MT-303

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已经改变了血液恶性肿瘤患者的治疗结局，但其应用受到劳动密集型的制备过程、有限的生产能力和参差不齐的临床疗效的限制。体内CAR-T细胞工程，即在患者体内直接生成CAR-T细胞，旨在通过消除对体外细胞处理和复杂物流的需求，并改善临床疗效，来克服这些挑战。病毒学、RNA药物和纳米技术领域的最新进展推动了对这种方法的彻底改革，该方法使用靶向递送系统（如慢病毒载体和脂质纳米颗粒）将编码CAR的遗传物质导入内源性T细胞。早期临床研究已显示出高效的转导、持续的CAR表达以及抗肿瘤活性的初步迹象，确立了概念验证。 《Nature Reviews Drug Discovery》（IF=101.8）近日发表综述，探讨了相关的基础技术并讨论了如何调整这些技术以开发更广泛适用、可扩展、安全有效的CAR-T细胞疗法。通过消除体外操作和化疗预处理的需要，该策略可以使CAR-T细胞疗法得到更广泛的应用，不仅用于血液肿瘤，也可用于自身免疫性疾病（例如系统性红斑狼疮）。 引言 在过去的三十年里，免疫疗法经历了重大变革，这得益于单克隆抗体、抗体-药物偶联物、细胞因子、免疫细胞衔接器 、DNA疫苗以及最近的基于RNA的疫苗和工程化T细胞疗法的进展。在这些治疗方式中，自体CAR-T细胞疗法因其效力而脱颖而出，在B细胞恶性肿瘤中显示出治愈潜力。尽管期望很高，但自体或异基因CAR-T细胞疗法向更广泛适应症和患者群体的扩展速度比预期要慢，存在多重障碍，包括制备和物流的复杂性、有限的生产能力以及对基于化疗的清淋预处理的要求，所有这些都限制了可及性和适用性。因此，该领域正处于另一个转折点，需要在递送和工程技术方面进行创新，以克服这些限制，充分实现CAR-T细胞疗法乃至整个免疫疗法的潜力。 本综述首先讨论从传统体外工程化CAR-T细胞产品开发中获得的关键见解，这些见解推动了将体内CAR技术作为替代方法的研究。这种新颖的体内CAR-T策略可消除细胞制备及相关限制可及性的物流环节，并避免基于化疗的清淋预处理，从而为释放CAR技术的全部潜力提供了机会，包括应用于安全性要求更高的更大适应症。然后回顾了领先的体内CAR平台，以及支持其开发的临床前或临床概念验证。最后讨论了潜在的局限性、将这些疗法推向临床应用的策略，以及这一进展如何推动利用多样化机制和有效载荷向更广泛的体内免疫细胞工程转变。 从体外工程化CAR-T细胞中获得的经验教训 迄今为止，已有多种使用逆转录病毒或慢病毒载体靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）工程化的自体CAR-T细胞产品获批用于治疗多种B细胞恶性肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。此外，数百个CAR-T细胞项目处于不同的开发阶段，全球有超过1000项临床试验正在进行中。也包括现货型异基因CAR-T细胞（allo-CAR-T细胞）产品，这些产品在肿瘤学中尚未显示出与自体CAR-T细胞相当的临床疗效，但可能在自身免疫性疾病中找到其地位。对已获批CAR-T细胞的详细评估（包括旨在理解毒性和治疗耐药机制的反向转化分析）为指导下一代基于细胞和体内CAR疗法的设计提供了关键经验（BOX 1）。 CAR-T细胞疗法作为一种变革性治疗方式 尽管自体CAR-T细胞主要针对癌症开发，但新出现的证据支持其在治疗更广泛疾病方面的潜力，包括自身免疫性疾病。在纤维化和自身免疫方面的临床前研究，以及涵盖自身免疫性疾病适应症（包括狼疮性肾炎、肌炎和系统性硬化症）的多个临床病例研究，已显示出持久的、无需药物的缓解、自身反应性记忆B细胞的清除和疾病相关生物标志物的减少。这种机制称为“免疫重置”（immune reset），类似大剂量化疗后进行自体干细胞移植挽救以治疗严重自身免疫性疾病的效果。实质上，这种重置导致含有致病性自身反应性免疫细胞的免疫库被功能正常的免疫系统所取代，从而实现完全和持续的缓解。 体外工程化 CAR-T 细胞产品的大量临床数据，包括超过35000名接受市售产品治疗的癌症患者，使得对治疗相关不良事件，如细胞因子释放综合征 (CRS) 的分级和管理进行了表征和标准化，免疫效应细胞相关嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症样综合征 (IEC-HS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)、中性粒细胞减少症和低丙种球蛋白血症相关 B 细胞再生障碍性贫血。总而言之，这些知识可以用来促进新一代 CAR-T 细胞产品的临床开发，旨在大规模扩大这种治疗方式的足迹。 可及性和临床疗效的局限性 尽管取得了这些成功，成本、可扩展性和可行性问题严重限制了商业化体外工程化CAR-T细胞产品的可及性，并且也可能阻碍此类产品在非肿瘤和更早期癌症适应症中的更广泛应用。事实上，在美国，大约五分之四符合条件的淋巴瘤患者目前无法获得商业CAR-T细胞产品。除了可扩展性之外，CAR-T细胞产品在临床实践或开发中还有其他几个注意事项，包括需要采用基于化疗的清淋预处理（在肿瘤学实践中通常包括DNA烷化剂[如环磷酰胺]加上嘌呤类似物氟达拉滨）。这些药物增加了一些毒性，可能需要在部分患者中进行密集的院内管理，从而将CAR-T限制在认证的治疗中心。总的来说，所有这些因素都导致了可及性挑战，并可能限制其在自身免疫和再生医学等适应症中的更广泛应用。 此外，肿瘤学中的疗效限制源于影响部分患者的复杂治疗耐药机制。这些机制包括免疫细胞健康度（fitness）差、肿瘤内在因素（如免疫抑制性微环境）以及由靶抗原低表达或异质性表达驱动的免疫逃逸。系统地解决这些因素对于将CAR-T细胞的获益扩展到更广泛的血液恶性肿瘤患者群体以及在实体瘤中实现相当的疗效至关重要，这是一个雄心勃勃的目标，可能需要新的方法，例如免疫系统的多模式体内工程化。 体内细胞疗法：历史视角 体内CAR-T细胞疗法正在成为一种可扩展的替代方案，它同时避免了体外细胞操作和清淋预处理，其主要机制特征是利用现成的载体或制剂直接对免疫细胞进行原位（in situ）CAR 工程化（BOX 2）。 这些体内工程化的免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、NK细胞和/或其他免疫细胞，它们已经分化为效应细胞，甚至是具有分化为免疫效应细胞强大能力的造血干细胞（HSCs）。这种方法有望将CAR分子的变革性效力与这些现成的无细胞方法的可扩展性结合起来，从而可能解决传统疗法在可及性甚至部分临床疗效方面的限制。 该领域出现在纳米技术、RNA药物、病毒学和CAR疗法等多个领域的交叉点（图1），引起了生物制药界的极大兴趣，多家公司已进入临床阶段（表1和表2）。 首批成功原位编程CAR-T细胞的临床前报告来自Fred Hutchinson癌症中心的Matthias Stephan团队（2017年8月）和Paul-Ehrlich研究所的Christian Buchholz团队（2018年9月）。Fred Hutchinson癌症中心的团队开发了可生物降解的携带DNA的聚合物纳米颗粒，该颗粒靶向小鼠T细胞上的CD3以递送治疗性有效载荷——一个编码CD19特异性CAR的piggyBac转座子系统。在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，静脉输注的抗CD19 CAR纳米颗粒的表现与过继性T细胞疗法一样良好，同时避免了体外细胞操作。Paul-Ehrlich研究所的团队早在2012年就描述了一种人CD8靶向的慢病毒载体，并表明这一特性对于向细胞毒性T细胞进行体内基因递送抗原受体至关重要。在包载CD19特异性CAR后，临床前概念验证包括在通过输注人外周血单核细胞或HSCs生成的移植人源化小鼠模型中的T细胞工程化，伴随着B细胞的清除和细胞因子的产生。 然而，临床转化似乎还很遥远，主要有三个原因。首先，这些体内编程的突破并未立即在风险投资家和生物制药界中广为人知。其次，诺华和凯特刚刚获得美国FDA对首批CAR-T细胞疗法的批准，凯特制药公司被吉利德以119亿美元收购，增强了投资者对体外工程化CAR-T细胞产品的信心。最后，人们对现货型异基因细胞技术能够迅速转化为具有更广泛应用性的第二波商业产品寄予厚望。与开发可注射的多组分纳米药物（当时大多数生物制药公司不熟悉的领域）的挑战相比，在临床概念验证和产品获批之后，体外T细胞工程技术似乎风险较小，且是通往市场和财务回报的更容易途径。此外，围绕CAR-T细胞技术的知识产权法律纠纷以及关于纳米颗粒药物递送系统的学术争议进一步复杂化体内CAR-T细胞技术的转化。尽管如此，2018年7月，首家专注于体内CAR-T细胞疗法的生物技术公司Tidal Therapeutics成立，其他公司也迅速跟进——Umoja Biopharma、Orna Therapeutics和Sana Biotechnology于2019年成立，Abintus Bio于2020年成立，Capstan Therapeutics于2021年成立，为该领域的快速成长、创新和投资奠定了基础，目前有超过30家公司在此领域运营。2021年，赛诺菲收购了Tidal Therapeutics，目前正在开发三个用于肿瘤和炎症性疾病的体内CAR-T细胞项目。最近，阿斯利康收购了开发用于多发性骨髓瘤的体内病毒CAR疗法的EsoBiotec，而艾伯维收购了开发基于RNA-脂质纳米颗粒（RNA-LNPs）的体内CAR产品用于自身免疫和其他适应症的Capstan。 体内免疫工程：机制背景 体内CAR工程能够快速生成CAR修饰的免疫细胞，并使它们与靶细胞接触，无论是在修饰发生的同一微环境内，还是在CAR-T细胞迁移后的远处组织中。因此，清淋预处理不仅不必要，而且与体内CAR-T细胞治疗不兼容。相反，除了增加可及性和扩大适用性外，避免化疗预处理为更有效地协同利用更广泛的免疫机制（这是提高临床疗效所必需的）开辟了途径。然而，清淋预处理在肿瘤学CAR-T细胞疗法中的一些有益效果，例如对肿瘤微环境（TME）或先天免疫的免疫调节作用，仍可能需要加以解决，例如通过共同递送生物反应调节剂如γ链受体细胞因子。无论如何，为了成功重编程所需的免疫细胞并最大限度地减少病原性细胞或体内其他细胞的摄取，用于体内CAR-T细胞治疗的载体或制剂需要具有显著的组织和细胞选择性。进入临床开发的两个主要平台在其有效载荷和递送策略上有所不同：具有整合有效载荷的工程化病毒载体；携带瞬时表达RNA的LNPs。使用整合有效载荷的体内CAR技术产生的免疫细胞群体可以根据抗原的存在和负荷自我调整其扩增和持久性，在需要更高效力以实现临床疗效的适应症中可能是一个优势。相比之下，依赖于瞬时表达的非整合有效载荷的技术可提供通过调节给药方案相对独立于抗原负荷来控制暴露（调高或调低CAR工程化免疫细胞的数量和持久性）的机会，这在安全性要求更高的适应症中可能是一个优势。 下文将描述主要的体内 CAR 治疗平台和进入临床阶段的领先候选产品（表1和表2以及图2和3），并根据它们是否具有集成有效载荷进行分类。此外还概述将体内 CAR 技术从临床前转化为临床应用的具体挑战，并讨论这些挑战如何与传统体外 CAR-T 细胞疗法所面临的挑战进行比较。 病毒载体 用于体内CAR-T细胞治疗的病毒载体的早期发展 该平台依赖于细胞选择性载体递送和通过工程化慢病毒或γ-逆转录病毒载体实现CAR有效载荷的基因组整合，这些病毒载体的一个关键要求在于实现显著的选择性基因转移到患者的T细胞中。载体颗粒需要避免被不需要的细胞摄取，通过最大限度地减少“沉陷效应（sink effect）”来确保安全性和提高效率，可通过对用于假型化慢病毒载体的病毒包膜蛋白进行工程化改造来实现。这个概念基于同时消除与天然细胞表面受体的相互作用，并展示识别T细胞特异性细胞表面标志物的高亲和力结合物。使用麻疹病毒糖蛋白提供了慢病毒载体的概念验证，其中膜融合和受体附着功能被分离到两个蛋白质上，从而促进了工程化过程。工程化的尼帕病毒（NIV）糖蛋白使载体颗粒的基因递送活性更强，而展示CD4和CD8特异性结合物则实现T细胞特异性转导，后者对CD8阳性T细胞的特异性超过99%。 慢病毒糖蛋白工程的一个重要进展是将受体靶向递送策略应用于弹状病毒水疱性口炎病毒（VSV）的G糖蛋白，VSV慢病毒具有高产率、成熟的纯化和良好生产规范（GMP）工艺的优势。与在细胞表面介导高效pH非依赖性融合的副粘病毒糖蛋白相反，将受体结合和膜融合结合在单个分子中的VSV-G蛋白需要晚期内体的低pH来启动融合。临床评估最终将告知不同的进入模式是否对基因递送率以及脱靶递送和毒性产生影响。基于消除天然受体使用并展示高亲和力结合物（无论是与VSV-G蛋白融合还是作为单独的跨膜蛋白）的原理，已经评估了各种靶向受体，包括T细胞标志物。 用于体内 CAR-T 细胞生成的首个 T 细胞特异性慢病毒（CD8-慢病毒）是基于 NiV 糖蛋白显示高亲和力设计的锚蛋白重复蛋白 (DARPin)，该蛋白对CD8α链具有特异性，这种CD8-慢病毒使得在体内生成人CD19 CAR-T细胞的概念验证得以展示。在人源化小鼠模型中单次全身给药足以将足够多的人T细胞转导成CAR-T细胞，从而有效清除循环和骨髓中的原发性B细胞或淋巴瘤细胞。依赖类似人源化小鼠模型、使用靶向其他T细胞标志物的慢病毒的后续研究得出了与体内CAR治疗相关的发现。值得注意的是，通过抗CD4-慢病毒载体将CARs专门递送到CD4阳性T细胞中，在临床前模型中实现高效的靶细胞清除，其活性与CD8-慢病毒载体相当或更高。用激动性单链抗体靶向CD3可选择性结合T细胞，同时诱导其活化。由于CD3在T细胞上特异性表达并在T细胞受体（TCR）信号传导中起核心作用，其结合通常会触发内化和受体下调（作为活化过程的一部分）。为了防止这种表面CD3的丢失（可能限制载体结合和转导效率），在转导过程中可使用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼来瞬时抑制TCR信号，从而保留CD3表达并增强基因转移。通过靶向分化程度较低的T细胞上的标志物（如CD62L），CAR有效载荷可以优先递送到初始、干细胞样记忆或中央记忆T细胞中，可能有利于提高疗效或防止早期耗竭。该技术的一个障碍在于巨噬细胞，它们可能充当“降低”的角色。通过在慢病毒包膜膜内掺入“不要吃我”信号CD47，可以显著降低它们清除载体颗粒的活性。 上述所有用于体内CAR-T细胞工程的临床前模型都使用B细胞靶向的CARs。然而最近的一项临床前出版物表明，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（包含CD4阳性肿瘤细胞）可以通过使用CD8靶向慢病毒进行体内CD4 CAR-T细胞递送来有效解决。此外，将CAR有效载荷选择性递送到CD8+ T细胞可阻止CAR递送到恶性细胞中，从而避免潜在的治疗耐药性。 尽管小鼠模型对于生成体内CAR递送的概念验证是理想的，但大型动物模型（如非人灵长类动物[NHPs]）对于向临床转化也至关重要。NHPs在指导平台、产品和剂量方案优化方面发挥了重要作用，为使用带有NIV糖蛋白或弹状病毒包膜糖蛋白的T细胞靶向慢病毒进行临床测试奠定了基础，后者刚刚进入I期开发（表1）。 下文讨论由Interius Bio Therapeutics、Umoja Biopharma、Shenzen Genocury、EsoBiotec、Kelonia Therapeutics和Sana Biotechnology转化到临床或处于临床前开发阶段后期的领先工程化病毒载体（用于体内CAR治疗）。 临床开发中的工程化病毒平台 Interius Bio Therapeutics开发的递送平台是一种工程化的自我失活、复制无能的慢病毒载体，在单次静脉内给药后能够在体内靶向和转导特定细胞类型。Interius载体包括能够实现精确体内基因递送的专有组件：一个提供载体细胞特异性靶向的高亲和力结合物，以及一个去靶向的融合蛋白，用于将整合的慢病毒基因组转移到靶细胞中。 Interius Bio Therapeutics的第一个临床候选药物INT2104是一种CD7靶向的慢病毒载体，旨在递送CAR20转基因，编码一种抗CD20 CAR构建体，用于治疗B细胞恶性肿瘤。为了改善细胞靶向和载体稳定性，INT2104采用Gen 2.1 Fusogen进行假型化，这是VSV-G蛋白的修饰版本，经过工程改造具有氨基酸替换，以减少脱靶结合并增强在血流中的持久性。单个氨基酸替换将其融合蛋白从其天然受体（低密度脂蛋白受体（LDL-R））重新靶向，而不破坏其融合潜力。INT2104的精确体内靶向是通过载体上的高亲和力CD7特异性结合物实现的，该结合物对T细胞（包括CD4+和CD8+亚群）和自然杀伤细胞具有嗜性，从而在单次静脉治疗后产生多样化的效应性抗CD20 CAR细胞群体。 在NHPs和人源化小鼠模型中进行了INT2104的体内研究，以评估安全性、靶细胞转导的特异性以及生物学效应，为首次人体研究做准备。这些体内研究的结果证实了INT2104在静脉递送后能够特异性转导T细胞和自然杀伤细胞；生成和持久存在功能性抗CD20 CAR细胞；以及特异性清除CD20+ B细胞。在食蟹猴中进行的符合良好实验室规范（GLP）的毒理学研究表明，INT2104耐受性良好，静脉内给药后未见毒性证据、无CRS且无神经毒性，为首次人体临床研究选择的剂量范围和给药途径提供了支持。 2024年10月，首位研究参与者在INVISE研究（NCT0639338）中接受了给药，这是一项首次人体I期临床试验，评估INT2104静脉输注在成人难治性/复发性B细胞恶性肿瘤中的安全性。INVISE研究的数据预计将在2025年下半年公布。基于INT2104开发过程中产生的体外和体内数据，Interius预计INVISE研究的临床数据将支持其他产品的开发，包括INT2106，一种包含抗CD19 CAR有效载荷的CAR19载体，开发用于治疗自身免疫性疾病。最近，吉利德旗下的凯特公司宣布其有意收购Interius。 Umoja Biopharma开发的VivoVec是一种体内递送和CAR-T细胞生成平台，是一种表面工程化的、第三代、自我失活、复制无能的慢病毒载体颗粒系统，经过工程化可表达一种多结构域融合蛋白，能够在体内直接将遗传有效载荷递送到T细胞。该平台的一个关键差异化特征在于VivoVec颗粒采用Cocal融合病毒糖蛋白进行假型化，这种糖蛋白在人体内具有抗血清失活能力，从而改善了体内持久性，并允许直接向患者输注。此外，VivoVec产品将CD80和CD58 T细胞共刺激配体与抗CD3 scFv结合到一个单一的多结构域融合蛋白中，提供了对T细胞的高特异性嗜性，并赋予颗粒结合、激活和转导体内的T细胞的能力。实际上，VivoVec颗粒模拟了启动T细胞免疫反应的抗原呈递细胞。 Umoja的第一个主导项目是UB-VV111，这是一种基于VivoVec的药物产品，编码一个CD19靶向的CAR以及一个雷帕霉素激活的细胞因子受体（RACR）。UB-VV111能够在体内直接生成共表达RACR系统的CD19 CAR-T细胞，使这些细胞具备雷帕霉素诱导的扩增能力和增强的体内存活能力。Umoja于2024年7月获得FDA的研究性新药（IND）许可，并已在美国和国际上启动其I期临床试验，治疗B细胞恶性肿瘤。艾伯维（AbbVie）获得了UB-VV111的开发和商业化选择权，并于2024年1月宣布。在NHP模型中的评估表明，单次输注VivoVec药物颗粒可在淋巴结内或静脉内递送后，产生高达循环T细胞65%的CAR-T细胞峰值水平。同时证明了快速且持久的B细胞再生障碍，超过了基准的体外NHP CAR模型中观察到的水平。有趣的是，在一只接受治疗的动物中，在治疗后数月发生了继发性CAR-T细胞扩增，并伴有B细胞下降，归因于病毒转导的CAR-T细胞的持久性。接受治疗动物中的炎症性不良事件通过标准免疫抑制疗法（包括抗IL-6抗体托珠单抗）成功解决。 Umoja的第二个主导项目是UB-VV400，一种基于VivoVec的药物产品，编码一个CD22靶向的CAR，同样与RACR系统结合。该候选产品在人源化小鼠模型中显示了临床前概念验证。Umoja 与中国合作伙伴 IASO Biotherapeutics 的研究者发起的研究将于2025年开始，重点关注 B 细胞恶性肿瘤和在自身免疫性疾病中的进一步研究。其他项目正在研究基于 VivoVec 的治疗在多发性骨髓瘤、实体瘤治疗和自身免疫疾病的应用。 随着这一新兴领域的扩大，最近启动的试验通过病例研究获得临床活性的证据。郑州大学第一附属医院和深圳市济因生物科技有限公司报告了他们的首例复发性/难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤患者，接受了 T 细胞靶向、逆转录病毒形式的抗 CD19 CAR 治疗。设计水痘带状疱疹病毒 (VZV)-G 蛋白逆转录病毒载体，使其显示抗 CD3 结合剂和未披露的 X 活化结构域，CAR有效负载包括分别与 CD8 铰链/跨膜结构域连接的鼠 FMC63 CD19 scFv 以及 41BB 和CD3ζ刺激结构域。有趣且不同寻常的是，治疗方案包括单采采集 T 细胞，随后进行清淋预处理以及自体 T 细胞和病毒载体的共同输注，可能还会利用预处理的潜在获益。主要副作用为骨髓毒性和1级CRS，无神经毒性或感染证据。该治疗在输注后3周内导致 CAR-T 细胞扩增，并在第35天通过临床影像学记录部分缓解，并通过恶性细胞计数减少证实。最近的更新显示治疗后3个月完全缓解，但尚不清楚这是否是不同的患者。 使用类似的方法，基于第三代自我失活、VSV-G蛋白靶向缺陷的慢病毒载体，Esobiotec/Shenzen Pregene开发了一种抗BCMA CAR产品，该产品具有一些额外特征。这些包括一个工程化的包膜（ENaBL-T），通过一个对TCRαβ特异的结合物（一种骆驼源的单域重链抗体（VHH）纳米抗体）进行T细胞重新靶向，但通过主要组织相容性复合体（MHC）I类耗竭和CD47表达实现免疫隐形，并包含一个配备T细胞特异性启动子的有效载荷。该技术实现了对静息和活化T细胞的有效工程化，在多发性骨髓瘤模型中显示了临床前概念验证。此外，该公司已启动临床活动，最近报告了首例接受其体内抗BCMA产品治疗的多发性骨髓瘤患者，该患者获得了客观缓解，并消除骨髓中的播散性疾病。值得注意的是，反应评估在第28天进行（强调了临床反应的速度）从而支持了无需长期CAR暴露即可通过CAR疗法快速实现完全缓解的模式。最近的一次更新对此进行了补充，描述了四名恶性骨髓瘤患者的客观反应，包括早先报道的那位患者。连同无害的不良事件特征，催化了阿斯利康最近对EsoBiotec的收购，预示着大型生物制药公司对这个快速发展的体内CAR治疗领域的兴趣。 临床前研究中的工程化病毒载体 Kelonia Therapeutics开发的体内基因安置系统（IGPS）是一种现成的基因药物平台技术，能够在体内生成CAR-T细胞。IGPS颗粒设计为仅需单次静脉剂量即可产生强效、持久的CAR-T细胞。该平台旨在实现靶向T细胞时的高特异性，是基于旨在识别抗原反应性TCR的研究开发的。他们最初工程化能够特异性转导抗原特异性T细胞的慢病毒载体，方法是将VSV-G包膜蛋白从其天然进入受体LDL-R去靶向，转而共表达一个肽-MHC复合物。Kelonia通过使用CD3作为病毒进入受体，使该技术适应于靶向所有T细胞。将抗CD3 scFv与一个去靶向的VSV-G相结合，该VSV-G是从众多突变的VSV-G变体中选出的，这些变体在保持强效T细胞转导的同时，最好地抑制LDL-R结合。IGPS平台的潜力在一系列NHP研究中得到了凸显，其中使用抗CD20 CAR（靶向正常和恶性B细胞）在体内转导T细胞。单次静脉输注，剂量水平低至每公斤体重108个病毒颗粒即可产生足够的抗CD20 CAR-T细胞，以实现持续超过2个月的完全B细胞清除，且无需任何额外治疗。引人注目的是，强效的CAR-T细胞活性发生的同时，没有出现明显的毒性，包括肝毒性、CRS或神经毒性。 Kelonia的主导药物KLN-1010，在IGPS病毒颗粒中编码专有的、完全人源的抗BCMA CAR，用于治疗多发性骨髓瘤。在临床前研究中，用人源化多发性骨髓瘤小鼠模型治疗，单次静脉剂量的抗BCMA IGPS颗粒导致肿瘤完全清除，并且与模拟商业抗BCMA体外工程化CAR-T细胞产品（idecabtagene vicleucel [ide-cel]或 ciltacabtagene autoleucel [cilia-cel]）的体外CAR-T细胞相比表现更优。或许与记忆和干细胞样记忆CD4和CD8 T细胞比例较高有关，用KLN-1010生成的CAR-T细胞比体外工程化的T细胞持续更长时间。大多数off-target、非T细胞的CAR表达仅限于能够进行吞噬作用的细胞，如巨噬细胞。KLN-1010计划于2025年进入多发性骨髓瘤的临床开发，随后是肿瘤学和自身免疫领域的其他内部和合作项目。 Sana Biotechnology开发的靶向融合蛋白平台技术旨在通过全身给药慢病毒载体后实现强效和高度特异性的T细胞转导。该方法使用配备来自副粘病毒的可重新靶向融合蛋白的第三代自我失活慢病毒载体。该融合蛋白的天然受体结合被禁用（“致盲”），并被一个工程化的结构域取代，该结构域结合选定的T细胞表面受体。在与该受体结合后，融合蛋白被激活以介导膜融合，从而实现载体进入和基因递送。这种直接的质膜进入机制不仅提高了靶向特异性，还可规避通过内体进入途径观察到的非特异性摄取——这是一个已知会影响基于VSV-G的载体在体内应用的问题。受体耦合机制确保转导仅发生在T细胞中，最大限度地减少由与其他细胞类型的意外相互作用引起的off-target效应。这种靶向精度尤其重要，因为CAR蛋白在慢病毒生产过程中可以被整合到载体颗粒中，这是一个已知的人工假象，当与VSV-G融合蛋白结合时会驱动off-target转导。尽管融合蛋白是模块化的，可以靶向不同的TCR，如CD3和CD4，但这种拟议的治疗方法使用CD8靶向的融合蛋白。Sana早期在小鼠中使用CD8靶向慢病毒载体的工作显示，在外周血、脾脏和其他淋巴器官中特异性递送到CD8+ T细胞。Sana基于悬浮的制造工艺的进展将CD8靶向慢病毒载体（LV）滴度提高了约50倍，同时保留融合蛋白系统的特异性，这种增强效力的载体降低了在小鼠和 NHP 模型中实现稳健CAR-T细胞生产和B细胞清除所需的体内剂量。在使用增强效力载体的NHP研究中，在外周血、脾脏和其他淋巴器官中观察到靶向CD8+ T细胞的高度特异性转导，而在关键off-target器官（如肝脏）中缺乏信号。 Sana使用模块化可重新靶向系统递送到不同的T细胞亚群，以及肝细胞和HSCs，靶向融合体递送对体内递送均具有高度特异性。还可以向载体表面添加其他蛋白质以允许细胞活化而不改变特异性，例如通过添加CD3配体用于T细胞活化。此外，慢病毒载体可以修饰用于递送基因编辑货物，正如病毒样颗粒所展示的那样，提供了一个具有模块化细胞特异性靶向和多样化有效载荷整合的递送载体。将其主导产品（体内抗CD19 CAR，采用工程化慢病毒载体格式，靶向CD8+ T细胞）推进到临床的计划正在制定中。 工程化、靶向的慢病毒用于CAR治疗也正在由其他组织开发，例如Ensoma（通过重编程HSCs进行多细胞谱系工程）、Vyriad——最近宣布与诺华（Novartis）达成合作协定——以及Exuma Biotec（T细胞和NK细胞的共同工程化），已有临床前数据可用，临床计划尚未披露（表1）。包含用于体内CAR治疗的pH敏感性聚合物屏蔽慢病毒的新技术也正在由Alaya Bio探索。 基于RNA的平台 用于体内CAR-T细胞治疗的RNA递送系统的起源与演变 基于RNA的工程平台使用线性mRNA或环状RNA进行瞬时免疫细胞工程，通过组织嗜性脂质制剂或通过细胞靶向、抗体功能化的纳米颗粒递送。该平台的兴起得益于LNPs中mRNA疫苗的发展，作为对COVID-19大流行的快速响应。尽管早期研究使用装载抗CD19 CAR mRNA的CD3和CD8功能化聚合物纳米颗粒实现了临床前概念验证，但由于大规模疫苗接种经验以及在可离子化脂质方面的创新，LNPs成为首选的制剂方法。与通常用于mRNA-LNP疫苗接种的脂质相比，具有高生物降解性和低反应原性的可离子化脂质使得能够实现期望的目标产品特征，并在很大程度上允许重复给药。抗体功能化的LNPs能够实现有效的T细胞工程化和细胞类型选择性，而通过高通量筛选鉴定的免疫嗜性LNPs支持细胞或组织特异性递送。这些可用于有效工程化体内的T细胞亚群或整个淋巴细胞群体，而该LNP-RNA平台的另一个版本旨在工程化巨噬细胞，利用颗粒对髓系细胞的嗜性。这是通过颗粒电晕中尚未识别的组分与清道夫受体的相互作用发生的，可能不同于常规的ApoE/LDL-R介导的肝细胞摄取。巨噬细胞是先天免疫系统中众所周知的哨兵细胞，能够浸润肿瘤、进行吞噬作用、释放炎性细胞因子、招募T细胞和呈递抗原。与T细胞不同，巨噬细胞缺乏内源性抗原特异性；然而它们可以有效地调动免疫的多个分支。 下文更详细地描述新兴的LNP-mRNA体内CAR平台和领先产品（表2和图2），并进一步将基于 RNA 的工程方法分别归类为依赖于组织和细胞对脂质的趋向性 (Myeloid Therapeutics，Carisma Therapeutics，Orna Therapeutics) 或细胞选择性靶向抗体 (Capstan Therapeutics，Shenzen MagicRNA，赛诺菲，Immorna) 的技术。 临床开发中的非病毒RNA系统 Myeloid Therapeutics等公司正在追求体内髓系细胞编程。这种体内工程平台特异性靶向并激活髓系细胞，将它们重新定向以对抗肿瘤细胞。递送封装在mRNA格式中的CAR的LNPs会导致体内髓系细胞的摄取和选择性表达，从而在多种肿瘤模型中导致肿瘤消除。该方法利用LNPs对髓系细胞谱系的天然嗜性。CAR设计包含一个截短的FcαR（CD89）融合构建体，与内源性FcRγ链形成多链复合物，这是其稳定细胞表面表达所必需的，从而实现细胞谱系特异性表达和功能。mRNA有效载荷也通过引入mRNA编码序列和3'非翻译区（UTR）的修饰进行了优化，以增强和延长CAR表达。2022年，Myeloid与LNPs领域的创新者Acuitas达成协议，以开发用于癌症患者的新型体内CAR疗法。在小鼠中最初的临床前概念验证研究使用LNP-mRNA格式递送靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、肿瘤相关钙信号转导子2（TACSTD2；也称为TROP2）和糖蛋白75（GP75）的CARs。在小鼠肺异种移植模型中，静脉内给予TROP2 CAR mRNA-LNP导致肿瘤生长抑制。与荷瘤小鼠类似，在食蟹猴中，TROP2 CAR mRNA-LNPs主要被髓系细胞内化。 针对GPC3 CAR mRNA-LNP候选产品产生了类似的临床前数据集。体外转染人和食蟹猴全血细胞导致LNPs被髓系细胞有效摄取，GPC3 CAR在高达30%的单核细胞中选择性表达。此外，在食蟹猴中输注后观察到GPC3 CAR的剂量依赖性表达。最后，在小鼠模型中的抗肿瘤活性与细胞因子增加相关，这是CAR与肿瘤细胞上GPC3结合的指标。总的来说，这些发现表明，髓系细胞可以在体内被CAR mRNA-LNPs直接工程化，以消除肿瘤细胞并协调适应性免疫反应。 已有两个候选产品进入I期试验：MT-302，一种靶向TROP2+上皮恶性肿瘤的体内CAR，正在评估其安全性和初步疗效（NCT05969041），患者给药于2023年9月12日启动；以及MT-303，一种靶向过表达GPC3的原发性或转移性肝细胞癌的体内CAR，于2024年7月31日在I期研究（NCT06478693）中开始给药。在TROP2+肿瘤中，T-302导致在外周血和TME中均有CAR表达。在GPC3+肝细胞癌中，MT-303已显示出抗肿瘤活性，包括在经多线治疗的患者中病灶减少。在两个项目中，在当前剂量水平下耐受性仍然可接受，未观察到剂量限制性毒性，且CRS可控。这些发现证明了作用机制，并支持进一步的剂量递增和扩展到联合研究。最近，Myeloid Therapeutics将临床前概念验证扩展到针对HER2的CARs，也适用于实体瘤。 为了有效协同T细胞，Capstan Therapeutics开发了配体修饰的LNP颗粒（CellSeeker技术）以支持其体内CAR产品线。这种体内CAR平台包含以优化的线性mRNA格式的有效载荷，由靶向LNPs（tLNPs）递送，具有基于抗体的结合物，旨在选择性工程化免疫细胞亚群。与用于mRNA疫苗的LNPs相比，这些tLNPs含有高度可生物降解、反应原性较低的可离子化脂质，适合重复静脉输注。该平台设计得益于mRNA药物领域的重大进展，通过使用修饰核苷酸（如N1-甲基假尿苷）、纳米药物（通过可离子化脂质的出现）以及能够实现强效免疫细胞功能的CAR设计。基础科学包括在心脏纤维化模型中，使用抗CD5抗体修饰的tLNP-mRNA格式，原位生成抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-T细胞，减少FAP+成纤维细胞和改善器官功能。随后是平台和有效载荷的优化，产生了适合开发的制剂，以及一种抗CD19 CAR的抗CD8抗体-LNP-mRNA格式，最近被指定为领先的临床开发候选药物。 与其他不依赖整合载体的体内CAR技术类似，由于其瞬时的、自我限制的CAR表达，mRNA工程方法可能避免加剧或延长靶向毒性、由病毒组分引起的免疫原性以及遗传毒性，这些都可能影响患者可及性。此外，由于靶向抗体结合剂的使用，这种类型的技术能够优先工程免疫细胞亚群，而不选择其他细胞类型，如 B 细胞或 CAR 靶细胞，其可能对结果有不利贡献。去风险的 tLNP 免疫原性和反应原性至关重要，尤其是在与更高疗效条相关的疾病适应症中，需要长期重复输注。最后，mRNA序列优化是增强 CAR 活性的关键，强调了线性 mRNA 作为有效载荷类型的尚未开发的潜力。 Capstan的抗CD19 CAR领先候选产品的非临床证据包括对来自健康或患病个体的人T细胞进行相对高效的体外工程化。在人源化小鼠模型中的概念验证显示了快速的体内工程化以及人CD8+ T细胞对抗原发性或恶性B细胞的深刻活性。一种抗CD20 CAR的抗CD8-LNP-mRNA格式（一种适用于NHPs的替代产品）在淋巴组织和骨髓中显示出深刻的B细胞清除，包括记忆B细胞，随后主要是幼稚B细胞的重新填充，类似于传统CAR T细胞实现的免疫重置。仅需相隔3天的两次输注的紧凑治疗周期就足以实现淋巴器官中的B细胞清除。这一结果支持了该领先产品在自身免疫中的临床开发，以及其他体内CAR产品和针对更广泛适应症（包括遗传性疾病）的新治疗概念，前提是在早期临床试验中证明安全性和活性。一项首次人体试验（NCT06917742）于今年启动。Capstan打算开发更广泛的体内CAR产品组合，适用于自身免疫性疾病，以及其他类别的适应症（基于诸如用于浆细胞疾病的BCMA和用于再生医学、自身免疫和肿瘤学应用的活化成纤维细胞等靶点）。最近，艾伯维宣布收购Capstan therapeutics，强调了这一快速发展的领域的广泛兴趣。 另外两个组织也刚刚启动了其体内CAR疗法的临床测试，同样使用tLNP-RNA格式。Immorna Biotherapeutics开始评估其装载抗CD19 CAR的tLNP制剂在非霍奇金淋巴瘤患者中的I期试验。该候选产品（JCXH-213）旨在共同重编程T细胞、NK细胞和巨噬细胞，以增强药理效应。深圳MagicRNA也将其装载抗CD19 CAR（HM2301）的CD8-tLNP推进到临床。他们的Enc-LNP平台包括专有的抗体片段和可离子化脂质，以选择性工程化体内的免疫细胞。临床前证据显示，替代抗CD19 CAR在人CD8转基因狼疮性肾炎模型中的活性，以及在用替代抗CD20 CAR给药的NHPs中指示免疫重置的数据。这项由企业参与的研究者发起的研究正在评估HM2301在复发性和难治性系统性红斑狼疮患者中的安全性和有效性以及更广泛的平台可行性，显示了体内工程化抗CD19 CD8+ T细胞的首次证据，并伴有B细胞清除的证据、与靶向活性相关的细胞因子产生以及通过患者自身抗体滴度降低表现的临床相关生物标志物活性。 临床前研究中的基于RNA的平台 Orna Therapeutics开发的非病毒平台的独特之处在于其使用配制有免疫嗜性脂质的LNPs，这些脂质优先靶向免疫细胞，而不需要肽配体或任何其他类型的靶向部分，从化学、制造和控制（CMC）、监管和成本角度来看，可能具有相当大的优势。在免疫细胞中，使用下一代环状RNA瞬时表达CARs（panCAR）可利用LNP设计和环状RNA工程在患者免疫细胞中实现精确、瞬时的CAR表达。Orna平台使用跨物种反应的CAR设计，能够在临床前毒理学研究之前在啮齿动物和NHP研究中验证疗效。在2019年成立时，基于其基础的MIT技术，Orna专注于使用环状RNA平台内的组织特异性内部核糖体进入位点进行免疫细胞工程。随后，在ReNAgade证明了对NHP免疫细胞（包括>50%的T细胞工程化）的递送后，于2024年从ReNAgade收购了一个领先的非病毒递送平台。 使用环状RNA格式的抗CD20和抗CD19 CARs，该小组已在单次剂量给药后，在体外、啮齿动物和NHP模型中证明了强大的B细胞清除。抗CD20 CAR制剂在人源化小鼠模型中显示出显著的B细胞清除，表现为24小时内外周血、脾脏和骨髓中B细胞减少75-80%。这种效应在外周血和骨髓中持续到给药后7天。最后，该制剂在NHP中单次给药后显示血液中B细胞减少95%，并持续清除（82%）7天。第一个临床项目将在多种适应症的自身免疫性疾病中使用环状RNA格式的抗CD19 CAR。一个用于多发性骨髓瘤的BCMA项目将在首例抗CD19 CAR患者给药后不久启动。 环状RNA的概念也正在由其他目前处于临床前开发阶段的公司追求——例如最初专注于疫苗的Orbital Therapeutics——计划推出一种装载针对B细胞谱系抗原的CAR有效载荷的tLNP制剂。此外，Sall Biomedicines 、Strand Therapeutics和RiboX Therapeutics在体外或小鼠模型中的临床前证据都强调了人们对环状RNA平台的巨大兴趣，将其作为进一步优化由增强或延长的CAR有效载荷表达所带来的潜在疗效优势的手段，并通过颗粒功能化从而增强该方法的选择性和性能。 赛诺菲也在开发一个基于tLNP的平台，与Capstan Therapeutics、MagicRNA和Immorna追求的概念类似。其与用于疫苗的典型mRNA-LNP制剂不同，因为它旨在实现选择性T细胞工程化和控制CAR T细胞暴露。通过将修饰的mRNA封装在LNP内部，并在表面添加基于抗体的结合物以靶向CD8+细胞来实现细胞特异性CAR表达。该制剂中使用的专有可离子化脂质是广泛筛选的结果，旨在提高在T细胞中的耐受性、稳定性和活性。这是通过改变脂质分子的头部和尾部基团来实现的。LNP性能在很大程度上取决于可离子化脂质的结构，包括疏水链长度、支化、结构异构化和不饱和度，对这些特征的系统性修改导致T细胞转染效率比使用未优化脂质配制的LNPs提高了3到4倍。 临床前活性突出了tLNP系统的模块性和灵活性，支持其针对多种靶点和疾病的潜在效用。T细胞的转染是通过LNP表面的抗体片段实现的，这些片段促进了靶向纳米颗粒的相互作用和摄取。使用模型LNP制剂已经筛选了多种Fab和纳米抗体结合物。抗 CD3 的抗体片段能够快速摄取和有效负载表达，但导致非特异性活化，从而降低耐受性。用针对CD8的片段靶向LNPs导致快速的有效载荷表达（CAR或荧光蛋白），而没有非特异性激活和细胞因子表达，结合了经过功能筛选的脂质和T细胞结合物的LNPs能够在人T细胞中实现稳健的CAR表达。CAR表达仅限于CD8+细胞，包括T细胞和NK细胞亚群，且CAR表达细胞对靶细胞系具有活性。在体外和人源化小鼠模型中都证明了细胞转染，在该模型中，该平台还展示了控制肿瘤细胞生长的能力，无论是在全身还是在脾脏中。最近，在用单次或多次剂量含有CD19 CAR mRNA的CD8-tLNPs输注的恒河猴中产生了抗CD19 CAR工程化和药理效应的证据。在血液（相对于基线>95%）和骨髓（相对于对照动物90%）中记录了快速的B细胞清除，B细胞在骨髓中第29天和血液中第50天恢复到输注前水平。启动临床开发的计划尚未披露。 尽管如上所述，Myeloid Therapeutics进入了临床开发，但其他公司也认可体外或体内重编程髓系细胞的前景。Carisma Therapeutics开发了人CAR巨噬细胞和单核细胞（CAR-M），证明CARs可以将巨噬细胞效应功能重新定向以对抗肿瘤相关抗原。Pierini等人证明，CAR-M重塑实体瘤TME，招募T细胞，驱动表位扩散，并使实体瘤对检查点抑制敏感。随后，CAR-M的概念通过直接将CARs引入CD14+经典单核细胞而得到扩展，这些单核细胞在原位分化为CAR-M，同时实现增强的迁移和持久性。第一个CAR-M是CT-0508（自体，抗HER2），在14名晚期/转移性HER2过表达实体瘤患者中进行了评估，未使用清淋化疗，并证明了可行性、安全性、TME重塑和可诱导适应性免疫。基于循环肿瘤DNA的深度但短暂的减少，在HER2+实体瘤患者中证明了抗肿瘤活性。体外CAR-M方法的一个关键限制在于最大潜在剂量；单核细胞和巨噬细胞是终末分化的，不扩增，从而直接限制了单采输出的剂量。此外，异基因CAR-M方法在肿瘤学背景下的效用有限，因为MHC不匹配限制了抗原呈递。因此，直接向髓系细胞体内递送CARs是一个有吸引力的替代方案，符合前面讨论的潜在优势。2022年，Carisma Therapeutics和Moderna启动合作，开发使用mRNA-LNP技术的体内CAR-M。该平台是使用一种在体内具有强大转染髓系细胞能力的LNP和一种包含针对髓系细胞抗肿瘤活性优化的结构和信号结构域的新型CAR开发的。体外数据表明，CAR表达持续>7天，并诱导抗原依赖性细胞死亡、细胞因子释放、连续杀伤（依次杀死多个靶细胞的能力）以及在抗原刺激后将巨噬细胞极化为炎症表型。在体内，在人源化小鼠中植入了转移性实体瘤的HER2和GPC3阳性肿瘤模型中，全身给予mRNA-LNP均导致强大的抗肿瘤活性。在静脉内mRNA-LNP给药后，髓系细胞是主要的CAR表达免疫细胞。Carisma和Moderna宣布，在2024年提名了一个抗GPC3体内CAR-M开发候选药物，用于在肝细胞癌中进行进一步的临床开发。同时，这些公司继续开发针对其他未披露肿瘤靶点的体内CAR-M，并在2024年扩大了合作，包括两个自身免疫性疾病靶点。Carisma和Moderna此后终止了抗HER2项目，但继续开发靶向GPC3的CAR-M。 其他公司也在探索适用于体内CAR产品的tLNP设计和制造工艺的改进，例如由Acuitas Therapeutics、Mote Therapeutics、Nitto Denko Corporation、Aera Therapeutics和Grit Biotechnology。一个特别的兴趣是非病毒、全RNA有效载荷方法，用于在体内将CAR构建体基因永久插入T细胞的特定基因座。由Tessera Therapeutics开创的这种替代性敲入技术，避免了病毒载体的使用，可能因RNA写入（RNA writing）的出现而大大促进，与LNP平台高度兼容。得到NHP证据支持的临床前小鼠建模，为CD19、CD20和BCMA导向的CARs使用这种CAR敲入方法产生了概念验证。其他组织（如Stylus Medicine 和Integra Therapeutics）也在探索类似的路径，作为基于LV的体内CAR平台的替代方案，以寻求实现永久但更可控的CAR有效载荷整合和表达谱。最后，为了达到这个目的，NanoCell正在开发一种混合有效载荷方法，包括DNA格式的CAR和作为mRNA递送的转座酶。 临床开发中的体内CAR-T细胞 随着该领域进入临床阶段，首先是工程化慢病毒载体和髓系细胞嗜性LNP-mRNA制剂在恶性疾病中进行探索，临床病例研究显示出良好的安全性、耐受性以及生物学反应或临床疗效。这些首次人体试验要么是研究者发起并有企业参与的研究，要么是公司赞助的试验，并在全球范围内进行，包括中国、美国、澳大利亚和欧盟，说明了这个新兴生态系统的全球性。在T细胞靶向慢病毒格式中，抗BCMA和抗CD19 CARs分别在于多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤获得客观缓解。最近，有报道四名多发性骨髓瘤患者接受体内慢病毒抗BCMA CAR治疗后出现深度客观缓解；一名患者在第28天显示严格意义的完全缓解（sCR），另一名在第28天显示骨髓中微小残留病变（MRD）清除，强调了在癌症中实现快速和深刻缓解的可能性，前提是CAR暴露足够高。CRS特征呈现双相性，第一个峰值在数小时内出现，可能由对T细胞活化病毒粒子的急性输注反应加上CAR+效应细胞介导的活性共同介导，第二个峰值是病毒CAR的典型特征，可能由治疗后约7-14天新分化的效应细胞介导。尽管该领域仍处于起步阶段，但CAR-T细胞扩增的幅度和速度以及随后在治疗后数周内可测量的临床反应表明，在短暂的CAR暴露期间即可获得具有临床意义的结果。这对于设计上具有瞬时CAR表达的产品也可能适用，此时CAR暴露可以通过重复输注或调整剂量来校准。尽管包含针对实体瘤靶点（TROP2和GPC3）的CAR构建体的髓系细胞嗜性LNP-RNA制剂的新兴数据支持这一观察结果，但仍需要额外的证据。 尽管所有这些试验都仔细监测了安全性特征，但由于这些平台技术的新颖性以及来自具有独特且可能协同毒性的整合组分的风险，目前尚未报告严重不良事件或剂量限制性毒性。除了低起始剂量的缓慢剂量递增外，这些研究可能包括监测（sentinel）患者、院内治疗和输注后随访、队列间延长的观察间隔、严格的停止规则和剂量限制性毒性的定义，以及与输注反应、可能的靶向毒性和产品免疫原性相关的广泛安全性生物标志物评估。这些努力也旨在支持后续试验的剂量方案选择。基于处于临床前阶段的公司数量以及该领域不断扩大的兴趣，预计进入临床开发的公司数量将继续迅速增加，超过30家，在过去两年中实现了惊人的两位数扩张（表1和表2）。 体内免疫工程：关键挑战 随着首批体内CAR疗法进入临床评估（表1和表2以及图4），几个关键风险和未解答的问题仍然存在（BOX 3）。为了解决这些问题，早期试验正在纳入广泛的安全性和药理学反应生物标志物以指导进一步开发。最值得注意的是，在安全性方面，这种方法代表了未知领域，结合了各自具有其自身风险特征的不同技术。 技术风险和当前局限性 为了预测与体内CAR治疗相关的风险，NHP建模可能具有高度信息量。此外，医生们对商业CAR-T细胞产品的经验越来越丰富；然而对于使用慢病毒载体和LNP-RNA产品进行直接体内CAR-T细胞治疗的临床经验非常有限。因此，在早期临床开发中部署基于风险的监测方法至关重要，要考虑平台技术（基于病毒或LNP-RNA）的具体情况以及已经在临床上使用传统CAR-T细胞产品的经验。 由于有效载荷的整合性质，基于慢病毒的CAR产品存在固有的挑战，主要源于在CAR激活、扩增和持久性方面可实现的有限控制。CAR-T细胞扩增的自我调节与靶细胞负荷成比例，可以增强治疗效果。然而，不受控制的药理反应（由倾向性因素放大）可能引发严重的炎症性不良事件，如CRS、ICANS和IEC-HS，需要积极的管理和住院治疗。一个关键的挑战在于，这类不良事件可能在治疗后延迟一段时间发生，因此难以预测，从而需要对患者进行长期监测。目前使用传统体外工程化CAR-T细胞在自身免疫性疾病中的努力应继续提供丰富信息：尽管由于正在阐明的原因，炎症性不良事件的患病率和严重程度似乎低于肿瘤学环境，但最近报道了在CAR-T细胞输注后数月出现的持久的CAR-T细胞持久性甚至再扩增，并伴有严重毒性，如高级别IEC-HS。最近，在接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者中描述了一种新的毒性：局部免疫效应细胞相关毒性综合征（LICATS）。然而这似乎是疾病突然发作，或者是旁观者CAR介导的活性短暂影响参与自身免疫过程的器官；30%的治疗患者使用低剂量皮质类固醇管理，8%需要住院治疗。一半的治疗患者在治疗后至少2周出现LICATS，再次强调了长期监测接受病毒工程化CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者的重要性。最后，CAR-T细胞的长期持久性可能导致延长的靶向毒性，表现为B细胞再生障碍和低丙种球蛋白血症（在靶向B细胞谱系的情况下需要预防感染）或帕金森综合征，这在体外抗BCMA CAR-T细胞产品中已有报道。除了长期监测外，为了增强依赖于基因组有效载荷整合的体内CARs的安全性特征和可控性，可能还需要整合确保CAR表达时空控制的特征，例如细胞谱系特异性启动子和杀伤开关。 与逆转录病毒载体相关的一个特别值得注意的方面是由于基因组整合相对随机性而导致的插入性肿瘤。最近的一些报告显示，接受传统病毒工程化CAR-T细胞疗法治疗的患者出现了CAR+继发性T细胞恶性肿瘤。然而，在CAR插入与肿瘤发展之间建立直接的因果关系具有挑战性，原因在于病例数量少、该患者群体的潜在癌症易感性以及转化分化T细胞的固有困难。显然，还需要对此事进行额外调查——特别是阐明CAR载体插入的相对贡献以及诸如基因座整合和与癌基因相互作用等辅助因子的身份。有行业监管指南可用于指导产品开发者关于人类基因产品给药后的长期监测，尽管这些指南可能需要进一步调整以促进基于逆转录病毒的体内CAR疗法的发展。 反过来说，依赖于LNP制剂的基于RNA的CARs可能存在由该技术三个主要组分相互作用而引起的安全风险：纳米制剂可能介导输注反应或急性期反应；具有固有先天免疫激活效应的RNA有效载荷；可能导致炎症性不良事件或不受控制的靶向药理学的具有深刻免疫药理活性的CAR构建体。由于基于RNA模板的CAR表达的瞬时性，特别是在T细胞快速分裂的情况下，可能需要重复给药或其他优化，以在关键时间间隔内实现足够的CAR暴露，这是临床有效性所必需的。这也提出了几个关键挑战，包括对肝脏去靶向以预防由于此类制剂固有的肝脏嗜性而导致的器官特异性毒性。其次，重复给予抗体-tLNPs或非靶向LNPs可能导致针对LNP组分、靶向部分和/或表达的有效载荷的抗体和T细胞反应的诱导。这些原则上可能限制这些疗法的有效性，但也可能引发免疫介导的不良事件，包括I型、III型和IV型超敏反应。 总之，这些潜在的局限性，加上缺乏体内LNP-RNA格式CARs的临床经验，强调了在包括NHPs在内的多样化临床前环境中以多种方式降低此类技术风险的重要性。先前批准的RNA纳米药物（如ONPATTRO）可能为开发体内LNP-RNA CAR产品提供关键的路线图构建模块，但它们需要与CAR治疗相关的考虑因素整合到未来的指南中。同时，在早期临床开发期间对所有潜在毒性进行全面、基于风险的监测，对于成功将这种治疗模式转化到临床仍然至关重要。这需要包括产品免疫原性、急性期反应、器官（肝脏）毒性和靶向炎症或其他类别的不良事件。尚待观察的是，包含瞬时表达有效载荷的体内CAR技术是否可能避免在病毒CARs中看到的相对延迟或慢性的靶向或off-target毒性，例如LICATS、与继发性CAR-T细胞扩增相关的IEC-HS、运动障碍、延迟性血细胞减少或长期B细胞再生障碍。 基于其主要目标产品特征，下文为主要类别的体内CAR疗法提出了一个产品开发路线图和潜在的初始适用性（图4和图5）。还提供了关于体内编程免疫系统概念的长期视角，其潜力可能超越传统治疗模式的能力。 产品开发策略 大多数申办者优先考虑经过充分验证的靶点（CD19、CD20、BCMA、CD22、TROP2、GPC3）来指导其平台技术的优化，从而实现临床转化和商业产品的开发。总体目标是扩大CAR疗法的临床适用性，通过取代或超越可扩展性较差的体外工程化细胞基产品或性能不足的生物制剂。第一波人体体内CAR试验，除了安全性和临床活性证据外，还将为后续的概念验证和注册试验提供剂量方案选择（图6）。这些在B细胞恶性肿瘤和涉及B细胞的自身免疫性疾病中的初始试验将调查风险，包括输注反应、产品免疫原性、急性、亚急性和慢性靶向毒性以及遗传毒性。因此，全面的转化分析对于建立充分的安全性监测和管理计划、为II期试验前的优化提供信息以及为注册试验选择适当的剂量方案至关重要。 在血液肿瘤中，由于将免疫疗法推进到更早期治疗线的强烈理由以及MRD检测的出现，一个主要机会将是在一线环境中治疗旨在治愈的高危患者。在自身免疫中，一个关键目标将是推进可扩展的疗法，以提供“免疫重置”，包括深度免疫细胞谱系清除和正常免疫细胞库的快速重新填充，两者都能导致持久的、无需药物的缓解，且没有任何组织或基因组后遗症。在再生医学、纤维化和衰老中，一个主要机会是通过体内CAR工程化免疫细胞导致组织中致病性细胞的清除，从而消除致病性细胞并恢复正常功能组织结构。基于预测的病毒和mRNA基体内CAR-T细胞治疗模式的目标产品特征，设想了不同的商业切入点，但用CAR mRNA工程化巨噬细胞靶向实体瘤可能代表一个例外（图5）。基于深度反向平移的迭代产品和平台优化可能会改善产品性能和目标产品特征，从而使所有这些平台具有更广泛的临床适用性。 迈向体内重编程免疫系统 由第一波体内CAR-T细胞产品实现的这些治疗平台的临床验证，可能为未来重新思考免疫疗法铺平道路。体内免疫工程与其他治疗模式的差异化特征众多，治疗潜力巨大（BOX 4）。例如，在肿瘤学中，可以设想多受体CARs或TCR工程化多种类别的免疫细胞，这些细胞相互协同工作，直接重编程免疫微环境，有效协同利用内源性免疫，调节免疫细胞的转录组和信号通路，以及对抗免疫检查点——所有这些都通过体内工程化实现，如下所述。 在自身免疫、移植排斥管理、过敏和其他免疫性疾病中，体内CAR-T细胞产品可以通过共同部署反调节机制或通过诱导操作耐受性，以各种方式重置或调节免疫系统，从而实现非常持久的无需药物的缓解。其他有前景的方向包括扩展CAR有效载荷设计以靶向更广泛的分子阵列，选择性将CARs导向抗原特异性致病细胞，或使用双靶向CAR构建体以在某些情况下扩大活性并增强临床安全性和疗效。在抗体引导的LNP介导的体内T细胞工程化首次演示十年后，目前的努力继续专注于改进向定义的免疫细胞亚群的精确递送，使用高选择性抗体片段和新兴类别的结合物，如纳米抗体。 包括可植入设备在内的新型平台可能极大地促进这种整体免疫系统工程方法。类似于可注射剂，可植入设备是体内遗传操纵患者T细胞的有前景的新技术。例如，生物材料植入物可以在原位招募宿主T细胞，用肿瘤特异性受体对其进行基因装备，并迅速扩增和分散这些细胞到肿瘤环境中。该设备是一个功能化的多孔胶原支架，带有强效的T细胞趋化因子、一个编码CAR的慢病毒载体和刺激性的抗CD3/CD28抗体。在乳腺癌小鼠模型中，植入物迅速聚集并编程癌症特异性宿主淋巴细胞，并驱动长期的肿瘤消退。这种局部植入技术的一个潜在优势是它大大减少了所需的载体剂量，节省了成本并最小化了全身毒性风险。这些设备可以在原发性减瘤手术期间或之后放置在实体瘤附近，或者战略性地放置在淋巴结附近，以促进原位编程的CAR-T细胞在整个体内的快速传播。此外，这些“现成的”支架可以与任何当前FDA批准的CAR-T细胞疗法使用的相同慢病毒载体一起工作。 市场上有六种用于体内基因治疗的药物产品，腺相关病毒（AAV）载体可能成为体内递送的多功能首选载体。由于AAVs的固有局限性，如免疫原性、附加体位置以及因此在增殖细胞中的瞬时活性，目前使用AAV载体生成CAR-T细胞非常有限。然而，将基于AAV的CAR递送与核酸酶介导的基因组靶向相结合，实现了稳定的CAR整合。另一个潜在的组合是与最近描述的基于衣壳设计策略（如慢病毒包膜的工程化）的T细胞靶向AAVs相结合，可能很快产生一种用于体内瞬时或永久精确工程化CAR-T细胞的替代载体系统。优化可能包括识别靶受体组合的具有逻辑“AND”门控的双特异性AAVs。直接重编程T细胞的另一种方法是HSC工程化，通过使用基于辅助依赖性腺病毒的病毒样颗粒，携带Sleeping Beauty（睡美人）整合有效载荷以及CAR构建体，来生成CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-M。 避免使用病毒载体的替代敲入技术也可能促成下一代体内CAR-T细胞疗法。RNA基因写入（RNA gene writing）的出现为开发具有增加CAR基因插入控制的整合有效载荷技术提供了巨大机会；并且来自体外和小鼠模型的晚期突破性临床前数据为这种格式的CD19、CD20和BCMA导向的CARs产生了概念验证，其通过tLNPs作为全RNA有效载荷递送。 进一步优化安全性和有效性特征的新技术对于实现此类体内工程平台的临床转化至关重要，尤其是在具有高安全性和疗效标准的疾病适应症中。学术研究继续推动这一领域，有几个额外的概念可能极大地促成下一代产品设计。关于避免毒性和增强靶向选择性，主要方向包括有效载荷表达的时空控制和组合抗原识别。其他途径包括利用组织和细胞系特异性启动子进行基因组整合技术，在基于 RNA 的 CAR 和其他有效载荷的情况下，利用组织特异性 microRNA 结合位点限制肝脏或其他器官的非预期翻译。具有增强生物活性的有效载荷保证了更好的性能和组织或细胞选择性纳米药物，通过条形码增强的高通量筛选和人工智能指导的设计促进。另一种增强 LNPs 作为体内 CAR 治疗载体的安全性的方法是共同配制免疫调节因子，如短发夹RNA，以敲低 IL-6 或其他促炎分子的产生。随着有效载荷多样化以包括基因编辑系统，高度特异性的组织和细胞递送载体变得更加关键。同时，人们不断关注探索不同的配方和有效载荷化学、功能化和制造优化。为了满足疾病适应症（如实体瘤）提供的更高疗效标准，正在考虑有效载荷的多样化，包括用于免疫细胞装甲的生物反应调节剂、选择额外效应机制的免疫细胞衔接器和免疫检查点调节剂。 展望 使用质粒 DNA 形式的简单抗原进行的基于基因的体内免疫的首次评估后35年、首次静脉输注用于临床治疗的逆转录病毒载体后25年和首个 CAR-T 细胞产品获批后8年，可以期待未来包括免疫系统精确和复杂的体内编程。这些技术 (图6) 目前已经进入临床阶段，最终将提供有效载荷表达的时空控制和可调谐性，并容纳相互协作的不同机制。因此，它们将超越当前治疗方式的能力，导致在更广泛的疾病中增强临床性能。更具体地说，从体外到体内 CAR-T 细胞治疗的概念转变重新定义了免疫疗法的可扩展性和可及性，并通过大幅降低商品成本来促进，具有深刻的社会经济影响，导致挽救生命的疗法实现大众化。 参考文献：Bot, A., Scharenberg, A., Friedman, K. et al. In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01291-5 本文素材来源与官方媒体、网络新闻、引自细胞治疗前沿公众号。 【科企新球】私域活动（部分） 免责声明：本微信文章中的信息仅供一般参考之用，不可直接作为决策内容，本号不对任何主体因使用本文内容而导致的任何损失承担责任。

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法已经改变了血液恶性肿瘤患者的治疗结局，但其应用受到劳动密集型的制备过程、有限的生产能力和参差不齐的临床疗效的限制。体内CAR-T细胞工程，即在患者体内直接生成CAR-T细胞，旨在通过消除对体外细胞处理和复杂物流的需求，并改善临床疗效，来克服这些挑战。病毒学、RNA药物和纳米技术领域的最新进展推动了对这种方法的彻底改革，该方法使用靶向递送系统（如慢病毒载体和脂质纳米颗粒）将编码CAR的遗传物质导入内源性T细胞。早期临床研究已显示出高效的转导、持续的CAR表达以及抗肿瘤活性的初步迹象，确立了概念验证。 《Nature Reviews Drug Discovery》（IF=101.8）近日发表综述，探讨了相关的基础技术并讨论了如何调整这些技术以开发更广泛适用、可扩展、安全有效的CAR-T细胞疗法。通过消除体外操作和化疗预处理的需要，该策略可以使CAR-T细胞疗法得到更广泛的应用，不仅用于血液肿瘤，也可用于自身免疫性疾病（例如系统性红斑狼疮）。 引言 在过去的三十年里，免疫疗法经历了重大变革，这得益于单克隆抗体、抗体-药物偶联物、细胞因子、免疫细胞衔接器 、DNA疫苗以及最近的基于RNA的疫苗和工程化T细胞疗法的进展。在这些治疗方式中，自体CAR-T细胞疗法因其效力而脱颖而出，在B细胞恶性肿瘤中显示出治愈潜力。尽管期望很高，但自体或异基因CAR-T细胞疗法向更广泛适应症和患者群体的扩展速度比预期要慢，存在多重障碍，包括制备和物流的复杂性、有限的生产能力以及对基于化疗的清淋预处理的要求，所有这些都限制了可及性和适用性。因此，该领域正处于另一个转折点，需要在递送和工程技术方面进行创新，以克服这些限制，充分实现CAR-T细胞疗法乃至整个免疫疗法的潜力。 本综述首先讨论从传统体外工程化CAR-T细胞产品开发中获得的关键见解，这些见解推动了将体内CAR技术作为替代方法的研究。这种新颖的体内CAR-T策略可消除细胞制备及相关限制可及性的物流环节，并避免基于化疗的清淋预处理，从而为释放CAR技术的全部潜力提供了机会，包括应用于安全性要求更高的更大适应症。然后回顾了领先的体内CAR平台，以及支持其开发的临床前或临床概念验证。最后讨论了潜在的局限性、将这些疗法推向临床应用的策略，以及这一进展如何推动利用多样化机制和有效载荷向更广泛的体内免疫细胞工程转变。 从体外工程化CAR-T细胞中获得的经验教训 迄今为止，已有多种使用逆转录病毒或慢病毒载体靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）工程化的自体CAR-T细胞产品获批用于治疗多种B细胞恶性肿瘤，包括B细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。此外，数百个CAR-T细胞项目处于不同的开发阶段，全球有超过1000项临床试验正在进行中。也包括现货型异基因CAR-T细胞（allo-CAR-T细胞）产品，这些产品在肿瘤学中尚未显示出与自体CAR-T细胞相当的临床疗效，但可能在自身免疫性疾病中找到其地位。对已获批CAR-T细胞的详细评估（包括旨在理解毒性和治疗耐药机制的反向转化分析）为指导下一代基于细胞和体内CAR疗法的设计提供了关键经验（BOX 1）。 CAR-T细胞疗法作为一种变革性治疗方式 尽管自体CAR-T细胞主要针对癌症开发，但新出现的证据支持其在治疗更广泛疾病方面的潜力，包括自身免疫性疾病。在纤维化和自身免疫方面的临床前研究，以及涵盖自身免疫性疾病适应症（包括狼疮性肾炎、肌炎和系统性硬化症）的多个临床病例研究，已显示出持久的、无需药物的缓解、自身反应性记忆B细胞的清除和疾病相关生物标志物的减少。这种机制称为“免疫重置”（immune reset），类似大剂量化疗后进行自体干细胞移植挽救以治疗严重自身免疫性疾病的效果。实质上，这种重置导致含有致病性自身反应性免疫细胞的免疫库被功能正常的免疫系统所取代，从而实现完全和持续的缓解。 体外工程化 CAR-T 细胞产品的大量临床数据，包括超过35000名接受市售产品治疗的癌症患者，使得对治疗相关不良事件，如细胞因子释放综合征 (CRS) 的分级和管理进行了表征和标准化，免疫效应细胞相关嗜血细胞性淋巴组织细胞增生症样综合征 (IEC-HS)、免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS)、中性粒细胞减少症和低丙种球蛋白血症相关 B 细胞再生障碍性贫血。总而言之，这些知识可以用来促进新一代 CAR-T 细胞产品的临床开发，旨在大规模扩大这种治疗方式的足迹。 可及性和临床疗效的局限性 尽管取得了这些成功，成本、可扩展性和可行性问题严重限制了商业化体外工程化CAR-T细胞产品的可及性，并且也可能阻碍此类产品在非肿瘤和更早期癌症适应症中的更广泛应用。事实上，在美国，大约五分之四符合条件的淋巴瘤患者目前无法获得商业CAR-T细胞产品。除了可扩展性之外，CAR-T细胞产品在临床实践或开发中还有其他几个注意事项，包括需要采用基于化疗的清淋预处理（在肿瘤学实践中通常包括DNA烷化剂[如环磷酰胺]加上嘌呤类似物氟达拉滨）。这些药物增加了一些毒性，可能需要在部分患者中进行密集的院内管理，从而将CAR-T限制在认证的治疗中心。总的来说，所有这些因素都导致了可及性挑战，并可能限制其在自身免疫和再生医学等适应症中的更广泛应用。 此外，肿瘤学中的疗效限制源于影响部分患者的复杂治疗耐药机制。这些机制包括免疫细胞健康度（fitness）差、肿瘤内在因素（如免疫抑制性微环境）以及由靶抗原低表达或异质性表达驱动的免疫逃逸。系统地解决这些因素对于将CAR-T细胞的获益扩展到更广泛的血液恶性肿瘤患者群体以及在实体瘤中实现相当的疗效至关重要，这是一个雄心勃勃的目标，可能需要新的方法，例如免疫系统的多模式体内工程化。 体内细胞疗法：历史视角 体内CAR-T细胞疗法正在成为一种可扩展的替代方案，它同时避免了体外细胞操作和清淋预处理，其主要机制特征是利用现成的载体或制剂直接对免疫细胞进行原位（in situ）CAR 工程化（BOX 2）。 这些体内工程化的免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、NK细胞和/或其他免疫细胞，它们已经分化为效应细胞，甚至是具有分化为免疫效应细胞强大能力的造血干细胞（HSCs）。这种方法有望将CAR分子的变革性效力与这些现成的无细胞方法的可扩展性结合起来，从而可能解决传统疗法在可及性甚至部分临床疗效方面的限制。 该领域出现在纳米技术、RNA药物、病毒学和CAR疗法等多个领域的交叉点（图1），引起了生物制药界的极大兴趣，多家公司已进入临床阶段（表1和表2）。 首批成功原位编程CAR-T细胞的临床前报告来自Fred Hutchinson癌症中心的Matthias Stephan团队（2017年8月）和Paul-Ehrlich研究所的Christian Buchholz团队（2018年9月）。Fred Hutchinson癌症中心的团队开发了可生物降解的携带DNA的聚合物纳米颗粒，该颗粒靶向小鼠T细胞上的CD3以递送治疗性有效载荷——一个编码CD19特异性CAR的piggyBac转座子系统。在急性淋巴细胞白血病小鼠模型中，静脉输注的抗CD19 CAR纳米颗粒的表现与过继性T细胞疗法一样良好，同时避免了体外细胞操作。Paul-Ehrlich研究所的团队早在2012年就描述了一种人CD8靶向的慢病毒载体，并表明这一特性对于向细胞毒性T细胞进行体内基因递送抗原受体至关重要。在包载CD19特异性CAR后，临床前概念验证包括在通过输注人外周血单核细胞或HSCs生成的移植人源化小鼠模型中的T细胞工程化，伴随着B细胞的清除和细胞因子的产生。 然而，临床转化似乎还很遥远，主要有三个原因。首先，这些体内编程的突破并未立即在风险投资家和生物制药界中广为人知。其次，诺华和凯特刚刚获得美国FDA对首批CAR-T细胞疗法的批准，凯特制药公司被吉利德以119亿美元收购，增强了投资者对体外工程化CAR-T细胞产品的信心。最后，人们对现货型异基因细胞技术能够迅速转化为具有更广泛应用性的第二波商业产品寄予厚望。与开发可注射的多组分纳米药物（当时大多数生物制药公司不熟悉的领域）的挑战相比，在临床概念验证和产品获批之后，体外T细胞工程技术似乎风险较小，且是通往市场和财务回报的更容易途径。此外，围绕CAR-T细胞技术的知识产权法律纠纷以及关于纳米颗粒药物递送系统的学术争议进一步复杂化体内CAR-T细胞技术的转化。尽管如此，2018年7月，首家专注于体内CAR-T细胞疗法的生物技术公司Tidal Therapeutics成立，其他公司也迅速跟进——Umoja Biopharma、Orna Therapeutics和Sana Biotechnology于2019年成立，Abintus Bio于2020年成立，Capstan Therapeutics于2021年成立，为该领域的快速成长、创新和投资奠定了基础，目前有超过30家公司在此领域运营。2021年，赛诺菲收购了Tidal Therapeutics，目前正在开发三个用于肿瘤和炎症性疾病的体内CAR-T细胞项目。最近，阿斯利康收购了开发用于多发性骨髓瘤的体内病毒CAR疗法的EsoBiotec，而艾伯维收购了开发基于RNA-脂质纳米颗粒（RNA-LNPs）的体内CAR产品用于自身免疫和其他适应症的Capstan。 体内免疫工程：机制背景 体内CAR工程能够快速生成CAR修饰的免疫细胞，并使它们与靶细胞接触，无论是在修饰发生的同一微环境内，还是在CAR-T细胞迁移后的远处组织中。因此，清淋预处理不仅不必要，而且与体内CAR-T细胞治疗不兼容。相反，除了增加可及性和扩大适用性外，避免化疗预处理为更有效地协同利用更广泛的免疫机制（这是提高临床疗效所必需的）开辟了途径。然而，清淋预处理在肿瘤学CAR-T细胞疗法中的一些有益效果，例如对肿瘤微环境（TME）或先天免疫的免疫调节作用，仍可能需要加以解决，例如通过共同递送生物反应调节剂如γ链受体细胞因子。无论如何，为了成功重编程所需的免疫细胞并最大限度地减少病原性细胞或体内其他细胞的摄取，用于体内CAR-T细胞治疗的载体或制剂需要具有显著的组织和细胞选择性。进入临床开发的两个主要平台在其有效载荷和递送策略上有所不同：具有整合有效载荷的工程化病毒载体；携带瞬时表达RNA的LNPs。使用整合有效载荷的体内CAR技术产生的免疫细胞群体可以根据抗原的存在和负荷自我调整其扩增和持久性，在需要更高效力以实现临床疗效的适应症中可能是一个优势。相比之下，依赖于瞬时表达的非整合有效载荷的技术可提供通过调节给药方案相对独立于抗原负荷来控制暴露（调高或调低CAR工程化免疫细胞的数量和持久性）的机会，这在安全性要求更高的适应症中可能是一个优势。 下文将描述主要的体内 CAR 治疗平台和进入临床阶段的领先候选产品（表1和表2以及图2和3），并根据它们是否具有集成有效载荷进行分类。此外还概述将体内 CAR 技术从临床前转化为临床应用的具体挑战，并讨论这些挑战如何与传统体外 CAR-T 细胞疗法所面临的挑战进行比较。 病毒载体 用于体内CAR-T细胞治疗的病毒载体的早期发展 该平台依赖于细胞选择性载体递送和通过工程化慢病毒或γ-逆转录病毒载体实现CAR有效载荷的基因组整合，这些病毒载体的一个关键要求在于实现显著的选择性基因转移到患者的T细胞中。载体颗粒需要避免被不需要的细胞摄取，通过最大限度地减少“沉陷效应（sink effect）”来确保安全性和提高效率，可通过对用于假型化慢病毒载体的病毒包膜蛋白进行工程化改造来实现。这个概念基于同时消除与天然细胞表面受体的相互作用，并展示识别T细胞特异性细胞表面标志物的高亲和力结合物。使用麻疹病毒糖蛋白提供了慢病毒载体的概念验证，其中膜融合和受体附着功能被分离到两个蛋白质上，从而促进了工程化过程。工程化的尼帕病毒（NIV）糖蛋白使载体颗粒的基因递送活性更强，而展示CD4和CD8特异性结合物则实现T细胞特异性转导，后者对CD8阳性T细胞的特异性超过99%。 慢病毒糖蛋白工程的一个重要进展是将受体靶向递送策略应用于弹状病毒水疱性口炎病毒（VSV）的G糖蛋白，VSV慢病毒具有高产率、成熟的纯化和良好生产规范（GMP）工艺的优势。与在细胞表面介导高效pH非依赖性融合的副粘病毒糖蛋白相反，将受体结合和膜融合结合在单个分子中的VSV-G蛋白需要晚期内体的低pH来启动融合。临床评估最终将告知不同的进入模式是否对基因递送率以及脱靶递送和毒性产生影响。基于消除天然受体使用并展示高亲和力结合物（无论是与VSV-G蛋白融合还是作为单独的跨膜蛋白）的原理，已经评估了各种靶向受体，包括T细胞标志物。 用于体内 CAR-T 细胞生成的首个 T 细胞特异性慢病毒（CD8-慢病毒）是基于 NiV 糖蛋白显示高亲和力设计的锚蛋白重复蛋白 (DARPin)，该蛋白对CD8α链具有特异性，这种CD8-慢病毒使得在体内生成人CD19 CAR-T细胞的概念验证得以展示。在人源化小鼠模型中单次全身给药足以将足够多的人T细胞转导成CAR-T细胞，从而有效清除循环和骨髓中的原发性B细胞或淋巴瘤细胞。依赖类似人源化小鼠模型、使用靶向其他T细胞标志物的慢病毒的后续研究得出了与体内CAR治疗相关的发现。值得注意的是，通过抗CD4-慢病毒载体将CARs专门递送到CD4阳性T细胞中，在临床前模型中实现高效的靶细胞清除，其活性与CD8-慢病毒载体相当或更高。用激动性单链抗体靶向CD3可选择性结合T细胞，同时诱导其活化。由于CD3在T细胞上特异性表达并在T细胞受体（TCR）信号传导中起核心作用，其结合通常会触发内化和受体下调（作为活化过程的一部分）。为了防止这种表面CD3的丢失（可能限制载体结合和转导效率），在转导过程中可使用酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼来瞬时抑制TCR信号，从而保留CD3表达并增强基因转移。通过靶向分化程度较低的T细胞上的标志物（如CD62L），CAR有效载荷可以优先递送到初始、干细胞样记忆或中央记忆T细胞中，可能有利于提高疗效或防止早期耗竭。该技术的一个障碍在于巨噬细胞，它们可能充当“降低”的角色。通过在慢病毒包膜膜内掺入“不要吃我”信号CD47，可以显著降低它们清除载体颗粒的活性。 上述所有用于体内CAR-T细胞工程的临床前模型都使用B细胞靶向的CARs。然而最近的一项临床前出版物表明，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（包含CD4阳性肿瘤细胞）可以通过使用CD8靶向慢病毒进行体内CD4 CAR-T细胞递送来有效解决。此外，将CAR有效载荷选择性递送到CD8+ T细胞可阻止CAR递送到恶性细胞中，从而避免潜在的治疗耐药性。 尽管小鼠模型对于生成体内CAR递送的概念验证是理想的，但大型动物模型（如非人灵长类动物[NHPs]）对于向临床转化也至关重要。NHPs在指导平台、产品和剂量方案优化方面发挥了重要作用，为使用带有NIV糖蛋白或弹状病毒包膜糖蛋白的T细胞靶向慢病毒进行临床测试奠定了基础，后者刚刚进入I期开发（表1）。 下文讨论由Interius Bio Therapeutics、Umoja Biopharma、Shenzen Genocury、EsoBiotec、Kelonia Therapeutics和Sana Biotechnology转化到临床或处于临床前开发阶段后期的领先工程化病毒载体（用于体内CAR治疗）。 临床开发中的工程化病毒平台 Interius Bio Therapeutics开发的递送平台是一种工程化的自我失活、复制无能的慢病毒载体，在单次静脉内给药后能够在体内靶向和转导特定细胞类型。Interius载体包括能够实现精确体内基因递送的专有组件：一个提供载体细胞特异性靶向的高亲和力结合物，以及一个去靶向的融合蛋白，用于将整合的慢病毒基因组转移到靶细胞中。 Interius Bio Therapeutics的第一个临床候选药物INT2104是一种CD7靶向的慢病毒载体，旨在递送CAR20转基因，编码一种抗CD20 CAR构建体，用于治疗B细胞恶性肿瘤。为了改善细胞靶向和载体稳定性，INT2104采用Gen 2.1 Fusogen进行假型化，这是VSV-G蛋白的修饰版本，经过工程改造具有氨基酸替换，以减少脱靶结合并增强在血流中的持久性。单个氨基酸替换将其融合蛋白从其天然受体（低密度脂蛋白受体（LDL-R））重新靶向，而不破坏其融合潜力。INT2104的精确体内靶向是通过载体上的高亲和力CD7特异性结合物实现的，该结合物对T细胞（包括CD4+和CD8+亚群）和自然杀伤细胞具有嗜性，从而在单次静脉治疗后产生多样化的效应性抗CD20 CAR细胞群体。 在NHPs和人源化小鼠模型中进行了INT2104的体内研究，以评估安全性、靶细胞转导的特异性以及生物学效应，为首次人体研究做准备。这些体内研究的结果证实了INT2104在静脉递送后能够特异性转导T细胞和自然杀伤细胞；生成和持久存在功能性抗CD20 CAR细胞；以及特异性清除CD20+ B细胞。在食蟹猴中进行的符合良好实验室规范（GLP）的毒理学研究表明，INT2104耐受性良好，静脉内给药后未见毒性证据、无CRS且无神经毒性，为首次人体临床研究选择的剂量范围和给药途径提供了支持。 2024年10月，首位研究参与者在INVISE研究（NCT0639338）中接受了给药，这是一项首次人体I期临床试验，评估INT2104静脉输注在成人难治性/复发性B细胞恶性肿瘤中的安全性。INVISE研究的数据预计将在2025年下半年公布。基于INT2104开发过程中产生的体外和体内数据，Interius预计INVISE研究的临床数据将支持其他产品的开发，包括INT2106，一种包含抗CD19 CAR有效载荷的CAR19载体，开发用于治疗自身免疫性疾病。最近，吉利德旗下的凯特公司宣布其有意收购Interius。 Umoja Biopharma开发的VivoVec是一种体内递送和CAR-T细胞生成平台，是一种表面工程化的、第三代、自我失活、复制无能的慢病毒载体颗粒系统，经过工程化可表达一种多结构域融合蛋白，能够在体内直接将遗传有效载荷递送到T细胞。该平台的一个关键差异化特征在于VivoVec颗粒采用Cocal融合病毒糖蛋白进行假型化，这种糖蛋白在人体内具有抗血清失活能力，从而改善了体内持久性，并允许直接向患者输注。此外，VivoVec产品将CD80和CD58 T细胞共刺激配体与抗CD3 scFv结合到一个单一的多结构域融合蛋白中，提供了对T细胞的高特异性嗜性，并赋予颗粒结合、激活和转导体内的T细胞的能力。实际上，VivoVec颗粒模拟了启动T细胞免疫反应的抗原呈递细胞。 Umoja的第一个主导项目是UB-VV111，这是一种基于VivoVec的药物产品，编码一个CD19靶向的CAR以及一个雷帕霉素激活的细胞因子受体（RACR）。UB-VV111能够在体内直接生成共表达RACR系统的CD19 CAR-T细胞，使这些细胞具备雷帕霉素诱导的扩增能力和增强的体内存活能力。Umoja于2024年7月获得FDA的研究性新药（IND）许可，并已在美国和国际上启动其I期临床试验，治疗B细胞恶性肿瘤。艾伯维（AbbVie）获得了UB-VV111的开发和商业化选择权，并于2024年1月宣布。在NHP模型中的评估表明，单次输注VivoVec药物颗粒可在淋巴结内或静脉内递送后，产生高达循环T细胞65%的CAR-T细胞峰值水平。同时证明了快速且持久的B细胞再生障碍，超过了基准的体外NHP CAR模型中观察到的水平。有趣的是，在一只接受治疗的动物中，在治疗后数月发生了继发性CAR-T细胞扩增，并伴有B细胞下降，归因于病毒转导的CAR-T细胞的持久性。接受治疗动物中的炎症性不良事件通过标准免疫抑制疗法（包括抗IL-6抗体托珠单抗）成功解决。 Umoja的第二个主导项目是UB-VV400，一种基于VivoVec的药物产品，编码一个CD22靶向的CAR，同样与RACR系统结合。该候选产品在人源化小鼠模型中显示了临床前概念验证。Umoja 与中国合作伙伴 IASO Biotherapeutics 的研究者发起的研究将于2025年开始，重点关注 B 细胞恶性肿瘤和在自身免疫性疾病中的进一步研究。其他项目正在研究基于 VivoVec 的治疗在多发性骨髓瘤、实体瘤治疗和自身免疫疾病的应用。 随着这一新兴领域的扩大，最近启动的试验通过病例研究获得临床活性的证据。郑州大学第一附属医院和深圳市济因生物科技有限公司报告了他们的首例复发性/难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤患者，接受了 T 细胞靶向、逆转录病毒形式的抗 CD19 CAR 治疗。设计水痘带状疱疹病毒 (VZV)-G 蛋白逆转录病毒载体，使其显示抗 CD3 结合剂和未披露的 X 活化结构域，CAR有效负载包括分别与 CD8 铰链/跨膜结构域连接的鼠 FMC63 CD19 scFv 以及 41BB 和CD3ζ刺激结构域。有趣且不同寻常的是，治疗方案包括单采采集 T 细胞，随后进行清淋预处理以及自体 T 细胞和病毒载体的共同输注，可能还会利用预处理的潜在获益。主要副作用为骨髓毒性和1级CRS，无神经毒性或感染证据。该治疗在输注后3周内导致 CAR-T 细胞扩增，并在第35天通过临床影像学记录部分缓解，并通过恶性细胞计数减少证实。最近的更新显示治疗后3个月完全缓解，但尚不清楚这是否是不同的患者。 使用类似的方法，基于第三代自我失活、VSV-G蛋白靶向缺陷的慢病毒载体，Esobiotec/Shenzen Pregene开发了一种抗BCMA CAR产品，该产品具有一些额外特征。这些包括一个工程化的包膜（ENaBL-T），通过一个对TCRαβ特异的结合物（一种骆驼源的单域重链抗体（VHH）纳米抗体）进行T细胞重新靶向，但通过主要组织相容性复合体（MHC）I类耗竭和CD47表达实现免疫隐形，并包含一个配备T细胞特异性启动子的有效载荷。该技术实现了对静息和活化T细胞的有效工程化，在多发性骨髓瘤模型中显示了临床前概念验证。此外，该公司已启动临床活动，最近报告了首例接受其体内抗BCMA产品治疗的多发性骨髓瘤患者，该患者获得了客观缓解，并消除骨髓中的播散性疾病。值得注意的是，反应评估在第28天进行（强调了临床反应的速度）从而支持了无需长期CAR暴露即可通过CAR疗法快速实现完全缓解的模式。最近的一次更新对此进行了补充，描述了四名恶性骨髓瘤患者的客观反应，包括早先报道的那位患者。连同无害的不良事件特征，催化了阿斯利康最近对EsoBiotec的收购，预示着大型生物制药公司对这个快速发展的体内CAR治疗领域的兴趣。 临床前研究中的工程化病毒载体 Kelonia Therapeutics开发的体内基因安置系统（IGPS）是一种现成的基因药物平台技术，能够在体内生成CAR-T细胞。IGPS颗粒设计为仅需单次静脉剂量即可产生强效、持久的CAR-T细胞。该平台旨在实现靶向T细胞时的高特异性，是基于旨在识别抗原反应性TCR的研究开发的。他们最初工程化能够特异性转导抗原特异性T细胞的慢病毒载体，方法是将VSV-G包膜蛋白从其天然进入受体LDL-R去靶向，转而共表达一个肽-MHC复合物。Kelonia通过使用CD3作为病毒进入受体，使该技术适应于靶向所有T细胞。将抗CD3 scFv与一个去靶向的VSV-G相结合，该VSV-G是从众多突变的VSV-G变体中选出的，这些变体在保持强效T细胞转导的同时，最好地抑制LDL-R结合。IGPS平台的潜力在一系列NHP研究中得到了凸显，其中使用抗CD20 CAR（靶向正常和恶性B细胞）在体内转导T细胞。单次静脉输注，剂量水平低至每公斤体重108个病毒颗粒即可产生足够的抗CD20 CAR-T细胞，以实现持续超过2个月的完全B细胞清除，且无需任何额外治疗。引人注目的是，强效的CAR-T细胞活性发生的同时，没有出现明显的毒性，包括肝毒性、CRS或神经毒性。 Kelonia的主导药物KLN-1010，在IGPS病毒颗粒中编码专有的、完全人源的抗BCMA CAR，用于治疗多发性骨髓瘤。在临床前研究中，用人源化多发性骨髓瘤小鼠模型治疗，单次静脉剂量的抗BCMA IGPS颗粒导致肿瘤完全清除，并且与模拟商业抗BCMA体外工程化CAR-T细胞产品（idecabtagene vicleucel [ide-cel]或 ciltacabtagene autoleucel [cilia-cel]）的体外CAR-T细胞相比表现更优。或许与记忆和干细胞样记忆CD4和CD8 T细胞比例较高有关，用KLN-1010生成的CAR-T细胞比体外工程化的T细胞持续更长时间。大多数off-target、非T细胞的CAR表达仅限于能够进行吞噬作用的细胞，如巨噬细胞。KLN-1010计划于2025年进入多发性骨髓瘤的临床开发，随后是肿瘤学和自身免疫领域的其他内部和合作项目。 Sana Biotechnology开发的靶向融合蛋白平台技术旨在通过全身给药慢病毒载体后实现强效和高度特异性的T细胞转导。该方法使用配备来自副粘病毒的可重新靶向融合蛋白的第三代自我失活慢病毒载体。该融合蛋白的天然受体结合被禁用（“致盲”），并被一个工程化的结构域取代，该结构域结合选定的T细胞表面受体。在与该受体结合后，融合蛋白被激活以介导膜融合，从而实现载体进入和基因递送。这种直接的质膜进入机制不仅提高了靶向特异性，还可规避通过内体进入途径观察到的非特异性摄取——这是一个已知会影响基于VSV-G的载体在体内应用的问题。受体耦合机制确保转导仅发生在T细胞中，最大限度地减少由与其他细胞类型的意外相互作用引起的off-target效应。这种靶向精度尤其重要，因为CAR蛋白在慢病毒生产过程中可以被整合到载体颗粒中，这是一个已知的人工假象，当与VSV-G融合蛋白结合时会驱动off-target转导。尽管融合蛋白是模块化的，可以靶向不同的TCR，如CD3和CD4，但这种拟议的治疗方法使用CD8靶向的融合蛋白。Sana早期在小鼠中使用CD8靶向慢病毒载体的工作显示，在外周血、脾脏和其他淋巴器官中特异性递送到CD8+ T细胞。Sana基于悬浮的制造工艺的进展将CD8靶向慢病毒载体（LV）滴度提高了约50倍，同时保留融合蛋白系统的特异性，这种增强效力的载体降低了在小鼠和 NHP 模型中实现稳健CAR-T细胞生产和B细胞清除所需的体内剂量。在使用增强效力载体的NHP研究中，在外周血、脾脏和其他淋巴器官中观察到靶向CD8+ T细胞的高度特异性转导，而在关键off-target器官（如肝脏）中缺乏信号。 Sana使用模块化可重新靶向系统递送到不同的T细胞亚群，以及肝细胞和HSCs，靶向融合体递送对体内递送均具有高度特异性。还可以向载体表面添加其他蛋白质以允许细胞活化而不改变特异性，例如通过添加CD3配体用于T细胞活化。此外，慢病毒载体可以修饰用于递送基因编辑货物，正如病毒样颗粒所展示的那样，提供了一个具有模块化细胞特异性靶向和多样化有效载荷整合的递送载体。将其主导产品（体内抗CD19 CAR，采用工程化慢病毒载体格式，靶向CD8+ T细胞）推进到临床的计划正在制定中。 工程化、靶向的慢病毒用于CAR治疗也正在由其他组织开发，例如Ensoma（通过重编程HSCs进行多细胞谱系工程）、Vyriad——最近宣布与诺华（Novartis）达成合作协定——以及Exuma Biotec（T细胞和NK细胞的共同工程化），已有临床前数据可用，临床计划尚未披露（表1）。包含用于体内CAR治疗的pH敏感性聚合物屏蔽慢病毒的新技术也正在由Alaya Bio探索。 基于RNA的平台 用于体内CAR-T细胞治疗的RNA递送系统的起源与演变 基于RNA的工程平台使用线性mRNA或环状RNA进行瞬时免疫细胞工程，通过组织嗜性脂质制剂或通过细胞靶向、抗体功能化的纳米颗粒递送。该平台的兴起得益于LNPs中mRNA疫苗的发展，作为对COVID-19大流行的快速响应。尽管早期研究使用装载抗CD19 CAR mRNA的CD3和CD8功能化聚合物纳米颗粒实现了临床前概念验证，但由于大规模疫苗接种经验以及在可离子化脂质方面的创新，LNPs成为首选的制剂方法。与通常用于mRNA-LNP疫苗接种的脂质相比，具有高生物降解性和低反应原性的可离子化脂质使得能够实现期望的目标产品特征，并在很大程度上允许重复给药。抗体功能化的LNPs能够实现有效的T细胞工程化和细胞类型选择性，而通过高通量筛选鉴定的免疫嗜性LNPs支持细胞或组织特异性递送。这些可用于有效工程化体内的T细胞亚群或整个淋巴细胞群体，而该LNP-RNA平台的另一个版本旨在工程化巨噬细胞，利用颗粒对髓系细胞的嗜性。这是通过颗粒电晕中尚未识别的组分与清道夫受体的相互作用发生的，可能不同于常规的ApoE/LDL-R介导的肝细胞摄取。巨噬细胞是先天免疫系统中众所周知的哨兵细胞，能够浸润肿瘤、进行吞噬作用、释放炎性细胞因子、招募T细胞和呈递抗原。与T细胞不同，巨噬细胞缺乏内源性抗原特异性；然而它们可以有效地调动免疫的多个分支。 下文更详细地描述新兴的LNP-mRNA体内CAR平台和领先产品（表2和图2），并进一步将基于 RNA 的工程方法分别归类为依赖于组织和细胞对脂质的趋向性 (Myeloid Therapeutics，Carisma Therapeutics，Orna Therapeutics) 或细胞选择性靶向抗体 (Capstan Therapeutics，Shenzen MagicRNA，赛诺菲，Immorna) 的技术。 临床开发中的非病毒RNA系统 Myeloid Therapeutics等公司正在追求体内髓系细胞编程。这种体内工程平台特异性靶向并激活髓系细胞，将它们重新定向以对抗肿瘤细胞。递送封装在mRNA格式中的CAR的LNPs会导致体内髓系细胞的摄取和选择性表达，从而在多种肿瘤模型中导致肿瘤消除。该方法利用LNPs对髓系细胞谱系的天然嗜性。CAR设计包含一个截短的FcαR（CD89）融合构建体，与内源性FcRγ链形成多链复合物，这是其稳定细胞表面表达所必需的，从而实现细胞谱系特异性表达和功能。mRNA有效载荷也通过引入mRNA编码序列和3'非翻译区（UTR）的修饰进行了优化，以增强和延长CAR表达。2022年，Myeloid与LNPs领域的创新者Acuitas达成协议，以开发用于癌症患者的新型体内CAR疗法。在小鼠中最初的临床前概念验证研究使用LNP-mRNA格式递送靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）、肿瘤相关钙信号转导子2（TACSTD2；也称为TROP2）和糖蛋白75（GP75）的CARs。在小鼠肺异种移植模型中，静脉内给予TROP2 CAR mRNA-LNP导致肿瘤生长抑制。与荷瘤小鼠类似，在食蟹猴中，TROP2 CAR mRNA-LNPs主要被髓系细胞内化。 针对GPC3 CAR mRNA-LNP候选产品产生了类似的临床前数据集。体外转染人和食蟹猴全血细胞导致LNPs被髓系细胞有效摄取，GPC3 CAR在高达30%的单核细胞中选择性表达。此外，在食蟹猴中输注后观察到GPC3 CAR的剂量依赖性表达。最后，在小鼠模型中的抗肿瘤活性与细胞因子增加相关，这是CAR与肿瘤细胞上GPC3结合的指标。总的来说，这些发现表明，髓系细胞可以在体内被CAR mRNA-LNPs直接工程化，以消除肿瘤细胞并协调适应性免疫反应。 已有两个候选产品进入I期试验：MT-302，一种靶向TROP2+上皮恶性肿瘤的体内CAR，正在评估其安全性和初步疗效（NCT05969041），患者给药于2023年9月12日启动；以及MT-303，一种靶向过表达GPC3的原发性或转移性肝细胞癌的体内CAR，于2024年7月31日在I期研究（NCT06478693）中开始给药。在TROP2+肿瘤中，T-302导致在外周血和TME中均有CAR表达。在GPC3+肝细胞癌中，MT-303已显示出抗肿瘤活性，包括在经多线治疗的患者中病灶减少。在两个项目中，在当前剂量水平下耐受性仍然可接受，未观察到剂量限制性毒性，且CRS可控。这些发现证明了作用机制，并支持进一步的剂量递增和扩展到联合研究。最近，Myeloid Therapeutics将临床前概念验证扩展到针对HER2的CARs，也适用于实体瘤。 为了有效协同T细胞，Capstan Therapeutics开发了配体修饰的LNP颗粒（CellSeeker技术）以支持其体内CAR产品线。这种体内CAR平台包含以优化的线性mRNA格式的有效载荷，由靶向LNPs（tLNPs）递送，具有基于抗体的结合物，旨在选择性工程化免疫细胞亚群。与用于mRNA疫苗的LNPs相比，这些tLNPs含有高度可生物降解、反应原性较低的可离子化脂质，适合重复静脉输注。该平台设计得益于mRNA药物领域的重大进展，通过使用修饰核苷酸（如N1-甲基假尿苷）、纳米药物（通过可离子化脂质的出现）以及能够实现强效免疫细胞功能的CAR设计。基础科学包括在心脏纤维化模型中，使用抗CD5抗体修饰的tLNP-mRNA格式，原位生成抗成纤维细胞活化蛋白（FAP）CAR-T细胞，减少FAP+成纤维细胞和改善器官功能。随后是平台和有效载荷的优化，产生了适合开发的制剂，以及一种抗CD19 CAR的抗CD8抗体-LNP-mRNA格式，最近被指定为领先的临床开发候选药物。 与其他不依赖整合载体的体内CAR技术类似，由于其瞬时的、自我限制的CAR表达，mRNA工程方法可能避免加剧或延长靶向毒性、由病毒组分引起的免疫原性以及遗传毒性，这些都可能影响患者可及性。此外，由于靶向抗体结合剂的使用，这种类型的技术能够优先工程免疫细胞亚群，而不选择其他细胞类型，如 B 细胞或 CAR 靶细胞，其可能对结果有不利贡献。去风险的 tLNP 免疫原性和反应原性至关重要，尤其是在与更高疗效条相关的疾病适应症中，需要长期重复输注。最后，mRNA序列优化是增强 CAR 活性的关键，强调了线性 mRNA 作为有效载荷类型的尚未开发的潜力。 Capstan的抗CD19 CAR领先候选产品的非临床证据包括对来自健康或患病个体的人T细胞进行相对高效的体外工程化。在人源化小鼠模型中的概念验证显示了快速的体内工程化以及人CD8+ T细胞对抗原发性或恶性B细胞的深刻活性。一种抗CD20 CAR的抗CD8-LNP-mRNA格式（一种适用于NHPs的替代产品）在淋巴组织和骨髓中显示出深刻的B细胞清除，包括记忆B细胞，随后主要是幼稚B细胞的重新填充，类似于传统CAR T细胞实现的免疫重置。仅需相隔3天的两次输注的紧凑治疗周期就足以实现淋巴器官中的B细胞清除。这一结果支持了该领先产品在自身免疫中的临床开发，以及其他体内CAR产品和针对更广泛适应症（包括遗传性疾病）的新治疗概念，前提是在早期临床试验中证明安全性和活性。一项首次人体试验（NCT06917742）于今年启动。Capstan打算开发更广泛的体内CAR产品组合，适用于自身免疫性疾病，以及其他类别的适应症（基于诸如用于浆细胞疾病的BCMA和用于再生医学、自身免疫和肿瘤学应用的活化成纤维细胞等靶点）。最近，艾伯维宣布收购Capstan therapeutics，强调了这一快速发展的领域的广泛兴趣。 另外两个组织也刚刚启动了其体内CAR疗法的临床测试，同样使用tLNP-RNA格式。Immorna Biotherapeutics开始评估其装载抗CD19 CAR的tLNP制剂在非霍奇金淋巴瘤患者中的I期试验。该候选产品（JCXH-213）旨在共同重编程T细胞、NK细胞和巨噬细胞，以增强药理效应。深圳MagicRNA也将其装载抗CD19 CAR（HM2301）的CD8-tLNP推进到临床。他们的Enc-LNP平台包括专有的抗体片段和可离子化脂质，以选择性工程化体内的免疫细胞。临床前证据显示，替代抗CD19 CAR在人CD8转基因狼疮性肾炎模型中的活性，以及在用替代抗CD20 CAR给药的NHPs中指示免疫重置的数据。这项由企业参与的研究者发起的研究正在评估HM2301在复发性和难治性系统性红斑狼疮患者中的安全性和有效性以及更广泛的平台可行性，显示了体内工程化抗CD19 CD8+ T细胞的首次证据，并伴有B细胞清除的证据、与靶向活性相关的细胞因子产生以及通过患者自身抗体滴度降低表现的临床相关生物标志物活性。 临床前研究中的基于RNA的平台 Orna Therapeutics开发的非病毒平台的独特之处在于其使用配制有免疫嗜性脂质的LNPs，这些脂质优先靶向免疫细胞，而不需要肽配体或任何其他类型的靶向部分，从化学、制造和控制（CMC）、监管和成本角度来看，可能具有相当大的优势。在免疫细胞中，使用下一代环状RNA瞬时表达CARs（panCAR）可利用LNP设计和环状RNA工程在患者免疫细胞中实现精确、瞬时的CAR表达。Orna平台使用跨物种反应的CAR设计，能够在临床前毒理学研究之前在啮齿动物和NHP研究中验证疗效。在2019年成立时，基于其基础的MIT技术，Orna专注于使用环状RNA平台内的组织特异性内部核糖体进入位点进行免疫细胞工程。随后，在ReNAgade证明了对NHP免疫细胞（包括>50%的T细胞工程化）的递送后，于2024年从ReNAgade收购了一个领先的非病毒递送平台。 使用环状RNA格式的抗CD20和抗CD19 CARs，该小组已在单次剂量给药后，在体外、啮齿动物和NHP模型中证明了强大的B细胞清除。抗CD20 CAR制剂在人源化小鼠模型中显示出显著的B细胞清除，表现为24小时内外周血、脾脏和骨髓中B细胞减少75-80%。这种效应在外周血和骨髓中持续到给药后7天。最后，该制剂在NHP中单次给药后显示血液中B细胞减少95%，并持续清除（82%）7天。第一个临床项目将在多种适应症的自身免疫性疾病中使用环状RNA格式的抗CD19 CAR。一个用于多发性骨髓瘤的BCMA项目将在首例抗CD19 CAR患者给药后不久启动。 环状RNA的概念也正在由其他目前处于临床前开发阶段的公司追求——例如最初专注于疫苗的Orbital Therapeutics——计划推出一种装载针对B细胞谱系抗原的CAR有效载荷的tLNP制剂。此外，Sall Biomedicines 、Strand Therapeutics和RiboX Therapeutics在体外或小鼠模型中的临床前证据都强调了人们对环状RNA平台的巨大兴趣，将其作为进一步优化由增强或延长的CAR有效载荷表达所带来的潜在疗效优势的手段，并通过颗粒功能化从而增强该方法的选择性和性能。 赛诺菲也在开发一个基于tLNP的平台，与Capstan Therapeutics、MagicRNA和Immorna追求的概念类似。其与用于疫苗的典型mRNA-LNP制剂不同，因为它旨在实现选择性T细胞工程化和控制CAR T细胞暴露。通过将修饰的mRNA封装在LNP内部，并在表面添加基于抗体的结合物以靶向CD8+细胞来实现细胞特异性CAR表达。该制剂中使用的专有可离子化脂质是广泛筛选的结果，旨在提高在T细胞中的耐受性、稳定性和活性。这是通过改变脂质分子的头部和尾部基团来实现的。LNP性能在很大程度上取决于可离子化脂质的结构，包括疏水链长度、支化、结构异构化和不饱和度，对这些特征的系统性修改导致T细胞转染效率比使用未优化脂质配制的LNPs提高了3到4倍。 临床前活性突出了tLNP系统的模块性和灵活性，支持其针对多种靶点和疾病的潜在效用。T细胞的转染是通过LNP表面的抗体片段实现的，这些片段促进了靶向纳米颗粒的相互作用和摄取。使用模型LNP制剂已经筛选了多种Fab和纳米抗体结合物。抗 CD3 的抗体片段能够快速摄取和有效负载表达，但导致非特异性活化，从而降低耐受性。用针对CD8的片段靶向LNPs导致快速的有效载荷表达（CAR或荧光蛋白），而没有非特异性激活和细胞因子表达，结合了经过功能筛选的脂质和T细胞结合物的LNPs能够在人T细胞中实现稳健的CAR表达。CAR表达仅限于CD8+细胞，包括T细胞和NK细胞亚群，且CAR表达细胞对靶细胞系具有活性。在体外和人源化小鼠模型中都证明了细胞转染，在该模型中，该平台还展示了控制肿瘤细胞生长的能力，无论是在全身还是在脾脏中。最近，在用单次或多次剂量含有CD19 CAR mRNA的CD8-tLNPs输注的恒河猴中产生了抗CD19 CAR工程化和药理效应的证据。在血液（相对于基线>95%）和骨髓（相对于对照动物90%）中记录了快速的B细胞清除，B细胞在骨髓中第29天和血液中第50天恢复到输注前水平。启动临床开发的计划尚未披露。 尽管如上所述，Myeloid Therapeutics进入了临床开发，但其他公司也认可体外或体内重编程髓系细胞的前景。Carisma Therapeutics开发了人CAR巨噬细胞和单核细胞（CAR-M），证明CARs可以将巨噬细胞效应功能重新定向以对抗肿瘤相关抗原。Pierini等人证明，CAR-M重塑实体瘤TME，招募T细胞，驱动表位扩散，并使实体瘤对检查点抑制敏感。随后，CAR-M的概念通过直接将CARs引入CD14+经典单核细胞而得到扩展，这些单核细胞在原位分化为CAR-M，同时实现增强的迁移和持久性。第一个CAR-M是CT-0508（自体，抗HER2），在14名晚期/转移性HER2过表达实体瘤患者中进行了评估，未使用清淋化疗，并证明了可行性、安全性、TME重塑和可诱导适应性免疫。基于循环肿瘤DNA的深度但短暂的减少，在HER2+实体瘤患者中证明了抗肿瘤活性。体外CAR-M方法的一个关键限制在于最大潜在剂量；单核细胞和巨噬细胞是终末分化的，不扩增，从而直接限制了单采输出的剂量。此外，异基因CAR-M方法在肿瘤学背景下的效用有限，因为MHC不匹配限制了抗原呈递。因此，直接向髓系细胞体内递送CARs是一个有吸引力的替代方案，符合前面讨论的潜在优势。2022年，Carisma Therapeutics和Moderna启动合作，开发使用mRNA-LNP技术的体内CAR-M。该平台是使用一种在体内具有强大转染髓系细胞能力的LNP和一种包含针对髓系细胞抗肿瘤活性优化的结构和信号结构域的新型CAR开发的。体外数据表明，CAR表达持续>7天，并诱导抗原依赖性细胞死亡、细胞因子释放、连续杀伤（依次杀死多个靶细胞的能力）以及在抗原刺激后将巨噬细胞极化为炎症表型。在体内，在人源化小鼠中植入了转移性实体瘤的HER2和GPC3阳性肿瘤模型中，全身给予mRNA-LNP均导致强大的抗肿瘤活性。在静脉内mRNA-LNP给药后，髓系细胞是主要的CAR表达免疫细胞。Carisma和Moderna宣布，在2024年提名了一个抗GPC3体内CAR-M开发候选药物，用于在肝细胞癌中进行进一步的临床开发。同时，这些公司继续开发针对其他未披露肿瘤靶点的体内CAR-M，并在2024年扩大了合作，包括两个自身免疫性疾病靶点。Carisma和Moderna此后终止了抗HER2项目，但继续开发靶向GPC3的CAR-M。 其他公司也在探索适用于体内CAR产品的tLNP设计和制造工艺的改进，例如由Acuitas Therapeutics、Mote Therapeutics、Nitto Denko Corporation、Aera Therapeutics和Grit Biotechnology。一个特别的兴趣是非病毒、全RNA有效载荷方法，用于在体内将CAR构建体基因永久插入T细胞的特定基因座。由Tessera Therapeutics开创的这种替代性敲入技术，避免了病毒载体的使用，可能因RNA写入（RNA writing）的出现而大大促进，与LNP平台高度兼容。得到NHP证据支持的临床前小鼠建模，为CD19、CD20和BCMA导向的CARs使用这种CAR敲入方法产生了概念验证。其他组织（如Stylus Medicine 和Integra Therapeutics）也在探索类似的路径，作为基于LV的体内CAR平台的替代方案，以寻求实现永久但更可控的CAR有效载荷整合和表达谱。最后，为了达到这个目的，NanoCell正在开发一种混合有效载荷方法，包括DNA格式的CAR和作为mRNA递送的转座酶。 临床开发中的体内CAR-T细胞 随着该领域进入临床阶段，首先是工程化慢病毒载体和髓系细胞嗜性LNP-mRNA制剂在恶性疾病中进行探索，临床病例研究显示出良好的安全性、耐受性以及生物学反应或临床疗效。这些首次人体试验要么是研究者发起并有企业参与的研究，要么是公司赞助的试验，并在全球范围内进行，包括中国、美国、澳大利亚和欧盟，说明了这个新兴生态系统的全球性。在T细胞靶向慢病毒格式中，抗BCMA和抗CD19 CARs分别在于多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤获得客观缓解。最近，有报道四名多发性骨髓瘤患者接受体内慢病毒抗BCMA CAR治疗后出现深度客观缓解；一名患者在第28天显示严格意义的完全缓解（sCR），另一名在第28天显示骨髓中微小残留病变（MRD）清除，强调了在癌症中实现快速和深刻缓解的可能性，前提是CAR暴露足够高。CRS特征呈现双相性，第一个峰值在数小时内出现，可能由对T细胞活化病毒粒子的急性输注反应加上CAR+效应细胞介导的活性共同介导，第二个峰值是病毒CAR的典型特征，可能由治疗后约7-14天新分化的效应细胞介导。尽管该领域仍处于起步阶段，但CAR-T细胞扩增的幅度和速度以及随后在治疗后数周内可测量的临床反应表明，在短暂的CAR暴露期间即可获得具有临床意义的结果。这对于设计上具有瞬时CAR表达的产品也可能适用，此时CAR暴露可以通过重复输注或调整剂量来校准。尽管包含针对实体瘤靶点（TROP2和GPC3）的CAR构建体的髓系细胞嗜性LNP-RNA制剂的新兴数据支持这一观察结果，但仍需要额外的证据。 尽管所有这些试验都仔细监测了安全性特征，但由于这些平台技术的新颖性以及来自具有独特且可能协同毒性的整合组分的风险，目前尚未报告严重不良事件或剂量限制性毒性。除了低起始剂量的缓慢剂量递增外，这些研究可能包括监测（sentinel）患者、院内治疗和输注后随访、队列间延长的观察间隔、严格的停止规则和剂量限制性毒性的定义，以及与输注反应、可能的靶向毒性和产品免疫原性相关的广泛安全性生物标志物评估。这些努力也旨在支持后续试验的剂量方案选择。基于处于临床前阶段的公司数量以及该领域不断扩大的兴趣，预计进入临床开发的公司数量将继续迅速增加，超过30家，在过去两年中实现了惊人的两位数扩张（表1和表2）。 体内免疫工程：关键挑战 随着首批体内CAR疗法进入临床评估（表1和表2以及图4），几个关键风险和未解答的问题仍然存在（BOX 3）。为了解决这些问题，早期试验正在纳入广泛的安全性和药理学反应生物标志物以指导进一步开发。最值得注意的是，在安全性方面，这种方法代表了未知领域，结合了各自具有其自身风险特征的不同技术。 技术风险和当前局限性 为了预测与体内CAR治疗相关的风险，NHP建模可能具有高度信息量。此外，医生们对商业CAR-T细胞产品的经验越来越丰富；然而对于使用慢病毒载体和LNP-RNA产品进行直接体内CAR-T细胞治疗的临床经验非常有限。因此，在早期临床开发中部署基于风险的监测方法至关重要，要考虑平台技术（基于病毒或LNP-RNA）的具体情况以及已经在临床上使用传统CAR-T细胞产品的经验。 由于有效载荷的整合性质，基于慢病毒的CAR产品存在固有的挑战，主要源于在CAR激活、扩增和持久性方面可实现的有限控制。CAR-T细胞扩增的自我调节与靶细胞负荷成比例，可以增强治疗效果。然而，不受控制的药理反应（由倾向性因素放大）可能引发严重的炎症性不良事件，如CRS、ICANS和IEC-HS，需要积极的管理和住院治疗。一个关键的挑战在于，这类不良事件可能在治疗后延迟一段时间发生，因此难以预测，从而需要对患者进行长期监测。目前使用传统体外工程化CAR-T细胞在自身免疫性疾病中的努力应继续提供丰富信息：尽管由于正在阐明的原因，炎症性不良事件的患病率和严重程度似乎低于肿瘤学环境，但最近报道了在CAR-T细胞输注后数月出现的持久的CAR-T细胞持久性甚至再扩增，并伴有严重毒性，如高级别IEC-HS。最近，在接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者中描述了一种新的毒性：局部免疫效应细胞相关毒性综合征（LICATS）。然而这似乎是疾病突然发作，或者是旁观者CAR介导的活性短暂影响参与自身免疫过程的器官；30%的治疗患者使用低剂量皮质类固醇管理，8%需要住院治疗。一半的治疗患者在治疗后至少2周出现LICATS，再次强调了长期监测接受病毒工程化CAR-T细胞治疗的自身免疫性疾病患者的重要性。最后，CAR-T细胞的长期持久性可能导致延长的靶向毒性，表现为B细胞再生障碍和低丙种球蛋白血症（在靶向B细胞谱系的情况下需要预防感染）或帕金森综合征，这在体外抗BCMA CAR-T细胞产品中已有报道。除了长期监测外，为了增强依赖于基因组有效载荷整合的体内CARs的安全性特征和可控性，可能还需要整合确保CAR表达时空控制的特征，例如细胞谱系特异性启动子和杀伤开关。 与逆转录病毒载体相关的一个特别值得注意的方面是由于基因组整合相对随机性而导致的插入性肿瘤。最近的一些报告显示，接受传统病毒工程化CAR-T细胞疗法治疗的患者出现了CAR+继发性T细胞恶性肿瘤。然而，在CAR插入与肿瘤发展之间建立直接的因果关系具有挑战性，原因在于病例数量少、该患者群体的潜在癌症易感性以及转化分化T细胞的固有困难。显然，还需要对此事进行额外调查——特别是阐明CAR载体插入的相对贡献以及诸如基因座整合和与癌基因相互作用等辅助因子的身份。有行业监管指南可用于指导产品开发者关于人类基因产品给药后的长期监测，尽管这些指南可能需要进一步调整以促进基于逆转录病毒的体内CAR疗法的发展。 反过来说，依赖于LNP制剂的基于RNA的CARs可能存在由该技术三个主要组分相互作用而引起的安全风险：纳米制剂可能介导输注反应或急性期反应；具有固有先天免疫激活效应的RNA有效载荷；可能导致炎症性不良事件或不受控制的靶向药理学的具有深刻免疫药理活性的CAR构建体。由于基于RNA模板的CAR表达的瞬时性，特别是在T细胞快速分裂的情况下，可能需要重复给药或其他优化，以在关键时间间隔内实现足够的CAR暴露，这是临床有效性所必需的。这也提出了几个关键挑战，包括对肝脏去靶向以预防由于此类制剂固有的肝脏嗜性而导致的器官特异性毒性。其次，重复给予抗体-tLNPs或非靶向LNPs可能导致针对LNP组分、靶向部分和/或表达的有效载荷的抗体和T细胞反应的诱导。这些原则上可能限制这些疗法的有效性，但也可能引发免疫介导的不良事件，包括I型、III型和IV型超敏反应。 总之，这些潜在的局限性，加上缺乏体内LNP-RNA格式CARs的临床经验，强调了在包括NHPs在内的多样化临床前环境中以多种方式降低此类技术风险的重要性。先前批准的RNA纳米药物（如ONPATTRO）可能为开发体内LNP-RNA CAR产品提供关键的路线图构建模块，但它们需要与CAR治疗相关的考虑因素整合到未来的指南中。同时，在早期临床开发期间对所有潜在毒性进行全面、基于风险的监测，对于成功将这种治疗模式转化到临床仍然至关重要。这需要包括产品免疫原性、急性期反应、器官（肝脏）毒性和靶向炎症或其他类别的不良事件。尚待观察的是，包含瞬时表达有效载荷的体内CAR技术是否可能避免在病毒CARs中看到的相对延迟或慢性的靶向或off-target毒性，例如LICATS、与继发性CAR-T细胞扩增相关的IEC-HS、运动障碍、延迟性血细胞减少或长期B细胞再生障碍。 基于其主要目标产品特征，下文为主要类别的体内CAR疗法提出了一个产品开发路线图和潜在的初始适用性（图4和图5）。还提供了关于体内编程免疫系统概念的长期视角，其潜力可能超越传统治疗模式的能力。 产品开发策略 大多数申办者优先考虑经过充分验证的靶点（CD19、CD20、BCMA、CD22、TROP2、GPC3）来指导其平台技术的优化，从而实现临床转化和商业产品的开发。总体目标是扩大CAR疗法的临床适用性，通过取代或超越可扩展性较差的体外工程化细胞基产品或性能不足的生物制剂。第一波人体体内CAR试验，除了安全性和临床活性证据外，还将为后续的概念验证和注册试验提供剂量方案选择（图6）。这些在B细胞恶性肿瘤和涉及B细胞的自身免疫性疾病中的初始试验将调查风险，包括输注反应、产品免疫原性、急性、亚急性和慢性靶向毒性以及遗传毒性。因此，全面的转化分析对于建立充分的安全性监测和管理计划、为II期试验前的优化提供信息以及为注册试验选择适当的剂量方案至关重要。 在血液肿瘤中，由于将免疫疗法推进到更早期治疗线的强烈理由以及MRD检测的出现，一个主要机会将是在一线环境中治疗旨在治愈的高危患者。在自身免疫中，一个关键目标将是推进可扩展的疗法，以提供“免疫重置”，包括深度免疫细胞谱系清除和正常免疫细胞库的快速重新填充，两者都能导致持久的、无需药物的缓解，且没有任何组织或基因组后遗症。在再生医学、纤维化和衰老中，一个主要机会是通过体内CAR工程化免疫细胞导致组织中致病性细胞的清除，从而消除致病性细胞并恢复正常功能组织结构。基于预测的病毒和mRNA基体内CAR-T细胞治疗模式的目标产品特征，设想了不同的商业切入点，但用CAR mRNA工程化巨噬细胞靶向实体瘤可能代表一个例外（图5）。基于深度反向平移的迭代产品和平台优化可能会改善产品性能和目标产品特征，从而使所有这些平台具有更广泛的临床适用性。 迈向体内重编程免疫系统 由第一波体内CAR-T细胞产品实现的这些治疗平台的临床验证，可能为未来重新思考免疫疗法铺平道路。体内免疫工程与其他治疗模式的差异化特征众多，治疗潜力巨大（BOX 4）。例如，在肿瘤学中，可以设想多受体CARs或TCR工程化多种类别的免疫细胞，这些细胞相互协同工作，直接重编程免疫微环境，有效协同利用内源性免疫，调节免疫细胞的转录组和信号通路，以及对抗免疫检查点——所有这些都通过体内工程化实现，如下所述。 在自身免疫、移植排斥管理、过敏和其他免疫性疾病中，体内CAR-T细胞产品可以通过共同部署反调节机制或通过诱导操作耐受性，以各种方式重置或调节免疫系统，从而实现非常持久的无需药物的缓解。其他有前景的方向包括扩展CAR有效载荷设计以靶向更广泛的分子阵列，选择性将CARs导向抗原特异性致病细胞，或使用双靶向CAR构建体以在某些情况下扩大活性并增强临床安全性和疗效。在抗体引导的LNP介导的体内T细胞工程化首次演示十年后，目前的努力继续专注于改进向定义的免疫细胞亚群的精确递送，使用高选择性抗体片段和新兴类别的结合物，如纳米抗体。 包括可植入设备在内的新型平台可能极大地促进这种整体免疫系统工程方法。类似于可注射剂，可植入设备是体内遗传操纵患者T细胞的有前景的新技术。例如，生物材料植入物可以在原位招募宿主T细胞，用肿瘤特异性受体对其进行基因装备，并迅速扩增和分散这些细胞到肿瘤环境中。该设备是一个功能化的多孔胶原支架，带有强效的T细胞趋化因子、一个编码CAR的慢病毒载体和刺激性的抗CD3/CD28抗体。在乳腺癌小鼠模型中，植入物迅速聚集并编程癌症特异性宿主淋巴细胞，并驱动长期的肿瘤消退。这种局部植入技术的一个潜在优势是它大大减少了所需的载体剂量，节省了成本并最小化了全身毒性风险。这些设备可以在原发性减瘤手术期间或之后放置在实体瘤附近，或者战略性地放置在淋巴结附近，以促进原位编程的CAR-T细胞在整个体内的快速传播。此外，这些“现成的”支架可以与任何当前FDA批准的CAR-T细胞疗法使用的相同慢病毒载体一起工作。 市场上有六种用于体内基因治疗的药物产品，腺相关病毒（AAV）载体可能成为体内递送的多功能首选载体。由于AAVs的固有局限性，如免疫原性、附加体位置以及因此在增殖细胞中的瞬时活性，目前使用AAV载体生成CAR-T细胞非常有限。然而，将基于AAV的CAR递送与核酸酶介导的基因组靶向相结合，实现了稳定的CAR整合。另一个潜在的组合是与最近描述的基于衣壳设计策略（如慢病毒包膜的工程化）的T细胞靶向AAVs相结合，可能很快产生一种用于体内瞬时或永久精确工程化CAR-T细胞的替代载体系统。优化可能包括识别靶受体组合的具有逻辑“AND”门控的双特异性AAVs。直接重编程T细胞的另一种方法是HSC工程化，通过使用基于辅助依赖性腺病毒的病毒样颗粒，携带Sleeping Beauty（睡美人）整合有效载荷以及CAR构建体，来生成CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-M。 避免使用病毒载体的替代敲入技术也可能促成下一代体内CAR-T细胞疗法。RNA基因写入（RNA gene writing）的出现为开发具有增加CAR基因插入控制的整合有效载荷技术提供了巨大机会；并且来自体外和小鼠模型的晚期突破性临床前数据为这种格式的CD19、CD20和BCMA导向的CARs产生了概念验证，其通过tLNPs作为全RNA有效载荷递送。 进一步优化安全性和有效性特征的新技术对于实现此类体内工程平台的临床转化至关重要，尤其是在具有高安全性和疗效标准的疾病适应症中。学术研究继续推动这一领域，有几个额外的概念可能极大地促成下一代产品设计。关于避免毒性和增强靶向选择性，主要方向包括有效载荷表达的时空控制和组合抗原识别。其他途径包括利用组织和细胞系特异性启动子进行基因组整合技术，在基于 RNA 的 CAR 和其他有效载荷的情况下，利用组织特异性 microRNA 结合位点限制肝脏或其他器官的非预期翻译。具有增强生物活性的有效载荷保证了更好的性能和组织或细胞选择性纳米药物，通过条形码增强的高通量筛选和人工智能指导的设计促进。另一种增强 LNPs 作为体内 CAR 治疗载体的安全性的方法是共同配制免疫调节因子，如短发夹RNA，以敲低 IL-6 或其他促炎分子的产生。随着有效载荷多样化以包括基因编辑系统，高度特异性的组织和细胞递送载体变得更加关键。同时，人们不断关注探索不同的配方和有效载荷化学、功能化和制造优化。为了满足疾病适应症（如实体瘤）提供的更高疗效标准，正在考虑有效载荷的多样化，包括用于免疫细胞装甲的生物反应调节剂、选择额外效应机制的免疫细胞衔接器和免疫检查点调节剂。 展望 使用质粒 DNA 形式的简单抗原进行的基于基因的体内免疫的首次评估后35年、首次静脉输注用于临床治疗的逆转录病毒载体后25年和首个 CAR-T 细胞产品获批后8年，可以期待未来包括免疫系统精确和复杂的体内编程。这些技术 (图6) 目前已经进入临床阶段，最终将提供有效载荷表达的时空控制和可调谐性，并容纳相互协作的不同机制。因此，它们将超越当前治疗方式的能力，导致在更广泛的疾病中增强临床性能。更具体地说，从体外到体内 CAR-T 细胞治疗的概念转变重新定义了免疫疗法的可扩展性和可及性，并通过大幅降低商品成本来促进，具有深刻的社会经济影响，导致挽救生命的疗法实现大众化。 参考文献 Bot, A., Scharenberg, A., Friedman, K. et al. In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy. Nat Rev Drug Discov (2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01291-5