Burfiralimab

01 引言 生物技术药物已成为医药产业增长最快的领域，根据弗若斯特沙利文分析报告，全球生物药市场预计到2030年将突破8000亿美元，年复合增长率显著高于小分子化学药。治疗性蛋白、单抗等生物大分子药物及其生物类似物的研发是生物技术药物领域中公认的研究热点，是目前治疗血液恶性肿瘤和实体瘤最成功和最重要的策略之一。例如，靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂已彻底改变了晚期非小细胞肺癌、黑色素瘤等多种癌症的治疗格局。新靶点抗体、新型抗体类药物不断涌现，如纳米抗体(以其分子小、穿透力强为特点)、 双靶点单抗(如卡度尼利单抗，能同时阻断PD-1和CTLA-4通路)、 ADC (抗体药物偶联物，如用于HER2阳性乳腺癌的恩美曲妥珠单抗) 。但选用上述药物进行治疗时会出现一个不容忽视的问题，即抗体的免疫原性。在临床上，免疫原性可能会降低药物疗效(如使药物在起效前被快速清除) 或导致机体严重的不良反应(从轻微的输液反应到危及生命的过敏性休克或自身免疫病) 。在临床前，免疫原性对药物具有竞争抑制作用，可能会中和药物的活性，影响药物清除、血浆半衰期和组织分布，改变药效或药动学，在非临床研究中观察到的效应可能并非药物真正的药理或毒性反应。一个典型的例子是，在灵长类动物毒理试验中，若动物产生了高滴度的中和抗体，可能完全掩盖药物的长期毒性，导致无法评估其真实的安全风险。因此在临床前和临床试验中评价免疫原性是生物技术药物申请临床试验注册申报研究资料的重要内容，对预测和阐明这些药物临床安全性和有效性具有关键的作用。 02 免疫原性产生的影响因素 药物的免疫原性是指药物刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的性质。这好比人体将进入体内的药物误认为是“入侵者”(如病毒或细菌)，从而发动免疫系统进行攻击。许多因素可以影响生物技术药物的免疫原性，包括氨基酸序列中的B细胞和 T细胞的抗原表位、聚合物、给药途径、患者人群的遗传背景和免疫状态、产品纯度、给药剂量和浓度以及其他因素等。 2.1 内源性因素 内源性因素与药物自身的特点有关，例如药物分子大小、异源氨基酸序列以及产品纯度等。 1)分子大小 对不表达此类分子的哺乳动物来说，相对分子质量(relative molecular weight,RMW)大于10000的蛋白多肽常有免疫原性，RMW 在5000~10000的蛋白多肽也可能有免疫原性，但引起的免疫反应相对较弱。例如，胰岛素(RMW约5808)的免疫原性通常较低，而完整的IgG单抗(RMW约150000)则更容易诱发免疫反应，RMW 在1000~5000的化合物免疫原性则难以预测。此外，分子结构复杂者(如具有复杂糖基化修饰的促红细胞生成素) 免疫原性强，反之(如线性多肽) 则较弱。 2)异源氨基酸序列 来自非人源氨基酸序列(比如鼠源抗体等)不同于人的氨基酸序列等，人体免疫系统能敏锐地识别这些“非我”序列，并启动免疫应答。例如从上市单抗和融合蛋白类药物的免疫原性发生率来看，人源序列从鼠源抗体(0%人源序列，如单抗CD3(OKT3)，到嵌合抗体(约67%人源序列，如利妥昔单抗(Rituxan)，英利夫单抗(Remicade)到人源化抗体(约 95% ~100% 人源序列，如奥马珠单抗,Xolair；贝伐单抗,Avastin)，再到全人抗体(约100%人源序列，如阿达木单抗,Humira；戈利木单抗,Simponi)，免疫原性的发生率极大下降，如表13-1所示。具体而言，早期鼠源单抗OKT3的ADA发生率可高达80%以上，而全人源阿达木单抗在临床上的ADA发生率约为5%-50%，个体差异较大，但整体风险已显著降低。 3)产品纯度 药物蛋白含杂质如细胞基质、培养基成分等，会直接导致免疫原性，或者具有佐剂的作用。这些杂质作为“危险信号”，能激活天然免疫系统，从而增强针对药物本身的适应性免疫应答。 2.2 外源性因素 外源性因素包括给药途径、配方、给药频率时间和包装材料，甚至与宿主密切相关。 1)给药途径 给药途径在一定程度上影响蛋白质的免疫原性证据显示，具有免疫原性的蛋白质不适于皮下注射给药，因为皮下组织富含树突状细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞，更容易捕获抗原并启动免疫反应。例如，由于绝大多数纯红细胞性贫血(pure red cell aplasia, PRCA)病例发生在皮下注射红细胞生成素α(erythropoietin α,EPOα,Eprex)，因此欧洲的药品注册管理部门限制Eprex通过静脉注射途径给药。但从本质上，皮下注射本身并不能使蛋白质从非免疫原性变为具有免疫原性，改变给药途径也不能使本身具有的免疫原性消失，仅能使具有免疫原性的蛋白发生免疫反应的概率降低。 2)配方、保存或运输条件 配方不合理、保存或运输不当(如反复冻融、暴露于高温或剧烈震荡) 可能会使蛋白质聚集或变性，从而增强其免疫原性。蛋白质聚集体可作为多价抗原，更有效地交联B细胞受体，或作为内源性佐剂激活免疫通路。许多药物为了降低成本需要提高抗体表达量而未做好糖基化修饰，导致多聚体产生；在抗体生产工艺里没有任何一步骤能够把多聚体去除，因此多聚体是免疫原性产生的一个主要原因。以重组人促红细胞生成素α(依泊汀α,Eprex/Erypo)为例，它最早于1988在欧洲获得批准上市，用于刺激贫血或正在接受化疗患者生成红细胞，Eprex最初含有人血清白蛋白，其作用是稳定蛋白质分子，防止聚集，后欧盟监管机构鼓励Eprex/erypo开发不含人血清白蛋白的配方，以求通过降低传播病毒性疾病的风险来提高安全性。2002年 Nicole Casadevall教授等报道了13例纯红细胞生障碍(pure red cell aplasia,PRCA)病例检测出外源性和内源性促红细胞生成素的中和抗体。后有报道称，自1998-2004年共有191例PRCA 患者体内有上述中和抗体产生，其中2001年发生率最高，且仅出现在欧洲；而美国未出现此病例，美国一直使用的是含人血清白蛋白配方。由此，人们推测PRCA 病例中促红细胞生成素中和抗体产生的原因可能是去除白蛋白后的重组人红细胞生成素发生聚集氧化，导致抗原性质发生改变。后续调查进一步将风险聚焦于配方变更后，与特定橡胶瓶塞中的化学物质(如有机化合物)相互作用，促进了蛋白质聚集。 3)给药频率和时间 单次注射以产生IgM 为主，多次注射14天后以IgG为主。IgG抗体亲和力更高，效应更强，是导致药物中和与清除的主要原因。给药间隔越长，抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)的亲和力越高。患者的从药性提高了，药效有可能下降很快。例如，在间歇性给药方案中，免疫系统有足够时间进行亲和力成熟，产生的高亲和力ADA能更有效地中和药物。因此FDA强调，药物研发是一个长期的系统工程，对免疫原性的关注必须贯穿药物研发和上市后。 4)包装材料 以Eprex为例，其免疫原性的产生还可能与所用的包装(包括密封系统)材料有关。研究发现，注射器中含有硅油，在特定条件下可能使得促红细胞素聚集，从而导致抗促红素抗体形成，这凸显了药物与直接接触的包装材料之间的相容性研究至关重要。 5)宿主因素 生物技术药物具有免疫原性，并不意味着一定会诱导患者体内产生免疫反应。比如西妥昔单抗(Erbitux)和贝伐单抗(Avastin)，非临床研究表明它们在健康猴子体内的ADA较高，但由于被治疗的患者(如晚期结直肠癌患者) 本来免疫功能低下，且接受化疗和放疗后，免疫系统几乎被彻底摧毁，故Erbitux和 Avastin的 ADA 发生率都非常低。相反患有自身免疫疾病(如类风湿关节炎或多发性硬化) 的患者，其免疫系统高度敏感，即使原本较弱的免疫原性也会放大很多倍。此外，患者的特定HLA(人类白细胞抗原)基因型也可能决定其对某些药物表位的应答强度。 03 免疫原性评价内容 免疫原性是生物技术药物安全性评价的重要内容，主要有以下3方面的意义： ·对患者和医师来说，免疫原性会影响药物的安全性和有效性。某些治疗性蛋白质，抗药抗体反应能引起临床各种的不良反应，包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征。例如药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能使药物的疗效发生改变。例如，在使用α-干扰素治疗过程中产生的中和抗体，可导致病毒性肝炎患者病毒载量反弹，治疗失败。 ·对企业来说，研发风险大大增加。免疫原性难以预测，因为免疫原性的强弱与多种因素相关，包括药物活性成分、杂质、辅料种类、稳定性、给药途径、剂量、受试群体等，加上临床前免疫原性测定对临床免疫原性预测评价的局限性，有时到了临床才发现ADA问题，损失惨重。一个著名的失败案例是某公司在研的促血小板生成素受体激动剂，因其在健康志愿者中诱发强烈的ADA，并交叉中和内源性促血小板生成素，导致致命性血小板减少，最终项目终止，造成数亿美元的直接损失。 ·对药监部门来说，免疫原性也是影响药物临床研究或者上市许可决定的风险因素之一。许多国家的监管机构均要求在临床前药理学或毒理学研究中，采用经过验证并符合免疫原性研究要求的方法对抗药抗体进行评估。例如，美国FDA要求所有生物药上市前必须提供免疫原性评价数据，确保药物的安全性和有效性。我国国家药监局(NMPA)也发布了相应的《药物免疫原性研究技术指导原则》，以规范相关研究。 在临床前和临床试验中进行免疫原性评价是生物技术药物注册申报研究的重要内容。在评价内容方面，非临床和临床免疫原性评价各有侧重。 3.1 临床前免疫原性评价 临床前免疫原性评价中测定药物的结合抗体，有助对非临床研究结果做出更加合理的解释，通常使用多层的方法(multi-tiered testing approach)，包括抗药抗体筛选(screening assay)、确证(confirmatory assay)、抗体滴度检测(titering assay)、中和抗体检测(neutralization assay)和(或)抗体亚型分析。这个分层策略如同一个“诊断漏斗”：首先用高灵敏度的方法进行广泛筛查(避免漏检)，然后对阳性样本进行特异性确证(避免假阳性)，最后对确证的阳性样本进行定量和功能分析。首先对结合抗体进行检测，如果检测结果表明存在抗体反应，则需要对抗体反应进行进一步的研究，如抗体滴度、抗体反应的阳性率、是否为中和抗体以及抗体的亚型等。例如，IgG4亚型通常与免疫耐受相关，而高滴度的IgG1或IgG4若具有中和能力，则更具临床意义。其次，抗体形成还应与药理和(或)毒理学变化相联系，进行综合分析，如抗体产生对药代动力学(如导致药物血药浓度骤降)、药效动力学(如药效减弱或丧失)、补体激活或毒性反应出现等是否存在影响。此外，还应关注抗体产生与免疫复合物形成和沉积相关的病理变化(如在肾脏、关节血管壁观察到的免疫复合物沉积)。 3.2 临床免疫原性评价 生物技术药物临床免疫原性研究主要关注其对安全性和疗效(增效、减效、失效)的影响，研究中受试者的数量应足够多，对采样时间、样品处理/储存以及数据分析所用统计方法等需要进行科学论证。抗体检测方法应具有较高的特异性和灵敏度，免疫原性风险越大，分析检测方法的开发越要早，对免疫原性的关注需要贯穿整个研发和上市后。抗体监测的观察期取决于药物的疗程、抗体产生的预期时间和带来的后果。以抗体的检测频率为例，如果体内存在与药物相似的内源性蛋白且其功能十分重要(如促红细胞生成素、凝血因子) ，或药物可能会引起特异性反应，就必须详细地进行免疫原性研究，抗体的检测频度也最密集(如在每个给药周期前、后及随访期多次采样) ；可能会因免疫原性而导致毒性反应的生物技术药物，抗体的检测频度次之；免疫原性低或无免疫毒性风险低的生物技术药物，抗体的检测频度可适当延长。所有采样时间点的设计，都应考虑到抗体产生的动力学：初始应答、峰值和可能的衰减。 04 免疫原性检测技术和方法学验证要点 免疫原性是生物技术药物安全性和疗效评价中重点评估的一项，通过检测抗药抗体可评价药物的免疫原性。开发和完善免疫原性检测的技术方法(如结合抗体和中和抗体检测技术)则更具挑战性，因为需要在高浓度药物(靶标)存在下，灵敏且特异地检测出低浓度的ADA，这如同在巨大的瀑布声中听清一滴水的声音。 4.1 常见的抗体检测方法 目前抗体药物ADA检测方法有很多，如桥式ELISA法、间接ELISA法、放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation,RIP)、表面等离子共振法(surface plasmon resonance,SPR)等。 1)桥式ELISA法 该法用于包被药物，用标记的药物检测。优点是可高通量检测，能检测各类抗体亚型，无种属特异性；缺点是不易检测到低亲和力的抗体，包被或标记时可能会掩盖或改变药物的抗原表位，易受药物本身的干扰。(“药物干扰”是指当患者体内存在游离药物时，会与ADA竞争结合位点，导致假阴性结果)。 2)直接ELISA法 此法用于包被药物，用标记的抗体检测。优点是能够检测低亲和力抗体；缺点是包被时可能会掩盖或改变药物的表位，有种属特异性，多次洗涤时低亲和力抗体容易丢失。 3)间接ELISA法 此法包被单抗或生物素，再加药物。优点是药物与包被的单抗结合后仍能保持抗原表位的暴露；缺点与上述直接法相似。 4)生物薄膜干涉法(BLI) 生物薄膜干涉法(bio-layer interferometry, BLI)，生物传感器与药物偶联再加样本。此法的优点是液相法、高通量、自动化，不需要使用酶标记抗体，能检测到不同亲和力的抗体和各亚型抗体，无种属特异性；缺点是需要使用特殊仪器，灵敏度较低。 5)电化学发光法(ECL) 此法的优点是液相法，可检测各种抗体亚型，无种属特异性，高通量，灵敏度高；缺点是需制备2种标志物(生物素和 TAG)，在标记过程中标志物分子的表位可能会变化，需要使用特殊仪器，所用试剂通用性差。MSD平台是此方法的代表，因其高灵敏度和宽动态范围而被广泛使用。 6)放射免疫沉淀法(RIP) 放射免疫沉淀法(RIP)的优点是液相法，灵敏度高，中等或高通量水平；缺点是使用同位素，同位素半衰期短，同位素标记影响表位暴露，有种属特异性，由于标记的药物非特异性地夹带在沉淀物中，因此相对于固相表面结合力较弱。 7)中和抗体检测 生物技术药物在动物体内产生的抗体并不一定具有中和活性，需要对生物技术药物或结构/功能上相关的内源性蛋白质的中和活性进行检测。抗体中和活性的检测方法一般采用该制剂的生物学活性检测方法，如采用基于细胞的抗体中和活性检测。例如，检测抗PD-1单抗的中和抗体时，可使用能表达PD-1/PD-L1通路报告基因的细胞系，观察ADA是否能逆转药物对该通路的阻断效应。 4.2 抗药抗体分析方法验证一般原则 临床和非临床研究通常是通过对抗药抗体反应的检测和表征鉴定来评估药物的免疫原性的。不管采用何种方法，在方法开发和优化后应进行正式的方法学验证，以保证该方法的各项性能适合相应的检测要求。目前，美国FDA的指导性文件阐述了免疫原性检测的方法学开发和验证应包括的主要研究内容。抗药抗体免疫分析方法学验证应对筛选临界点、确证临界点、灵敏度、(通常要求能检测到100-500ng/mL范围内的阳性对照抗体) 耐药性、(评估在预期最高药物浓度下，方法仍能可靠检测出ADA的能力) 精密度、鲁棒性、稳定性等参数进行测定。 05 免疫原性评价未来面临的问题 随着生物技术药物的快速发展，特别是新型模态如细胞与基因治疗、双特异性抗体、复杂ADC等的出现，也给药物的免疫原性评价带来了挑战。如何优化检测技术、实现评价方法的规范化和标准化、提高动物模型的预测性是未来免疫原性评价亟需解决的问题。 5.1 方法的规范化和标准化 目前国内外尚无免疫原性临床前检测的综合性指导原则，有关这方面的要求分散在多个指导原则中，检测方法、要求和解释也不统一。由于每种生物技术药物的特性不同，因此难以抽象地推荐使用一种检测方法。这导致了不同实验室、甚至同一药物不同研究阶段的数据可比性差，为监管审评和行业交流带来了困难。 5.2 抗药抗体检测方法的优化 目前抗药抗体检测存在很多问题，比如，在灵长类动物实验中，由于猴与人的高度同源性，测定中会产生交叉干扰，造成高的背景性反应；基质中可能含有研究药物、内源性抗体和类风湿因子等，可能会抑制抗药抗体与药物的结合；产生抗药抗体和体内药物结合从而影响抗体检测(即“药物耐受性”问题) ；ADC药物在动物体内诱发抗药抗体水平较低，需要灵敏的检测方法；许多动物血清中特异性抗抗体亲和力普遍较低，这也对检测方法提出新的要求和标准。未来的方向包括开发更高效的药物耐受性方法(如酸解离、固相提取)和利用高灵敏度质谱技术进行检测。 5.3 动物模型的预测性 在临床前毒理学试验中，检测抗药抗体可以在一定程度上反映生物技术药物的免疫原性强弱，但由于不同种属的动物与人体免疫系统之间存在着巨大的差异，动物试验中观察到的免疫反应并不一定代表受试药物在人体会产生同样的免疫反应，甚至有的生物技术药物在动物试验中发现具有免疫原性，而在临床上基本上无免疫原性，两者之间无明显相关性，因此从动物试验结果外推到临床试验需慎重。 尽管如此，对于大部分生物技术药物来说，非人灵长类动物是目前免疫原性检测最好的动物。阿达木在临床上报道的 ADA为43%~51%，临床前健康猴子检测的阿达木 ADA 为 41.7%，与健康人的数据非常接近，这表明猴子和人没有太大的差异。当然，健康的动物或健康人群的ADA数据必须加上患者免疫体系影响因子来预测患者中的免疫反应强度。此外，从动物数据外推到人时，还需要考虑在药物暴露时间上人大于动物，且抗体产生时间难以确定，有的甚至要在给药后12个月才出现抗体。未来，人类源化小鼠模型或基于人外周血单核细胞(PBMC)的体外免疫模型可能提供更好的预测工具。 生物技术药是目前药物研发的热点，但几乎所有的生物技术药物都会有一定程度的免疫原性，可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应，因此，生物技术药物的免疫原性问题必须要予以特别重视。免疫原性与药物安全性和有效性的之间的关联依赖临床前和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征，因此，在生物技术药物免疫原性评价中，应充分考虑方法的适应性，设计有效可行的检测方法，以产生高质量的抗药抗体数据，并结合PK、安全性和有效性等数据进行综合判定，从而更好地了解和预测免疫原性对毒性或疗效可能产生的影响。最终目标是实现个体化风险管理：通过对患者进行免疫监测，识别出ADA高风险人群，优化给药方案，或及时切换疗法，以最大化患者获益。 参考文献 1. 《抗体药物研发》，上海交通大学出版社 2. 其它信息源于网络搜索 免责声明：推文基于已公开的资料信息撰写，仅用于知识分享和传递，任何情况下本文的信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。