CT-0525

▲体内CAR疗法-全球研究与发展格局（2025）免费领取！  理论篇| 靶向实体瘤的CAR-M巨噬细胞药物开发 CAR结构设计|靶向实体瘤的CAR-M巨噬细胞药物开发 本文是我们推出的靶向实体瘤的CAR-M药物开发系列的第三篇文章，本来两周前稿子已完成，准备在理论篇发布后的次日推送本文—工艺篇。然而，发生了一件令人极其沮丧的事情：写好的稿子存在公众号草稿箱里，被我手贱一键删除了，近万字的长文，瞬间一个字也找不到了，心情顿时跌入谷底。总不能，就这样子算了吧，硬着头皮，重新开始查找资料重新码字，并且，将重点放到CAR-M制备工艺上面来。一点点写，终于在今天完稿了。相信大家看完以后，对于体外CAR-M和体内CAR-M的工艺路线差异会有一个较为清晰的认知。希望朋友多点赞支持，这篇实在是写的艰难了。 目前，CAR-M 药物可分为：离体 CAR-M(Ex vivo)和体内 CAR-M(In vivo)。起初，不管是 Carisma，还是国内的鲲石、元迈等公司都在全力开发离体 CAR-M 药物，然而，随着 mRNA-LNP 技术成功商业化，In vivo CAR-T 的风潮袭来，Carisma 竟终止离体 CAR-M 药物的独立开发，选择与 Moderna 合作，All in 体内 CAR-M 药物。实际上，Carisma 首个离体 CAR-M 药物 CT-0508 项目的临床 1 期数据非常好。Carisma 骤然改变工艺路线，放弃已有的成果，除了面临巨大的资金压力，得靠 Moderna 回血以外，实在是近一年多以来，In vivo CAR-T 太火了。体外 CAR-M 药物在制备过程中，工艺繁琐，涉及白细胞单采、巨噬细胞分化、病毒载体生产、病毒转导等多个环节，更重要的是，巨噬细胞在体外的增殖能力极其有限，很难进行大规模培养，反观体内 CAR-M 的制备工艺，尤其是采用 mRNA-LNP 作为技术路线时，工艺变得极其简单，还易于大规模制备，方便储存。In vivo 好处很多，但是，要想实现，首当其冲要解决的一个难题是：如何把编码 CAR 的基因精确并且高效地递送至体内的巨噬细胞？这种递送挑战可以说是地狱级别的。一旦解决了，体内 CAR-T/M/NK 便会遍地开花，mRNA 技术也会迎来梅开二度，再度爆火。 本期内容，我们想跟大家分享一下离体和体内 CAR-M 药物的制备工艺。 1 离体 CAR-M 药物工艺（Ex vivo） 2024 年 12 月，鲲石生物研发团队在 STAR Protocol 发表文章：Protocol for generating of human CAR-engineered macrophages by Vpx-containing lentivirus，他们将基于病毒载体生产离体 CAR-M 的工艺路线划分为 4 个部分：构建病毒质粒载体，病毒生产，巨噬细胞制备，病毒转导。在体外将外源 CAR 基因（质粒或者 mRNA）导入靶细胞的递送工具主要有慢病毒载体、腺病毒载体及其他的非病毒载体（例如，LNP 或者电转等）。根据巨噬细胞来源，离体 CAR-M 药物可分为源自 PBMC-CAR-Mac 和源自 IPSC-CAR-Mac。从患者自身的 PBMCs 中采集单核细胞，使其在体外分化为巨噬细胞，然后，通过递送载体导入外源 CAR 基因，则可制备 CAR-Macrophage；如果将表达 CAR 的单核细胞回输至体内再分化为巨噬细胞，则可制备 CAR-Monocytes。将患者自身细胞重编程为诱导多潜能干细胞，并且导入外源 CAR 基因，再让其在体外分化为巨噬细胞，则可制备 IPSC-CAR-Mac。离体 CAR-M 药物虽说工艺繁琐，但是，能够严格保证 CAR-M 药物的质量和均一性，此外，还易于利用基因编辑技术对巨噬细胞基因组进行改造，制备 Edited CAR-Mac。 1.1 慢病毒载体 慢病毒载体是基于逆转录病毒科慢病毒属里面的病毒进行改造的，最常见来源有 HIV-1，HIV-2，SIV（猴免疫缺陷病毒）等。慢病毒基因组为两条相同的单链正链 RNA，一经感染宿主细胞，便利用反转录酶将其 RNA 转录成 cDNA，让后将其 DNA 整合至宿主基因组上，并可长期表达病毒基因，因此，研究人员通过拆分慢病毒基因组，使其作为基因递送工具，实现外源靶基因在宿主细胞的稳定持久表达。 慢病毒基因组最为显著的特征是在 5’/3’末端拥有 LTR（长末端重复序列），含有基因表达、逆转录和整合到宿主基因组所需要的元件。慢病毒基因组编码的蛋白可分为 3 类：第一，所有的慢病毒均表达的 3 种主要病毒蛋白—gag/pol/env；第二，2 种病毒调控蛋白—tat/rev；第三，其他辅助病毒蛋白—vif/vpr/nef 等。gag 编码核心结构蛋白，pol 编码逆转录酶和整合酶，env 编码包膜蛋白。不同的慢病毒，含有不同的辅助蛋白，例如，Vpx 存在于 HIV-2/SIV，但在 HIV-1 中不存在 Vpx。 慢病毒载体的包装系统经历了三次升级。第一代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统包括以下部分：(1)一个含有Ψ（RNA 包装信号）的转移质粒，携带靶基因，也称为靶基因表达质粒;（2）一个包装质粒，除 gag 和 pol 外，还包含有辅助基因及调节基因；（3）一个包膜质粒。在包膜质粒中，用异源病毒的糖蛋白基因 VSV-G 替换 HIV-1 env 基因，这一过程称为假型（pseudotyping），目的是提高慢病毒感染的宿主范围，因为 HIV-1 的 env 蛋白只能结合表达 CD4+受体的宿主细细胞。需要注意的是，包装质粒 DNA 的序列中缺乏Ψ，使得转录的病毒 RNA 不会被包封到病毒颗粒中，因此，最终产生的是一个没有复制能力的病毒。 在第二代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统中，将有助于致病的辅助基因 vif/vpr/vpu/nef 从包装质粒序列中删除，使得 HIV-1 病毒基因数量从 9 个减少至 4 个。即使发生多个重组事件，形成具备复制能力的逆转录病毒的机会也大大减少，慢病毒载体的安全性得到提升。 在第三代 HIV-1 衍生的慢病毒载体质粒系统中，修改天然的 5'LTR 序列，引入异源启动子，使得慢病毒的转录不再需要 tat，从而将 tat 从包装质粒序列中删除。然后，将剩余的 HIV-1 包装质粒拆分为两个包装质粒，一个含有 gag 和 pol，另外一个含有 rev。这些改造主要是为了减少转移质粒和包装质粒之间的重组概率，降低产生复制能力的逆转录病毒的风险。 HIV-1 慢病毒载体在神经细胞、肝细胞、脑细胞和其他组织细胞中表现出很高的转导效率，然而，它们感染人类原代髓系细胞的能力极差。在 HIV-1 病毒早期感染阶段，人单核-巨噬细胞中的限制因子 SAMHD1 会水解 dNTP，耗竭用于病毒 cDNA 合成的 dNTP 库，从而阻止 HIV-1 感染。与此形成反差的是，HIV-2/SIV 病毒中存在的 Vpx 辅助病毒蛋白会引起 SAMHD1 的降解，从而使得宿主细胞内的 dNTP 浓度恢复至病毒复制所需要的水平，实现成功感染。有趣的是，Vpx 仅存在于 HIV-2/SIV，在 HIV-1 中不存在 Vpx。如果我们让 HIV-1 慢病毒载体中携带 Vpx，是否能够提升其转导巨噬细胞的效率呢？ 鲲石生物尹秀山等人改造基于 HIV-1 的第二代慢病毒载体质粒系统，一方面将 Vpx 结合基序插入到包封质粒 psPAX2 Gag 的 C 端形成 psPAX2-mut 质粒，另外一方面将 Vpx 基因插入到包膜质粒 pMD2G 上形成 pMD2G-Vpx 质粒，以允许 Vpx 与 VSV-g 包膜蛋白共表达。pMD2G-Vpx 和 psPAX2-mut 转染 293T 细胞生成包封有 Vpx 的慢病毒颗粒，其对人巨噬细胞的感染效率可达到 74%，与此相反，常规包膜质粒 pMD2G 和 psPAX2 在 293T 细胞中生产的慢病毒颗粒感染原代人巨噬细胞的效率仅有 3%。此外，在 Vpx-慢病毒感染的原代人巨噬细胞中还发现 SAMHD1 含量发生显著下降[1]。 Michael Klichinsky 等人在第三代慢病毒载体质粒系统（pVSV-G/pRSV-Rev/PMDL-CHP6）中额外添加 pVPX 质粒，与携带 CAR 基因的慢病毒表达质粒，构成 5 质粒包封系统，共转染 293T 细胞，产生携带 Vpx 的慢病毒。Vpx-慢病毒可成功感染 THP-1 细胞，制备 CD3ζ-CAR-M 细胞，靶向 CD19/HER2/MSLN 细胞，表现出抗原特异性的吞噬活性[2]。 1.2 腺病毒载体 腺病毒载体是首个应用于人体的基因递送载体，由腺病毒（adenoviral）改造而成。腺病毒属于无包膜病毒，其病毒衣壳呈典型的二十面体对称结构，由 252 个病毒衣壳粒组成；这些衣壳粒又分为两类，分别是 240 个六邻体（hexons）和 12 个五邻体（pentons）。每个五邻体的末端会延伸出细长的纤突蛋白（fiber protein），该蛋白顶端的球形结构被称为纤突结（fiber knot），而纤突结(fiber knob)的核心功能是与宿主细胞表面的吸附受体相结合。 腺病毒家族目前有 52 个已知血清型，分为 6 个亚群。目前最常用的腺病毒载体为 Ad5，即血清型为 5 的腺病毒，属于 C 亚群。各个血清型纤突结的编码序列存在很大差异，正是这些差异导致不同血清型的腺病毒识别不同的吸附受体。B 组腺病毒(Ad35 等)采用 CD46 作为吸附受体，而其他各种组腺病毒均采用 CAR(coxsackievirus-adenovirus receptors)作为其吸附受体。原代人巨噬细胞表面高表达 CD46，恰好是 B 组腺病毒的吸附受体，因此，将 Ad35 型腺病毒的纤突结插入到 Ad5 腺病毒中，获得一种"改外壳"的腺病毒杂合载体 Ad5F35。Michael Klichinsky 等人使用 Ad5F35 嵌合病毒载体转导原代人巨噬细胞，成功在细胞表面高效表达 CD3ζ-CAR。 腺病毒的基因组为线性双链 DNA，其末端带有 ITR 序列（即长倒置末端序列），紧邻 ITR 序列的是包装信号 Ψ。从功能划分来看，腺病毒基因组主要包含两类基因：一类是病毒 DNA 复制前期表达的 E1a、E1b、E2a、E2b、E3、E4 基因，它们负责编码病毒调节蛋白；另一类是 DNA 复制后期表达的 L1～L5 基因，主要编码病毒结构蛋白。 在第一代腺病毒载体中，基因组的 E1/E3 区域被删除，这部分缺失区域成为外源靶基因的插入位点。其中，E1 基因为腺病毒复制所必需，删除 E1 后，腺病毒便无法完成自身复制；而 E3 基因编码的蛋白，主要通过改变抗原呈递、抑制细胞因子及触发凋亡等方式破坏宿主细胞的免疫反应，且该基因并非腺病毒复制的必需条件，因此删除 E3 可减少宿主的免疫反应。与慢病毒相比，腺病毒基因组不会整合到宿主基因组中，其感染宿主细胞后，能快速启动基因表达。 目前广泛应用的腺病毒包装系统主要包括 pAdEasy 系统与 pAdMax 系统。其中，pAdEasy 系统由三部分构成：一是携带外源靶基因的穿梭质粒，二是携带腺病毒基因组的骨架质粒，三是作为宿主的原核细胞（BJ5183）。该系统的包装流程为：先将线性化后的穿梭质粒与环状骨架质粒共同转化至 BJ5183 感受态细胞中，借助同源重组机制，使外源靶基因整合到腺病毒基因组内，从而获得重组腺病毒基因组；最终，将线性化的重组腺病毒基因组质粒转染至 HEK-293 细胞，即可包装得到携带外源基因的重组腺病毒。与依赖同源重组的 pAdEasy 系统不同，pAdMax 系统利用 Cre-loxP 或 FLP-frt 位点特异性重组酶介导重组过程：将穿梭质粒与骨架质粒共转染至 HEK-293 细胞后，通过上述重组酶的作用，两种质粒在细胞内发生特异性重组，进而包装形成重组腺病毒。 除上述两种主流系统外，Michael Klichinsky 等人还采用了第三种腺病毒包装系统。该系统通过酶切连接的方式，直接将外源基因插入腺病毒基因组质粒中，待腺病毒重组质粒线性化后转染至 HEK–293 细胞，最终成功包装出携带 CAR 基因的 Ad5F35 嵌合腺病毒。 1.3 PBMC-CAR-Mac 生产工艺 我们前面提到，基于患者 PBMCs 制备的 CAR-PMac 药物，可分为 CAR-Macrophage 和 CAR-Monocytes，其对应的药物代表分别为 Carisma 开发的 CT0508 和 CT0525。CT0508 是 Carisma 公司利用 Ad5F35 嵌合腺病毒载体制备的一款靶向 HER2 的 离体 CAR-M 药物，也是全球首款进行临床试验的 CAR-M 药物，那它是如何被生产出来的呢？首先，需要从患者外周血中采集白细胞。从外周血中采集白细胞时，需要提前注射非格司亭（粒细胞集落刺激因子），剂量为 10μg/kg/每天，持续注射 4 天，旨在进造血祖细胞迁移至外周血中，提升单核细胞数量。接着，从采集到的白细胞（主要成分为 PBMCs）中分离出 CD14+单核细胞，并且在 GM-CSF(粒细胞-单核细胞集落刺激因子)刺激下，使单核细胞分化为巨噬细胞。最后，使用制备好的携带 CAR 基因的 Ad5F35 腺病毒颗粒转导巨噬细胞，使其细胞表面成功表达 HER2-CAR，便得到最终的 CAR-M 药物。从血液采集到冻存 CAR-M，整个生产工艺周期为 7 天。此外，在旧文康德赛|巨噬细胞的GMP级别生产与mRNA技术改造，我们曾详细介绍过 PBMCs 来源的 GMP 级别巨噬细胞制备所需的设备和工艺流程，感兴趣的朋友可以回顾查阅。CT0525 是对 CT0508 工艺的一种简化升级，不需要在体外将采集到的单核细胞分化为巨噬细胞，而是直接用携带 CAR 基因的 Ad5F35 腺病毒颗粒转导单核细胞，然后，将表达 CAR 的单核细胞回输至病人体内，让其自行在体内分化为 CAR-M 巨噬细胞。 1.4 IPSC-CAR-Mac 生产工艺 诱导多能干细胞（iPSC）是通过对已分化的体细胞进行重编程，使其回到多能状态，从而具备自我更新能力和分化为不同细胞类型的潜力。2020 年，赛元生物张进团队开启利用 iPSC 制备 CAR-iMac 的研究，其制备工艺主要分为以下三大核心步骤[3]： 第一步：健康供体 PBMCs 重编程为 iPSCs 。首先，通过电转将编码重编程因子的游离型质粒导入来自健康供体的 PBMCs 中，启动重编程过程；随后，需逐步更换培养基，从初始的 H3000+CC100 培养基过渡至 E8 培养基（无饲养层 iPSCs 专用培养基），以适应 iPSCs 的生长需求；通常在电转后 15~25 天，可在培养体系中观察到 iPSC 克隆，此时需挑取形态良好的克隆进行后续培养；长期培养过程中，采用 Matrigel Matrix（来源于天然胞外基质成分)作为培养基质，为 iPSCs 提供贴近体内的生长微环境，维持其多能性。 第二步：携带 CAR 基因的慢病毒感染 iPSCs 。首先，将 pMD2G、psPAX2 两种辅助质粒与携带 CAR 基因的穿梭质粒共同转染 HEK-293 细胞，包装出携带 CAR 基因的重组慢病毒；待慢病毒包装完成并测定滴度合格后，使用该慢病毒感染已获得的 iPSCs，使 CAR 基因稳定整合至 iPSCs 基因组中，获得 CAR-iPSCs。 第三步：CAR-iPSCs 分化为巨噬细胞该步骤是将 CAR-iPSCs 定向诱导为功能成熟的巨噬细胞。赛元生物曾公开相关专利《一种用于干细胞分化成巨噬细胞的培养基及方法》，其核心技术是在培养过程中通过依次更换六种专用培养基，模拟巨噬细胞体内发育的微环境信号，逐步引导 CAR-iPSCs 经历诱导中胚层、造血干细胞定向分化、髓系细胞扩增、单核细胞分化等阶段，最终分化为具有靶向杀伤功能的 CAR-iMac（CAR 修饰的诱导多能干细胞来源巨噬细胞）。 1.5 Edited CAR-Mac 生产工艺 旧文，我们介绍的重点在于如何通过 CAR 设计来增强巨噬细胞的抗肿瘤活性，但是，CAR-Mac 回输至病人体内后，在肿瘤微环境中容易转变为抑炎型巨噬细胞，进而失去抗肿瘤功能。此外，CAR-IPSC 在分化为成熟巨噬细胞的过程中，也可能很难保证持续的促炎表型。因此，赛元生物张进团队利用 CRISPA 基因编辑技术对于 IPSC 的代谢通路或者表面受体进行改造，使其可维系长久的促炎活性，增强抗肿瘤活性。目前，张进团队在开发 Edited CAR-Mac 方向上做了两方面的尝试： （1）衣康酸通过烷基化使得 KEAP1 失活，促进 NRF2 的积累和核转位，最终抑制促炎基因的转录，增强抗氧化基因的转录，而 ACOD1 是负责衣康酸产生的唯一酶。张进等人在 CAR-iMac 中发现敲除 ACOD1 基因会降低免疫代谢物衣康酸盐的水平，使 KEAP1 能够阻止 NRF2 进入细胞核以激活抗炎程序，从而实现更持久的促炎状态，增强释放 ROS，提升吞噬活性和细胞毒性[5]。 （2）唾液酸（Sialic acid）是一种带负电荷的 9 碳糖，在肿瘤细胞表面高表达，并且能够将其分泌到 TME。大多数免疫细胞表面表达 Siglecs（唾液酸结合受体），识别结合肿瘤细胞表面的唾液酸后会传递免疫抑制信号。赛元生物张进团队发现 MSLN-CAR-iMac 在分化和成熟过程中，Siglecs 家族成员的基因表达水平显著上升，这些高表达的 Siglecs 成员与肿瘤细胞表面的唾液酸结合后，会抑制 CAR-iMac 的激活和吞噬活性。他们利用基因编辑技术将 CAR-IPSC 细胞中的 Siglec-5 和 Siglec-10 基因双敲除，待其历经 28 天分化为成熟的巨噬细胞 DK-CAR-iMac，发现其 M2 型巨噬细胞比例显著降低，而对肿瘤细胞的吞噬活性和毒性得到显著增强[4]。 1.6 质量控制 在 CAR-M 药物回输患者之前，需对其质量进行严格检测。在 CT0508 的Ⅰ期临床试验中，流式细胞术检测结果显示：CAR-M 细胞的平均活率达 86.39%，平均纯度达 86.78%，CAR 的平均转导效率达 79.28%。为评估 CT0508 的杀伤活性，研究采用了两种对该 CAR-M 药物敏感性不同的肿瘤细胞系。结果表明，CT0508 对过表达 HER2 的人乳腺癌细胞系 AU565 表现出强烈的杀伤活性，而对过表达 HER2 的人卵巢癌细胞系 SKOV3 则表现出较弱的杀伤活性。研究将 CT0508 的吞噬活性定义为表达 GFP 的靶细胞在巨噬细胞中的占比。实验发现，与未表达 CAR 的对照组巨噬细胞相比，CT0508 与 AU565 或 SKOV3 共孵育后，均表现出显著的吞噬活性。 单细胞转录组学（scRNA-seq）分析促炎基因表达水平显示，相较于未表达 CAR 的巨噬细胞，CT0508 呈现出明显的促炎极化特征。此外，与其他非特异性抗原（如 MSLN）刺激相比，在 HER2 抗原刺激下，CT0508 能分泌更高水平的促炎细胞因子和趋化因子。利用可同时检测转录组与细胞表面蛋白的单细胞测序技术 CITE-seq，对 CT0508 及其前体单核细胞进行分析，结果再次证实 CT0508 已彻底分化为促炎型巨噬细胞。 2 体内 CAR-M 药物工艺（In vivo） 2022 年 1 月 7 日，美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的 Jonathan A. Epstein 等人在 Science 上发表文章：CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury ，他们采用 T 细胞靶向性的 CD5-LNP 递送 FAP-CAR-mRNA(靶向成纤维活化蛋白)，将其注射到心力衰竭小鼠模型中，从而在小鼠体内产生瞬时有效的 CAR T 细胞群，使其能够消融病理性激活的成纤维细胞，从而减轻心脏纤维化，修复损伤后的心脏功能。这项研究正式开启了体内 CAR-T 研究的热潮，同时，考虑到体内高丰度的巨噬细胞，也有人开始尝试如何在体内高效生成 CAR-M，利用其抗原特异性的吞噬效应，更好地攻克实体瘤。 2.1 外泌体靶向递送 CAR-mRNA 在小鼠肺癌组织内发现大量浸润的巨噬细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和肺泡巨噬细胞（AM）。基于这一点，中山大学附属第五医院黄曦团队想在小鼠肺部原位生成 MSLN-CAR-M 细胞，以靶向 MSLN 阳性的肺癌细胞，达到抑制肿瘤生长的治疗效果。他们选择将 MSLN-CAR mRNA 递送至肺癌组织内的巨噬细胞中，那么，就必须找到一种高效精确的递送载体。 2018 年，苏黎世联邦理工学院 Ryosuke Kojima 等人开发了一种包封特定 mRNA 的 EXOtic 外泌体递送系统—实现在工程化的哺乳动物细胞中高效、可定制地生产设计外泌体。EXOtic 系统由 RNA 包装系统、靶向系统及胞质递送辅助系统构成。RNA 包封系统由 C/D box RNA 结构元件与古细菌核糖体蛋白 L7Ae 组成，其机制为：嵌入到 CAR-mRNA 3'UT 序列中的 C/D box RNA 结构元件与与 L7Ae（与外泌体最为广泛的标记物 CD63 融合表达）特异性结合，从而使得 CAR-mRNA 被包封进入外泌体。靶向系统由能够与靶细胞表面受体发生特异性结合的 scFv 与跨膜蛋白 lamp2b 融合表达而成。胞质递送辅助系统由 Cx43-S368A（Cx43 突变形式，具有长久活性）构成，其机制为：富集于外泌体表面的 Cx43(间隙连接蛋白)会形成六聚体通道，这将有利于 mRNA 从外泌体转移至靶细胞细胞质[6]。 基于 EXOtic 外泌体靶向递送系统，黄曦团队构建了三种慢病毒表达质粒：anti-CD206-LAMP2-neo(新霉素)负责外泌体靶向 M2 巨噬细胞表面标记物 CD206；CD63-L7Ae-P2A-Cx43S68A-Hygro(潮霉素)负责外泌体包封 mRNA 及胞质释放 mRNA；MSLN-CAR-C/D box-Puro(嘌呤毒素)负责转录 C/D box 元件的 CAR-mRNA。将上述质粒分别与慢病毒包装辅助质粒共转染 293T 细胞，能够产生三种携带不同抗生素标签的重组慢病毒。随后，用三种慢病毒依次转导 HEK293T 细胞，在进行下一轮病毒转导之前，完成每一轮转导成功克隆的筛选，最终得到能够稳定产生 MSLN-CAR mRNA@aCD206 sEVs 的单克隆细胞系。将获得的单克隆细胞系在含有无外泌体胎牛血清的 DMEM 培养基中扩增 2 天。之后，收集细胞培养上清液，并使用差速离心从培养基中分离得到 MSLN-CAR-mRNA@aCD206 sEVs，由此制备出一种可靶向 M2 巨噬细胞、内部包封 MSLN-CAR-mRNA 的外泌体制剂。 考虑到静脉注射导致 sEV 主要在肝脏和脾脏中积累，研究人员将 CARmRNA@aCD206 sEV 外泌体通过吸入式给药递送至 MLSN 阳性的肺癌小鼠模型体内，结果显示，CARmRNA@aCD206 sEV 具备良好的肿瘤浸润能力，聚集在肺部肿瘤组织内，凭借 CD206 scFv 的靶向性，能够将 CAR mRNA 精准递送给巨噬细胞，促使原位 MSLN-CAR-M 巨噬细胞的产生，在 CAR 介导下靶向吞噬 MSLN 阳性肿瘤细胞，触发适应性免疫反应，有效抑制肿瘤生长[7]。 2.2 去核间充质干细胞靶向递送 CAR-Plasmid 多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的颅内肿瘤之一，目前尚无有效的治疗方法。在 GBM 肿瘤组织内，浸润性小胶质细胞/巨噬细胞（GAM）比例占到 30%~50%。基于这一点，郑州大学史进进等人利用去核间充质干细胞（eMSCs）将 CD133-pCAR 质粒递送至颅内胶质瘤部位，原位生成 CAR-M 细胞，达到抑制肿瘤生长的目的。具体来说，该治疗方法包括两个核心要点： 第一，设计 CD133-CAR 结构。与正常组织相比，GBM 组织高表达 CD133，且 CD133 水平与病人存活率呈负相关，说明 CD133 可作为肿瘤治疗的理想靶标。 第二，去核间充质干细胞作为编码 CD133-pCAR 的递送载体，以自身凋亡实现巨噬细胞的精准靶向递送。eMSCs在细胞核移除后仍保持固有的肿瘤趋向迁移能力，但是，无法长期生存，大约在 60 小时活性后即启动程序性细胞凋亡。该凋亡过程以磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和表面暴露为特征，产生特异性"吞噬信号"从而促进巨噬细胞高效识别。 采取细胞松弛素 B 处理小鼠脂肪源性间充质基质细胞（MSCs），通过梯度超速离心获得 eMSCs。首先，将 CD133-pCAR 质粒、Zn2+离子及 NLS（核定位序列肽）混合以制备 NP/pCAR，然后，将 NP/pCAR 与 eMSCs 孵育便可获得包封 pCAR 的 eMSCs。 值得一提的是，他们还使用 LNP 递送 pCAR，LNP 配方由可电离脂质 DLin-KC2-DMA，辅助脂质 DSPC，胆固醇，PEG 2000-DSPE 构成。然而，在原位胶质细胞瘤小鼠模型中，静脉注射 eMSC/pCAR 要比 LNP/pCAR 表现出更高的递送效率，更加显著的抗肿瘤效果。 2.3 甘露糖修饰 LNP 递送 CAR-mRNA 胰腺导管腺癌（PDAC）占所有胰腺癌病例的 90% 以上，且其五年生存率低于 10%。PDAC一个关键病理特征是广泛的纤维化。超过 90% 的 PDAC 组织由非肿瘤细胞组成，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和细胞外胶原 。这些成分形成一道致密的 “壁垒”，包裹并浸润胰腺癌细胞，阻碍药物渗透和免疫细胞浸润，进而导致耐受肿瘤药物。活化的 CAFs 被认为是维持纤维化屏障最重要的细胞，同时，也是细胞外胶原的主要来源。针对活化 CAFs 的 CAR-T 疗法在心力衰竭（心脏纤维化）中已显示出治疗潜力。然而，由于免疫抑制性的肿瘤微环境，CAR-T 在克服实体瘤中的纤维化和治疗屏障方面仍面临重大挑战。 FAP（成纤维细胞激活蛋白-α）是激活 CAFs 的特异标志物，其高表达与患者预后负相关，因此，FAP 是清除纤维化屏障的理想靶点。中国药科大学杨勇/王文广/李娴静团队希望在体内原位生成靶向 FAP 的 CAR-M 细胞，高效清除掉 CAFs，从而降低肿瘤纤维化屏障，增强化疗药物和免疫治疗对 PDAC 的敏感性。 鉴于 CD206 是 M2 巨噬细胞表面的甘露糖受体，因此，他们选择在 LNP 配方中加入甘露糖，制备甘露糖修饰的脂质体(MLNP)，递送 FAP-CAR mRNA，特异性靶向 M2 巨噬细胞，从而原位生成靶向 FAP 的 CAR-M 细胞。在 PDAC 皮下荷瘤小鼠模型或者原位 PDAC 小鼠模型中，静脉注射 FAP-CAR-mRNA-MLNP+吉西他滨（GEM）或者 PD1 可显著抑制肿瘤生长，延长生存期。 3 小结 在商业化过程中，CAR-M 药物首先选择的工艺路线是离体制备，原因在于在体外用病毒载体将 CAR 基因递送至巨噬细胞的难度较小，并且，病毒载体生产和细胞培养的工艺相当成熟。此外，体外生成的 CAR-M 药物更容易对其进行质量控制，保证均一性。然而，体外 CAR-M 药物的制备是针对每一个病人个体的，无法实现大规模的通用性制备，耗费的人力物力巨大。病人自身的健康状态也会影响体外 CAR-M 的最终质量。相反，In vivo CAR-M 制备，是可以规模化生产和存储的现货型药物，极大降低了生产成本，提升了生产效率。只要能够解决 LNP 靶向递送的问题，基于 mRNA 技术的体内 CAR-M 药物一定会成为未来免疫细胞疗法的经典范例。 参考文献： Enhanced infection efficiency and cytotoxicity mediated by vpx-containing lentivirus in chimeric antigen receptor macrophage (CAR-M).       Human chimeric antigen receptor macrophages for cancer immunotherapy.   A second-generation M1-polarized CAR macrophage with antitumor efficacy.   Targeted glycan degradation potentiates cellular immunotherapy for solid tumors.       Metabolic Reprogramming via ACOD1 depletion enhances function of human induced pluripotent stem cell-derived CAR-macrophages in solid tumors.         Designer exosomes produced by implanted cells intracerebrally deliver therapeutic cargo for Parkinson’s disease treatmen.         Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles.     In vivo generation of CAR macrophages via the enucleated  mesenchymal stem cell delivery system for glioblastoma therapy.   In vivo FAP-CAR macrophages enhance chemotherapy and immunotherapy against pancreatic cancer by removing the fibrosis barrier.         识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。

今日，石药官宣了与百济的重磅合作，将其一款由AI驱动小分子药物设计平台获得、有望成为BIC的临床候选药物，以及后续开发的由该化合物组成或含有该化合物的任何药品在全球的开发、制造及商业化，独家授权给后者，合作总金额最高达18.35亿美元，约134亿元人民币。 无疑，这是近几年中国医药行业内部少见的高额BD合作。一方是在研管线储备较为丰富的“创新转型三剑客”，一方是创新药“一哥”。结合本周刘勇军突然从石药集团离职一事，叠加近3个月从石药集团到其创新药子公司一连串人事、资本和创新策略上的变动，能够看到，石药集团在创新研发、国际化等方面或正受到一定挑战，但同时正在作积极调整。 恰是在本周，恒瑞宣布赴港上市，加上此前新诺威收购石药百克，中生制药入股A股IVD小巨头，中国创新转型三剑客不约而同地都在进行A+H的上市布局。 兜兜转转，时移世易。继今年宣布换股合并，不再执着于“回A”，而转向寻求整体在H股上市后，另一庞大的医药集团东阳光正式有了新动作：广东东阳光药业股份有限公司（东阳光药）已成功向联交所提交上市申请，这标志着东阳光集团医药资产资本运作的重要一步，有利于东阳光药研发、生产和销售一体化进程全面提速、成为市值破千亿的国内医药龙头企业。 同在本周，第十批集采上海开标，开标前夕国家医保局、国家卫健委联合发文，完善集采和执行工作机制，重点从集采药品耗材进院、使用、监测、考核、反馈等各环节提出多项细化措施。 悄然之中，中国医药行业故事再翻新篇。 政策动态 第十批集采上海开标：12月12日，第十批国家组织药品集中带量采购产生拟中选结果。本次集采有62种药品采购成功，覆盖高血压、糖尿病、肿瘤、心脑血管疾病、感染、精神疾病等领域，共有234家企业的385个产品获得拟中选资格。 两部门发文，完善集采和执行工作机制：12月10日，国家医保局、国家卫健委联合印发《关于完善医药集中带量采购和执行工作机制的通知》，文件在原有政策基础上进一步完善了医药集中带量采购和执行工作机制，巩固深化药品、医用耗材集中带量采购改革成果，重点从集采药品耗材的进院、使用、监测、考核、反馈等各环节提出细化措施，体现出部门间协同监管、优先使用中选产品的政策导向。 湖北医保服务平台挂出《关于全国中成药采购联盟集中采购相关数据信息的公示》：第三批中成药纳入集采的共有20个中成药产品组，涉及95个中成药产品。从产品组企业数量看，生脉、益气复脉采购组有97家企业参与，竞争最为激烈，独一味、丹参、灯盏花素和灯盏细辛、芪龙和消栓等产品组厂家均超过20家。 上海设立百亿基金，引导药企并购重组：12月10日，上海市人民市政府办公厅官网发布《上海市支持上市公司并购重组行动方案（2025-2027年）》，内容提到，力争到2027年落地一批重点行业代表性并购案例，在生物医药等重点产业领域，培育10家左右具有国际竞争力的上市公司，力争形成3000亿元并购交易规模。上海将设立100亿元生物医药产业并购基金，政府通过普通股、优先股、可转债等方式参与并购基金出资。另外，政府会引入专业赛道市场化并购基金管理人，吸引集聚市场化并购基金。 大型制药 Lonza计划重组CDMO业务：随着新任首席执行官的上任，全球CDMO龙头公司Lonza计划通过加倍投入CDMO业务，并剥离利润较低的业务领域，以重振业绩。Lonza公布了一项名为“一个Lonza”的重组战略，根据该战略，公司将重组其CDMO业务，重塑其运营模式，努力提升制造和工程能力，扩大生产足迹，并计划在“适当时机”将其胶囊和健康成分（CHI）业务剥离出去。 第一三共首次在中国建立ADC工厂：12月11日，第一三共宣布将在上海张江投资约11亿元，用于筹建ADC新生产楼项目，这是第一三共首次在中国建立ADC药物工厂。该厂包括生产设施、研发实验室、质量控制中心等，以满足未来ADC药物的研发、生产和质量控制需求。据悉，该工厂计划于2030年运行。 罗氏停止多项乙肝新药管线：根据今年Q3财报信息，罗氏又停止了4项乙肝领域管线，分别为RG6449、RG7854、RG6346及RG6084，这些项目分别处于I期/II期临床阶段，并在早前有部分临床试验数据公布。终止研发的管线主要涉及乙肝领域。 诺华新高管加入，来自武田：近期，武田宣布抗肿瘤事业部负责人闫薇离职，随即，诺华宣布闫薇加入，担任诺华肿瘤治疗领域负责人，成为诺华国际业务部中国区管理团队成员。在带领武田中国肿瘤事业部期间，闫薇组建了肺癌团队确保两大品牌成功上市，并在血液肿瘤、乳腺/前列腺肿瘤以及肺癌聚焦业务机会，应对临床需求。 安进中国总经理等三高管同日离任：据多个信源消息，12月11日下午，安进宣布多项重要人事变动，安进副总裁兼中国总经理许蔼龄、安进中国心血管事业部负责人吴海、安进中国骨科业务负责人范成敏同时离任。安进亚太区总经理柯美玲通过邮件向全体员工通报了这一消息，柯美玲也表示，安进在中国的战略重心将保持不变。（相关阅读：太突然！安进中国总经理等三高管同日离任） 超18亿美元，石药与百济达成合作：石药集团发布公告，称与百济神州就集团的新型甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)抑制剂(SYH2039)，以及后续开发的由该化合物组成或含有该化合物的任何药品在全球的开发、制造及商业化订立独家授权协议。根据协议，石药将收取总计1.5亿美元的预付款，并有权收取最高1.35亿美元的潜在开发里程碑付款及最高15.50亿美元的潜在销售里程碑付款。除去分层销售提成，合作总金额最高达18.35亿美元。 正大天晴与香港中文大学医学院签署合作框架协议：12月9日，中国生物制药旗下核心企业正大天晴药业集团与香港中文大学（中大）医学院签署首份合作框架协议，建立战略合作伙伴关系，发挥双方在医学科研及临床应用的优势，加速两地创新生物医药研究成果转化，打造香港成为创新医药产业的亚太区枢纽。根据本次协议，中大医学院与正大天晴将推动包括临床试验、人才联合培养等在内的多领域合作及促进科研活动。 上药控股与科伦博泰达成战略合作：12月9日，上药控股与科伦博泰举行战略合作签约仪式，双方将进一步整合优势资源，在全国市场准入、创新金融支付等领域探索更为全面深入的合作模式，聚力推动芦康沙妥珠单抗（sac-TMT，佳泰莱）的全方位合作。上药控股、上药云健康、镁信健康将围绕创新药上市前服务、全国控股网络、创新增值等方面，开展与科伦博泰的合作，巩固战略伙伴关系。（相关阅读：中国头部Pharma创新战略：布局上海前沿，携手跨国巨头，上药全产业链版图如何“亮剑”？） 甘李药业GLP-1双周制剂进入临床III期：12月11日，美国临床试验收录网站Clinicaltrials信息显示，甘李药业启动了长效胰高血糖素样-1受体（GLP-1R）激动剂GZR18注射液的首个III期研究（GZR18-BWM-301）。该药物是首款进入III期阶段的单靶点GLP-1双周制剂，涉及研究的主要终点是第48周受试者体重相对于基线的百分比变化。 生物技术 康方生物两款双抗新药国谈价格传出：12月12日，网络上流出康方生物卡度尼利和依沃西国谈最终价格，有机构按挂网价格进行测算，卡度尼利年费用约为15.1万元，依沃西年费用近16万元。受此消息影响，康方生物午后股价大涨。 国内首款，瓴路药业CD19 ADC获批上市：12月10日，NMPA显示，瓴路药业靶向CD19的ADC产品、注射用泰朗妥昔单抗（Loncastuximab tesirine）上市申请已获得批准，适应证为单药治疗复发/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤（R/R DLBCL）。这是国内首个获批上市的CD19 ADC药物。 国内首个杜氏肌营养不良治疗新药获批上市：近期，曙方医药申报的伐莫洛龙口服混悬液获批上市，用于治疗四岁及以上杜氏肌营养不良（DMD）患者，这是国内首个获批的 DMD 新药。2022年，曙方医药以高达1.24亿美元与瑞士Santhera制药公司达成独家授权协议，获得伐莫洛龙用于DMD及其他罕见病适应证在大中华区的独家开发和商业化权益。2023年10月，伐莫洛龙首次在美国获FDA批准上市。 “渐冻症”领域又一笔合作诞生：近日，Dewpoint Therapeutics宣布与田边三菱制药株式会社达成战略研究合作协议，双方将共同推进Dewpoint一款在研TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）靶向小分子凝聚体调节剂（c-mod），用于治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者。根据协议，该合作的总交易金额最高可达4.8亿美元。 Moderna RSV疫苗“摔跟头”：12月10日，FDA宣布所有针对婴幼儿和幼童的RSV疫苗研究被全面暂停，其中包括Moderna两款疫苗mRNA-1345和mRNA-1365的研究，并计划在12日召开咨询委员会会议讨论疫苗的安全性。继年中CDC建议缩窄成人用RSV疫苗的覆盖人群后，历经近70年的研究才有三款产品上市的RSV疫苗，其安全性和未来前景又蒙上了一层阴影。而顶着“第一款上市的非COVID-19 mRNA疫苗”光环还不到半年，Moderna在RSV疫苗里又摔了个大跟头，RSV疫苗研究被FDA按下“暂停键”。（相关阅读：FDA突然叫停！Moderna大跌，国内RSV疫苗快跟者，咋办？） 细胞疗法先驱公司Carisma裁员34%：作为重新确定其产品线优先级以专注于纤维化、肿瘤学和自身免疫疾病治疗方法的“战略重组计划”的一部分，Carisma Therapeutics 在近期宣布再裁员34%，裁员包括23名全职员工，包括三名高管和研发相关人员。此外，Carisma还停止了其主要候选药物CT-0525的开发。 Editas裁员65%：12月12日，Editas Medicine宣布一项关键战略调整，以优化其成本结构，将其现金流延伸至2027年第二季度。内容提到，Editas将在未来6个月内裁减约65%的员工，包括管理团队的多名成员，如CMO。Editas是全球最早致力于基因编辑疗法开发的公司之一，成立于2013年，创始团队成员包括张锋。 两家生物技术公司裁员并合并：近期，两家美国生物技术公司——Chroma Medicines和Nvelop Therapeutics正在裁员并合并，以组建一家新的基因药物公司——nChroma Bio，新公司将聚焦研发Chroma针对慢性乙型肝炎和丁型肝炎的主要研发资产CRMA-1001，目标在2025年提交临床试验申请。 资本市场 恒瑞宣布拟赴港上市：本周，恒瑞发布公告称，拟在境外发行股份(H股)并在香港联交所主板上市，本次发行的H股股票募集资金在扣除发行费用后，将用于研发创新、产品商业化及公司运营等用途。拟赴港上市，是为了推动科技创新和国际化双轮驱动战略，进一步助力其国际化业务发展。 东阳光药成功提交联交所上市申请：12月11日，东阳光长江药业发布公告，其控股股东广东东阳光药业股份有限公司（东阳光药）成功向联交所提交上市申请，这标志着东阳光集团医药资产资本运作的重要一步，东阳光药研发、生产和销售一体化进程全面提速，有利于东阳光药释放增长潜力，有望成为市值破千亿的国内医药龙头企业。东阳光药融合了东阳光长江药业的国内制剂销售业务，以其强劲的盈利能力为研发管线提供有力支持，形成商业与研发的良性循环。（相关阅读：东阳光药成功提交联交所上市申请，医药龙头迈向发展新高度） 新华制药拟收购挪亚圣诺不超过75%股权：12月10日，新华制药发布公告，称与NovoSana（Europe）B.V.（挪亚欧洲公司）签订《股权收购意向协议》，拟受让挪亚欧洲公司持有的挪亚圣诺(太仓)生物科技有限公司不超过75%股权。收购完成后，新华制药将成为挪亚圣诺的控股股东，挪亚圣诺将纳入新华制药合并报表范围。挪亚圣诺与新华制药鱼油产业具有高度互补性和协同性，本次股权收购符合新华制药在大健康板块的战略规划与布局。 迪哲医药再融资获审核通过：近期，迪哲医药发布公告，称其定向增发方案已经获上交所审核通过，预计募集资金18.48亿元。此次定增方案是证监会《关于深化科创板改革、服务科技创新和新质生产力发展的八条措施》发布以来，上交所首家未盈利企业再融资获得审核通过。 华润医药商业发行30亿元可续期公司债：12月9日，华润医药商业在深交所成功发行总规模30亿元的可续期公司债。采用3年、5年双向回拨机制，票面利率分别为2.15%、2.26%，全场认购倍数分别为1.85倍、2.68倍，创下该公司债发行最低票面利率，发行价格和发行利差均为今年以来市场较低水平。 礼来批准150亿美元股票回购：近期，礼来宣布董事会批准了一项高达150亿美元股票回购计划，以反映重磅减肥药Zepbound对礼来增长的推动力。同时，礼来将季度股息提高15%。 安济盛生物完成1.2亿美元C轮融资：12月11日，安济盛生物（Angitia）宣布完成由Bain Capital Life Sciences领投的1.2亿美元C轮融资。参与本轮投资的包括新投资人Janus Henderson及奥博资本、三正健康投资、涌铧投资、君联资本和骊宸投资。该轮融资所得款项将用于支持公司创新药物管线，致力于开发针对骨骼、关节和肌肉重症疾病领域的差异化创新治疗方案。 一审| 黄佳 二审| 李芳晨 三审| 李静芝 精彩推荐 CM10 | 集采 | 国谈 | 医保动态 | 药审 | 人才 | 薪资 | 榜单 | CAR-T | PD-1 | mRNA | 单抗 | 商业化 | 国际化 ｜ 猎药人系列专题 | 出海 启思会 | 声音·责任 | 创百汇 | E药经理人理事会 | 微解药直播 | 大国新药 | 营销硬观点 | 投资人去哪儿 | 分析师看赛道 | 药事每周谈 | 医药界·E药经理人 | 中国医药手册 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