进一步证实了 三者对 VEGFR-2 具有潜在的靶向抑制活性。同时，三者也存在明显的差异化特征：舒尼替尼作为临床经典药物， 以氢键与 π-阳离子相互作用构成的多极性作用为核心；化合物 6o 以刚性稠环骨架形成了更充分的疏水包裹与稳定的氢键作用；化合物 6p 则通过三氟甲基修饰引入了独特的极性卤素相互作用，在保留疏水优势的同时新增了强特 异性作用力。结果表明，化合物 6o 与 6p 的结合模式既符合 VEGFR-2 抑制剂的经典作用机制，又具备骨架新颖、 相互作用优化的差异化优势，为后续四氢-β-咔啉类 VEGFR-2 抑制剂的结构修饰与进一步优化提供了重要的理论依据(表 3)。 图 7 化合物 6p 的分子动力学模拟图 为了进一步证实四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物与靶蛋白 4AGD 结合体系的稳定性，我们对该体系进行了分子 动力学模拟分析。选取体外抗肿瘤活性优异的化合物 6p 来评估配体与靶蛋白的稳定性及相互作用模式(图 7)。 图 8 化合物 6p 的二维和三维自由能地貌图 为多维度探究靶蛋白-复合物体系的动态构象稳定性及内在作用机制，继续通过构建二维(2D)和三维(3D)自由能 地貌图(Free Energy Landscape, FEL)，系统分析体系在构象空间中的能量分布特征(图 8)。     为了探寻具有高效低毒且良好活性的抗肿瘤药物，对 2,3-位四氢-β-咔啉并二酮哌嗪环的结构进行修饰，并在 N9 位进一步修饰共得到 30 个具有新结构四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类衍生物，采用 MTT 法测试了目标化合物对三种 肿瘤细胞株(LLC、A-549、NCI-H1666)增殖的抑制活性。活性数据分析表明该系列化合物对测试的三种肿瘤细胞株 具有中等至良好的抑制活性，大部分化合物的 IC50 值小于 20 μM，部分化合物优于阳性对照顺铂，其中化合物 6o、 化合物 6p、化合物 6y 和化合物 6z 对 A549 细胞系表现出较优异的抑制活性。结果表明：在二酮哌嗪的 N4 位引入对 氟苄基可以提高对多种肿瘤细胞的抑制作用，在四氢-β-咔啉的 N9 位引入对氟苄基和对三氟苄基可以提高对肿瘤细 胞的抑制作用。分子对接结果显示，化合物 6o 和化合物 6p 与靶蛋白 4AGD 具有较高的结合能力。为了进一步验证 化合物 6p 与靶蛋白 4AGD 的结合能力，同时又对化合物 6p 与靶蛋白 4AGD 的对接体系进行了分子动力学模拟，模 拟结果显示该对接体系能保持结合稳定性和构象一致性。根据以上结果可初步推测，化合物 6p 与具有潜在的抗肿 瘤价值，后续可在四氢-β-咔啉并二酮哌嗪类化合物的 N9 位引入其它适当的取代基进一步来提高其抗肿瘤活性。 图文摘要 请尊重原创，如需辅导或代做请联系上面老师。